NL8304190A

NL8304190A - Werkwijze ter bereiding van l-carnitine en daarbij toegepaste chemische tussenprodukten.

Info

Publication number: NL8304190A
Application number: NL8304190A
Authority: NL
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 1982-12-06
Filing date: 1983-12-06
Publication date: 1984-07-02
Also published as: NO834461L; SE8306714D0; DK559283D0; ES527807A0; GB2132614A; ES8601305A1; IL70352A0; DK559283A; IT1167289B; SE8306714L; GB8332359D0; IE56322B1; JPH0767674A; SE455501B; FR2537130A1; FR2537130B1; GR78767B; AU2175883A; DK163917C; KR840008165A

Description

N.0. 32.179 «. a ^ *

Werkwijze ter bereiding van L-camitine en daarbij toegepaste chemische tus s enprodukt en_____

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op werkwijzen ter bereiding van L-carnitine. In het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor de microbiologische reductie van /-gesubstitueerde acetoazijnzuuresters of -amiden tot hun respectievelijke 5 L-ft-hydroxy-/-gesubstitueerde boterzuurder!vaten, welke derivaten gemakkelijk kunnen worden omgezet tot L-carnitinechloride. I>e uitvinding heeft eveneens betrekking op bij de werkwijze toegepaste nieuwe chemische tussenprodukten.

Zoals bekend bevat carnitine (S-hydroxy-/-trimethylaminoboter-10 zuur) een centrum van asymmetrie en derhalve bestaat carnitine in twee stereoisomere vormen, de D- en de L-vormen.

L-carnitine is normaliter in het lichaam aanwezig, waar het functioneert om geactiveerde vrije vetzuren met lange keten door het mito-chondrische membraan te transporteren. Aangezien het mitochondrische 15 membraan impermeabel is voor acyl-CoA-derivaten, kunnen vrije vetzuren met lange keten alleen binnentreden, wanneer verestering met L-carnitine heeft plaatsgevonden. Pe dragerfunctie van L-carnitine wordt zowel door het transporteren van actieve vetzuren met lange keten van de plaatsen van hun bio-synthese, bijvoorbeeld de microsomen naar de mito-20 chondrieën, waar zij geoxydeerd worden als door het transporteren van acetyl-CoA uit de mitochondrieën, waar het wordt gevormd, naar de ex-tramicrochondrische plaatsen, waar de synthese van vetzuren met lange keten plaats heeft, bijvoorbeeld in de microsomen, waarin het acetyl-CoA gebruikt kan worden voor het synthetiseren van cholesterol en vet-25 zuren, uitgeoefend.

Terwijl is vastgesteld, dat het linksdraaiende lsomeer (L-carnitine) uitsluitend de biologische vorm is (D-carnitine is tot dusverre in zoogdierweefsels nooit bepaald), is het D,L-carnitine-racemaat gedurende een aantal jaren voor verschillende indicaties gebruikt. Bijvoor-30 beeld wordt D,L-carnitine in Europa verkocht als een eetlust stimulerend middel en vermeld is, dat het produkt een effect heeft op de groeisnelheid van kinderen; zie bijvoorbeeld Borniche c.s., Clinica Chemica Acta, (1960) 171-176 en Alexander c.s., "Protides in de Biological Fluids", 6de Colloquim, Brugge, 1958, 306-310. In het Ameri-35 kaanse octrooischrift 3.830.931 worden verbeteringen beschreven in de samentrekbaarheid van het hart en systolische ritme bij congestieve hartverlamming, die vaak verkregen kunnen worden door toediening van 6.94190 2 F "4 D,L-camitine. In het Amerikaanse octrooischrift 3.968.241 wordt het gebruik van D,L-carnitine bij hart-aritmieën beschreven. In het Amerikaanse octrooischrift 3.810.994 wordt het gebruik van D,L-carnitine bij de behandeling van corpulentie beschreven.

5 De laatste tijd is er echter een toenemende nadruk op het belang van toepassing van uitsluitend het linksdraaiende isomeer van carnitine voor ten minste sommige therapeutische toepassingen. Feitelijk is gebleken, dat D-carnitine een concurrende remmer van met carnitine verbonden enzymen is, zoals carnitine-acetyltransferase (CAT) en carniti-10 ne-palmityltransferase (PTC). Bovendien suggereert recent bewijsmateriaal, dat D-carnitine L-carnitine uit het hartweefsel kan afvoeren. Dientengevolge is het essentieel, dat L-carnitine uitsluitend wordt toegediend aan patiënten, die onder medische behandeling zijn voor hartziekten of voor het verlagen van de lipiden in het bloed.

15 Verscheidene werkwijzen zijn voorgesteld voor de produktie van carnitine op een industriële schaal. De chemische synthese van carnitine leidt echter onvermijdelijk tot een racemisch mengsel van de D- en L-isomeren. Dientengevolge dienen scheidingsmethoden te worden toegepast voor het verkrijgen van de gescheiden optische antipoden van het 20 racemaat. Deze scheidingsmethoden zijn echter omslachtig en kostbaar.

Het is een oogmerk van de onderhavige uitvinding L-camitine in een goede opbrengst te produceren door een combinatie van microbiologische en chemische processen.

Een oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van 25 een verbeterde werkwijze voor de synthese van L-carnitine uit gemakkelijk verkrijgbare grondstoffen van matige kostprijs.

Een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het beschrijven van de bereiding van nieuwe, geschikte optische actieve tussenprodukten voor de synthese van L-carnitine en de zouten of esters daarvan.

30 Een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van werkwijzen voor de bereiding van L-carnitine via de vervanging van de halogeengroep van een 4-halogeen-3CR)-hydroxybutyraat door de trime-thylaminegroep.

Nog een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het ver-35 schaffen van een werkwijze ter bereiding van 4-jood- of 4-broom-3(R)-hydroxybutyraten uit 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraten.

Deze en andere oogmerken van de uitvinding zullen duidelijker worden naarmate de beschrijving daarvan voortgaat.

De voordelen van de onderhavige uitvinding zullen voor de deskun-40 dige duidelijk zijn uit de volgende gedetailleerde beschrijving.

8 3 0 4 1-9 0- 3 •--, «V *

Dat de β-ketogroep op de plaats 3 in de /-gesubstitueerde aceto-azijnzuurderivaten door hydrogeneren over Pt/C gereduceerd kan worden is bekend {bijvoorbeeld Amerikaans octrooischrift 3.969.406). Echter is de hydroxyverbinding, die uit een dergelijke werkwijze resulteert, ra-5 cemisch. Daarentegen kan door toepassing van de fermentatieve werking van een microörganisme volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding, de hydrogenering van de oxogroep op de plaats 3 stereoselectief tot stand worden gebracht onder vorming van optisch actieve /-gesubstitueerde β-hydroxyboterzuurderivaten.

10 In het bijzonder wordt na een geschikte keuze (zoals hierna be schreven) van het aan de fermentatieve werking van de microörganismen volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding bloot te stellen substraat, de 3(R) of L epimere configuratie verkregen. Deze configuratie is vereiste voor de omzetting tot het natuurlijke L-camitine.

15 In ruime zin omvat de onderhavige uitvinding het gebruik van het

microbiële reductase enzym, Ι-β-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC

I. 1.1.35], om stereoselectief de hydrogenering van /-gesubstitueerde acetoazijnzuurderivaten, zoals hierna gedefinieerd, te katalyseren.

Derhalve omvat in overeenstemming met het ruimste aspect de werk-20 wijze van de onderhavige uitvinding voor de bereiding van optisch actieve /-gesubstitueerde β-hydroxyboterzuurderivaten met de formule II, waarin X gekozen is uit Cl, Br, J en OR en R een groep is met een rechte keten, vertakte keten of cyclische 25 configuratie gekozen uit de groep bestaande uit alkoxygroepen met 1 tot ongeveer 15 koolstofatomen, alkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 15 koolstofatomen, cycloalkoxygroepen en cycloalkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 12 koolstofatomen, 30 fenoxy- en fenylalkoxygroepen met 7 tot ongeveer 14 koolstofato men, fenylamino- en fenylalkylaminogroepen met de formules 12 en 13, waarin Y en Z gekozen zijn uit F, een alkylgroep met 1 tot ongeveer 8 koolstofatomen, fenyl of benzyl en A gekozen is uit H, CH-}, Cl en Br uit overeenkomstige /-gesubstitueerde aceto-35 azijnzuuresters of -amiden, het onderwerpen van de genoemde /-gesubstitueerde acetoazijnzuuresters of -amiden aan de fermentatieve enzymatische werking van een microörganisme, dat L-β-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] voortbrengt en het winnen van de gewenste optisch actieve /-gesubstitueerde-40 β-hydroxyboterzuurderivaten.

8304190 £ * 4

In het bijzonder omvat teneinde de optisch actieve /-gesubstitueerde 3(R)-hydroxyboterzuurderivaten met de formule 2 met de 3(R) configuratie te bereiden, de werkwijze het onderwerpen van verbindingen met de formule 1, waarin X en R de bovengenoemde betekenissen 5 hebben, op voorwaarde dat wanneer R een alkoxygroep is, deze 5 tot ongeveer 15 koolstofatomen bevat, aan de fermentatieve enzymatische werking van een microörganisme, dat L-0-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] voortbrengt en het winnen van de gewenste optisch actieve 4-gesubstitueerde 3(R)-hydroxyboterzuurderivaten uit het fermentatieve 10 reactiemengsel.

Gebleken is, dat elk microörganisme, dat het gewenste enzym voortbrengt, in staat is te functioneren als katalysator van de stereoselectieve reductie. Bijzonder geschikt zijn de microörganismen van de klasse Ascomycetes, de orde Endomycetales, Mucorales, Moniliales en 15 Eurotiales en het geslacht Saccharomyces. Bijzonder de voorkeur verdient Saccharomyces Cerevisiae.

Voor de bereiding van optisch actieve 4-gesubstitueerde 3(R)-hy-droxybutyraatesters, die 1-4 koolstofatomen bevatten, is het noodzakelijk gezuiverd L-6-hydroxy CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] te gebrui-20 ken, zoals dat van varkenshart, omdat het intacte microörganisme storende oxido-reductasen van tegengestelde configuratie bezit. Daarom brengt microbiële reductie van bijvoorbeeld 4-chlooracetoazijnzuures-ters met 1-4 koolstofatomen 4-chloor-3-hydroxybutyraten van onbevredigende optische zuiverheden voort.

25 Derhalve verschaft de onderhavige uitvinding eveneens een werkwij ze ter bereiding van optische actieve /-gesubstitueerde 3(R)-hydroxy-boterzuurderivaten met de formule 2 met de 3(R)-configuratie, waarin X Cl, Br, J of OH is en R een alkoxygroep met 1 tot 4 koolstofatomen is, die het onderwerpen van verbindingen met de formule 1, waarin X en R de 30 bovengenoemde betekenis hebben aan de enzymatische werking van L-8-hy-droxyacyl Coa dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in gezuiverde vorm en het winnen van de gewenste optisch actieve /-gesubstitueerde 3(R)-hydro-xyboterzuurderivaten uit het enzymatische reactiemengsel, omvat.

De onderhavige uitvinding verschaft derhalve verbindingen met de 35 formule 2 met de 3(R)-configuratie, waarin X gekozen is uit Cl, Br, J en OH en R een groep met een rechte keten, vertakte keten of cyclische-configuratie is gekozen uit de groep bestaande uit alkoxygroepen met 1 tot ongeveer 15 koolstofatomen, 40 alkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 15 koolstofatomen, <3 7 -Γ- f. 4 Λ Λ v v - } -5? y « « 5 cycloalkoxygroepen en cycloalkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 12 koolstofatomen, fenoxy- en fenylalkoxygroepen met 7 tot ongeveer 14 koolstofatomen, fenylamlno- en fenylalkylaminogroepen met de formules 12 en 5 13, waarin Y en Z gekozen zijn uit H, een alkylgroep met 1 tot on geveer 8 koolstofatomen, fenyl of benzyl en A gekozen is uit H, CH3, Cl en Br.

De optisch actieve /-gesubstitueerde-L-8-hydroxyboterzuurderiva-ten kunnen vervolgens met trimethylamine worden omgezet onder vorming 10 van het overeenkomstige /-trimethylammonium-L-S-hydroxyboterzuurderi-vaat, dat gemakkelijk tot L-carnitine kan worden omgezet door behandeling met water bevattende zuren. In figuur 1 wordt een schematische voorstelling van de reactietrappen van deze werkwijze gegeven.

Gebleken is, dat de reactie 1 ......) 2 gemakkelijker plaats heeft 15 wanneer X Cl is. Aangezien echter de daaropvolgende reactie 2->· 3 met betere opbrengsten plaats heeft, wanneer X jood of broom is, verdient het de voorkeur eerst het chloorderivaat te bereiden en dit vervolgens om te zetten tot het overeenkomstige jood- of broomderivaat.

De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op een verbe-20 terde werkwijze, die eerst omzetting van 4-chloor-3(R)-hydroxvbutyraat-ester tot de overeenkomstige 4-jood- of 4-broom-3(R)-hydroxybutyraten omvat. Fenvoudigheidsbalve zal hierna worden verwezen naar het joodde-rivaat. Het joodhydrine (formule 5) kan gemakkelijk met trimethylamine bij kamertemperatuur worden omgezet onder vorming van de verbinding met 25 de formule 6, die gemakkelijk tot L-carnitine wordt omgezet volgens het reactieschema met figuur 2.

Deze werkwijze, zoals voorgesteld door de vergelijking, is vatbaar voor talrijke variaties. Ongeacht welke vorm dan beschikbaar wordt gemaakt, wordt de ester met natriumjodide in een geschikt oplosmiddel zo-30 als 2-butanon, aceton, butanol, enz. omgezet. De voornaamste reactie, die bij dit punt in de reactie met natriumjodide is gewenst, is een vervangingsreactie, die het joodhydrine met de formule 5 vormt zonder het chirale centrum aan het aangrenzende koolstofatoom te storen. Voor deze reactie is ten minste voldoende natriumjodide vereist om alle 35 chloride uit de verbinding met de formule 2 te vervangen. In het algemeen gesproken wordt een geringe overmaat natriumjodide gebruikt.

De reactie van de verbinding met de formule 5 met trimethylamine kan bij een milde temperatuur (bijvoorbeeld 25°C) worden uitgevoerd (zie S.G. Boots en M.R. Boots, J. Pharm, Sci., 64, (1975) 1262 in ver-40 schillende oplosmiddelen zoals methanol of ethanol, die een overmaat ' ' Λ M 9 0 it * 6 trimethylamine bevatten. Het is opmerkenswaardig, dat afhankelijk van de gebruikte alcoholische oplossing, een esteruitwisseling plaats heeft. Wanneer bijvoorbeeld methanol als oplosmiddel wordt gebruikt, wordt de L-carnitine-methylester bij de reactie verkregen. Deze uitwis-5 selingsreactie is voordelig, omdat het bekend is dat L-carnitine-methylester direkt tot de vrije basevorm van L-carnitine kan worden omgezet door de ester door een ionenuitwisselingskolom (OH”) te leiden [zie E. Strack en J. Lorenz, J.Physiol. Chem. 344,(1966) 276].

Uit de beschrijving van de voorafgaande werkwijzen kan worden ge-10 zien, dat een aantal nieuwe en zeer bruikbare optische actieve tussen-produkten worden gevormd. In het bijzonder geschikt zijn de 4-jood-3(R)-hydroxyboterzuuralkylesters, waarin de alkylgroepen elk 6 tot 10 koolstofatomen bevatten. De octylester verdient in het bijzonder de voorkeur.

15 Microörganismen, die de gewenste oxido-reductase-activiteit heb ben, zijn in de microbiologische techniek goed bekend en elk van deze microörganismen kan worden toegepast voor de uitvoering van de werkwijze van de onderhavige uitvinding (zie. K. Kieslich, "Microbial Transformations of Non-Steroid Cyclic Compounds" (Georg Thierae 20 Publishers, Stuttgart, 1976)), waarbij elk van de geslachten van microörganismen, die daarin specifiek beschreven zijn, bijzonder geschikt zijn. Gemakkelijk verkrijgbare en goedkope microörganismen van het geslacht Saccharomyces, bijvoorbeeld brouwersgist, bakkersgist en wijn-bereidersgist (Saccharomyces vini) zijn gebleken het L-$-hydroxyacyl 25 CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] voort te brengen en zijn in hoge mate voordelig bij de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding. Het enzym is beschreven door S.J. Wakil en E.M. Barnes Jr. in Comprehensive Biochemistry 185 (1971) 57-104.

Het 4-gesuhstitueerde acetoazijnzuursubstraat kan opgenomen worden 30 in een voedingsmilieu van standaardsamenstelling, waarin dergelijke organismen worden gekweekt en de gebruikelijke fermentatie-omstandigheden kunnen vervolgens worden toegepast om de reductieve omlegging uit te voeren. Ook kan het actieve principe uit de groeiende kweek van het microörganisme worden verwijderd, bijvoorbeeld door lysis van de cellen 35 om de enzymen vrij te maken, of door het suspenderen van de overbijven-de cellen in een vers water bevattend systeem. Bij elk van deze technieken zal de S-ketogroep selectief gereduceerd worden, zolang het actieve enzym, voortgebracht door de microörganismen, in het milieu aanwezig is. Vanzelfsprekend zijn de temperatuur-, tijd- en drukomstandig-40 heden, waaronder het contact van het 4-gesubstitueerde acetoazijnzuur- 8304190 7 J * derivaat met het reductieve enzym wordt uitgevoerd, onderling afhankelijk, zoals voor de deskundige duidelijk zal zijn. Bijvoorbeeld zal bij zachte verwarming en bij atmosferische druk, de tijd, die vereist is om de reductieve omzetting te bewerkstelligen, minder zijn, dan wanneer de 5 omzetting bij kamertemperatuur onder overigens dezelfde omstandigheden verloopt. Vanzelfsprekend dienen noch de temperatuur, noch de druk, noch de tijd, zo hoog of lang te zijn, dat het resulteert in afbraak van het substraat. Wanneer een groeiende kweek van het organisme wordt gebruikt, dienen de procesomstandigheden eveneens voldoende zacht te 10 zijn, zodat het organisme niet wordt gedood, voordat het voldoende hy-drolytische enzymen heeft voortgebracht om de reactie te doen verlopen.

In het algemeen kan bij atmosferische druk de temperatuur van ongeveer 10°C tot ongeveer 35°C en de tijd van ongeveer 12 uren tot ongeveer 10 dagen variëren.

15 In de volgende voorbeelden, die ter toelichting van de onderhavige uitvinding zijn gegeven en niet zijn opgesteld om de omvang van de conclusies te beperken, werden de /-halogeenacetoazijnzuurderivaat substraten, die aan de microbiologische reductie worden onderworpen, bereid uit diketeen volgens de algemene methode van C.D. Hurd en H.L.

20 Abemethy (J. Am. Chem. Soc., 61_ (1940) 1147 voor de /-chlooraceto-azijnzuurderivaten en F. Chick, N.T.M. Wilsmore [J. Chem. Soc., 1978 (1910)] voor de /-broomazijnzuurderivaten via het reactieschema met figuur 3, waarin X Cl of Br is, Y H of alkyl is en R zoals hiervoor gedefinieerd is.

25 Ook kunnen desgewenst de /-halogeenacetoazijnzuurderivaten via een gebruikelijke Grignard-reactie uit )-halogeenazijnzuuresters bereid worden. Bijvoorbeeld werd y-chlooracetoazijnzuuroctylester gemakkelijk bereid door /-chlooroctylester met twee equivalenten magnesium in ether gedurende 48 uren onder terugvloeikoeling te verhitten.

30 Na verwijdering van het oplosmiddel werd de acetoazijnzuuroctylester in een opbrengst van ongeveer 70 % verkregen.

y-Fydroxyacetoazijnzuurderivaten werden uit de overeenkomstige y-broomacetoazijnzuurderivaten ervan bereid door in een dioxaan-wa-ter (1:1) oplossing, die CaCOg bevat bij 25°C gedurende 12 uren te 35 roeren.

Elk van de produkten, voortgebracht volgens de volgende voorbeelden, werd wat de structuur betreft geïdentificeerd door het gebruik van kernmagnetische resonantie (NMR), infraroodspectra en bewegelijkheid volgens dunne-laag-chromatografie. De optische zuiverheid en de absolu-40 te configuratie van de produkten werd vastgesteld door hun omzetting 8304190 8 * • » tot L-carnitine, alsmede door omzetting tot de esters ervan, die gemakkelijk geanalyseerd worden door NMR, spectrometrie en optische draaiing.

Voorbeeld I (gisten) 5 (+)4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuuroctylester werd bereid volgens de reactievergelijking van figuur 4.

A. Fermentatie. Oppervlaktegroei van een week oude schuin opgestelde agar van Candida keyfr. NRRL Y-329, gekweekt op agar met de volgende samenstelling: 10

Aantal gram agar 20 glucose 10 gistextract 2,5 15 K2Hpo4 1 gedestilleerd water, q.s. 1 liter (15 min. bij 140 kPa gesteriliseerd) werd in 5 ml van een 0,85-procents zoutoplossing gesuspendeerd. Porties 20 van 1 ml van deze suspensie werden gebruikt om een Erlenmeyerkolf van 250 ml (trap F-l), die 50 ml van het volgende milieu bevatte (milieu volgens Vogel), te inoculeren:

Aantal gram 25 gistextract 5 casaminozuren 5 dextrose 40

Na3“citraat-5 1/2 H20 3 g KH2P04 5 g 30 NH4NO3 2 g

CaCl2-2H20 0,1 g

MgSOA.7H20 0,2 g sporenelement oplossing 0,1 ml gedestilleerd water, q.s. 1 liter 35 pH 5,5 (15 min. bij 210 kPa gesteriliseerd).

8304130 Λ « 9

Sporenelementoplossing g/100 ml citroenzuur-lH20 5 • ZnSO4.7H20 7 5 Fe(NH4)2(S04)2.6F20 1

CuS04.5H20 0,25

MnS04.lH20 0,05 H3BO3 0,05

NaH2Mo04.2H20 0,05 10

De kolf werd bij 25°C gedurende 24 uren op een roterende schudin-rlchting (250 cycli/min. - straal 5 cm) geïncubeerd, waarna een overbrenging van 10 vol.% naar een andere Erlenmeyerkolf van 250 ml (trap F-2), die 50 ml milieu volgens Vogel bevatte, werd gedaan. Na 24 uren 15 incubatie op een roterende schudinrichting werden 150 mg y-chloorace-toazijnzuuroctylester in 0,1 ml 10-procents Tween 80 toegevoegd.

De kolf van de trap F-2 werd vervolgens nogeens 24 uren geïncubeerd onder de omstandigheden, die gebruikt werden bij de incubatie van de kolven van de trap F-l.

20 B. Isolering. Vierentwintig uren na de toevoeging van de /-chloor-acetoazijnzuuroctylester werden de cellen door centrifugeren verwijderd. De bovenstaande laag werd uitputtend met 50 ml ethylacetaat driemaal geëxtraheerd. Het ethylacetaat werd boven natriumsulfaat gedroogd en ingedampt onder vorming van een olieachtig residu (186 mg). Het re-25 sidu werd in 0,5 ml van de mobiele fase opgelost en toegevoegd aan een kolom (1 x 25 cm) silicagel (MN-kiezelgel 60). De kolom werd met Skelly B:ethylacetaat (8:1) geëlueerd en fracties van 14 ml werden verzameld. De fracties 6 en 7, die het gewenste produkt bevatten, werden verenigd en tot droog geconcentreerd onder vorming van 120 mg kristal-30 lijn residu. Herkristallisatie uit ethylacetaat-hexaan gaf 4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuur octylester [a]^3 + 13,3° (c, 4,45) (CHCI3); pmr G^CDC^) 0,88 [3H, tr. verdraaiend, CH3“(CH2)n~]; 1,28 [10H, s, -(CH2)5“I; 1,65 (2H, m, 35 -CH2-CH2-CH20-C-); 2,62 (2H, d, J - 6 Hz, -CH-CH^-COOR);

0 OH

3,22 (1H, br., -OH); 3,60 (2H, d, J = 6 Hz, 3304190 10 C1CH2-CH-R); 4,20 3H, -CH2“CH-CH2 en -0-0-¾¾) .

OH OH 0 5 Analyse berekend voor 0^2^23^3^1: C 57,47, H 9,25.

Gevonden: C 57,52, H 9,07. [BLO Rf - 0,5, silicagelplaat volgens Brinkmann, 0,25 cm EM; Skelly Btethylacetaat (5:1)].

Voorbeeld II

Overblijvende cellen. Honderd gram verse bakkergist uit de handel 10 Saccharomyces cerevisiae (Red Star) werden in 250 ml leidingwater gesuspendeerd, waaraan 10 g sucrose en 3,6 g y-cblooracetoazijnzuur oc-tylester werden toegevoegd. Nadat de inhoud bij 25°C gedurende 24 uren op een roterende schudinrichting (250 cycli/minuut - straal 5 cm) was ge’lncubeerd, werden nogeens 10 g sucrose aan de kolf toegevoegd en werd 15 de reactie nogeens 24 uren voortgezet. Vervolgens werden de cellen door filtratie door een kussen van Celite verwijderd. De cellen werden met water en ethylacetaat gewassen. De wasvloeistoffen werden verenigd met het filtrtaat en uitputtend met ethylacetaat geëxtraheerd. De ethylace-taatlaag werd boven MgS04 gedroogd en ingedampt onder vorming van een 20 olieachtig residu, dat aan een chromatögrafische behandeling werd onderworpen over een silicagelkolom onder vorming van 2,52 g 4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuur octylester als een vaste stof met laag smeltpunt; [o]23 + 13,2° (C, 4,0, CÏÏCI3).

Voorbeeld III

25 (+)4-chloor-3(R)hydroxyboterzuur benzylester werd volgens de reactie-vergelijking met figuur 5 bereid.

A. Fermentatie. Oppervlaktegroei van een één week oude schuin opgestelde agar van Gliocladium virens ATCC 13362, gekweekt op agar met de volgende samenstelling: 30

Aantal gram moutextract 20 glucose 20 pepton 1 35 agar 20 gedestilleerd water, q.s. 1 liter (15 min. bij 140 kPa gesteriliseerd) werd in 5 ml van een 0,85-procents zoutoplossing gesuspendeerd. Porties 40 van 1 ml van deze suspensie werden gebruikt om een Erlenmeyerkolf van 5 3 0 413 0 . -* * 11 250 ml (trap F-l), die 50 ml van het volgende milieu bevatte (sojaboon-dextrose-milieu) te inoculeren: sojameel 5 g 5 dextrose 20 g STaCl 5 g KR2HP04 5 g gist 5 g water 1 1 10 pH op 7,0 ingesteld

Autoclaaf gedurende 15 minuten bij 105 kPa.

De kolf werd gedurende 24 uren bij 25°C op een roterende schudin-richting (250 cycli/min. - straal 5 cm) gelncubeerd, waarna een over-15 brenging van 10 vol.% naar een andere Erlenmeyerkolf van 250 ml (trap F-2), die 50 ml sojaboon-dextrose-milieu bevatte, werd uitgevoerd. Na een incubatie van 24 uren op een roterende schudinrichting werden 150 mg /-chlooracetoazijnzuur benzylester in 0,5 ml 10-procents Tween 80 toegevoegd. De kolf van de trap F-2 werd vervolgens nogeens 24 uren on-20 der de omstandigheden, die gebruikt werden bij de incubatie van de kolven van de trap F-l, gelncubeerd.

B. Isolering. Vierentwintig uren na de toevoeging van de X-chloor-acetoazijnzuur benzylester werd het mycelium door filtratie verwijderd.

Het filtraat werd uitputtend driemaal met 50 ml ethylacetaat geëxtra-25 heerd. De ethylacetaatlaag werd boven MgS04 gedroogd en onder verminderde druk geconcentreerd onder vorming van een residu (160 mg). Het residu werd aan een chromatografische behandeling onderworpen over een silicagel (MN-kiezelgel 60) kolom (1 x 25 cm). De kolom werd geëlueerd met Skelly B en ethylacetaat (10:1) en fracties van 12 ml werden verza-30 meld. De fracties 11-16, die het gewenste produkt bevatten, werden verenigd en tot droog geconcentreerd onder vorming van 115 mg 4-chloor- 23 3(R)-hydroxyboterzuur benzylester, [a]^ + 8,7° (c, 5,26; CHCI3); pmr (i5"CDCl3) 2,65 (2H, 8304 1 0.0 12 d, J *» 6 Hz, -CH-CH2COOR), 3,20 (1H, br, -OH); 3,54 (2H, d, J - 6 Hz,

OH

CI-CH2CH); 4,20 (1H, m, -CH2-CH-CH2-), 5,12 (2F, s,

5 OH OH

-C-O-CH^C^He;); 7,31 (5F, s, vijf aromatische protonen.

H

Anal, ber. voor C11H13O3CI: C 57,77, H 5,73.

10 Gevonden: C 57,64, H 5,67. [DLC silicagel EM Brinkmann plaat, 0,25 cm, = 0,43, Skelly B-ethylacetaat (5:1)].

Voorbeelden IV-XXIII

De methode van voorbeeld I werd herhaald met elk van de in tabel A vermelde organismen, behalve dat /-chlooracetoazijnzuur octylester 15 bij een concentratie van 1 mg/ml werd toegevoegd. Omzetting tot het gewenste produkt (+)4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuur octylester werd verkregen. De methoden van deze voorbeelden werden herhaald door continu het substraat aan de gist-milieus toe te voegen. De gewichtsverhouding substraat/gist was ongeveer 1:1,5 met een uitstekende omzetting tot het 20 gewenste produkt.

Voorbeelden mV-XlVIII

De methode van voorbeeld III werd herhaald met elk van de in tabel B vermelde organismen, behalve dat /-chlooracetoazijnzuur octylester (1 mg/ml) werd gebruikt. Omzetting tot de gewenste verbinding 25 (+)4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuur octylester werd verkregen.

Voorbeelden XLIX-LXVIII

De methode van voorbeeld I werd herhaald met elk van de in tabel A vermelde organismen, behalve dat /-chlooracetoazijnzuur benzylester (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste 30 produkt (+)4-chloor3(R)-hydroxyboterzuur benzylester werd verkregen. Voorbeelden LXIX-XCIII

De methode van voorbeeld III werd herhaald met elk van de in tabel B vermelde organismen, onder toepassing van /-chlooracetoazijnzuur benzylester (1 mg/ml) als substraat. Omzetting tot de gewenste verbin-35 ding (+)4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuur benzylester werd verkregen. Voorbeelden XCIV

(+)4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuuranilide werd bereid volgens de methode van voorbeeld II, behalve dat 4-chlooracetoaceetanilide bij een concentratie van 1 mg/ml werd gebruikt (zie figuur 6) als het substraat 40 voor de omzetting tot het gewenste optisch actieve produkt, smpt.

8304190 13 110-111°C [α]23 + 17,5°

O

(c, 3,0, CHC13; pmr (é CD3CCD3) 2,67 (2F, d, J» 6 Hz, 5 -HOHCH2-CONHR), 3,66 (2H, d, J s 6 Hz, CICH2CFOH-R), 4,43 flF, m, ~CH2“CHOH-CF2-), 7,03-7,44 (3F, m, aromatische protonen, meta en para), 7,69 (2H, d, J = Hz, aromatische protonen, ortho), 9,24 (1H, br, -C-N-0). Anal, her, voor C].o^12^2^: 0 56,21, H 5,66 0 10 Gevonden: C 56,16, F 5,47.

Voorbeelden XCV-CXIV

De methode van voorbeeld I werd herhaald met elk van de in tabel A vermelde organismen, behalve dat /-chlooracetoaceetanilide werd ge-15 bruikt bij een concentratie van 1 mg/ml. In alle gevallen werd omzetting tot het gewenste produkt, (+)4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuuranilide werd verkregen.

Voorbeelden CXCV-CXXXIX

De methode van voorbeeld III werd herhaald met de in tabel B ver-20 melde organismen, /-chlooracetoaceetanilide werd toegevoegd bij een concentratie van 1 mg/ml. In deze gevallen werd omzetting tot het gewenste (+)4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuuranilide bereikt.

Voorbeelden CXL-CLIX

De methode van voorbeeld I werd herhaald met de in tabel A vermel-25 de organismen, behalve dat /-broomacetoazijnzuur octylester (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste produkt, (+)4-broom-3(R)-hydroxyboterzuur octylester werd verkregen.

Voorbeelden CLX-CLXXXIV

De methode van voorbeeld III werd herhaald met met de in tabel B 30 vermelde organismen, behalve dat /-broomacetoazijnzuur octylester (1 mg/ml) werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste produkt, (+)4-broom-3(R)-hydroxyboterzuur octylester werd verkregen.

Voorbeelden CLXXXV-CCIV

De methode van voorbeeld I werd herhaald met de in tabel A vermel-35 de organismen, behalve dat /-broomacetoazijnzuur benzylester 1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste produkt, (+)4-broom-3(R)-hydroxyboterzuurbenzylester werd verkregen.

Voorbeelden CCV-CCXXIX

De methode van voorbeeld III werd herhaald met de in tabel B ver-40 melde organismen, behalve dgt /-broomacetoazijnzuur benzylester (1 83CΛ 1S0 14 mg/ml) werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste produkt, (+)4-broom-3(R)-hydroxyboterzuurbenzylester werd verkregen.

Voorbeelden CCXXX-CCXLIX

De methode van voorbeeld I werd herhaald met de in tabel A vermel-5 de organismen, behalve dat ^-broomaceetanilide (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste (+)4-broom-3(R)-hydro-xyboterzuuranilide werd verkregen.

Voorbeelden CCL-CCLXXIV

De methode van voorbeeld III werd herhaald met de in tabel B ver-10 melde organismen, behalve dat /-broomaceetanilide (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste (+)4-broom-3(R)-hy-droxyboterzuuranilide werd verkregen.

Voorbeelden CCLXXV-CCXOIV

De methode van voorbeeld I werd herhaald met de in tabel A vermel-15 de organismen, behalve dat Jf-hydroxyacetoazijnzuur octylester (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot de gewenste 4-hy-droxy-3(R)-hydroxyboterzuur octylester werd verkregen.

Voorbeelden CCCXCV-CCCXIX

De methode van voorbeeld III werd herhaald met de in tabel B ver-20 melde organismen, behalve dat Jf-hydroxyacetoazijnzuur octylester (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot de gewenste 4-hy-droxy-3(R)-hydroxyboterzuur octylester werd verkregen.

Voorbeelden CCCXX-CCCXXXIX

De methode van voorbeeld I werd hethaald met de in tabel A vermel-25 de organismen, behalve dat /-hydroxyacetoaceetanilide (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot het gewenste 4-hydroxy-3(R)-hydroxyboterzuuranilide werd verkregen.

Voorbeelden CCCXL-CCCLXIV

De methode van voorbeeld III werd herhaald met de in tabel B ver-30 melde organismen, behalve dat y-hydroxyacetoaceetanilide (1 mg/ml) als het substraat werd gebruikt. Omzetting tot het 4-hydroxy-3(R)-hy-droxyboterzuuranilide werd verkregen.

Voorbeeld CCCLXV

Methyl-4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat (verbinding met formule 8) 35 (zie de reactievergelijking met figuur 7).

100 mg methyl-4-chlooracetoacetaat (verbinding met de formule 7) werden geïncubeerd met 29 eenheden varkenshart (EC 1.1.1.35), B-hydro-xyacyl CoA dehydrogenase (Sigma, H4626) en 1,36 g NADH (Sigma, 90 %) in 30 ml van een 0,1 molaire natriumfosfaatbuffer, pH 6,5.

40 Na 30 uren bij 25°C werd het reactiemengsel viermaal met 30 ml

8 3 0 4 1 ^ Q

15 ] ethylacetaat geëxtraheerd. Be organische laag werd boven natriumsulfaat gedroogd en werd onder een verminderde druk tot droog ingedampt. Het residu (90 mg) werd aan een chromatografische behandeling onderworpen over een silicagel (12 g) kolom (1,3 x 34 cm). De kolom werd geëlueerd 5 met een oplosmiddelsysteem bestaande uit Skelly B-ethylacetaat (8:1) en fracties van 20 ml werden verzameld. De fracties 9-11, die het gewenste methyl-4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat (verbinding met de formule 8) bevatten, zoals bleek uit DLC, fct]^ + 23,5° (c, 5,2 CHCI3) werden verenigd.

10 Voorbeeld CCCLXVI

De methode van voorbeeld CCCLXV werd herhaald onder toepassing van ethyl-4-chlooracetoacetaat als het substraat onder vorming van ethyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat [®1^ +22,7° (c, 4,7 CÏÏC13).

15 Voorbeeld CCCLXVII

De methode van voorbeeld CCCLXV werd herhaald onder toepassing van n-propyl 4-chlooracetoacetaat als het substraat onder vorming van 23 n-propyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat f a]^ + 21,5° (c, 5,0, CHCI3).

20 Voorbeeld CCCLXVIII

De methode van voorbeeld CCCLXV werd herhaald onder toepassing van n-butyl 4-chlooracetoacetaat als het substraat onder vorming van n-bu- 23 tyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat [a]^ + 20,1° (c, 3,1, (CHCI3).

25 Algemene methode voor de omzetting van 4-halogeen-3(R)-hydroxyboter-zuuresters en -amiden tot L-carnitine.

Voorbeeld CCCLXIX

Een mengsel van 1,5 g 4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuur octylester, 3 ml methanol en 3 ml van een 25 gew.procents oplossing van trimethylami-30 ne in water werd ongeveer 2 uren op 80-90°C verwarmd. De oplosmiddelen en de overmaat trimethylamine werden onder een verminderde druk tot droog ingedampt onder vorming van 1,8 g onzuiver residu. Het onzuivere produkt (1 g) werd gedurende 1,5 uren in 7 ml van een 10-procents HC1— oplossing op 80-90°C verwarmd. Na verdamping van de oplosmiddelen onder 35 een verminderde druk, werd het onzuivere produkt tweemaal met 10 ml absolute ethanol geëxtraheerd en werd de ethanol onder een verminderde druk verdampt. Het kristallijne residu werd in een kleine hoeveelheid ethanol opgelost en het L-carnitine-chloride werd door de toevoeging van ether neergeslagen in een goede opbrengst (320 mg), smpt. 142° 40 (ontl.); [a] - 23,7° (c, 4,5, H2o).

8 3 0 4 ;: o 16

Het L-carnitine-chloride kan gemakkelijk worden omgezet tot een inwendig zout van L-carnitine, dat farmaceutisch de voorkeur verdient, door een ionenuitwisselingsmiddel, zoals in de techniek bekend is. Voorbeeld CCCLXX

5 Octyl 4-jood-3(R)-hydroxybutyraat (verbinding met formule 9) (zie de reactievergelijking met figuur 8)

Een mengsel van 1,426 g octyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat (verbinding met de formule 2) en 1,2 g watervrij NaJ in 15 ml methylethyl-keton werd gedurende 24 uren onder terugvloeikoeling verhit. Het meng-10 sel werd op een roterende verdamper ingedampt en met 100 ml ether en 50 ml water omgezet. De organische fase werd afgescheiden en met 150 ml van een 10-procents oplossing van natriumthiosulfaat en 150 ml zoutoplossing gewassen en boven watervrij natriumsulfaat gedroogd. Het oplosmiddel werd onder een verminderde druk ingedampt onder vorming van 15 1,762 g van de verbinding met formule 9 als een lichtgele olie; IR

(dunne film) 3460 cm-^· (OH) en 1730 cm-·'· (ester 0=0); PMR (CDCI3) - 3,93-4,27 (m, 3H), 3,17 (d, 2H), 2,50 (d, 2H), 1,50-1,87 (m, 2H), 1,30 (bs, 12H), 0,93 (m, 3H).

Omzetting van octyl 4-jood-3(R)-hydroxybutyraat (verbinding met de 20 formule 9) tot L-carnitine (zie de reactievergelijking met figuur 9).

Aan een oplossing van 1,593 g van de verbinding met formule 9 in 15 ml methanol werden 8 ml van een 25-procents oplossing van triëthyl-amine in water toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 20 uren bij 27°C geroerd. De oplosmiddelen en de overmaat trimethylamine werden onder 25 een verminderde druk verdampt onder vorming van een half-kristallijne vaste stof met de formule 10. Dit residu werd met kleine hoeveelheden ether gewassen om de octanol te verwijderen en werd vervolgens in water opgelost en over een Dowex l-x4 kolom geleid [OH- vorm - deeltjesgrootte 0,15-0,3 mm, kolomvolume (2,5 x 15 cm). De kolom werd met ge-30 destilleerd water gewassen. Verwijdering van het oplosmiddel onder verminderde druk uit de eerste 200 ml van het eluaat gaf L-carnitine als een witte kristallijne vaste stof (490 mg, opbrengst 65 %) [ojp3 - 29,2° (c, 6,5 H20).

Voorbeeld CCCLXXI

35 De methode van voorbeeld CCCLXX werd herhaald onder toepassing van

hexyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat onder vorming van hexyl 4-jood-3(R)-hydroxybutyraat, dat vervolgens tot L-camitine werd omgezet. Voorbeeld CCCLXXII

De methode van voorbeeld CCCLXX werd herhaald onder toepassing van 40 heptyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat onder vorming van heptyl 4-jood- 8 1 Π Λ 4 « Λ U J J > j j nj 17 3(R)-hydroxybutyraat, dat vervolgens tot L-carnitine werd omgezet. Voorbeeld CCCLmil

De methode van voorbeeld CCCLXX werd herhaald onder toepassing van decyl 4-chloor-3(F)-hydroxybutyraat onder vorming van decyl 4-jood-5 3(R)-hydroxybutyraat, dat vervolgens tot L-carnitine werd omgezet. Voorbeeld GCCLXXIV

De methode van voorbeeld CCCLXX werd herhaald onder toepassing van methyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat (verbinding met de formule 8) onder vorming van methyl 4-jood-3(R)-hydroxybutyraat, dat vervolgens tot 10 L-carnitine werd omgezet.

Voorbeeld CCCLXXV

De methode van voorbeeld CCCLXX werd herhaald onder toepassing van ethyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat onder vorming van ethyl 4-jood-3(R)-hydroxybutyraat, dat vervolgens tot L-carnitine werd omgezet.

15 Voorbeeld CCCLXXVI

De methode van voorbeeld CCCLXX werd herhaald onder toepassing van n-propyl 4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat onder vorming van n-propyl 4-jood-3(R)-hydroxybutyraat, dat vervolgens tot L-carnitine werd omgezet.

20 Voorbeeld CCCLXXVII

De methode van voorbeeld CCCLXX werd herhaald onder toepassing van n-butyl-4-chloor-3(R)-hydroxybutyraat onder vorming van n-butyl 4-jood-3(R)-hydroxybutyraat, dat vervolgens tot L-carnitine werd omgezet.

25 Representatieve gisten, die het gewenste enzym voortbrengen, zijn

In tabel A vermeld en representatieve fungi zijn in tabel B vermeld.

8304190 18

Tabel A (gisten) 1. Candida lipolytica NRRL Y-1095 2. Candida pseudotropicalis NRRL Y-1264 3. Mycoderma cerevisiae NRRL Y-1615 4. Torula lactosa NRRL Y-328 5. Geotrichum candidum NRRL Y-552 6. Hansenula anomala NRRL Y-366 7. Hansenula subpelliculosa NRRL Y-1683 8. Pichia alcoholphila NRRL Y-2026 9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12.632 10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140 11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12.624 12. Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253 13. Kloeckera corticis ATCC 20109 14. Cryptococus mascerans ATCC 24194 15. Rhodotorula sp. ATCC 20254 16. Candida albicans ATCC 752 17. Dipodascus albidus ATCC 12934 18. Saccharomyces cerevisiae (Red Star uit de handel) 19. Rhodotornula rubra NRRL Y-1592 20. Oospora lactis ATCC 14318 NRRL - Northern Regional Research Lab. te Peoria, Illinois.

ATCC - American Type Culture Collection te Rockville, Maryland.

* 8304190 19

Tabel B (fungi) 1. Gliocladium virens ATCC 13362 2. Caldariomyces Fumago ATCC 16373 3. Linderina pennissopora ATCC 12442 4. Aspergillus ochraceus NRRL 405 5. Trichoderma lignorum ATCC 8678 6. Heterocephalum autantiacum ATCC 16328 7. Entomophthora coronata NRRL 1912 8. Scopulariopsis constantini NRRL 1860 9. Zygorhynchus heterogamus ATCC 6743 10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 2157 11. Rhizopus arrhizus NRRL 2286 12. Penicillium thomii NRRL 2077 13. Mucor hiemalis (-) NRRL 4088 14. Byssochlamys nivea ATCC 12550 15. Penicillium patulum NRRL 1952 16. Metarrhizium anisopliae ATCC 24942 17. Penicillium islandicum ATCC 10127 18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a 19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a 20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907 21. Aspergillus amstelodami NRRL 90 22. Gliocladium roseum ATCC 10521 23. Aspergillus giganteus ATCC 10059 24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b 25. Penicillium roquefort! NRRL 849a 8 3 0 4 ! 9 0

Claims

1. Verbindingen met de formule 2 met de 3(R) configuratie, waarin X gekozen is uit Cl, Br, J en OH en R een groep met een rechte keten, vertakte keten of cyclische confi-5 guratie is, gekozen uit de groep bestaande uit alkoxygroepen met 1 tot ongeveer 15 koolstofatomen, alkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 15 koolstofatomen, cycloalkoxygroepen en cycloalkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 12 koolstofatomen, 10 fenoxy- en fenylalkoxygroepen met 7 tot ongeveer 14 koolstofato men, fenylamino- en fenylalkylaminogroepen met de formules 12 en 13, waarin Y en Z gekozen zijn uit H, een alkylgroep met 1 tot ongeveer 8 koolstofatomen, fenyl of benzyl en A gekozen is uit H, CH3, Cl en Pr.

2. Verbinding volgens conclusie 1, waarin R een alkoxygroep met rechte keten met 1 tot 10 koolstofatomen is.

3. Verbinding volgens conclusie 2, waarin R OC^qF^j is.

4. Verbinding volgens conclusie 2, waarin R OCgHjj is.

5. Verbinding volgens conclusie 2, waarin R OCyH^^ is.

6. Verbinding volgens conclusie 2, waarin R OCgFjj is.

7. Verbinding volgens conclusie 2, waarin R een klein-alkyloxy-groep met 1 tot 4 koolstofatomen is.

8. G 4 1 9 0

8. Verbinding volgens conclusie 1, waarin R gekozen is uit fenoxy en fenylalkoxy gesubstitueerd met een klein-alkyl-, halogeen- of nitro- 25 groep.

9. Verbinding volgens conclusie 8, waarin R benzyloxy is en X gekozen is uit Cl en Br.

10. Verbinding volgens conclusie 1, waarin R fenylamino is en X gekozen is uit Cl en Br.

11. Werkwijze ter bereiding van optisch actieve /-gesubstitueer de 8-hydroxyboterzuurderivaten met de formule 11, waarin X gekozen is uit Cl, Br, J en OH en R een groep met rechte keten, vertakte keten of cyclische configuratie is, gekozen uit de groep bestaande uit 35 alkoxygroepen met 1 tot ongeveer 15 koolstofatomen, alkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 15 koolstofatomen, cycloalkoxygroepen en cycloalkylaminogroepen met ongeveer 5 tot ongeveer 12 koolstofatomen, fenoxy- en fenylalkoxygroepen met 7 tot ongeveer 14 koolstofato-40 men, fenylamino- en fenylalkylaminogroepen met de fqrmules 12 en " f; Λ 1 0 A V V 'J “ï I j U Γ > = Λ 13, waarin Υ en Ζ gekozen zijn uit Η, een alkylgroep met 1 tot on-veer 8 koolstofatomen, fenyl of benzyl en A gekozen is uit H, CHg, Cl en Br. uit de overeenkomstige /-gesubstitueerde acetoazijnzuuresters 5 of -amiden, met het kenmerk, dat men /-gesubstitueerde aceto azi jnzuuresters of -amiden onderwerpt aan de fermentatieve enzymatische werking van een microörganisme, dat L-8-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [FC 1.1.1.35] voortbrengt en de gewenste optische actieve /-gesubstitueerde β-hydroxyboterzuurderivaten wint.

12. Werkwijze volgens conclusie 11 ter bereiding van optisch ac tieve /-gesubstitueerde 3(R)-hydroxyboterzuurderivaten met de formule 2 met de 3(R)-configuratie, waarin X en R de bovengenoemde betekenissen hebben, met dien verstande, dat wanneer R een alkoxygroep is, deze 5 tot ongeveer 15 koolstofatomen bevat, met het kenmerk, dat men een ver- 15 binding met de formule 1, waarin X en R de bovengenoemde betekenissen hebben, onderwerpt aan de fermentatieve enzymatische werking van een microorganisme, dat L-fJ-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] voortbrengt en de gewenste optische actieve 4-gesubstitueerde 3(R)-hy-droxyboterzuurderivaten uit het fermentatieve reactiemengsel wint.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het mi croörganisme gekozen is uit de klasse Ascomycetes.

14. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het microörganisme gekozen is uit de ordes Endomycetales, Mucorales, Honiliales of Eurotiales.

15. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het mi croörganisme gekozen is uit het geslacht Saccharomyces.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat het microörganisme Saccharomyces cerevisiae is.

17. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het 30 /-gesubstitueerde acetoazijnzuurderivaat, dat aan de fermentatieve enzymatische werking wordt onderworpen, /-chlooracetoazijnzuur octyl-ester is.

18. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het /-gesubstitueerde acetoazijnzuurderivaat, dat aan de fermentatieve 35 enzymatische werking wordt onderworpen, /-chlooracetoazijnzuur ben-zylester is.

19. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het /-gesubstitueerde acetoazijnzuurderivaat, dat aan de fermentatieve enzymatische werking wordt onderworpen, /-chlooracetoaceetanilide 40 is.

20. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het mi-croörganisme Saccharomyces cerevisiae is.

21. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het mi-croörganisme Saccharomyces cerevisiae is.

22. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat het mi- croorganisme Saccharomyces cerevisiae is.

23. Werkwijze volgens conclusie 11 voor de bereiding van optisch actieve /-gesubstitueerde 3(R)hydroxyboterzuurderivaten met de formule 2 met de 3(R) configuratie, waarin X de bovengenoemde betekenissen 10 heeft en R een alkoxygroep met 1 tot 4 koolstofatomen is, met het kenmerk, dat men verbindingen met de formule 1, waarin X en R de bovengenoemde betekenis hebben, onderwerpt aan de enzymatische werking van L-0-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in gezuiverde vorm en de gewenste optisch actieve /-gesubstitueerde 3(R)-hydroxyboterzuur- 15 derivaten uit het enzymatische reactiemengsel wint.

24. Werkwijze volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat het genoemde L-p-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in gezuiverde vorm het produkt is, dat uit varkenshart is geïsoleerd.

25. Werkwijze ter bereiding van een inwendig zout van L-carnitine, ^ 20 met het kenmerk, dat men een 4-gesubstitueerd 3(R)-hydroxyboterzuurde- rivaat volgens conclusie 1 achtereenvolgens met trimethylamine en waterstof chloride omzet, het L-camitinechloride extraheert en dit chloride aan een ionenuitwisseling onderwerpt en het inwendige zout van L-carnitine wint.

26. Werkwijze ter bereiding van een 4-jood- of 4-broom-3(R)-hydroxyboterzuurderivaat, met het kenmerk, dat men een 4-chloor-3(R)-hydroxyboterzuurderivaat met natriumjodide of natriumbromide in een oplosmiddel bij een temperatuur van 50°C tot 100°C omzet onder vorming van het overeenkomstige 4-jood- of 30 4-broom-3(R)-hydroxyboterzuurderivaat.

27. Werkwijze ter bereiding van een inwendig zout van L-carnitine, met het kenmerk, dat men a) een 4-jood- of 4-broom-3(R)-hydroxybutyraat alkylester, waar bij de alkylgroep 1-10 koolstofatomen bevat, met trimethylamine in 35 methanol of ethanol omzet onder vorming van een L-carnitine me thyl- of ethylesterzout en b) dit L-carnitine-esterzout tot een inwendig zout van L-carnitine omzet. 40 -l-H- Μ· l"l"H l· 8 3 0 4 1 9 o