DE3344085A1 - Verfahren zur herstellung von l-carnitin und zwischenprodukte fuer das verfahren - Google Patents
Verfahren zur herstellung von l-carnitin und zwischenprodukte fuer das verfahrenInfo
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Description
Ö ό k k υ ο Ό
SIGMA-TAU INDUSTRIE FARMACEUTICHE RIUNITE S.p.A.,
ROM / ITALIEN
Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin und Zwischenprodukte für das Verfahren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren
zur mikrobiologischen Reaktion von ^-substituierten Acetoessigsaureestern oder -amiden in die
entsprechenden L-ß-Hydroxy- ^-substituierten Buttersäurederivate,
wobei die Derivate einfach in L-Carnitinchlorid umgewandelt werden können. Die Erfindung
betrifft auch die in dem Verfahren verwendeten, neuen chemischen Zwischenprodukte.
10
10
Es ist bekannt, dass Carnitin-(ß-hydroxy- ■y-trimethy1-aminobuttersäure)
(auch als 3-Hydroxy-4-(trimethylammonio)-buttersäure-betain
bezeichnet) ein asymmetrisches
Zentrum enthält und daher in den beiden stereoisomeren Formen, der D- und der L-Form, vorliegt.
Im Körper liegt gewöhnlich L-Carnitin vor, wo es dazu dient, aktivierte langkettige, freie Fettsäuren
durch die Mitochondrialmembran zu transportieren. Da die Mitochondrialmembran gegenüber Acyl-CoA-derivaten
undurchlässig ist, können langkettige freie Fettsäuren nur eintreten, wenn sie mit L-Carnitin
verestert sind. Die Trägerfunktion von L-Carnitin macht sich sowohl beim Transport von aktiven langkettigen
Fettsäuren von der Stelle ihrer Biosynthese, z.B. den Mikrosomen zu den Mitochondria, wo sie
oxidiert werden, bemerkbar, als auch beim Transport von Acetyl-CaO von den Mitochondria, in denen es gebildet
wird, zu den extramitochondrialen Stellen, wo die Synthese von langkettigen Fettsäuren stattfindet,
z.B. in den Mikrosomen, wobei Acetyl-CoA zur Synthese von Cholesterin und Fettsäuren verwendet
werden kann.
Es steht fest, dass das linksdrehende Isomer (L-Carnitin) die ausschliesslich biologische Form darstellt
(D-Carnitin wurde bisher noch nie in Säugetiergeweben nachgewiesen) und das D,L-Carnitin-Racemat
wurde in den vergangenen Jahren für zahlreiche Indikationen verwendet. D,L-Carnitin wird
beispielsweise in Europa als AppetitsStimulans verwendet und es wurde darüber berichtet, dass dieses
Material das Wachstum von Kindern beeinflusst (siehe z.B. Borniche et al, Clinica Chemica Acta, 5, 171-176,
BAD ORIGINAL
1969; und Alexander et al, "Protides in the Biological
Fluids", 6th Colloquim, Bruges, 1958, 306-310. In der
US-PS 3 830 931 werden Verbesserungen der myocardialen Kontrakt!Iitat und des systolischen Rhythmus bei
Stauungsherzversagen beschrieben, wobei man diese Verbesserungen durch die Verabreichung von D,L-Carnitin
erzielt hat. In US-PS 3 968 241 ist die Verwendung von D,L-Carnitin bei Herzarythmien beschrieben. In
US-PS 3 810 994 wird die Verwendung von D,L-Carnitin für die Behandlung der Fettsucht offenbart.
In jüngerer Zeit besteht jedoch die Tendenz, ausschliesslich das linksdrehende Carnitinisomer zumindest
bei gewissen therapeutischen Anwendungen einzusetzen. Es wurde tatsächlich festgestellt, dass D-Carnitin.ein
kompetitiver Inhibitor von Carnitinverbundenen Enzymen, wie Carnitinacetyltransferase
(CAT) und Carnetinpalmityltransferase (PTC) ist. Darüber hinaus geht aus jüngeren Versuchen hervor,
dass D-Carnitin eine Verarmung an L-Carnitin im Herzgewebe ergeben kann. Infolgedessen ist es wesentlich,
dass ausschliesslich L-Carnitin an solche Patienten verabreicht wird, die gegen Herzkrankheiten oder
eine Lipämie behandelt werden.
Es gibt eine Reihe von Verfahren zur technischen Herstellung von Carnitin. Die chemische Synthese führt
jedoch unvermeidlich zu einem racemischen Gemisch von D- und L-Isomeren. Infolgedessen hat man Spaltmethoden
entwickelt, um die getrennten optischen Antipoden aus Racematen zu gewinnen. Solche Spaltmethoden
sind jedoch mühselig und teuer.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Herstellung von
L-Carnitin in guten Ausbeuten durch eine Kombination von mikrobiologischen und chemischen Verfahren
zu zeigen.
Verbunden mit dieser Aufgabe ist es, ein verbessertes
Verfahren zur Synthese von L-Carnitin aus leicht zugängigen preiswerten Rohmaterialien zu zeigen.
Ziel der Erfindung ist es auch, die Herstellung von neuen brauchbaren, optisch aktiven Zwischenprodukten
für die Synthese von L-Carnitin und dessen Salzen oder Estern zu zeigen, sowie ein Verfahren zu zeigen
zur Herstellung von L-Carnitin durch Trimethylaminverdrängung der Halogruppe von 4-Halo-3(R)-hydroxybutyrat.
Schliesslich ist es auch ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von 4-Jodo- oder 4-Bromo-3(R)-hydroxybutyraten
aus 4-Chlor-3(R)-hydroxybutyraten zu zeigen.
Diese und weitere Ziele der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.
Die Vorteile der Erfindung sind für den Fachmann aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlieh.
Es ist bekannt, dass man die ß-Ketofunktion in der 3-Stellung
von ^-substituierten Acetoessigsäurederivaten durch Hydrieren über Pt/C reduzieren kann (siehe
beispielsweise US-PS 3 969 406). Die dabei entstehende Hydroxyverbindung stellt jedoch ein Racemat
dar. Wenn man dagegen die fermentative Wirkung von Mikroorganismen gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren
anwendet, dann kann man die Hydrierung der Oxofunktion in der 3-Stellung stereoselektiv vornehmen
und man erhält optisch aktive ^-substituierte ß-Hydroxybuttersäurederivate.
Insbesondere kann man durch eine geeignete Auswahl (wie nachfolgend beschrieben wird) der der fermentativen
Wirkung der Mikroorganismen ausgesetzten Substrate beim erfindungsgemässen Verfahren die 3(R)-
oder Ii-epimerische Konfiguration erhalten. Diese Konfiguration wird für die Umwandlung in das natürliche
L-Carnitin benötigt.
Breit gesagt, betrifft die Erfindung die Verwendung des mikrobischen Reduktaseenzyms L-ß-Hydroxyacyl·*-
CoA-dehydrogenase (EC 1.1.1.35), um die stereoselektive Hydrierung von T-substituierten Acetoessigsäurederivaten
zu katalysieren.
Gemäss dem breitesten Aspekt der Erfindung betrifft diese die Herstellung von optisch aktiven -^--substituierten
ß-Hydroxybuttersäurederivaten der allgemeinen Formel
OH 0
H η
worin bedeuten
X Chlor, Brom, Jod oder OH,
R einen geradkettigen, verzweigten oder cycli-ο
sehen Rest aus der Gruppe
Alkoxyreste mit 1 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
Alkylaminoreste mit etwa 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
-
Cycloalkoxyreste und Cycloalkylaminoreste mit
etwa 5 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen,
0 Phenoxy- und Phenylalkoxyreste mit 7 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen,
Phenylamino- und Phenylalkylaminoreste der Formeln
Y YZ
Y YZ
-N-0-A und -N-CH-0-Ä
worin Y und Z H, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl und
AH, CH3, Cl oder Br bedeuten.
BAD ORIGINAL
aus den entsprechenden ^""-substituierten Acetoessigsäureestern
oder -amiden, wobei das erfindungsgemässe Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man
^-substituierte Acetoessigsäureester oder -amide einer fermentativen enzymatischen Einwirkung eines
Mikroorganismus, welches L-ß-Hydroxyacyl-CöA-dehydrogenase
(EC 1.1.1.35) bewirkt, unterwirft, und dass man die gewünschten optisch aktiven ^-substituierten
ß-Hydroxybuttersäurederivate gewinnt. 10
Zur Herstellung von optisch aktiven ^-substituierten
3(R)-Hydroxybuttersäurederivaten der Formel mit der 3(R)-Konfiguration
besteht das Verfahren darin, dass man Verbindung der
allgemeinen Formel
20
20
0 O
XCH2-C-CH2CR
XCH2-C-CH2CR
worin X und R die vorher angegebenen Bedeutungen haben, mit dem Proviso, dass R, wenn es ein Alkoxyradikal
ist, 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatome enthält, einer fermentativen enzymatischen Wirkung eines Mikroorganismus,
welcher L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase bewirkt (EC 1.1.1.35) unterwirft und dass man aus
dem fermentativen Reaktionsgemisch das gewünschte optisch aktive 4-substituierte 3(R)-Hydroxybuttersäurederivat
gewinnt.
Es wurde festgestellt, dass jeder Mikroorganismus, welcher das gewünschte Enzym produziert, in der Lage
ist, die stereoselektive Reduktion zu katalysieren. Besonders geeignet sind solche Mikroorganismen, welehe
der Klasse Ascomycetes, den Ordnungen Endomycetales, Mucorales, Moniliales und Eurotiales angehören,
sowie vom Genus Saccharomyces, wobei Saccharomyces cerevisiae besonders bevorzugt ist.
Zur Herstellung von optisch aktiven 4-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäureestern mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
ist es erforderlich, gereinigte L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (EC 1.1.1.35) zu verwenden,
z.B. solche aus Schweineherzen, weil intakte Mikroorganismen eine störende Oxidoreduktase der entgegengesetzten
Reduktion haben. Infolgedessen ergibt eine mikrobiale Reduktion von beispielsweise 4-Chloroacetoessigsäureestern
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen 4-Chloro-3-hydroxybutyrate einer ungenügenden optisehen
Reinheit.
Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven ^-substituierten
3(R)-Hydroxybuttersäurederivaten der Formel mit der
3(R)-Konfiguration
worin X Chlor, Brom, Jod oder OH und R einen Alkoxyrest
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten und ist
BAD
dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Formel
O
XCH2-C-CH2C-R
5 worin X und R die vorher angegebenen Bedeutungen haben, der enzymatischen Einwirkung von L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase
(EC 1.1.1.35) in reiner Form unterwirft und dass man die gewünschten, optisch aktiven Ύ'-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivate
aus dem enzymatischen Reaktionsgemisch gewinnt
Die Erfindung ergibt Verbindungen der Formel mit der 3(R)-Konfiguration
worin bedeuten:
X Chlor, Brom, Jod oder OH,
R einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Rest aus der Gruppe
Alkoxyreste mit 1 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
Alkylaminoreste mit etwa 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen/
Cycloalkoxyreste und Cycloalkylaminoreste mit
etwa 5 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen/
Phenoxy- und Phenylalkoxyreste mit 7 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen,
Phenylamino- und Phenylalkylaminoreste der Formeln
Y YZ
-N-0-A und -N-CH-0-A
worin Y und Z H, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl und
A H, CH3, Cl oder Br bedeuten.
Die optisch aktiven, 'J -substituierten L-ß-Hydroxybuttersäurederivate
können dann mit Trimethylamin umgesetzt werden, unter Ausbildung der entsprechenden
·' -Trimethylammonium-L-ß-hydroxybuttersäurederivate,
die man leicht in L-Carnitin überführen kann, indem man sie mit wässrigen Säuren behandelt. Nachfolgend
wird ein Reaktionsschema dieses Verfahrens gezeigt.
j J
- 19 -
OH
X-Cl, Br, J,: OH
CH3 OH
CH-
Micro-Organismus >.
or L-ß-Hydroxyacyl
CoA-dehydrogenase
H+
IV L-Caxnitin ..
N!
CH
CH-
A'
CH-
Ill
Es wurde festgestellt, dass die vorstehende Umsetzung I —->
II leichter abläuft, wenn X Cl bedeutet.
Da jedoch die anschliessende Umsetzung II >
III
in besseren Ausbeuten abläuft, wenn X Jod oder Brom bedeutet, ist es bevorzugt, zunächst das Chlorderivat
herzustellen und es dann in das entsprechende Jod- oder Bromderivat zu überführen.
Die Erfindung betrifft auch ein verbessertes Verfahren, bei dem man zuerst 4-Chlor-3(R)-hydroxybuttersäureester
in das entsprechende 4-Jodo- oder 4-Bromo-3(R)-hydroxybutyrat
überführt. Aus Gründen der
Einfachheit wird nachfolgend auf die Jodderivate verwiesen. Das Jodohydrin (V) kann einfach mit Trimethylamin
bei Raumtemperatur umgesetzt werden unter Erhalt von (VI), welches dann nach dem folgenden Reaktionsschema
in L-Carnitin überführt wird.
HO, K 0
HO,
rr
R * H oderEster
HeOH
3 OH . 0
Harz
OH" F bra
OH" F bra
L-Carnitini
f3
N-CH.
I ;
CH3
CH, OH H
Das obige als Beispiel gezeigte Verfahren kann in zahlreichen Varianten vorliegen. Unabhängig davon,
welche Form zur Verfügung gestellt wird, wird der Ester mit Natriumjodid in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie 2-Butanon, Aceton, Butanol etc., umgesetzt. Die an dieser Stelle gewünschte Hauptreaktion bei
der Umsetzung mit Natriumjodid ist die Verdrängungsreaktion unter Ausbildung des Jodohydrins (V), ohne
dass das chirale Zentrum am anliegenden Kohlenstoffatom
gestört wird. Für diese Umsetzung benötigt man wenigstens soviel Natriumjodid, um das gesamte Chlorid
aus (II) zu verdrängen. Im allgemeinen wird ein geringer Überschuss an Natriumjodid verwendet.
5
Die Umsetzung von (V) mit Trimethylami kann bei milden Temperaturen (z.B. 25°C) (siehe S.G. Boots und
M.R. Boots, J. Pharm. Sei., ([4, 1262, 1975) in
zahlreichen Lösungsmitteln, wie Methanol oder Ethanol, die einen Überschuss an Trimethylamin enthalten,
durchgeführt werden. Es ist bemerkenswert, dass in Abhängigkeit von dem verwendeten alkoholischen
Lösungsmittel ein Esteraustausch stattfindet.Verwendet man beispielsweise Methanol als Lösungsmittel,
so erhält man den L-Carnitinmethylester bei der Umsetzung. Diese Austauschreaktion ist vorteilhaft,
weil man den L-Carnitinmethylester direkt in die freie Base des L-Carnitins überführen kann, indem
man ihn durch eine Iorienaustauschsäule (OH ) leitet (siehe E. Strack und J. Lorenz, J. Physiol. Chemy
(1966) 3_4_4, 276) .
Aus der Beschreibung des vorhergehenden Verfahrens wird ersichtlich, dass eine Anzahl von neuen und
sehr brauchbaren optisch aktiven Zwischenprodukten gebildet wird. Besonders brauchbar sind die 4-Jodo-3(R)-hydroxybuttersäurealkylester
mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe. Ganz besonders
bevorzugt wird der Octylester.
Mikroorganismen mit der gewünschten Oxido-Reduktaseaktivität sind bekannt und alle solche Mikroorganismen
können bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet werden (siehe K. Kieslieh,
"Microbial Transformations of Non-Steroid Cyclic Compounds", Georg Thieme Publishers, Stuttgart,
1976), wobei alle der Mikroorganismengenera, die hier spezifisch beschrieben sind, besonders anwendbar
sind. Die leicht zugängigen und billigen Mikroorganismen vom Genus Saccharomyces, z.B. Brauerhefe,
Bäckerhefe und Weinhefe (Saccharomyces vini), bilden die L-ß-Hydroxylacyl-CoA-dehydrogenase (EC
1.1.1.35) und sind ganz besonders vorteilhaft bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens.
Das Enzym wird von S.J. Wakil und E.M. Barnes jr.
in Comprehensive Biochemistry, Bd. 185 (1971), S.
57-104, beschrieben.
Das 4-substituierte Acetoessigestersubstrat kann
in ein Nährmedium von Standardzusammensetzungen eingebracht werden, in welchen solche Organismen kultiviert
werden, wobei man die üblichen Fermentationsbedingungen zur Durchführung der reduktiven Transformation
anwendet. Alternativ kann das aktive Prinzip von der wachsenden Kultur des Mikroorganismus entfernt
werden, z.B. durch Lysis der Zellen unter Freigabe des Enzyms oder indem man die ruhenden Zellen
in einem frischen wässrigen System suspendiert. Bei allen diesen Verfahren wird die ß-Keto-Funktion
selektiv reduziert, solange das aktive Enzym, welches durch die Mikroorganismen ausgebildet wird,
in dem Medium vorhanden ist. Selbstverständlich besteht ein gegenseitiger Zusammenhang zwischen der
Temperatur, der Zeit und dem Druck, bei denen der Kontakt des 4-substituierten Acetoessigsäurederivats
mit dem reduktiven Enzym durchgeführt wird. Beispielsweise benötigt man bei schwachem Erwärmen
und unter Atmosphärendruck weniger Zeit, um die reduktive Umwandlung zu bewirken, als bei Raumtemperatur
unter sonst gleichen Bedingungen. Selbstverständlich dürfen weder die Temperatur noch der
Druck noch die Zeit so gross sein, dass das Substrat abgebaut wird. Verwendet man eine wachsende Kultur
des Organismus, dann sollen die Verfahrensbedingungen
ausreichend milde sein, dass die Organismen nicht abgetötet werden, bevor sie das hydrolytische Enzym
ausgebildet haben, durch welches die Reaktion ablaufen kann. Im allgemeinen liegen bei Atmosphärendruck
die Temperaturen im Bereich von etwa 100C bis etwa
350C und. die Zeit beträgt etwa 12 Stunden bis etwa
10 Tage.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Die '^-Haloacetoessigsäurederivat-Substrate,
die der mikrobiologischen Reduktion unterworfen werden, erhält man aus Diketen nach der allgemeinen Methode von CD. Hurd und H.L.
Abernethy (J. Am. Chem. Soc, 62, 1147, 1940) für
die ^-Chlor-acetoessigsäurederivate und F. Chick,
N.T.M. Wilsmore (J. Chem. Soc, 1978 (1910)) für
die 2v~Bromo'"acetoess:i-gsäurederivate durch die nachfolgende
Reaktionsfolge:
XCH2C-CH2CX
OR
O
XCH2CCH2COR
worin bedeuten: X = Chlor oder Brom
Y=H oder Alkyl R= die vorher angegebene Bedeutung.
Gewünschtenfalls kann man alternativ die V-HaIoacetoessigsäurederivate
aus den "r-Haloessigsäureestern durch eine übliche Grignard-Reaktion herstellen.
Beispielsweise kann man den ν—Chloro-acetoessigsäureoctylester
einfach herstellen, indem man den "■"—Chlorooctylester mit zwei Äquivalenten Magnesium
in Ether während 48 Stunden unter Rückfluss behandelt. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde der
Acetoessigsäureoctylester in etwa 70 %-iger Ausbeute gewonnen.
Jy--Hydroxyacetoessigsaurederivate erhält man aus
den entsprechenden ^'-Bromoacetoessigsäurederivaten,
indem man in einer Dioxan-Wasser (1:1)-Lösung, enthaltend
CaCO3, 12 Stunden bei 250C rührt.
• J .J
Jedes der in den nachfolgenden Beispielen hergestellten Produkte wurde durch kernmagnetische Resonanzmessung
(NMR), Infrarotspektren (IR) und durch Dünnschichtchromatografie hinsichtlich der Struktur
identifiziert. Die optische Reinheit und die absolute Konfiguration der Produkte wurde durch deren Umwandlung
in L-Carnitin und auch durch die Umwandlung in ihre Ester, die einfach durch NMR-Spektrometrie
analysiert werden können, sowie durch optische Drehhung festgestellt.
Beispiel 1 (Hefen)
15
15
Der (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester
wurde wie folgt hergestellt
OUk.
> >OCH
OC8H17
(A) Fermentation
25
25
Oberflächenwachstum einer 1-wöchigen Agar-Schrägkultur
von Candida keyfr. NRRL Y-329, gewachsen auf Agar der folgenden Zusammensetzung:
Gramm
Agar 20
Glucose 10 Hefeextrakt 2,5
K2HPO4 1
destilliertes Wasser bis auf 1 1
(15 Minuten bei 1,4 bar sterilisiert)
wurde in 5 ml einer 0,85 %-igen Kochsalzlösung suspendiert.
1 ml-Anteile dieser Suspension wurden zum Inokulieren eines 250 ml-Erlenmeyer-Kolbens (F-1-Stufe),
enthaltend 50 ml des nachfolgenden Mediums (Vogel's Medium) verwendet:
Gramm
Hefeextrakt
Casamxnosauren
Dextrose
Na^-Citrat-S 1/2 H3O
20 KH2PO4
NH4NO3 CaCl2-2H2O
MgSO4-7H2O
Spurenelementenlösung
25 destilliertes Wasser bis auf
(pH 5,6 (15 Minuten bei 2,1 bar 30 psi) sterilisiert
| 5 | ,1 |
| 5 | ,2 |
| 40 | ,1 ml |
| 3 | 1 |
| 5 | |
| 2 | |
| 0 | |
| 0 | |
| 0 | |
| 1 | |
j j 4 k υ ο
| Citronensäure. | •7H | 2° | 4 | »2 | 1H2O |
| ZnSO4- | I)2 | (SO | |||
| Fe (NH^ | ■5H | 2° | .6H2O | ||
| CuSO4· | •1H | 2° | |||
| MnSO4- | 2 | 0 | |||
| H3BO3 | NaH2MoO4 | •2H | |||
- 27 -
0,25 0,05 0,05 0,05
i. 1 £■
Der Kolben wurde bei 250C auf einem Drehschüttler
(250 Zyklen/Min., 5 cm (2") Radius) 24 Stunden inkubiert und anschliessend wurden 10 Vol.% davon in
einen anderen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben (F-2-Stufe)
enthaltend 50 ml Vogel's Medium, überführt. Nach 24-stündiger Inkubation auf einem Drehschüttler
wurden 150 mg JT-Chloroacetoessigsäureocty!ester
in 0,1 ml einer 10 %-igen Tween 80-Lösung zugegeben.
Der Kolben der F-2-Stufe wurde dann weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie sie für den
Kolben der F-1-Stufe verwendet wurden, inkubiert.
(B) Isolierung
24 Stunden nach Zugabe des τ-Chloroessigsäureoctylesters
wurden die Zellen durch Znetrifugiere'n entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde gründlich
dreimal mit je 50 ml Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde über Na3SO4 getrocknet und dann
abgedampft, wobei man 186 mg eines öligen Rückstandes
erhielt. Der Rückstand wurde in 0,5 ml der mobilen Phase gelöst und dann auf eine Kieselgelsäule
(1 χ 25 cm) (MN-Kieselgel 60) gegeben. Die Säule wurde mit Skelly B:Ethylacetat (8:1) eluiert
und es wurden 14 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 6 und 7, welche das gewünschte Produkt enthielten,
wurden zusammengegeben und zur Trockne konzentriert, wobei man 120 mg eines kristallinen Rück-Standes
erhielt. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat-Hexan erhielt man 107 mg 4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.
' + 13,3° (c, 4,45) (CHCl3)?
15
PMR (5CDCl3) 0,88 (3H, tr. verzerrt, CH3'
1 ,28 (10H, s, -(CH2J5-)
1,65 (2H, m, -CH9-CH0-CH9O-C-)
Δ Δ Δ „
O 2,62 (2Η, d, J=6Hz, -CH-CH2-COOR)
OH
3,22 (1H, br, -OH) 3,60 (2H, d, J=6Hz, ClCH2-CH-R)
OH 4,20 (3H, CH0-CH-CH0 und -C-O-CH0CH0)
OH O
Elementaranalyse für C12H23O3Cl:
Berechnet: C 57,47 H 9,25
Gefunden : 57,52 - ·9. ,Ο?
Gefunden : 57,52 - ·9. ,Ο?
(TLC Rf - 0,5, Brinmann-Kieselgelplatte, 0,25 cm EM;
Skelly B:Ethylacetat (5:1))
Ruhende Zellen: 100 g übliche frische Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (Red Star) wurden in 250 ml
Leitungswasser, zu dem 10 g Saccharose und 3,6 g '^-Chloroacetoessigsäureoctylester gegeben worden
waren, suspendiert. Nach 24-stündigem Inkubieren bei 250C auf einem Drheschüttler (250 Zyklen/Min., 5 cm
Radius), wurden weitere 10g Saccharose in den KoI-ben
gegeben und man liess die Umsetzung weitere Stunden ablaufen. Die Zellen wurden dann durch ein
Zelithbett abfiltriert. Anschliessend wurden die Zellen mit Wasser und mit Ethylacetat gewaschen. Die
Waschlösungen wurden mit dem Filtrat vereint und gründlich mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht
wurde über MgSO. getrocknet und abgedampft, wobei man einen öligen Rückstand erhielt, der
über einer Kieselgelsäule chromatografiert wurde. Man erhielt 2,52 g 4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester
als einen niedrigschmelzenden Feststoff.
/ÖO723 +13,2° (c, 4,0, CHCl.)
Der (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäurebenzylester
wurde wie folgt hergestellt:
(A) Fermentation
Das Oberflächenwachstum einer 1 Woche alten Schrägkultur von Gliocladium virens ATCC 13362, gewachsen
auf Agar der folgenden Zusammensetzung:
Gramm
Malzextrakt 20
Glucose 20
Pepton 1
Agar 20
destilliertes Wasser bis auf 1 1
(sterilisiert 15 Minuten bei 1,4 bar)
wurde in 5 ml einer 0,85 %-igen Kochsalzlösung suspendiert. 1 ml-Anteile dieser Suspension wurden zum
Inokulieren eines 250 ml-Erlenmeyer-Kolbens (F-1-Stufe),
enthaltend 50 ml des nachfolgenden Mediums (Sojabohnen-Dextrosemedium) verwendet:
BAD
■■ ί · S S
- 31 -
Gramm
Sojabohnenmehl 5
Dextrose 20
NaCl 5
KH2HPO4 5
Hefe 5
Wasser 1 1
pH eingestellt auf 7,0
(15 Minuten bei 1,05 bar autoklavisiert)
(15 Minuten bei 1,05 bar autoklavisiert)
Der Kolben wurde auf einem Drehschüttler (250 Zyklen/ Min., 5 cm Radius) bei 25°C während 24 Stunden inkubiert
und anschliessend wurde ein 10 %-iger Volumenanteil,
in einen anderen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben
(F-2-Stufe), welcher 50 ml des Sojabohnen-Dextrosemediums enthielt, gegeben. Nach 24-stündigem Inkubieren
auf einem Drehschüttler wurden 150 mg T-Chloroessigsäurebenzylester
in 0,1 ml 10 %-iger Tween 80-Lösung zugegeben. Der F-2-Stufen-Kolben wurde dann
weitere 24 Stunden unter den für die Inkubierung in dem F-1-Stufen-Kolben-Bedingungen inkubiert.
(B) Isolierung·
24 Stunden nach der Zugabe des ^-Chloroessigsäurebenzylesters
wurden die Mycele abfiltriert. Das FiI-trat
wurde gründlich dreimal mit je 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde über MgSO,
getrocknet und dann im Vakuum konzentriert, wobei man 160 mg eines Rückstandes erhielt. Der Rückstand wurde
über eine Kieselgelsäule (MN-Kieselgel 60) (1 χ 25 cm)
chromatografiert. Die Säule wurde mit Skelly B und Ethylacetat (10:1) eluiert, wobei 12 ml-Fraktionen gesammelt
wurden. Die Fraktionen 11 bis 16 enthielten das gewünschte Produkt und wurden zusammengegeben und
zur Trockne konzentriert, wobei man 115 mg des 4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersaurebenzylesters
erhielt.
^q3 +8,7° (c, 5,26; CHCl3);
PMR (0 CDCl3) 2,65 (2H, d, J=6Hz, -CH-CH2COOR)
OH
3,54 (2H, d, J=6Hz, Cl-CH0CH OH 4,20 (1H, m, -CH2-CH-CH2-)
OH 5,12 (2H, s, -C-O-CH0C^H1-)
H —Δ D J
7,31 (5H, s, fünf aromatische Protonen) 20 Elementaranalyse für C11H13O3Cl:
Berechnet: C 57,77 H 5,73 Gefunden : 57,64 5,67 25 (TLC Kieselgel-EM Brinkmann-Platte, 0,25 cm, Rf = 0,43,
Skelly B-Ethylacetat (5:1)).
BAD
3 3 4 4 U 8 b
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei
die in der Tabelle 1 angegebenen Organismen verwendet wurden, mit der Ausnahme, dass der ^-Chloro-
essigsäureoctylester in einer Konzentration von 1 mg/ml
zugegeben wurde. Man erreichte die Umwandlung in das gewünschte Produkt, den (+)4-Chloro~3(R)-hydroxybuttersäureocty
lester. Das Verfahren in diesen Beispielen wurde wiederholt, indem man kontinuierlich
Substrat zu den Hefemedien gab. Das Gewichtsverhältnis Substrat/Hefe betrug etwa 1:1,5, wobei man eine
ausgezeichnete Umwandlung in das gewünschte Produkt erzielte.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
f-Chloroessigsäureoctylester (1 mg/ml) verwendet wurde.
Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
Ύ- -Chloroacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als
Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt ( + )4-Chloro-3(R) hydroxybuttersäurebenzylester.
5
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit allen in Tabelle
2 aufgelisteten Organismen unter Verwendung von ?—Chloroacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als
Substrat wiederholt. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäurebenzylester.
(+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureanilid wurde nach
dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt, wobei jedoch das 4-Chloroacetoacetanilid bei einer Konzentration
von 1 mg/ml
OH
als Substrat für die Umwandlung in das gewünschte optisch aktive Produkt verwendet wurde. F: 110 bis
3 ό 4 k L1 a b
7P +17,5° (c, 3,0, CHCl3;
O
PMR (6CD3CCD3) 2,67 (2H, d, J-6HZ, -HOHCH2-CONHr) 3,66 (2H, d, J=6HZ, ClCH2CHOH-R) .4,43 (1H, m, -CH2-CHOH-CH2-)
PMR (6CD3CCD3) 2,67 (2H, d, J-6HZ, -HOHCH2-CONHr) 3,66 (2H, d, J=6HZ, ClCH2CHOH-R) .4,43 (1H, m, -CH2-CHOH-CH2-)
7,03-7,44 (3H, m, aromatische Protonen, meta und para)
7,69 (2H, d, J=6Hz, aromatische Protonen, ortho)
9,24 (1H, br, -C-N-0)
9,24 (1H, br, -C-N-0)
Il
0 Elementaranalyse für C1nH10NO0Cl:
Berechnet: C 56,21 H 5,66 Gefunden : 56,17 5,47 .
Beispiele 95 bis 114
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit allen in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei
jedoch '--Chloroacetoacetanilid in einer Konzentration
von 1 mg/ml zugegeben wurde. In allen Fällen erzielte man die Umwandlung in das gewünschte Produkt
(+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt. '/'-Chloroacetoacetanilid
wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml eingeführt. In diesen Fällen erzielte man
die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle
1 aufgeführten Organismen wiederholt, wobei jedoch ■'--Bromoacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml)
als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte.Produkt ( + )4-Bromo-3(R)-hydroxy buttersäureoctylester.
20
20
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
,--Bromoacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) verwendet
wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.
j 4'-;ο ^
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle
1 aufgelisteten Organismen wiederholt/ wobei jedoch T-Bromoacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) als Substrat
verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(RV-hydroxybuttersäurebenzylester.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
">"- -Bromoacetoessigsäurebenzylester (1 mg/ml) verwendet
wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-BrOmO-S(R)-hydroxybuttersäurebenzylester.
20
20
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
)~--Bromoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendet
wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte Produkt (+)4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.
30
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei man jedoch
O^-Bromoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendete.
Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte (+)4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
>-Hydroxyacetoessigsäureoctylester (1 mg/ml) als Substrat verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung
in den gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureocty!ester.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
-Hydroxyacetoessigsäureocty!ester (1 mg/ml) als Substrat
verwendet wurde. Man erzielte die Umwandlung in den gewünschten 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureoctylester.
30
30
ORIGINAL
3 3 4-Mi a. b
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
^-Hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendet
wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Organismen wiederholt, wobei jedoch
>-Hydroxyacetoacetanilid (1 mg/ml) als Substrat verwendet
wurde. Man erzielte die Umwandlung in das gewünschte 4-Hydroxy-3(R)-hydroxybuttersäureanilid.
VIX VIII
100 mg Methyl-4-chloroacetoacetat (VII) wurden mit
29 Einheiten Schweineherz (EC 1.1.1.35), ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase
(Sigma, H4626) und 1,36 g NADH
(Sigma, 90 %) in 30 ml eines 0,1M Natriumphosphatpuffers,
pH 6,5, inkubiert.
Nach 30 Stunden bei 250C wurde das Reaktionsgemisch
viermal mit je 30 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische
Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft.
Der Rückstand (90 mg) wurde über eine Kieselgel (12 g)-Säule
(1,3 χ 34 cm) chromatografiert. Die Säule wurde
0 mit einem Lösungsmittelsystem aus Skelly B-Ethylacetat (8:1) eluiert und es wurden 20 ml-Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen 9 bis 11 enthielten das gewünschte Methyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat (VIII), wie durch
TLC, CdJ^ +23,5° (c, 5,2 CHCl3) festgestellt wurde.
Diese Fraktionen wurden zusammengegeben.
Beispiel 366
20
20
Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt, wobei jedoch als Substrat Ethyl-4-chloroacetoacetat verwendet
wurde und man Ethyl-4-chloro-3(R)-hydroxybuty-
rat, /λ 7?3 +22,7° (c, 4,7 CHCl-,) erhielt.
Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt, wobei man jedoch als Substrat n-Propyl-4-chloroacetoacetat
ORIGINAL
verwendete und n-Propyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat,
Ö3 +21,5° (c, 5,0, CHCl3) erhielt.
Das Verfahren von Beispiel 365 wurde wiederholt, wobei man jedoch n-Butyl-4-chloroacetoacetat als Substrat
verwendete und n-Butyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, /Οθ7^3 +20,1° (c, 3,1, CHCl3) erhielt.
Allgemeines Verfahren für die Umwandlung von 4-HaIo-3(R)-hydroxybuttersäureestern und -amiden in L-Carnitin
Eine Mischung aus 4-Chloro~3(R)-hydroxybuttersäureoctylester
(1,5 g), Ethanol (3 ml) und Trimethylamin (25 Gew.%-ige Lösung) in 3 ml Wasser wurde 2 Stunden
auf 80 bis 900C erwärmt. Die Lösungsmittel und überschüssiges
Trimethylamin wurden im Vakuum abgedampft, wobei man 1,8g eines rohen Rückstandes erhielt. 1 g
des Rohproduktes wurde in einer Lösung aus 10 % HCl (7 ml) 1,5 Stunden bei 80 bis 900C erwärmt. Nach dem
Abdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck
wurde das Rohprodukt zweimal mit 10 ml absolutem Ethanol
extrahiert und das Ethanol wurde im Vakuum abgedampft. Der kristalline Rückstand wurde in einer
kleinen Menge Ethanol gelöst und das L-Carnitinchlorid durch Zugabe von Ether ausgefällt und in einer Ausbeute
von 320 mg, F: 1420C (Zersetzung), Ü/J -23,7°
(c, 4,5, H2O) erhalten.
Das L-Carnitinchlorid kann einfach in das pharmazeutisch bevorzugte innere Salz des L-Carnitins durch
Ionenaustausch sowie auf andere Art überführt werden.
15 Beispiel 370 20 ^l
Ii ix
Eine Mischung aus Octyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat
(II). CI ,426 g) und wasserfreiem NaJ (1,2 g) in 15 ml
Methylethylketon wurde 24 Stunden rückflussbehandelt. Die Mischung wurde auf einen Drehverdampfer gegeben
und mit 100 ml Ether und 50 ml Wasser umgesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit einer 10 %
ogen Natriumthiosulfatlösung (150 ml), Sole (150 ml),
gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei man 1 ,762 g (IX) als
hellgelbes öl erhielt.
hellgelbes öl erhielt.
5 IR (Dünnschicht) 3460 cm"1 (OH) und 1730 cm"1 (Ester
C = 0) ;
PMR (CDCl3) 3,93-4,27 (m, 3H 3,17 (d, 2H),
2,50 (d, 2H),
1,50-1,87 (m, 2H), 1,30 (bs, 12H),
0,93 (m, 3H).
Umwandlung des Octyl~4-jodo-3(R)-hydroxybutyrats (IX)
in L-Carnitin
OH
OC8H17
CH
N-CH3
CH3OH
I CH
L-Carnitin.
Zu einer Lösung von 1,593 g (IX) in 15 ml Methanol wurden 8 ml einer 25 %-igen wässrigen Trimethylaminlösung
gegeben. Die Mischung wurde 20 Stunden bei 270C gerührt. Die Lösungsmittel und das überschüssige
Trimethylamin wurden unter vermindertem Druck abgedampft, wobei ein halbkristalliner Feststoff (X)
zurückblieb. Dieser Rückstand wurde mit einer geringen Menge Ether zur Entfernung des Octanols gewaschen
und dann in Wasser gelöst und über eine Dowex 1-x4 (OH~ Form, 50-100 Mesh, Säulenvolumen 2,5 χ 15 cm)
Säule gegeben. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Beim Abdampfen des Lösungsmittels im
Vakuum aus den ersten 200 ml des Eluats erhielt man L-Carnitin als weissen kristallinen Feststoff (490 mg,
65 %-ige Ausbeute) CdJ^ -29,2° (c, 6,5, H3O).
Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Hexyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat,
wobei man Hexyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyral erhielt, welches dann in L-Carnitin überführt wurde.
Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Heptyl-4-chloro-3(R)-hydroxy-
BAD ORIGINAL
butyrat, wobei man Heptyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat
erhielt, welches dann in L-Carnitin überführt wurde.
Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch
unter Verwendung von Decyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat, wobei man Decyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat
erhielt, welches dann in L-Carnitin überführt wurde.
Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, wobei man jedoch Methyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat
(VIII) verwendete und Methyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat
erhielt, welches dann in das L-Carnitin überführt wurde.
Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, unter'Verwendung von Ethyl-4-chloro-3(R)-hydroxybutyrat,
wobei man Ethyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat erhielt,
welches dann in das L-Carnitin überführt wurde.
Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von n-Propyl-4-chloro.3(R) hydroxybutyrat,
unter Erhalt von n-Propyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat,
welches dann in das L-Carnitin überführt wurde.
Das Verfahren von Beispiel 370 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von n-Butyl-4-chloro-3(R) hydroxybutyrat,
welches n-Butyl-4-jodo-3(R)-hydroxybutyrat ergab, welches dann in das L-Carnitin überführt
wurde.
Typische Hefen, die das gewünschte Enzym bilden, werden in Tabelle 1 aufgelistet und typische Fungi
werden in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 1 (Hefen)
1. Candida lipolytica NRRL Y-1095
2. Candida pseudotropicalls NRRL Y-1264
3. Mvcoderma cerevisiae NRRL Y-1615
4. Torula lactosa NRRL Y-329
5. Geotrichum candidum NRRL Y-552
6. Hansenula anomala NRRL Y-366
7. . Hansenula subpelliculosa ■ NRRL Y-16S3
8. Pichia alcoholophila NRRL Y-2026
9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12,632
10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140
11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12,624
Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-72S3
13. Kloeckera corticis ATCC 20109
14. Cryptococus mascerans ATCC 24194
15. Rhodotorula sp. ATCC 20254
16. Candida albicans ATCC 752
17. Dipodascus albidus ATCC 12934
IS. Saccharomyces cerevisiae (commercial Red Star)
19. Rhodotorula rubra NRRL Y-1592
20. Oospora lactis ATCC 14318
NRRL - Northern Regional Research Lab. at Peoria, Illinois. ATCC - American Type Culture Collection at Rockville,
Maryland.
1. Gliocladium virens ATCC 13362
2. Caldariomyces fumago ATCC 16373
3. Linderina penniaopora ATCC 12442
4. Aspergillus ochraeeus NRRL 405
5. Trichoderma lignorum ATCC 8678
6. Heterocephalmn autantiacum ■ ATCC 16328
7. Entomophthora coronata NRRL 1912
8. Scopulariopsis constantini NRRL 1860
9. Zygorhynchus heterogamus ATCC 6743
10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 21S7
11. Rhizopus arrhizus NRRL 2286
12. Penicillium thomii NRRL 2077
13. Mucor hiemalis (-) NRRL 4088
14. Byssoehlamv3 nivea ATCC 12550
15. Penicillimn patulum NRRL 1952
16. Metarrhizium anisopliae ATCC 24942
17. Penicillium islandicum ATCC 10127
18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a
19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a
20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907
21. Aspergillus amsteiodami NRRL 90
22. Gliocladium roseum ATCC 10521
23. Aspergillus giganteus ATCC 10059
24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b
25. Penicilliura rocrueforti NRRL 849a
Claims (26)
1. / Verbindungen der allgemeinen Formel und mit 3(R)-Konfiguration
worin bedeuten:
X Chlor, Brom, Jod oder OH7
R einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Rest aus der Gruppe
Alkoxyreste mit 1 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
Alkylaminoreste mit etwa 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
5
5
Cycloalkoxyreste und Cycloalkylaminoreste mit
etwa 5 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen,
Phenoxy- und Phenylalkoxyreste mit 7 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen,
Phenylamino- und Phenylalkylaminoreste der Formeln
Y YZ
-N-0-A und -N-CH-0-A
worin Y und Z H, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl und
A H, CH3, Cl oder Br bedeuten. 20
2. Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R einen
geradkettigen Alkoyrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet.
3. Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R OC10H-,.
bedeutet.
4. Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R OCnH17
bedeutet.
5. Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R OC7H
bedeutet.
BAD ORIGINAL
6. Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R OCgH1.,
bedeutet.
7. Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R ein Niedrigalkylrest
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
8. Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R ein Phenoxyrest oder ein Phenylalkoxyrest, der mit einem
Niedrigalkyl, einem Halogen oder einer Nitrogruppe substituiert ist, bedeutet.
9. Verbindung gemäss Anspruch 8, worin R Benzyloxy und X Chlor oder Brom bedeuten.
10. Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R Phenylamino und X Chlor oder Brom bedeuten.
11. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven
^substituierten ß-Hydroxybuttersäurederivaten der allgemeinen Formel
worin bedeuten:
X Chlor, Brom, Jod oder OH,
R einen geradkettigen, verzweigten oder cyclisehen
Rest aus der Gruppe
Alkoxyreste mit 1 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
Alkylaminoreste mit etwa 5 bis etwa 15 Kohlenstoffatomen,
5
5
Cycloalkoxyreste und Cycloalkylaminoreste mit etwa 5 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen,
Phenoxy- und Phenylalkoxyreste mit 7 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen,
Phenylamino- und Phenylalkylaminoreste der Formeln
Y YZ
-N-0-A und -N-CH-0-A
worin Y und Z H, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl und
A H, CH3, Cl oder Br bedeuten,
aus den entsprechenden 2~~sukstituierten Acetoessigsäureestern
oder -amiden, dadurch gekennzeichnet , dass man die ^-substituierten
Acetessigsäureester oder -amide einer fermentativen enzymatischen Wirkung eines
Mikroorganismus, welcher L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase
(EC 1.1.1.35) ergibt, unterwirft,
und dass man das gewünschte optisch aktive ysubstituierte ß-Hydroxybuttersäurederivat gewinnt.
12. Verfahren gemäss Anspruch 11, zur Herstellung
BAD ORIGINAL
k ί\ J ö
von aktiven ^-substituierten 3(R)-Hydroxybuttersäurederivaten
der Formel und mit 3(R)
Konfiguration
Konfiguration
worin X und R die vorher angegebenen Bedeutungen haben» mit dem Proviso, dass wenn R einen
Alkoxyrest bedeutet, dieser 5 bis etwa 15 Kohlenstoff atome hat, dadurch gekennzeich
net, dass man Verbindungen der allgemeinen Formel
' OO
XGH2-C-CH2CR
worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, einer fermentativen enzymatischen Einwirkung
eines Mikroorganismus unterwirft, welcher L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
ergibt, und dass man das gewünschte optisch aktive 4-substituierte 3(R)-Hydroxybuttersäurederivat
aus dem fermentativen Reaktionsgemisch gewinnt.
13. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin der Mikroorganismus
ausgewählt ist aus der Klasse Ascomycetes.
14. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin der Mikroorganismus
ausgewählt ist aus den Ordnungen
Endomycetales, Mucorales, Moniliales oder Eurotiales.
15. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin der Mikro-Organismus
ausgewählt ist aus dem Genus Saccharomyces.
16. Verfahren gemäss Anspruch 15, worin der Mikroorganismus
Saccharomyces cerevisiae ist.
17. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin das 2^~suk~
stituierte Acetoessigsäurederivat das der fermentativen enzymatischen Umsetzung unterworfen wird,
^Chloro-acetoessigsäureocty!ester ist.
18. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin das ^"-substituierte
Acetoessigsäurederivat, das der fermentativen enzymatischen Umsetzung unterworfen
wird, r^Chloro-acetoessigsäurebenzylester ist.
19. Verfahren gemäss Anspruch 12, worin das Q--substituierte
Acetoessigsäurederivat, welches
der fermentativen enzymatischen Umsetzung unterworfen wird, )^-Chloro-acetoacetanilid ist.
25
20. Verfahren gemäss Anspruch 17, worin der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.
21. Verfahren gemäss Anspruch 18, worin der Mikro-Organismus Saccharomyces cerevisiae ist.
όό4 4Uo
22. Verfahren gemäss Anspruch 19, worin der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.
23. Verfahren gemäss Anspruch 11 zur Herstellung
von optisch aktiven ^-substituierten ■* (R) Hydroxybuttersäurederivaten der Formel und
mit 3(R)-Konfiguration
von optisch aktiven ^-substituierten ■* (R) Hydroxybuttersäurederivaten der Formel und
mit 3(R)-Konfiguration
worin X die vorher angegebene Bedeutung hat und R ein Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
ist, dadurch gekennzeichnet , dass . man Verbindungen der allgemeinen Formel
0 0
XCH2-C-CH2C-R
XCH2-C-CH2C-R
worin X und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, einer enzymatischen Einwirkung von L-ß-Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase
(EC 1.1.1.35) in reiner Form unterwirft und dass man das gewünschte, optisch aktive ^■*su^)St:'-tuierte 3(R)-Hydroxybuttersäurederivat
aus dem enzymatischen Reaktionsgemisch gewinnt.
24. Verfahren gemäss Anspruch 23, worin die L-ß-
Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (EC 1.1.1.35) in
reiner Form eine aus Schweineherzen isolierte
ist.
ist.
25. Verfahren zur Herstellung des inneren Salzes von L-Carnitin, dadurch gekennzeichnet,
dass man ein 4-substituiertes 3(R) Hydroxybuttersäurederivat gemäss Anspruch 1 nacheinander
mit Trimethylamin und Salzsäure umsetzt, das L-Carnitinchlorid extrahiert und das Chlorid
einem Ionenaustausch unterwirft und das innere Salz des L-Carnitins gewinnt.
26. Verfahren zur Herstellung eines 4-Jodo- oder 4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäurederivates, dadurch
gekennzeichnet , dass man ein 4-Chloro-3(R)-hydroxybuttersäurederivat
mit Natriumjodid oder Natriumbromid in einem Lösungsmittel bei einer Temperatur von 50 bis 1000C unter Bildung
des entsprechenden 4-Jodo- oder 4-Bromo-3(R) hydroxybuttersäurederivates
umsetzt.
\ 27./ Verfahren zur Herstellung des inneren Salzes von
"^-—'
L-Carnitin, dadurch gekennzeichnet ,
L-Carnitin, dadurch gekennzeichnet ,
dass man
(a) einen 4-Jodo- oder 4-Bromo-3(R)-hydroxybuttersäurealkylester
mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen mit Trimethylamin in Methanol oder Ethanol
unter Bildung eines L-Carnitinmethyl- oder -ethylestersalzes
umsetzt, und
(b) das L-Carnitinestersalz in das innere
Salz des L-Carnitins überführt.
BAD ORIGINAL
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/447,171 US4642290A (en) | 1982-12-06 | 1982-12-06 | Process for preparing a compound for use in the production of L-carnitine |
| US54495783A | 1983-10-24 | 1983-10-24 |
Publications (2)
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