CN105713884A - 生物催化氢化组合物及其合成罗素伐他汀手性中间体方法 - Google Patents
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Abstract
一种选择性生物催化氢化组合物，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶。本发明还提供了一种(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。本发明还提供了一种罗素伐他汀中间体的制备方法，其主要是通过选择性生物催化氢化组合物得到产品。本发明相对于目前的技术具有反应条件温和、安全环保、成本低、产物立体选择性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种选择性生物催化氢化组合物及其合成(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法。具体来说，本发明属于医药中间体制备技术领域，具体来说，本发明涉及生物催化合成降血脂药物罗素伐他汀手性中间体(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯。
背景技术
以胆固醇和甘油三酯水平过高或伴有血清高密度脂蛋白胆固醇水平过低为特征的高脂血症是引起动脉粥样硬化进而导致冠心病、高血压和脑血管疾病的主要原因。羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂类降脂药是目前降低胆固醇的首选药物。他汀类药物就是通过抑制HMG-CoA还原酶的通路效率来限制体内胆固醇的代谢途径，降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平，从而起到降血脂的作用。目前已上市或正处于开发中的他汀类药物有洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗素伐他汀、匹伐他汀等多种。其中，罗素伐他汀是2003年上市，降低胆固醇的能力优于同类他汀类药物的新型降脂药，该药物自上市以来年销售额已远超过60亿美元，该药疗效好、安全性高、市场前景乐观。
罗素伐他汀上市后，各种合成该药物及其中间体的制备方法不断公开。美国专利US5399722提供了一种制备(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法：以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，经苄氧化后用RuCl2[(R)-BINAP]催化氢化，然后经克莱森酯缩合增长碳链，再用三乙硼不对称还原3号碳上的羰基，丙酮叉保护3,5位的羟基，再用钯碳将苄基脱去，得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该法使用了三乙基硼试剂，需在零下60℃进行，反应条件苛刻，生产成本昂贵。另外，超低反应温度影响了不对称还原的立体选择性，造成底物转化率和产物ee值都较低。
美国专利US5286883提供了一种有效的制备方法：以4-氯乙酰乙酸已酯为起始原料，经苄氧化，用Ru2X4[(R)-R3-BINAP]2N(CH2CH3)3催化氢化，并将新生成的羟基用四氢吡喃保护基进行保护，然后继续使用Ru2X4[(R)-R3-BINAP]2N(CH2CH3)3做催化剂制备第二个手性碳。在脱去保护基四氢吡喃的同时，用丙酮叉将3,5位的羟基保护起来，再将苄基脱去得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该专利发现只有将5号碳上的羟基保护起来之后，第二次不对称催化氢化的选择性才高，并且该法的产率只有59-70％，产物ee值也只有80％-98％。
中国专利200610027347.0提供了一种制备(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法：从4-氯乙酰乙酸乙酯出发，经苄氧化，再用RuCl2[(R)-BINAP]催化氢化，制得(3S)-3-羟基-4-苄基丁酸乙酯。用甲氧基苄基保护羟基，克莱森酯缩合反应增长碳链，继续用RuCl2[(R)-BINAP]催化氢化3号碳上的羰基制得(3R,5S)-5-对甲氧基苄氧基-6-苄氧基-3-羟基己酸叔丁酯。用硝酸铈铵将对甲氧基苄基脱去，再用丙酮叉保护，脱去苄基，得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该发明涉及了八步反应，总收率只有39.5％，产物ee值99％，成本较高，反应过程复杂，不易于大规模工业化生产。
文献(3R,5S)-3,5-O-亚异丙基-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的合成也报道了一种有效的合成方法：以L-苹果酸为原料，经2,2-二甲氧基丙烷保护得(S)-2,2-二甲基-5-氧代-1,3-二氧杂-4-乙酸，后者与羰酰二咪唑反应得到活性酰胺(S)-2,2-二甲基-5-氧代-1,3-二氧杂-4-乙酰基咪唑。活性酰胺再与丙二酸环亚异丙酯发生缩合反应得到化合物(S)-2-(4’-氧代-3’,4’-O-亚异丙基-3’,4’-二羟基-1’-羟基-烯)-丙二酸环亚异丙酯,后者在叔丁醇的作用下醇解得到β-酮基酯，然后在甲醇钠的作用下开环得到己二酸二酯化合物。后者与硼烷和硼氢化钠立体选择性还原得到化合物(2S,4R)-1-甲基-6-叔丁基-2,4-二羟基己二酸二酯，然后再经丙酮叉保护、硼氢化钠还原得到(3R,5S)-3,5-O-亚异丙基-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该报道共涉及八步反应，操作繁琐，收率较低，不利于大规模生产。
上述各个文献报道的方法一般都需要6-8步化学反应，操作过程繁琐，总体收率低，不适合大规模生产。而且都是化学合成法，安全性低，污染严重，反应条件苛刻，收率低，产物立体选择性差。因此，亟需开发一种操作简便、收率较高、适合大规模生产的技术方案。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种选择性生物催化氢化组合物。
本发明解决的另一个技术问题是提供一种制备(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法。
本发明还解决的一个技术问题是提供了一种制备罗素伐他汀手性中间体的方法
具体来说，本发明通过如下技术方案实现的：
一种选择性生物催化氢化组合物，其特征在于，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶。
其中，底物：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)；所述辅酶为NAD+，NADP+中的一种。
其中，所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。
其中，所述发酵罐培养通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。
其中，所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的二级培养后进行处理的过程均是：将二级培养液离心，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：(5～10)的浓度超声/高压破碎；破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液或葡萄糖脱氢酶粗酶液；将得到的酮基还原酶粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶。
其中，在所述二级培养的过程中，超声破碎时间为15-20分钟；所述的絮凝过程加入絮凝剂的量为2.5‰-3.5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入2.5g-3.5g的絮凝剂；所述防腐剂为N-羟甲基甘氨酸钠，其添加量为3‰-5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入3g-5g的防腐剂；所述保护剂为丙三醇，其添加量为20％-40％，该比例是体积比，即100mL粗酶液加入20-40mL丙三醇。
其中，所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的培养基成分为：蛋白胨10g/L-12g/L，酵母抽提物20g/L-24g/L,甘油3g/L-5g/L，磷酸二氢钾1.8g/L-2.2g/L，磷酸氢二钾14.5g/L-16.5g/L，硫酸镁0.5g/L-1g/L。
其中，所述底物为(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯，得到的产物为(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸酸叔丁酯。
本发明还提供了一种(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。
其中，所述(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)。
其中，所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。
其中，所述发酵罐培养通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。
本发明还提供一种罗素伐他汀中间体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在四氢呋喃溶液中，按物质的量之比(S)-3-羟基丁内酯：乙酸叔丁酯＝1：2投料，在氩气保护、低温条件下，经二异丙基氨基锂催化发生克莱森缩合反应，生成(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯；
(2)将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯；
(3)将步骤(2)得到的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯与2，2-甲氧基丙烷在甲磺酸的催化下进行反应得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。
其中，步骤(2)中(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)。
其中，所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。
其中，所述酮基还原酶酶活检测方法如下：称取1.0g(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯和(1.0g-1.2g)葡萄糖固体于100mL磷酸钠缓冲液中，在pH＝6.5-7.5，温度为30℃水浴上搅拌，然后向反应体系中加入2800U-3200U葡萄糖脱氢酶、(0.8mL-1.2mL)酮基还原酶和(0.48mg-0.72mg)辅酶NADP+，磁力搅拌后取样通过气相色谱进行检测；通过公式计算酶活：酶活力＝(1.0×106÷220.13)×产物含量÷60。
本发明的有益技术效果如下：
本发明技术方案只需三步、操作简便、收率较高、适合大规模生产罗素伐他汀中间体。本发明采用了生物催化法，反应条件温和，安全无公害，立体选择性强，收率高。
本发明的技术方案的反应条件温和、安全环保、立体选择性高的生物催化法替代原有的反应条件苛刻、污染严重、立体选择性低的化学合成方法。
本发明提供了一种三步法合成罗素伐他汀中间体丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的思路和方法，相对与目前最少6步的技术报道(现有技术)来说，具有明显的优势。
本发明首次采用生物酶作催化剂来合成罗素伐他汀中间体(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法，属于绿色合成范畴。而目前的化学合成法，采用金属螯合物还原剂、进行反复的分子内基团的保护和去保护，操作步骤繁琐、反应条件苛刻、环境污染严重、成本高、不安全、产物立体选择性差。所以本发明相对于目前的技术具有反应条件温和、安全环保、成本低、产物立体选择性高等优点。
目前检测酮基还原酶的酶活大小的方法主要是通过紫外-可见分光光度计，根据NADPH或NADH在340nm处吸收强度的减弱来判断酶活的大小，该法适合经高度纯化后的还原酶的酶活检测，但对于不需要进行高度纯化的制药工业用酶来说，该检测方法无法反应酶活的真实结果。本发明以应用实验为基础，建立了一套有效的检测方法，该法不但可以检测纯化后的还原酶的酶活大小，还可以衡量其他工艺粗糙的工业用酶的酶活大小。
本发明以(S)-3-羟基丁内酯为原料，经与己酸叔丁酯发生克莱森酯缩合反应增长碳链，生成(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯，后者在葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅因子的相互作用下发生还原反应生成(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯，后者与2,2-二甲氧基丙烷在甲黄酸的催化作用下反应，得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该法只需要三步反应便能得到目标产物，大大简化了操作过程，具有广阔的应用前景。
本发明提供了一种三步法合成罗素伐他汀中间体丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的思路和方法，相对与目前最少6步的技术报道来说，具有明显的优势。
本发明首次使用生物酶作催化剂来合成罗素伐他汀中间体(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的方法，属于绿色合成范畴。而目前的化学合成法，采用金属螯合物还原剂、进行反复的分子内基团的保护和去保护，操作步骤繁琐、反应条件苛刻、环境污染严重、成本高、不安全、产物立体选择性差。所以本发明相对于目前的技术具有反应条件温和、安全环保、成本低、产物立体选择性高等优点。
目前检测酮基还原酶的酶活大小的方法主要是通过紫外-可见分光光度计，根据NADPH或NADH在340nm处吸收强度的减弱来判断酶活的大小，该法适合经高度纯化后的还原酶的酶活检测，但对于不需要进行高度纯化的制药工业用酶来说，该检测方法无法反应酶活的真实结果。本发明以应用实验为基础，建立了一套有效的检测方法，该法不但可以检测纯化后的还原酶的酶活大小，还可以衡量其他工艺粗糙的工业用酶的酶活大小。
酮基还原酶属于重组大肠杆菌表达的一种胞内酶，通过分子生物学技术，便可以获得不同酶活大小的相同类型的酮基还原酶，所以采用相同或相似的技术方案，改变不同酶和底物的用量比例，采用类似本发明中的技术方案，均属于本发明保护的范围。
通过化学催化也可以合成罗素伐他汀中间体，但是不与本发明的方法形成冲突，因为本发明的技术方案要比化学合成法优越，而本发明的目的也是期望友好的生物催化法能够替代落后的化学合成法。
具体实施方式
本发明提供了一种选择性生物催化氢化组合物，其特征在于，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶；本发明使用的葡萄糖脱氢酶和酮基还原酶均为安琪酵母股份有限公司提供的酶产品；本发明技术方案使用的辅酶可以是NAD+或NADP+，优选使用的是NADP+,该辅因子的正确选择也是本发明技术方案能够成功实现的原因之一。
本发明催化氢化底物：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)；所述辅酶为NAD+，NADP+中的一种；该比例的选择通过以下因素影响催化氢化反应的进行：①反应是否能够完全进行；②反应时间的长短；③实验的收率；④实现工业化生产的生产成本。使用该比例的催化剂一般催化时间为10小时左右，底物转化率大于99％，如果葡萄糖脱氢酶和酮基还原酶分别少于0.5kg和1kg，或者辅酶少于0.00018kg，会因为酶添加量不够，导致底物转化率会小于99％，即有部分底物转化不完全，这是生产不允许的；如果辅酶添加量介于0.00018-0.00030之间，其他酶添加量不减少，底物转化能够完全，但是反应时间会超过10小时，并且该反应时间超过15小时，产物收率会减少2-3％质量收率，这对生产是不利的；若辅酶添加量大于0.00030，其他酶添加量不减少，反应时间会小于10小时，但是辅酶价格昂贵，会造成应用成本增加，这样会增加应用成本，因此添加量不宜过高。所以综合权衡，该比例添加量在不影响底物转化率和反应时间的前提下，是最佳添加比例。
本发明所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。
该生物催化技术的最适反应温度为30℃，该温度的选择直接影响这反应时间的长短，进而影响实验的收率；该生物催化技术的最适pH为pH＝7.0，该pH的正确选择直接影响反应时间的长短，进而影响实验的收率。因此为了保证催化氢化反应的时间和实验的收率需要将培养温度控制在25℃-35℃，发酵液pH控制在6.5-7.5，优选的培养温度控制在30℃，发酵液pH控制在7.0。
本发明发酵罐培养通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵；
本发明提供了一种有效评估酶活的检测方法。该法通过适当过量加入葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+的量，由最慢反应步骤酮基还原酶的催化步骤来衡量酮基还原酶的酶活大小，检测结果与催化效果一致；其中所述酮基还原酶酶活检测方法如下：准确称取1.0g(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯和1.0g葡萄糖固体于100mL磷酸钠缓冲液中，在pH＝6.5-7.5，温度为25-35℃水浴上搅拌，然后向反应体系中加入(2800U-3200U)葡萄糖脱氢酶、(0.8mL-1.2mL)酮基还原酶和(0.48mg-0.72mg)辅酶NADP+，磁力搅拌后取样通过气相色谱进行检测；通过公式计算酶活：酶活力＝(1.0×106÷220.13)×产物含量÷60。
本发明所述的酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的具体培养过程对组合物的催化氢化性质，以及对催化反应进行程度和产物收率都有很重要的影响，其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的培养基成分为：蛋白胨10g/L-12g/L，酵母抽提物20g/L-24g/L,甘油3g/L-5g/L，磷酸二氢钾1.8g/L-2.2g/L，磷酸氢二钾14.5g/L-16.5g/L，硫酸镁0.5g/L-1g/L；所述底物为(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯，得到的产物为(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸酸叔丁酯；所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的二级培养后进行处理的过程均是：将二级培养液离心，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：(5～10)的浓度超声/高压破碎；破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液或葡萄糖脱氢酶粗酶液；将得到的酮基还原酶粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中在所述二级培养的过程中，超声破碎时间为15-20分钟；所述的絮凝过程加入絮凝剂的量为2.5‰-3.5‰；所述防腐剂为K99(N-羟甲基甘氨酸钠)，所述防腐剂的添加量为3‰-5‰；所述保护剂为丙三醇，所述保护剂的添加量为20％-40％；
本发明还提供了一种(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯；其中所述(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)；其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0；其中所述发酵罐培养通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。
本发明还提供了一种罗素伐他汀中间体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在四氢呋喃溶液中，按物质的量之比(S)-3-羟基丁内酯：乙酸叔丁酯＝1：2投料，在氩气保护、低温条件下，经二异丙基氨基锂催化发生克莱森缩合反应，生成(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯；
(2)将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯；
(3)将步骤(2)得到的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯与2，2-甲氧基丙烷在甲磺酸的催化下进行反应得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。在该制备方法中步骤(2)中(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)。
在一种优选的具体实施方式中，本发明罗素伐他汀中间体的制备是通过如下技术方案实现的。
合成路线如下：
第一步：
其中，LDA：二异丙基氨基锂；THF：四氢呋喃。
第二步：
第三步：
其中，MsOH：甲磺酸。
其中，第一步是在四氢呋喃溶液中，按物质的量之比(S)-3-羟基丁内酯：乙酸叔丁酯＝1：2投料，在氩气保护、低温条件下，经二异丙基氨基锂催化发生克莱森缩合反应，生成(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯。该步骤的完成主要参考美国专利US6340767B1。
在第二步涉及使用三种酶的组合物合成中间体(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯，关于各种酶液的制备、酶活的检测、反应原理如下：
其中，技术原理为：在磷酸钠缓冲液中，葡萄糖经葡萄糖脱氢酶催化氧化生成葡萄糖酸，同时为辅酶NADP+提供还原氢形成还原性辅酶NADPH。底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯经酮基还原酶催化还原和辅酶NADPH提供还原氢，生产手性中间体(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯和辅酶NADP+，其中，后者NADP+继续参与生产辅因子NADPH的循环。
其中，酮基还原酶摇瓶发酵工艺如下：
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含20-30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成18-20小时的一级培养过程。然后，将一级培养种子接种到1L含5-10mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养20-24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：5～10的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶酶液。
所述酮基还原酶摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨10-12g/L，酵母抽提物20-24g/L,甘油3-5g/L，磷酸二氢钾1.8-2.2g/L，磷酸氢二钾14.5-16.5g/L，硫酸镁0.5--1g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝6.0-8.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入2-5‰的EDTA和3-5‰的Tris碱，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为15-20分钟，上述絮凝剂用量为2.5-3.5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入2.5g-3.5g的絮凝剂；上述防腐剂为K99(N-羟甲基甘氨酸钠)，加入量为3-5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入3g-5g的防腐剂；上述保护剂为丙三醇,加入量为20-40％，该比例是体积比，即100mL粗酶液加入20-40mL丙三醇。
所述酮基还原酶的罐子发酵工艺具体如下：
酮基还原酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为30℃，发酵液pH为7.0，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.6-0.8，且不再增长时，结束发酵。
酮基还原酶酶活检测方法如下：
酶活定义：在反应温度为30℃、pH＝7.0条件和下述实验方案下，1分钟内催化生成1微摩尔产物所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
实验方案：准确称取1.0g(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯和1.0g葡萄糖固体于100mL磷酸钠缓冲液(200mmol，pH＝7.0)中，30℃水浴磁力搅拌15min，然后向反应体系中加入(2800U-3200U)葡萄糖脱氢酶、
(0.8mL-1.2mL)酮基还原酶和(0.48mg-0.72mg)辅酶NADP+,磁力搅拌60min后取样检测。
取样方法：取500uL反应液于1.5mL离心管中，加入500uL乙酸乙酯，上下震摇使两者混合均匀，然后在8000r/min条件离心4min。
气相色谱条件：气相检测条件：色谱柱型号，SPB-5；进样量，2uL；进样器温度，250℃；柱温，200℃；FID检测器温度，280℃。
酶活计算公式：酶活力＝(1.0×106÷220.13)×产物含量÷60
其中，葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵工艺如下：
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含20-30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成18-20小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含5-10mL乳糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养20-24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：5～10的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得葡萄糖脱氢酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂后得葡萄糖脱氢酶酶液。
所述葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨10-12g/L，酵母抽提物20-24g/L,甘油3-5g/L，磷酸二氢钾1.8-2.2g/L，磷酸氢二钾14.5-16.5g/L，硫酸镁0.5-1g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝6.0-8.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入2-5‰的EDTA和3-5‰的Tris碱，上述比例是质量体积比，即1000mL酶液加入2-5gEDTA固体和3g-5g固体Tris)，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为15-20分钟，上述絮凝剂用量为2.5-3.5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入2.5g-3.5g的絮凝剂；上述防腐剂为K99，加入量为3-5‰，所述保护剂为丙三醇，其添加量为20％-40％，该比例是体积比，即100mL粗酶液加入20-40mL丙三醇。
所述葡萄糖脱氢酶的罐子发酵工艺如下：
葡萄糖脱氢酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为30℃，发酵液pH为7.0，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.6-0.8，且不再增长时，结束发酵。
其中葡萄糖脱氢酶酶活检测方法如下：
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释X倍)，300uL水作空白对照组。
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释X倍)，300uLNAD+水溶液(0.01mol/L)作实验组。340nm波长处测OD值，每30s记录一次实验数据。
酶活定义：在反应温度为30℃，pH值为7.0的条件下，每分钟催化还原NAD转化为NADH，在340nm下，用1cm比色皿比色，吸光度增加值为1时所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
酶活计算公式：U/ml＝[ΔA/min]*[1/d]*[Vt/Vs]*X
ΔA/min：每分钟吸光度的变化值(曲线斜率)
d：比色皿光径
Vt：反应液总体积
Vs：酶液体积
X：酶液稀释倍数
在一种优选的具体实施方式中，小量级实验方案如下：
在150mL锥形瓶中加入50g磷酸钠缓冲液、4.8g葡萄糖固体、4.18g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、2.09g葡萄糖脱氢酶、4.18g酮基还原酶和1.25mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC监测至反应完全。然后，向反应体系加入0.65g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次50mL、40mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品3.56g，收率85％。
在一种优选的具体实施方式中，中量级实验方案如下：
在1000mL锥形瓶中加入500g磷酸钠缓冲液、48g葡萄糖固体、41.8g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、20.9g葡萄糖脱氢酶、41.8g酮基还原酶和12.5mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC检测至反应完全。向反应体系加入6.5g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经500mL、400mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品36.8g，收率87％。
在一种优选的具体实施方式中，千克级实验方案如下：
在50L发酵罐中加入12kg磷酸钠缓冲液、1.15kg葡萄糖固体、1kg底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、0.5kg葡萄糖脱氢酶、1.0kg酮基还原酶和300mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC检测至反应完全。向反应体系加入155g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经9.0L、6.0L乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品920g，收率92％。
本发明的第三步是将合成的(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品与过量的2,2-二甲氧基丙烷在甲磺酸的催化作用下反应，得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。该步骤的完成可以参考文献StivenK.Ma,JohnGruber,ChrisDavis,etal.Agreen-by-designbiocatalyticprocessforatorvastainintermediate.GreenChemistry,2010,12,81-86.
实施例
首先，对下面实施例中的产品以及检测方法等说明如下：
酮基还原酶：安琪酵母股份有限公司
葡萄糖脱氢酶：安琪酵母股份有限公司
分光光度计：上海仪电分析有限公司
下述实施例中用到的其他产品均可以商购获得。
实施例1酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶的制备及活性检测
1.酮基还原酶的制备及活性检测
1.1酮基还原酶的制备
(1)酮基还原酶的摇瓶发酵培养
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含20uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在25℃、240rpm条件下，完成18小时的一级培养过程。然后，将一级培养种子接种到1L含5-10mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养20小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：10的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶酶液。
所述酮基还原酶摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物20g/L，甘油3g/L，磷酸二氢钾1.8g/L，磷酸氢二钾14.5g/L，硫酸镁0.5g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝6.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入2‰的EDTA和3‰的Tris碱，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为15分钟，上述絮凝剂用量为2.5‰，上述防腐剂为K99，加入量为3‰，上述保护剂为丙三醇，加入量为20％。
(2)酮基还原酶的罐子发酵(发酵罐培养)工艺具体如下：
酮基还原酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为25℃，发酵液pH为6.5，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.6，且不再增长时，结束发酵。
1.2酮基还原酶的酶活检测
酶活定义：在反应温度为30℃、pH＝7.0条件和下述实验方案下，1分钟内催化生成1微摩尔产物所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
实验方案：准确称取1.0g(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯和1.0g葡萄糖固体于100mL磷酸钠缓冲液(200mmol，pH＝6.5)中，25℃水浴磁力搅拌15min，然后向反应体系中加入2800U葡萄糖脱氢酶、0.8ml酮基还原酶和0.8mL辅酶NADP+(0.6mg/mL),磁力搅拌60min后取样检测。
取样方法：取500uL反应液于1.5mL离心管中，加入500uL乙酸乙酯，上下震摇使两者混合均匀，然后在8000r/min条件离心4min。
气相色谱条件：气相检测条件：色谱柱型号，SPB-5；进样量，2uL；进样器温度，250℃；柱温，200℃；FID检测器温度，280℃。
酶活计算公式：酶活力＝(1.0×106÷220.13)×产物含量÷60
经过上述酶活检测，得到本实施例制备得到的酮基还原酶的酶活力为24U/mL
2.葡萄糖脱氢酶的制备及活性检测
2.1葡萄糖脱氢酶的制备
(1)葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵过程如下：
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含20uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在25℃、240rpm条件下，完成18小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含5mL乳糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养20小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：10的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得葡萄糖脱氢酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂后得葡萄糖脱氢酶酶液。
所述葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母抽提物20g/L,甘油3g/L，磷酸二氢钾1.8g/L，磷酸氢二钾14.5g/L，硫酸镁0.5g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝6.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入2‰的EDTA和3‰的Tris碱，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为15分钟，上述絮凝剂用量为2.5‰，上述防腐剂为K99，加入量为3‰。
(2)葡萄糖脱氢酶的罐子发酵(发酵罐培养)工艺如下：
葡萄糖脱氢酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为25℃，发酵液pH为6.5，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.6，且不再增长时，结束发酵。
2.2葡萄糖脱氢酶酶活检测
酶活定义：在反应温度为30℃，pH值为7.0的条件下，每分钟催化还原NAD转化为NADH，在340nm下，用1cm比色皿比色，吸光度增加值为1时所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
实验方案：
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释100倍)，300uL水作空白对照组。
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释100倍)，300uLNAD+水溶液(0.01mol/L)作实验组。340nm波长处测OD值，每30s记录一次实验数据。
酶活计算公式：U/ml＝[ΔA/min]*[1/d]*[Vt/Vs]*X
ΔA/min：每分钟吸光度的变化值(曲线斜率)
d：比色皿光径
Vt：反应液总体积
Vs：酶液体积
X：酶液稀释倍数
根据测定得到的实验数据，其中ΔA/min＝0.89d＝1Vt＝2.8mLVs＝0.1mLX＝100通过酶活公式进行计算，得到本实施例制备的葡萄糖脱氢酶的酶活力为2490U/mL。
实施例2酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶的制备及活性检测
1.酮基还原酶的制备及活性检测
1.1酮基还原酶的制备
(1)酮基还原酶的摇瓶发酵培养
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含25uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成19小时的一级培养过程。然后，将一级培养种子接种到1L含8mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养22小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：8的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶酶液。
所述酮基还原酶摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨11g/L，酵母抽提物22g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，磷酸氢二钾15.5g/L，硫酸镁0.8g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝7.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入3.5‰的EDTA和4‰的Tris碱，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为18分钟，上述絮凝剂用量为3.0‰，上述防腐剂为K99，加入量为4‰，上述保护剂为丙三醇，加入量为30％。
(2)酮基还原酶的罐子发酵(发酵罐培养)工艺具体如下：
酮基还原酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为30℃，发酵液pH为7.0，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.7，且不再增长时，结束发酵。
1.2酮基还原酶的酶活检测
酶活定义：在反应温度为30℃、pH＝7.0条件和下述实验方案下，1分钟内催化生成1微摩尔产物所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
实验方案：准确称取1.0g(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯和1.0g葡萄糖固体于100mL磷酸钠缓冲液(200mmol，pH＝7.0)中，30℃水浴磁力搅拌15min，然后向反应体系中加入3000U葡萄糖脱氢酶、1mL酮基还原酶和1mL辅酶NADP+(0.6mg/mL),磁力搅拌60min后取样检测。
取样方法：取500uL反应液于1.5mL离心管中，加入500uL乙酸乙酯，上下震摇使两者混合均匀，然后在8000r/min条件离心4min。
气相色谱条件：气相检测条件：色谱柱型号，SPB-5；进样量，2uL；进样器温度，250℃；柱温，200℃；FID检测器温度，280℃。
酶活计算公式：酶活力＝(1.0×106÷220.13)×产物含量÷60
经过上述酶活检测，得到本实施例制备得到的酮基还原酶的酶活力为32U/mL。
2.葡萄糖脱氢酶的制备及活性检测
2.1葡萄糖脱氢酶的制备
(1)葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵过程如下：
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含25uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成19小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含8mL乳糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养22小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：8的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得葡萄糖脱氢酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂后得葡萄糖脱氢酶酶液。
所述葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨11g/L，酵母抽提物22g/L,甘油4g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，磷酸氢二钾15.5g/L，硫酸镁0.8g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝7.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入3.5‰的EDTA和4‰的Tris碱，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为18分钟，上述絮凝剂用量为3.0‰，上述防腐剂为K99，加入量为4‰。
(2)葡萄糖脱氢酶的罐子发酵(发酵罐培养)工艺如下：
葡萄糖脱氢酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为30℃，发酵液pH为7.0，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.7，且不再增长时，结束发酵。
2.2葡萄糖脱氢酶酶活检测
酶活定义：在反应温度为30℃，pH值为7.0的条件下，每分钟催化还原NAD转化为NADH，在340nm下，用1cm比色皿比色，吸光度增加值为1时所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
实验方案：
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释100倍)，300uL水作空白对照组。
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释100倍)，300uLNAD+水溶液(0.01mol/L)作实验组。340nm波长处测OD值，每30s记录一次实验数据。
酶活计算公式：U/ml＝[ΔA/min]*[1/d]*[Vt/Vs]*X
ΔA/min：每分钟吸光度的变化值(曲线斜率)
d：比色皿光径
Vt：反应液总体积
Vs：酶液体积
X：酶液稀释倍数
根据测定得到的实验数据，其中ΔA/min＝0.92D＝1Vt＝2.8mLVs＝0.1mLX＝100通过酶活公式进行计算，得到本实施例制备的葡萄糖脱氢酶的酶活力为2570U/mL。
实施例3酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶的制备及活性检测
1.酮基还原酶的制备及活性检测
1.1酮基还原酶的制备
(1)酮基还原酶的摇瓶发酵培养
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在35℃、240rpm条件下，完成20小时的一级培养过程。然后，将一级培养种子接种到1L含10mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：5的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶酶液。
所述酮基还原酶摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨12g/L，酵母抽提物24g/L，甘油5g/L，磷酸二氢钾2.2g/L，磷酸氢二钾16.5g/L，硫酸镁1g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝8.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入5‰的EDTA和5‰的Tris碱，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为20分钟，上述絮凝剂用量为3.5‰，上述防腐剂为K99，加入量为5‰，上述保护剂为丙三醇，加入量为40％。
(2)酮基还原酶的罐子发酵(发酵罐培养)工艺具体如下：
酮基还原酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为35℃，发酵液pH为7.5，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.8，且不再增长时，结束发酵。
1.2酮基还原酶的酶活检测
酶活定义：在反应温度为30℃、pH＝7.0条件和下述实验方案下，1分钟内催化生成1微摩尔产物所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
实验方案：准确称取1.0g(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯和1.0g葡萄糖固体于100mL磷酸钠缓冲液(200mmol，pH＝7.5)中，35℃水浴磁力搅拌15min，然后向反应体系中加入3200U葡萄糖脱氢酶、1.2mL酮基还原酶和1.2mL辅酶NADP+(0.6mg/mL)，磁力搅拌60min后取样检测。
取样方法：取500uL反应液于1.5mL离心管中，加入500uL乙酸乙酯，上下震摇使两者混合均匀，然后在8000r/min条件离心4min。
气相色谱条件：气相检测条件：色谱柱型号，SPB-5；进样量，2uL；进样器温度，250℃；柱温，200℃；FID检测器温度，280℃。
酶活计算公式：酶活力＝(1.0×106÷220.13)×产物含量÷60
经过上述酶活检测，得到本实施例制备得到的酮基还原酶的酶活力为28U/mL。
2.葡萄糖脱氢酶的制备及活性检测
2.1葡萄糖脱氢酶的制备
(1)葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵过程如下：
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在35℃、240rpm条件下，完成20小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含10mL乳糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：5的浓度超声/高压破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得葡萄糖脱氢酶粗酶液。粗酶液经絮凝、添加防腐剂后得葡萄糖脱氢酶酶液。
所述葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵的培养基成分为：蛋白胨12g/L，酵母抽提物24g/L,甘油5g/L，磷酸二氢钾2.2g/L，磷酸氢二钾16.5g/L，硫酸镁1g/L，配制好后用氢氧化钠调节pH＝8.0。上述所用的缓冲液为EDTA-tris缓冲液，即向蒸馏水中加入5‰的EDTA和5‰的Tris碱，搅拌均匀后即得。上述超声破碎时间为20分钟，上述絮凝剂用量为3.5‰，上述防腐剂为K99，加入量为5‰。
(2)葡萄糖脱氢酶的罐子发酵(发酵罐培养)工艺如下：
葡萄糖脱氢酶罐子发酵工艺是根据摇瓶发酵工艺按比例扩大后的发酵工艺，只是在发酵过程严格控制了发酵温度为35℃，发酵液pH为7.5，同时，通过检测OD600值来控制发酵时间。上述OD600值达到0.8，且不再增长时，结束发酵。
2.2葡萄糖脱氢酶酶活检测
酶活定义：在反应温度为30℃，pH值为7.0的条件下，每分钟催化还原NAD转化为NADH，在340nm下，用1cm比色皿比色，吸光度增加值为1时所需的酶量，定义为一个单位(U/mL)。
实验方案：
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释100倍)，300uL水作空白对照组。
向4mL体系比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液(1M)，2mL磷酸缓冲液(100mmol,pH＝7.0)，100uL葡萄糖脱氢酶液(稀释100倍)，300uLNAD+水溶液(0.01mol/L)作实验组。340nm波长处测OD值，每30s记录一次实验数据。
酶活计算公式：U/ml＝[ΔA/min]*[1/d]*[Vt/Vs]*X
ΔA/min：每分钟吸光度的变化值(曲线斜率)
d：比色皿光径
Vt：反应液总体积
Vs：酶液体积
X：酶液稀释倍数
根据测定得到的实验数据，其中ΔA/min＝0.86D＝1Vt＝2.8mLVs＝0.1mLX＝100通过酶活公式进行计算，得到本实施例制备的葡萄糖脱氢酶的酶活力为2400U/mL。
实施例4(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯的制备
在150mL锥形瓶中加入50g磷酸钠缓冲液、4.8g葡萄糖固体、4.18g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、2.09g实施例2制备的葡萄糖脱氢酶、4.18g实施例2制备的酮基还原酶和1.25mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC监测至原料峰完全消失表示反应完全。然后，向反应体系加入0.65g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经50mL、40mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品3.56g，收率85％。
实施例5(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯的制备
在1000mL锥形瓶中加入500g磷酸钠缓冲液、48g葡萄糖固体、41.8g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、20.9g实施例2制备的葡萄糖脱氢酶、41.8g实施例2制备的酮基还原酶和12.5mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC检测至反应完全。向反应体系加入6.5g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经500mL、400mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得
(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品36.5g，收率87％。
实施例6(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯的制备
在50L发酵罐中加入10kg磷酸钠缓冲液、1.15kg葡萄糖固体、1kg底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、0.5kg实施例2制备的葡萄糖脱氢酶、1.0kg实施例2制备的酮基还原酶和300mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC检测至反应完全。向反应体系加入155g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经9.0L、6.0L乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品920g，收率92％。
实施例7(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯的制备
在150mL锥形瓶中加入50g磷酸钠缓冲液、4.8g葡萄糖固体、4.18g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、2.51g实施例2制备的葡萄糖脱氢酶、5.02g实施例2制备的酮基还原酶和1.33mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC监测至原料峰完全消失表示反应完全。然后，向反应体系加入0.65g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经50mL、40mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品3.78g，收率89％。
实施例8
在150mL锥形瓶中加入50g磷酸钠缓冲液、4.8g葡萄糖固体、4.18g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、2.30g实施例2制备的葡萄糖脱氢酶、4.60g实施例2制备的酮基还原酶和1.29mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC监测至原料峰完全消失表示反应完全。然后，向反应体系加入0.65g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经50mL、40mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品3.56g，收率85％。
实施例9(对照例)
在150mL锥形瓶中加入50g磷酸钠缓冲液、4.8g葡萄糖固体、4.18g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、2.09g实施例2制备的葡萄糖脱氢酶、4.18g实施例2制备的酮基还原酶和0.75mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC监测至反应完全，发现反应时间达到14小时。然后，向反应体系加入0.65g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经50mL、40mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品3.47g，收率83％。
实施例10(对照例)
在150mL锥形瓶中加入50g磷酸钠缓冲液、4.8g葡萄糖固体、4.18g底物(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯、2.09g实施例2制备的葡萄糖脱氢酶、4.18g实施例2制备的酮基还原酶和1.25mg辅酶NADP+，反应温度25℃、pH＝6.5条件下(10％氢氧化钠溶液调节pH)磁力搅拌，GC监测至原料峰面积占比6％，转化率不再提高，反应时间约16小时，反应结束。然后，向反应体系加入0.65g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经50mL、40mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-3,5,6-三羟基乙酸叔丁酯粗品3.39g，收率81％。
通过上述实施例的实验数据可以看出，本发明的选择性生物催化氢化组合物对催化选择性的反应具有很好的技术效果。特别是使用本发明实施例2制备葡萄糖脱氢酶和酮基还原酶能够高效绿色的获得最终的产品。
Claims (16)
1.一种选择性生物催化氢化组合物，其特征在于，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶。
2.如权利要求1所述的选择性生物催化氢化组合物，其中底物：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)；所述辅酶为NAD+，NADP+中的一种。
3.如权利要求1或2所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。
4.如权利要求3所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述发酵罐培养通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。
5.如权利要求3或4所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的二级培养后进行处理的过程均是：将二级培养液离心，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：(5～10)的浓度超声/高压破碎；破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液或葡萄糖脱氢酶粗酶液；将得到的酮基还原酶粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶。
6.如权利要求5所述的选择性生物催化氢化组合物，其中在所述二级培养的过程中，超声破碎时间为15-20分钟；所述的絮凝过程加入絮凝剂的量为2.5‰-3.5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入2.5g-3.5g的絮凝剂；所述防腐剂为N-羟甲基甘氨酸钠，其添加量为3‰-5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入3g-5g的防腐剂；所述保护剂为丙三醇，其添加量为20％-40％，该比例是体积比，即100mL粗酶液加入20-40mL丙三醇。
7.如权利要求3-6任一项所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的培养基成分为：蛋白胨10g/L-12g/L，酵母抽提物20g/L-24g/L,甘油3g/L-5g/L，磷酸二氢钾1.8g/L-2.2g/L，磷酸氢二钾14.5g/L-16.5g/L，硫酸镁0.5g/L-1g/L。
8.如权利要求2-7任一项所述的选择性生物催化氢化组合物，所述底物为(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯，得到的产物为(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸酸叔丁酯。
9.一种(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。
10.如权利要求9所述制备方法，其中所述(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)。
11.如权利要求10所述制备方法，其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。
12.如权利要求10所述制备方法，其中所述发酵罐培养通过检测OD600确定是否结束发酵，优选所述OD600为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。
13.一种罗素伐他汀中间体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在四氢呋喃溶液中，按物质的量之比(S)-3-羟基丁内酯：乙酸叔丁酯＝1：2投料，在氩气保护、低温条件下，经二异丙基氨基锂催化发生克莱森缩合反应，生成(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯；
(2)将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯；
(3)将步骤(2)得到的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯与2，2-甲氧基丙烷在甲磺酸的催化下进行反应得到丙酮叉保护的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。
14.如权利要求13所述罗素伐他汀中间体的制备方法，其中步骤(2)中(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)。
15.如权利要求14所述罗素伐他汀中间体的制备方法，其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。
16.如权利要求9-12所述的(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，权利要求13-15所述的罗素伐他汀中间体的制备方法，其中所述酮基还原酶酶活检测方法如下：称取1.0g(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯和(1.0g-1.2g)葡萄糖固体于100mL磷酸钠缓冲液中，在pH＝6.5-7.5，温度为25℃-35℃水浴上搅拌，然后向反应体系中加入(2800U-3200U)葡萄糖脱氢酶、(0.8mL-1.2mL)酮基还原酶和(0.48mg-0.72mg)辅酶NADP+，磁力搅拌后取样通过气相色谱进行检测；通过公式计算酶活：酶活力＝(1.0×106÷220.13)×产物含量÷60。
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