nicht immer eine ausreichende Enantiomerenreinheit. Die Produktausbeute und-qualität hängen stark vom verwendeten Stamm und den Anzuchtbedingungen ab.
Aus der europäischen Patentanmeldung 0569 998 A2 ist schliesslich ein Verfahren bekannt, bei dem verschiedene Mikroorganismen zur Reduktion von Ethergruppen enthaltenden Diketoestern eingesetzt werden. Zu den nach der Beschreibung dieser Erfindung einsetzbaren Mikroorganismen zähien zahlreiche Hefen und Bakterien, jedoch nicht Lactobacillus-Arten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäss ein Verfahren zur Reduktion von Diketo-oder Hydroxyketocarbonsäuren oder deren Estern, das die geschilderten Nachteile nicht mehr aufweist. Unter Hydroxygruppen sind hier auch mit Schutzgruppen maskierte Hydroxygruppen zu verstehen.
Die Erfindung ist gekennzeichnet durch ein Verfahren zur Reduktion von Diketocarbonsäuren oder Hydroxyketocarbonsäuren oder deren Estem bei dem in Gegenwart von Lactobacillus-Arten wenigstens eine Ketogruppe zu einer Hydroxygruppe umgesetzt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Reduktion zu Diolen durchgeführt.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung beinhaltet insbesondere die katalytische Reduktion der prochiralen 3,5-Dioxocarbonsäurenderivate gemäss Formel 1 :
EMI1.1
Formel 1 A, B = C=O, CHOU, mit I = H oder Schutzgruppe für die Hydroxyfunktion, wobei A und B gleich oder verschieden sein können.
R', R2 = H oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z. B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert oder vollständig durch Heteroatome ersetzt sein können.
R3 = H, Metalikationen oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z. B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können.
Y = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z. B. Si, N, P, 0, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können. Ausgeschlossen wird X-CH2-O-CH2-, wobei X = Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, Aralkyl oder Cycloalkylalkyl sein kann. Unter den Halogenen sind Fluor und Chlor besonders bevorzugt. n = 0-10.
Unter Alkyl sind sowohl geradkettige als auch verzweigte gesättigte Kohlenstoff-Ketten zu verstehen. Beispielhaft können Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, t-Butyl, Pentyl, i-Pentyl, n-Hexyl, i-Hexyl genannt werden.
Mit Alkenyl sind geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffe bezeichnet, für die beispielhaft Vinyl, 1-Propenyl, Allyl, Butenyl, i-Butenyl genannt werden können.
Mit Alkinyl sind geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffe bezeichnet, die wenigstens eine-C¯C-Bindung enthalten, wie beispielsweise Ethinyl oder Propinyl.
Von dem Begriff Cycloalkyl werden gesättigte, ringförmige Kohlenwasserstoffketten umfasst, die aus drei, vier, fünf, sechs oder sieben Kohlenwasserstoffatomen bestehen.
Cycloalkenyl bezeichnet ungesättigte, ringförmige Kohlenwasserstoffe, mit fünf, sechs, sieben oder acht Kohienstoffatomen. Unter Aryl sind aromatische Systeme, eingeschlossen Heteroaromaten und substituierte aromatische Systeme, wie z. B. Phenyl, p-Methylphenyl oder Furanyl zu verstehen.
Unter Aralkyl sind Arylreste zu verstehen, die über Alkylgruppen angebunden sind, z. B. ein Benzylrest.
Unter den Begriff Cycloalkylalkyl fallen Cycloalkylreste, die über Alkylgruppen gebunden sind.
Ebenso sind Reaktionen der Verbindungen gemäss der Formeln 2,3 und 4 möglich.
EMI3.1
Formel 2
EMI3.2
Formel 3 Formel 4 Hierbei haben R', R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1.
# = H oder Schutzgruppen für die Hydroxyfunktionen.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können demgemäss insbesondere 3,5-Dihydroxycarbonsäurederivate der im folgenden dargestellten Formel 5 erzeugt werden :
EMI4.1
Formel 5 Hierbei haben R', R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1. z = H oder Schutzgruppe für die Hydroxyfunktion.
Insbesondere können mit den erfindungsgemässen Verfahren, im Gegensatz zum Stand der Technik, Verbindungen gemäss den Formeln 3 und 4 als Substrate umgesetzt werden.
Je nach Konfiguration an den Stereozentren C-3 und C-5 können die erfindungsgemäss hergestellten 3,5-Dihydroxycarbonsäurederivate der Formel 5 zielgerichtet bei der Synthese chialer Naturstoffe, Pharma-und Agrowirkstoffe, Katalysatoren und Hemmstoffen eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren des Mevinsäure-Typs und Lipase-Hemmer des Lipstatin-Typs.
Andere Natur-oder Wirkstoffe verlangen andere Konfigurationen der stereogenen Zentren in Position C-3 und C-5. Auch dies ist mit der vorliegenden Erfindung möglich.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht bei der Reduktion von 3,5 Dioxocarbonsäurederivaten die regioselektive Einführung einer Hydroxygruppe in Position C-3 oder C-5 oder C-3 und C-5, wobei ein Produkt mit r-Konfiguration erhalten wird. Zu dem Begriff r-Konfiguration sei beispielhaft an Formel 3 folgendes ausgeführt : In der Formel 3 tritt die O#-Gruppe in 5-Position aus der Papierebene hervor, während Y und die Kohlenstoffatome des Kohlenstoffgrundgerüstes in der Papierebene liegen :
EMI5.1
Formel 3 Diese Konfiguration wird im folgenden unabhängig von Y als r-Konfiguration bezeichnet.
Ferner ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren bei der Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäurederivaten der Formel 2 eine gezielte Festlegung der Stereozentren in den Position C-2 und C-4. Dies gilt insbesondere für den Fall, dass R1 und R2 von H verschieden sind und R1 beispielsweise eine Methylgruppe darstellt. Sowohl die Enantiomerenreinheit als auch die Diastereomerenreinheit sind hierbei sehr hoch ( > 95%).
Erfindungsgemäss können mit dem Reduktionsverfahren auch Gemische hergestellt werden, die Verbindungen mit unterschiedlichen Hydroxygruppen Gehalten aufweisen. Beispiele hierfür sind Gemische, die aus Verbindungen der Formeln 3,4 und 5 bestehen, wobei R', R2 = H ; Y =-CH3 oder-CH2CI und R3 = C (CH3) 3.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird mit Lactobacillus-Arten durchgeführt.
In Betracht kommen grundsätzlich alle Lactobacillus-Arten. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung von Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann unter üblichen Fermentationsbedingungen und in den üblichen Reaktoren durchgeführt werden.
Als Cosubstrat kann ein leicht metabolisierbares Kohlenstoff-haltiges Substrat, z. B. Glukose verwendet werden. Dadurch werden die bei der Umsetzung verbrauchten Reduktionsäquivalente nachgeliefert.
Die Reaktionen werden erfindungsgemäss bei Temperaturen von 10 bis 50 C, bevorzugt von 15 bis 40 C durchgeführt.
Der pH-Wert liegt bei 2 bis 10, bevorzugt zwischen 4 und 8. Zur Sicherstellung eines geeigneten pH-Wertes kann jede in der Fermentationstechnik übliche Puffersubstanz eingesetzt werden. Dies sind z.
B. Triethanolamin, Phosphat-Puffer, Phosphat-Citrat-Puffer, 2-Amino-2 (hydroxymethyl)-1, 3-propandiol-Puffer, 2-[N-Morpholino] ethansulfonsäure- Puffer (MES) oder Tris-Puffer. Die Konzentrationsbereiche für die Puffer liegen vorteilhafterweise zwischen 50 und 500 mmol/l.
Als Reaktoren können ebenfalls alle bekannten Reaktortypen Verwendung finden. So können sowohl herkömmliche Rührreaktoren als auch Festbettreaktoren eingesetzt werden.
Bei Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens entfallen vor allem kostenintensive und umweltbelastende Racemat-, oder Diastereomerentrennungen. Die in einer diastereoselektiven Synthese erforderliche Anbindung und Abspaltung einer stöchiometrischen Menge einer homochiralen Hilfsgruppe wird vermieden.
Weiterhin ist das Kohlenstoffgerüst der Dihydroxycarbonsäureester in den Ausgangsverbindungen bereits komplett, das heisst, die Stereozentren werden erst zu einem späteren Zeitpunkt in die Gesamtsynthesesequenz eingeführt. Dadurch wird der Verlust an homochiralem Material niedrig gehalten. Gleichzeitig werden mit dem erfindungsgemässen Verfahren sehr hohe Stereoselektivitäten erzielt. Durch die Verwendung ganzer Zellen entfällt ausserdem die Notwendigkeit, zusätzlich kostenintensive Coenzyme und Coenzym-Regenerierungssysteme in die Reaktionen einzusetzen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen gemäss den Formeln 1 bis 5 können insbesondere zur Herstellung von chiralen Naturstoffen, Pharmaund Agrowirkstoffen, Katalysatoren und Hemmstoffen eingesetzt werden.
Beispiele hierfür sind HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren des Mevinsäure-Typs und Lipase-Hemmer des Lipstatin-Typs.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben : HerstellungvonLactobacillus-Zellen(LactobacillusKefir)Beispiel1: Zellen für die Reduktion können erhalten werden, indem eine Stammkultur von Lactobacillus kefir (z. B.
DSM 20587) in foigendem Medium vermehrt wird : Pro 1 L : 10 g Caseinpepton, tryptisch verdaut ; 10 g Fleischextrakt ; 5 g Hefeextrakt, 20 g Glucose ; 1 g Tween 80 ; 2 g K2HP04 ; 5 g Na-acetat ; 2 g Diammoniumcitrat ; 0,2 9 MgS04 x 7 H20 ; 0,05 g MnS04 x H20 ; pH = 6,2-6,5. Nach 24 Std. Wachstum werden die Zellen durch Zentrifugation geemtet. Sie können durch Einfrieren gelagert werden.
Beispiel 2 : Ganzzelltransformation von 6-Chlor-3, 5-dioxohexansäure-tert- butvlester (1) mit Lactobacillus kefir Synthese der sekundären Alkohole (S)-11, (R)-ill und (3R, 5S)-IV (Formelschema l) Die im folgenden beschriebene Ganzzelltransformationen wird bei Raumtemperatur mit Zellen von Lactobacillus kefir durchgeführt, die wie unter Beispiel 1 beschrieben erhalten werden. Diketoverbindung I wird dargestellt wie beschrieben in M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller, Ger. Pat.
Appl. 19847302.2,1998.
EMI8.1
EMI8.2
Abbildung 1 Durchführunq der mikrobiellen Reduktion In einem 50 ml Becherglas werden 0.61 g Feuchtzellmasse in 0.5 ml Phosphat-Citrat-Puffer (250 mM, pH 5.5) unter Rühren suspendiert. Von dieser Zellsuspendion werden 0.9 ml mit 1 mi Glucose-Lösung (5 M, autoklaviert), 8 ml Phosphat-Citrat-Puffer (250 mM, pH 5.5) und 50 ul 6 Chlor-3, 5-dioxo-hexansäure-tertg-Butylester (1) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit einem Magnetrührer gerührt.
Reaktionskontrolle Nach 1 h, 2 h, 6.5 h und 10.5 h werden Proben gezogen. Dazu gibt man 40 pI der Reaktionslösung zu 200 pi Essigsäureethylester, schüttelt aus und analysiert die organische Phase gaschromatographisch, wobei ein Quadrupol-Massenspektrometer mit Elektronenstossionisation (70 eV) als Detektor zum Einsatz kommt (GC-MS-Kopplung).
GC-Kapillarsaule : HP-5MS (5% Phenyl-Methyl-Siloxan ; 30.0 m x 250 um x 0.25 pm nominal) Temperaturprogramm : 1 min 60 C, dann auf 280 C (15 C/min) Gasfluss : 1.0 ml/min Helium Injektion : split 50 : 1 Retentionszeiten :
I : 8.21 min (S)-il : 8.10 und 8.84 min (s. u.) (R)-III : 9.06 min (3R, 5S)-IV : 9.26 min Die Diketoverbindung I wird als Furanon nachgewiesen, ebenso der Hydroxyketoester (R)-lil (HCI-Abspaltung im Injektor, siehe auch Formelschema IV). Der Hydroxyketoester (S)-li erzeugt durch partielle thermische Lactonbildung im GC-Injektor zwei Signale.
Anhand der Chromatogramme kann der Verlauf der mikrobiellen Reduktion verfolgt werden : In den ersten beiden Proben lassen sich wachsende Anteile der Hydroxyketone (S)-Il und (R)-lil erkennen, während in den zu späteren Zeitpunkten entnommenen Proben das Signal für die Dihydroxyverbindung (3R, 5S)-IV an Intensität gewinnt.
Da gleichzeitig die Signale für die Hydroxyketone (S)-II und (R)-lil wieder an Intensität verlieren, kann davon ausgegangen werden, dass die Dihydroxyverbindung (3R, 55)- ! V durch mikrobielle Reduktion der intermediär auftretenden Hydroxyketone (S)-li und wird.(R)-IIIgebildet Aufarbeitung : Nach 12.5 h wird die Reaktion durch Abzentrifugieren der Zellen abgebrochen. Die Zellpellets und der Zentrifugationsüberstand werden getrennt voneinander je zweimal mit Essigsäureethylester extrahiert.
Nach Trocknen der vereinigten organischen Phasen mit Natriumsulfat und Einengen am Rotationsverdampfer werden 44 mg Rohprodukt erhalten.
Produktanalvtik a) Bestimmung der Anteile der Reaktionsprodukte im Rohprodukt Für eine zerfallsfreie gaschromatographische Analyse (GC-MS, Methode s. o.) werden in einem 1.5 ml GC-Glasvial 1.5 mg des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion in 0.5 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 10 pi Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA) und 10 pi Pyridin versetzt. Anschliessend wird das Glasvial mit einem Septum verschlossen und 30 min bei 40 C aufbewahrt (Wasserbad).
Die nachfolgende GC-MS-Analyse ergibt vier Hauptsignale, die anhand der zugehörigen Massenspektren den Derivatisierungsprodukten (3R, 5S)-V, (S)- VI, (S)-VII, und VIII zugeordnet werden können (Formelschema II).
EMI11.1
<tb>
<SEP> OTFA <SEP> OTFA <SEP> O <SEP> OTFA <SEP> OTFA <SEP> O
<tb> <SEP> c'JULA <SEP> c. <SEP> JLA
<tb> <SEP> Cl <SEP> OC <SEP> (CH3) <SEP> 3 <SEP> ci <SEP> OC <SEP> (CH3) <SEP> 3
<tb> <SEP> (3R, <SEP> 5S)-V <SEP> (S)-VI
<tb> <SEP> OTFA <SEP> OTFA
<tb> <SEP> Ci
<tb> <SEP> TFA <SEP> = <SEP> Trifluoracetyl <SEP> =-COCF3
<tb> <SEP> O <SEP> OC <SEP> (CH3) <SEP> 3
<tb> TFAO <SEP> 0
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> TFAO <SEP> OC <SEP> (CH3) <SEP> 3 <SEP> w <SEP> OC <SEP> (CH3) <SEP> 3
<tb>
Abbildung 2 Derivat (3R, 5S)-V wird aus dem mikrobiellen Reduktionsprodukt (3R, 5S)-IV gebildet, während das Hydroxyketon (S)-ll zu den zwei stereoisomeren Bisacylierungsprodukten (S)-VI und (S)-VII reagiert.
Das cyclische Derivat VIII bildet sich aus dem Furanon IX, dessen Formierung aus der Diketoverbindung I während der mikrobiellen Reaktion bekannt ist (Nebenprodukt durch intramolekulare Alkylierung, siehe M. Wolberg, W.
Hummel, M. Müller, Ger. Pat. Appl. 19857302.2,1998). Ein Derivat des Hydroxyketoesters (F1)-lil kann im Rohprodukt nicht gefunden werden. Diese intermediär auftretende Verbindung wird bei der hier gewählten Reaktionsführung (Abbruch der Reaktion nach 12.5 h) komplett zur Dihydroxyverbindung (3R, 5S)-IV umgesetzt.
Die Integration der vier Hauptsingnale im Gaschromatogramm ergibt folgende relative Intensitäten ( (S)-VI und (S)-VII zusammengefasst, Retentionszeiten in Kiammem) : (3R, 5S)-V : 34% (8.14 min) (5)-Vl/ (S)-VII: 61% (8. 30/7.84 min)
Vlil : 5% (6.85 min) Bei der hier beschriebenen Reaktionsführung der mikrobiellen Reduktion erhält man somit ein Rohprodukt, das hauptsächlich aus dem Hydroxyketon (S)-II besteht. Dieses Ergebnis wird durch NMR-Spektroskopie bestätigt (s. u.).
Es ist zweifellos möglich durch Variationen der Reaktionsführung die Zusammensetzung des Rohproduktes zu beeinflussen.
Die soeben beschriebene Derivatisierung und GC-MS-Analyse wurde mit dem racemischen Hydroxyketoester rac-ll und dem Diastereomerengemisch der Dihydroxyverbindungen syn-lanti-IV, welche durch eine unabhängige Synthese erhalten wurden (Formelschema lit), überprüft.
EMI13.1
EMI13.2
Syn-IVSyn-IV= (3S,5R)-IVund (3S,5S)-IVund(3R,5R)-IVanti-IV= (es ist nur jeweils eines der Enantiomere gezeigt)
Et =-CH2CH3 tBu =-C (CH3) 3 syn : anti= 1.4 : 1.0
Abbildung 3 Die Retentionszeiten und Massenspektren dieser racemischen Proben stimmen mit den Retentionszeiten und Massenspektren der Produkte der mikrobiellen Reduktion überein. Gleiches gilt für die jeweiligen TFA-Derivate (Formelschem II).
Das Furanon IX wurde ebenfalls in einer unabhängigen Synthese dargestellt (Formelschema IV).
EMI14.1
i : 250 mM Phosphat-Puffer pH 7.5/Ethanol (2 : 1 v/v) ; 20 h bei Raumtemperatur
Abbildung 4 Auch hier stimmen die Retentionszeiten und Massenspektren mit den analogen Signalen in den Spektren des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion überein. b) Bestimmung des Diastereomerenverhättnisses Die Diastereomere syn-IV und anti-IV werden mit der verwendeten gaschromatographischen Methode nicht getrennt. Eine Grundlinientrennung kann allerdings nach Derivatisierung mit TFAA/Pyridin erreicht werden (Formelschema V).
EMI14.2
Diastereomerengemisch, trennbar mit GC (es ist nur jeweils eines der Enantiomere gezeigt)
Abbildung 5 Das polarere Isomer anti-V weist gegenüber dem syn-Isomer eine längere Retentionszeit auf. Beide Signale zeigen identische Massenspektren.
Angewendet auf das Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion ergibt diese Methode für die Diastereomere syn-V und anti-V ein Verhältnis von 135 : 1.
Die mikrobielle Reduktion liefert somit das syn-Isomer in sehr hohem Überschuss. Dieses Ergebnis wird durch NMR-Spektroskopie bestätigt (s. u.).
Für die TFA-Derivate der Produkte der nahezu unselektiven NaBH4 Reduktion (Formelschem III) ergibt die Integration der GC-Signale ein Verhältnis von 1.4 : 1.0. c) NMR-Spektroskopie Die NMR-Spektren des Rohprodukts der mikrobiellen Reduktion bestätigen die Ergebnisse der GC-MS-Analysen. Das'H-NMR-Spektrum zeigt eine Überlagerung der einzelnen Spektren der Verbindungen (S)-II, (3R, 5S)-IVund IX, wobei die Signale des Hydroxyketons (S)-ii eindeutig dominieren, während die Signale des Furanons IX nur schwach zu sehen sind.
Hydroxyketoester (S)-II: 'H-NMR (300 MHz, CDCl3, 22 C, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) 5 : 4.31 (m, 1H, CHOH), 3.6 (m, Feinstruktur nicht erkennbar durch Überlagerung mit Multiplett von Verbindung (3R, 5S)-IV ; 2 x H6), 3.41 (s, 2H, H2), 2.90 (dd, J = 17.5,5.0 Hz, 1H, H4), 2.83 (dd, J = 17.5,7.3 Hz, 1 H, H4), 1.46 (s, 3 x CH3, Überlagerung mit analogem Signal der Verbindungen (3R, 5S)-IV und IX). Keto : Enol = ca. 95 : 5. 13C-NMR (75.5 MHz, CDCI3, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) 5 : 28.13 (OC(CH3)3), 46.57,48.43, (C4, C6), 51.31 (C2), 67.58 (C5), 82.73 (OC (CH3) 3), 166.22 (COOtBu), 202.93 (C3).
Dihydroxyverbindung (3R, 5S)-IV : 'H-NMR (300 MHz, CDCI3,22 C) 8 : 4.22 (m, 1H, H5), 4.05 (m, 1H, H3), 3.6 (m, Feinstruktur nicht erkennbar durch Überlagerung mit Multiplet von Verbindung (S)-II ; 2 x H6), 2.43 (d, J = 6.3 Hz, 2H, H2), 1.70 (m, 2H, H4), 1.46 (s, 3 x CH3, Überlagerung mit analogem Signal der Verbindungen (S)-11 und IX). 13C-NMR (75.5 MHz, CDCI3) 8 : 28.27 (OC(CH3)3), 39.45,42.47 (C2, C4), 49.17 (C6), 68.35 (C3), 71.57 (C5), 81.90 (OC (CH3) 3), 172.21 CoosU)- Furanon IX : 'H-NMR (300 MHz, CDCI3, 22 C)# : 5.69 (s, 1 H, H3), 4.54 (s, 2H, H5), 3.48 (s.
2H, H6), 1.47 (s, 3 x CH3, Überlagerung mit analogem Signal der Verbindungen (S)-Il und (3R, 5S)-IV).
Die angegebenen Verschiebungen beziehen sich auf CHC13 in CDC13 ('H NMR : 5 = 7.27 ; 13C-NMR : 8= 77.23) und stimmen mit den Daten der auf unabhängigem Wege synthetisierten Vergleichsverbindungen rac-ll, syn/anti IV und IX (Formelschema III) überein.
Die Signale der Dihydroxyverbindung anti-IV, die sich von denen der stereoisomeren Verbindung syn-IV unterscheiden, können im'3C-NMR- Spektrum des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion nicht beobachtet werden. Dies ist ein weiterer Beweis für den sehr hohen Anteil des syn Isomers (s. o.).
Dihydroxyverbindung anti-IV (aus unabhängiger Synthese, siehe Formelschem III): 13C-NMR (75.5 MHz, CDCI3) 8 : 28.27 (OC(CH3)3), 39.33,42.22 (C2, C4), 49.60 (C6), 65.46 (C3), 68.94 (C5), 81.87 (OC (CH3) 3), 172.54 (COOtBu).
Die Zuordnung der Signalsätze im 13C-NMR-Spektrum des lsomerengemisches syn-/anti-IV zu den Diastereomeren erfolgt anhand der charakteristischen chemischen Verschiebung der Kohlenstoffatome C-3 und C-5 (Formelschema VI).
EMI17.1
13C-Kernresonanzen in ppm (es ist nur jeweils eines der Enantiomere gezeigt)
Abbildung 6 Bei der vorliegenden Verbindungsklasse (1,3-Diole) weisen die Signale der hydroxyltragenden Kohlenstoffatome des syn-lsomers relativ zu den analogen Signalen des anti-Isomers für gewöhnlich eine Tieffeldverschiebung auf. Vergleiche hierzu : a) F. G. Kathawala et al., Helv. Chim. Acta 1986,69,803-805 b) K.-M. Chen et al., Tetrahedron Lett. 1987,28,155-158 c) C. Bonini et al., Gazz.
Chem. Ital. 1991,121,75-80 Das 13C-NMR-Spektrum des Rohproduktes belegt demnach, dass in der hier beschriebenen mikrobiellen Reduktion das syn-isomer gebildet wird. du Bestimmung der absoluten Konfiguration und der Enantiomerenreinheit Da die Konfiguration des Stereozentrums C-3 relativ zum Stereozentrum C-5 bereits durch die 13C-NMR-Spektroskopie aufgeklärt ist, beschränkt sich die weitere Analytik auf die Ermittlung der Konfiguration des Stereozentrums C5. Hierfür wird das Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion in das cyclische Derivat (S)-X überführt (Formelschema Vil).
EMI18.1
<tb>
<SEP> OH <SEP> O <SEP> O
<tb> <SEP> CI <SEP> I
<tb> <SEP> CrCr"33
<tb> <SEP> (5')-II <SEP> OH <SEP> OH <SEP> O
<tb> <SEP> OH <SEP> OH <SEP> 0
<tb> <SEP> +--- <SEP> CI
<tb> <SEP> EtOH, <SEP> 0 <SEP> C <SEP> OC <SEP> (CH3) <SEP> 3
<tb> <SEP> OH <SEP> OH <SEP> O
<tb> <SEP> Diastereomerengemisch
<tb> <SEP> CI <SEP> syn-lanti-II
<tb> <SEP> rCr"g3
<tb> <SEP> (3R, <SEP> 5S)-IV <SEP> kat.
<SEP> TsOH
<tb> <SEP> Toluol,
<tb> Rohprodukt <SEP> der <SEP> mikrobiellen <SEP> Reduktion <SEP> iToluol,, <SEP> L
<tb> (Nebenprodukt <SEP> IX <SEP> nicht <SEP> mit <SEP> abgebildet) <SEP> O
<tb> <SEP> 0\
<tb> <SEP> TsOH <SEP> = <SEP> p-Toluolsulfonsäure
<tb> <SEP> CI
<tb> <SEP> (S)-X
<tb>
Abbildung 7 Das racemische Derivat rac-X (Formeischema Vlil), welches mit der gleichen Methode aus dem Hydroxyketoester rac-ll erhalten wird, tässt sich durch HPLC mit chialer stationärer Phase trennen.
HPLC-Bedingungen : Chiracel OB (DAISO) ; 25 C ; 1 ml/min i-Hexan/i-Propanol (80 : 20) ; Detektion bei 210 nm.
Retentionszeiten : (S)-X : 24.7 min (R)-X : 21.5 min Die Zuordnung der absoluten Konfiguration der getrennten Enantiomere erfolgt durch Vergleich mit der Retentionszeit einer authentischen Probe des Lactons (S)-X, das analog zum racemischen Derivat rac-X aus dem Hydroxyketon (S)-Il ( > 99% ee) hergestellt wird (Formelschema VIII). Das enantiomerenreine Hydroxyketon (S)-lI wird nach einer bekannten Vorschrift erhalten (M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller, Ger. Pat. Appl. 19857302.2, 1998).
EMI19.1
Abbildung 8 Durch Intergration der Signale des Derivats (S)-X, welches aus dem Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion <RTI ID=19.9
Patentansprüche 1. Verfahren zur Reduktion von Diketocarbonsäuren oder Hydroxyketocarbonsäuren oder deren Estern, bei dem in Gegenwart von Lactobacillus-Arten wenigstens eine Ketogruppe zu einer Hydroxygruppe umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass zu Diolen reduziert wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass zu einem Gemisch aus Diolen und Monoalkoholen reduziert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen der Formel 1
EMI20.1
umgesetzt werden, wobei A, B = C=O, CHOU, mit ± = H oder Schutzgruppe für die Hydroxyfunktion, wobei A und B gleich oder verschieden sein können.
R', R2 = H oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z. B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert oder vollständig durch Heteroatome ersetzt sein können.
R3 = H, Metallkationen oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z. B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können.
Y = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z. B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können. Ausgeschlossen wird X-CH2-O-CH2-, wobei X = Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, Aralkyl oder Cycloalkylalkyl sein kann. n = 0-10.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen der Formel 2
EMI21.1
eingesetzt werden, wobei R', R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1 haben.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen der Formel 3
EMI22.1
oder deren Entantiomere eingesetzt werden, wobei R', R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1 haben. E = H oder Schutzgruppen für die Hydroxyfunktionen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen der Formel 4
EMI22.2
oder deren Enantiomere eingesetzt werden, wobei R', R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1 haben. # = H oder Schutzgruppen für die Hydroxyfunktionen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis oder eine Mischkultur dieser Mikroorganismen eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass es bei einem pH-Wert von 2 bis 10 durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass es bei einem pH-Wert von 4 bis 8 durchgeführt wird.
11. Verbindungen enthaltend wenigstens eine Hydroxygruppe hergestellt nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 11 zur Herstellung von chiralen Naturstoffen, Pharma-und Agrowirkstoffen, Katalysatoren oder Hemmstoffen.