JP2024029002A - テルペン化合物の生体触媒的な製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】新規なタイプのホスファターゼ酵素を適用することによるテルペン化合物の生体触媒的な製造方法を提供する。【解決手段】ファルネソールあるいはゲラニルゲラニオールであってよい、テルペンアルコール化合物の生体触媒的な製造方法であって、（１）前記テルペン化合物の対応するテルペニル二リン酸前駆体を、テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、前記テルペンアルコールを生成するステップと、（２）ステップ（１）の前記テルペンアルコールを任意選択で単離するステップとを含み、前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの二リン酸除去酵素メンバーから選択される、方法とする。【選択図】図１

Description

本明細書において提供されるのは、新規なタイプのホスファターゼ酵素を適用することによりテルペン化合物の生体触媒的な製造方法である。本方法は、例えばコパロールおよびラブデンジオール、ならびにそれらの誘導体のようなテルペン化合物の完全生化学合成を可能にし、このテルペン化合物は、例えばアンブロックスまたはγ－アンブロールなどの香料成分の生産にとって価値ある中間体となる。同じく提供されるのは、このような化合物および新規なホスファターゼ酵素ならびにそれに由来する突然変異体および変異体の作製のための新規な完全生化学多段階プロセスである。
発明の背景
テルペンは、ほとんどの生物（微生物、動物および植物）に見出される。これらの化合物は、イソプレン単位と呼ばれる５個の炭素単位で構成されており、その構造中に存在するこれらの単位の数により分類される。したがって、モノテルペン、セスキテルペンおよびジテルペンは、それぞれ１０個、１５個および２０個の炭素原子を含むテルペンである。例えば、セスキテルペンは、植物界において広く見出される。多くのセスキテルペン分子が、それらのフレーバー特性およびフレグランス特性ならびにそれらの美容効果、薬効および抗微生物効果で知られている。多数の炭化水素セスキテルペンおよびセスキテルペノイドが同定されている。
テルペンの生合成産生には、テルペンシンターゼと呼ばれる酵素が必要である。この酵素は、非環状テルペン前駆体を１種または複数種のテルペン生成物に変換する。特に、ジテルペンシンターゼは、前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の環化によりジテルペンを産生する。ＧＧＰＰの環化はしばしば、２つの連続する酵素反応において組合せで作用する２種の酵素ポリペプチド、Ｉ型およびＩＩ型ジテルペンシンターゼを必要とする。ＩＩ型ジテルペンシンターゼは、ＧＧＰＰの末端二重結合のプロトン付加により開始されるＧＧＰＰの環化／転位を触媒して、環式ジテルペン二リン酸中間体をもたらす。次いで、この中間体が、イオン化で開始される環化を触媒するＩ型ジテルペンシンターゼによりさらに変換される。
ジテルペンシンターゼは、植物中および他の生物中に存在し、ＧＧＰＰなどの基質を使用するが、それらは異なる生成物プロファイルを有する。ジテルペンシンターゼをコードする遺伝子およびｃＤＮＡはクローニングされており、対応する組換え酵素が特徴付けられている。
テルペン二リン酸中間体からの、特に、ジテルペンであるコパリル二リン酸（ＣＰＰ）またはラブデンジオール二リン酸（ＬＰＰ）のような環式テルペン二リン酸中間体からの二リン酸基の、ある特異的もしくは優先的な切断または除去を触媒する酵素はこれまで記述されていない。前記切断を実施するために、リン酸エステル結合の化学切断が必要であろう。
本発明により解決すべき課題は、テルペニル二リン酸結合の酵素切断において適用可能であり、かつテルペンアルコールの生体触媒的な製造を可能にするホスファターゼの酵素活性を示すポリペプチドを提供することである。
発明の概要
上述の課題は、驚くべきことに、大きいタンパク質チロシンホスファターゼファミリーの二リン酸除去酵素のサブグループから選択される、テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を示す新しいクラスの酵素を提供することにより解決することができた。基質としてのテルペニル二リン酸、特にＣＰＰおよびＬＰＰのようなこうした複雑な二環式化合物を利用するホスファターゼとしてのタンパク質チロシンホスファターゼファミリーのこのような酵素の適用性は、先行技術に記述されていない。
このアプローチは、Ａｍｂｒｏｘなどの非常に価値のある香料成分を製造するためのビルディングブロックであるコパロールおよびラブデンジオールなどのテルペン中間体を産生する、費用対効果がより高い方法の提供を可能にする。
本発明のいくつかの実施形態では、さらに、対応する二リン酸前駆体からのファルネソールまたはゲラニルゲラニオールのような非環式テルペンアルコールの生体触媒的な製造が実現される。
前記生体触媒的ステップは、いくつかの他の先行または連続する酵素ステップと合わせることができ、かつそれらのそれぞれの前駆体から価値のある複雑なテルペン分子を完全酵素合成するための生体触媒的多段階プロセスの提供を可能にすることができる。
コパロールの生合成経路を示す図である。１，ファルネシル－ピロリン酸シンターゼ。２，ゲラニルゲラニル－ピロリン酸シンターゼ。３，コパリル－ピロリン酸シンターゼ。４，ホスファターゼ。 Ｅ．コリ（E.coli）細胞により産生されたコパロールのＧＣ－ＭＳ分析のクロマトグラムである。上のクロマトグラム：メバロン酸経路の組換え酵素、ＣＰＰシンターゼおよびＡｓｐＷｅＴＰＰを産生するＥ．コリ（E.coli）細胞。中央のクロマトグラム：メバロン酸経路の組換え酵素、ＣＰＰシンターゼおよびＴａｌＶｅＴＰＰを産生するＥ．コリ（E.coli）細胞。下のクロマトグラム：メバロン酸経路の組換え酵素およびＣＰＰシンターゼを産生するＥ．コリ（E.coli）細胞を含む対照。 Ｅ．コリ（E.coli）細胞により産生されたコパロール（図１ａ中の保持時間１６．７のピーク）の質量スペクトル（Ａ）および基準コパロールの質量スペクトル（Ｂ）を示す図である。 ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰを使用した、操作されたＥ．コリ（E.coli）細胞内のコパロール産生を示す図である。 ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１を使用した、操作されたＥ．コリ（E.coli）細胞内のコパロール産生を示す図である。 ラブデンジオールの生合成経路を示す図である。１，ファルネシル－ピロリン酸シンターゼ。２，ゲラニルゲラニル－ピロリン酸シンターゼ。３，ラブデンジオール－ピロリン酸シンターゼ。４，ホスファターゼ。 ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１を使用した、操作されたＥ．コリ（E.coli）細胞内のラブデンジオール産生を示す図である。 Ｅ．コリ（E.coli）細胞により産生されたラブデンジオールのＧＣ－ＭＳ分析のクロマトグラムである。上のクロマトグラム：メバロン酸経路の組換え酵素、ＬＰＰシンターゼおよびＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１を産生するＥ．コリ（E.coli）細胞。下のクロマトグラム：メバロン酸経路の組換え酵素およびＬＰＰシンターゼを産生するＥ．コリ（E.coli）細胞を含む対照。 Ｅ．コリ（E.coli）細胞により産生されたラブデンジオール（図６ａ中の保持時間１８．２のピーク）の質量スペクトル（Ａ）および基準コパロールの質量スペクトル（Ｂ）を示す図である。 ファルネソールおよびゲラニルゲラニオールの生合成経路を示す図である。１，ファルネシル－ピロリン酸シンターゼ。２，ゲラニルゲラニル－ピロリン酸シンターゼ。３，ホスファターゼ。 ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１を使用した、操作されたＥ．コリ（E.coli）細胞内のファルネソール産生およびゲラニルゲラニオール産生を示す図である。 ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１を使用した、操作されたＥ．コリ（E.coli）細胞内のファルネソール、ゲラニルゲラニオール、コパロールおよびラブデジオールの産生の比較を示す図である。値は、各化合物について１００に設定した、産生された最大量に対する相対値である。 プラスミドＣＰＯＬ－２およびＬＯＨ－２で形質転換された、操作されたＥ．コリ（E.coli）細胞内のテルペン化合物の産生、ならびに組換えホスファターゼを発現させずにＬＰＰおよびＣＰＰを産生する細胞との比較を示す図である。 操作された細胞内のコパラールの産生を示す図である。この図は、Ｅ．コリ（E.coli）細胞により産生されたコパラールのＧＣ－ＭＳ分析のクロマトグラムを示す。メバロン酸経路からコパリル－二リン酸を産生し、かつタンパク質チロシンホスファターゼおよびＡＤＨ酵素を発現させるように細胞を操作した。細胞内で発現された異なるＡＤＨが各クロマトグラムに示されている。 メバロン酸経路の組換え酵素、ＣＰＰシンターゼ、タンパク質チロシンホスファターゼおよびＡＤＨを産生するように操作された細胞内のファルネソールからのファルネサールの生成を示すＧＣＭＳクロマトグラムである。 メバロン酸経路の組換え酵素、ＬＰＰシンターゼ、タンパク質チロシンホスファターゼおよびＡＤＨを産生するように操作されたＥ．コリ（E.coli）細胞内のラブデンジオール酸化生成物の産生のＧＣＭＳ分析を示す図である。細胞内で発現された異なるＡＤＨが各クロマトグラムに示されている。ラブデンジオールおよびその酸化生成物のピークはそれぞれラベル１および２である。 メバロン酸経路酵素をコードする遺伝子の染色体組込みおよび２つの合成遺伝子オペロンの組織化の概略図である。ｍｖａＫ１、Ｓ．ニューモニエ（S.pneumoniae）由来の、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子；ｍｖａＤ、Ｓ．ニューモニエ（S.pneumoniae）由来の、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子；ｍｖａＫ２、Ｓ．ニューモニエ（S.pneumoniae）由来の、ホスホメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子；ｆｎｉ Ｓ．ニューモニエ（S.pneumoniae）由来の、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子；ｍｖａＡ、Ｓ．アウレウス（S.aureus）由来の、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子；ｍｖａＳ Ｓ．アウレウス（S.aureus）由来の、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子；ａｔｏＢ Ｅ．コリ（E.coli）由来の、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子；ＥＲＧ２０、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）由来の、ＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子。 テルペニル－二リン酸ホスファターゼのアミノ酸配列と推定コンセンサス配列のアラインメントを示す図である。保存残基は、黒色の背景に白色の文字のものである。 テルペニル－二リン酸ホスファターゼの保存モチーフ領域のアミノ酸配列と推定コンセンサス配列のアラインメントを示す図である。保存残基は、黒色の背景に白色の文字のものである。 １８，１３－エポキシ－ラブダン－１５－アールの生合成経路を示す図である。破線の矢印は、複数の酵素ステップを表す。１，ホスファターゼ；２，アルコールデヒドロゲナーゼ。以下のステップは非酵素的転位反応である。 ＧＧＰＰシンターゼＣｒｔＥ、ＣＰＰシンターゼＳｍＣＰＳ２、ＣＰＰホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰおよび以下のアルコールデヒドロゲナーゼ：ＡｚＴｏｌＡＤＨ１、ＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１、ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１またはＳＣＨ２４－ＡＤＨ１のうちの１つを発現させる改変Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）株を使用して産生されたコパロールおよびコパラールのＧＣ－ＭＳ分析を示す図である。
使用される略語
ＡＤＨ アルコールデヒドロゲナーゼ
ｂｐ 塩基対
ｋｂ キロベース
ＣＰＰ コパリル二リン酸
ＣＰＳ コパリル二リン酸シンターゼ
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ
ＤＭＡＰＰ ジメチルアリル二リン酸
ＤＴＴ ジチオトレイトール
ＦＰＰ ファルネシル二リン酸
ＧＰＰ ゲラニル二リン酸
ＧＧＰＰ ゲラニルゲラニル二リン酸
ＧＧＰＳ ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ
ＧＣ ガスクロマトグラフ
ＩＰＰ イソペンテニル二リン酸
ＬＰＰ ラブデンジオール二リン酸
ＬＰＳ ラブデンジオール二リン酸シンターゼ
ＭＳ 質量分析計／質量分析法
ＭＶＡ メバロン酸
ＰＰ 二リン酸、ピロリン酸
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ リボ核酸
ｍＲＮＡ メッセンジャーリボ核酸
ｍｉＲＮＡ マイクロＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ 低分子干渉ＲＮＡ
ｒＲＮＡ リボソームＲＮＡ
ｔＲＮＡ 転移ＲＮＡ
ＴＰＰ テルペニル二リン酸
定義
本明細書において使用される「二リン酸」および「ピロリン酸」は同義語である。
「テルペニル」は、Ｃ５ビルディングブロックイソプレンに由来する、特に１つまたは複数のこのようなビルディングブロックを含む非環式および環式の化学的ヒドロカルビル残基を指す。
「二環式テルペン」または二環式テルペニル」または「二環式ジテルペン」または二環式ジテルペニル」は、その構造内に２つの炭素環式環、好ましくは２つの炭素環式縮合環を含むテルペン化合物またはテルペニル残基に関する。
「ヒドロカルビル」残基は、炭素原子および水素原子から実質的に構成される化学基であり、環式（例えば単環式または多環式）または非環式の、線状または分枝状の、飽和または不飽和の部分であってよい。この残基は、２個、３個、４個または５個のような１個を超える炭素原子を含むが、特に５～３０個、５～２５個、５～２０個、５～１５個または５～１０個の炭素原子などの５個以上の炭素原子を含む。前記ヒドロカルビル基は非置換であってよく、または１～５個のような少なくとも１個の、好ましくは０個、１個または２個の置換基を持っていてよい。置換基は、ＯまたはＮのような１種のヘテロ原子を含む。好ましくは、置換基は、－ＯＨ、Ｃ＝Ｏ、または－ＣＯＯＨから独立して選択される。最も好ましくは、前記置換基は－ＯＨである。
「単環式または多環式のヒドロカルビル残基」は、１個、２個または３個の任意選択で置換された飽和または不飽和の縮合（環状の）または非縮合炭化水素環基（または「炭素環式」基）を含む。各環は、互いに独立して３～８個、特に５～７個、とりわけ６個の環炭素原子を含んでよい。単環式残基の例として、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、およびシクロオクチル基など、３～７個の環炭素原子を有する炭素環式基である「シクロアルキル」基；ならびに対応する「シクロアルケニル」基に言及することができる。シクロアルケニル」（または「一または多不飽和シクロアルキル」）は、特に、５～８個、好ましくは最大６個の炭素環員を有する単環式の、一または多不飽和炭素環式基、例えば一不飽和シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基およびシクロオクテニル基を表す。
多環式残基の例として、多環式のシクロアルキル環またはシクロアルケニル環を形成するために、例えば環状の、１個、２個または３個のこのようなシクロアルキルおよび／またはシクロアルケニルが互いに結合されている基に言及することができる。非限定的な例として、環状の、２個の６員炭素環から構成される二環式デカリニル残基に言及することができる。
このような単環式または多環式のヒドロカルビル残基内の置換基の数は、１～１０個、特に１～５個の置換基で様々であってよい。このような環式残基の適した置換基は、低級アルキル、低級アルケニル、アルキリデン、アルケニリデン、またはＯもしくはＮのような１種のヘテロ原子を含む残基、例えば－ＯＨもしくは－ＣＯＯＨのような残基から選択される。特に、置換基は、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、メチルおよびメチリデンから独立して選択される。
「低級アルキル」または「短鎖アルキル」という用語は、１～４個、１～５個、１～６個、または１～７個、特に１～４個の炭素原子を有する直鎖または分枝状の飽和炭化水素基を表す。例として以下に言及することができる：メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル、ｎ－ブチル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、１，１－ジメチルエチル、ｎ－ペンチル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、１，１－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１－メチルペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１－エチル－１－メチルプロピルおよび１－エチル－２－メチルプロピル；ならびにｎ－ヘプチル、および単一または複数分枝したその類似体。
「短鎖アルケニル」または「低級アルケニル」は、２～４個、２～６個、または２～７個の炭素原子および任意の位置の１個の二重結合を有する一または多不飽和の、特に一不飽和の、直鎖または分枝状の炭化水素基、例えば、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－メチルエテニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－メチル－１－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－メチル－２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－メチル－１－ブテニル、２－メチル－１－ブテニル、３－メチル－１－ブテニル、１－メチル－２－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、３－メチル－２－ブテニル、１－メチル－３－ブテニル、２－メチル－３－ブテニル、３－メチル－３－ブテニル、１，１－ジメチル－２－プロペニル、１，２－ジメチル－１－プロペニル、１，２－ジメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－プロペニル、１－エチル－２－プロペニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニル、１－メチル－１－ペンテニル、２－メチル－１－ペンテニル、３－メチル－１－ペンテニル、４－メチル－１－ペンテニル、１－メチル－２－ペンテニル、２－メチル－２－ペンテニル、３－メチル－２－ペンテニル、４－メチル－２－ペンテニル、１－メチル－３－ペンテニル、２－メチル－３－ペンテニル、３－メチル－３－ペンテニル、４－メチル－３－ペンテニル、１－メチル－４－ペンテニル、２－メチル－４－ペンテニル、３－メチル－４－ペンテニル、４－メチル－４－ペンテニル、１，１－ジメチル－２－ブテニル、１，１－ジメチル－３－ブテニル、１，２－ジメチル－１－ブテニル、１，２－ジメチル－２－ブテニル、１，２－ジメチル－３－ブテニル、１，３－ジメチル－１－ブテニル、１，３－ジメチル－２－ブテニル、１，３－ジメチル－３－ブテニル、２，２－ジメチル－３－ブテニル、２，３－ジメチル－１－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－３－ブテニル、３，３－ジメチル－１－ブテニル、３，３－ジメチル－２－ブテニル、１－エチル－１－ブテニル、１－エチル－２－ブテニル、１－エチル－３－ブテニル、２－エチル－１－ブテニル、２－エチル－２－ブテニル、２－エチル－３－ブテニル、１，１，２－トリメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－メチル－２－プロペニル、１－エチル－２－メチル－１－プロペニルおよび１－エチル－２－メチル－２－プロペニルなどのＣ２－Ｃ６－アルケニルを表す。
「アルキリデン」基は、二重結合を介して分子の本体に結合された直鎖または分枝状の炭化水素置換基を表す。この置換基は、１～６個の炭素原子を含む。このような「Ｃ１－Ｃ６－アルキリデン」の例として、メチリデン（＝ＣＨ２）、エチリデン（＝ＣＨ－ＣＨ２）、ｎ－プロピリデン、ｎ－ブチリデン、ｎ－ペンチリデン、ｎ－ヘキシリデンおよび例えばイソ－プロピリデンのようなそれらの構造異性体に言及することができる。
「アルケニリデン」は、２個を超える炭素原子を有する上述のアルキリデンの一不飽和類似体を表し、「Ｃ３－Ｃ６－アルケニリデン」と呼ばれることがある。ｎ－プロペニリデン、ｎ－ブテニリデン、ｎ－ペンテニリデン、およびｎ－ヘキセニリデンに例として言及することができる。
不飽和環式基は、１個または複数個の、例えば１個、２個または３個のようなＣ＝Ｃ結合を含んでよく、かつ芳香族、または特に非芳香族である。
環式残基の特定の例は、式Ｃｙｃ－Ａ－［式中、Ａは、直鎖または分枝状のＣ１－Ｃ４－アルキレン架橋、特にメチレンを表し、Ｃｙｃは、Ｃ１－Ｃ４－アルキル、Ｃ１－Ｃ４－アルキリデン、Ｃ２－Ｃ４－アルケニル、オキソ、ヒドロキシ、またはアミノ、特にメチルのようなＣ１－Ｃ４－アルキル、およびメチリデンのようなＣ１－Ｃ４－アルキリデンから独立して選択される１～１０個、１～５個の置換基で任意選択で置換された、環当たり５～７個、特に６個の環原子を含む、単環式または多環式の、特に二環式の、飽和または不飽和のヒドロカルビル残基、特に二環式の環状ヒドロカルビル残基を表す］基である。Ｃｙｃ－Ａは、特に式ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃ
Figure 2024029002000002
 の基を表す。
このような残基を含む典型例の化合物は、以下の式（１）のものであり、特にコパロールおよびラブデンジオールならびにそれらの立体異性体である。
Ｃ１－Ｃ４－アルキルの非限定的な例は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル、ｎ－ブチル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、１，１－ジメチルエチルである
Ｃ１－Ｃ４－アルキリデンの非限定的な例は、メチリデン（＝ＣＨ２）、エチリデン、（＝ＣＨ－ＣＨ２）、ｎ－プロピリデン、ｎ－ブチリデン、およびそれらの構造異性体である。
Ｃ２－Ｃ４－アルケニルの非限定的な例は、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－メチルエテニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－メチル－１－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－メチル－２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニルである。
Ｃ１－Ｃ４－アルキレンの非限定的な例は、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）２－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－である。
本明細書に記載の標的化合物の「前駆体」分子は、好ましくは前記前駆体分子上で少なくとも１つの構造変化をもたらす適したポリペプチドの酵素作用を通じて、前記標的化合物に変換される。例えば、（例えば「テルペニル二リン酸前駆体」のような）「二リン酸前駆体」が、二リン酸部分の酵素的除去を介して、例えばホスファターゼ酵素による一リン酸基または二リン酸基の除去により、（例えばテルペンアルコールのような）前記標的化合物に変換される。例えば、（非環式テルペニル前駆体」のような）「非環式前駆体」が、シクラーゼ酵素またはシンターゼ酵素の作用を通じて、このような酵素の特定の酵素機構に関係なく、１つまたは複数のステップで（環式テルペン化合物のような）環式標的分子に変換されてよい。
「テルペンシンターゼ」は、テルペン前駆体分子を、特に加工された標的テルペンアルコールのようなそれぞれのテルペン標的分子に変換するポリペプチドを指す。このようなテルペン前駆体分子の非限定的な例は、例えば、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル－ピロリン酸（ＧＧＰＰ）、またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）との混合物から選択される非環式化合物である。得られたテルペンが二リン酸部分を含む場合、このシンターゼは「テルペニル二リン酸シンターゼ」と呼ばれる
「テルペニル二リン酸シンターゼ」または「テルペニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド」または「テルペニル二リン酸シンターゼタンパク質」または「テルペニル二リン酸を産生する能力を有する」という用語は、非環状テルペンピロリン酸、特にＧＰＰ、ＦＰＰもしくはＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰと一緒のＩＰＰから出発する、その立体異性体またはその混合物のいずれかの形態のテルペニル二リン酸の合成を触媒することができるポリペプチドに関する。テルペニル二リン酸は、唯一の生成物であってよく、またはテルペニルリン酸類の混合物の一部であってよい。前記混合物は、テルペニル一リン酸および／またはテルペンアルコールを含んでよい。上記の定義は、「二環式ジテルペニル二リン酸シンターゼ」の群にも適用され、これは、ＣＰＰまたはＬＰＰのような二環式テルペニル二リン酸を産生する。
このような「テルペニル二リン酸シンターゼ」酵素または「ジテルペニル二リン酸シンターゼ」酵素の例として、コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＰＳ）に言及することができる。コパリル－二リン酸は、唯一の生成物であってよく、またはコパリルリン酸類の混合物の一部であってよい。前記混合物は、コパリル－一リン酸および／または他のテルペニル二リン酸を含んでよい。
このような「テルペニル二リン酸シンターゼ」酵素または「ジテルペニル二リン酸シンターゼ」酵素の例として、ラブデンジオール二リン酸シンターゼ（ＬＰＳ）に言及することができる。ラブデンジオール二リン酸は、唯一の生成物であってよく、またはラブデンジオールリン酸類の混合物の一部であってよい。前記混合物は、ラブデンジオール一リン酸および／またはテルペニル二リン酸を含んでよい。
（ＣＰＳまたはＬＰＳ活性のような）「テルペニル二リン酸シンターゼ活性」または「ジテルペニル二リン酸シンターゼ」は、本明細書において以下に記載の「標準条件」下で決定される：これらの活性は、１～１００μＭ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５～５０μＭ、特に３０～４０μＭの範囲内の初期濃度で加えられた、または宿主細胞により内因的に産生された参照基質、この場合特にＧＧＰＰの存在下、約２５～４０℃、好ましくは２５～３２℃のような約２０～４５℃の範囲内の温度で、６～１１、好ましくは７～９の範囲内のｐＨを有する、好ましくは緩衝された、培養培地中または反応媒体中で、組換えテルペニル二リン酸シンターゼ発現宿主細胞、破壊テルペニル二リン酸シンターゼ発現細胞、これらまたは濃縮もしくは精製されたテルペニル二リン酸シンターゼ酵素の画分を使用して決定することができる。テルペニル二リン酸を生成する変換反応は、１０分～５時間、好ましくは約１～２時間実施される。内因性ホスファターゼが存在しない場合、シンターゼにより生成されたテルペニル二リン酸をそれぞれのテルペンアルコールに変換するために、１種または複数種の外因性ホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼが反応混合物に加えられる。次いで、例えば酢酸エチルのような有機溶媒で抽出後、テルペンアルコールを従来の方法で測定することができる。
「タンパク質チロシンホスファターゼ」という用語は、タンパク質上のリン酸化チロシン残基からリン酸基を除去することが一般に公知である酵素の群を表す。本明細書に記載の前記ファミリーのある特定のサブグループは、リン酸化テルペン分子を脱リン酸化するのに有用な酵素である。
テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーとして、特にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１３３５０を有するＹ＿ホスファターゼ３ファミリーのメンバーとして同定される。Ｐｆａｍタンパク質ファミリーシグネチャーデータベースに対して、特にＰｆａｍ ３２．０データベースリリース（２０１８年９月）において、例えば以下のウェブサイトを使用して、一致がないかポリペプチドを走査することができる：
ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ＃ｔａｂｖｉｅｗ＝ｔａｂ０、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｈｍｍｅｒ／ｓｅａｒｃｈ／ｈｍｍｓｃａｎまたは
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｆａ／ｐｆａｍｓｃａｎ／。
「Ｐｆａｍ」という用語は、Ｐｆａｍコンソーシアムにより維持されており、以下を含むいくつかのスポンサードワールドワイドウェブサイトにおいて利用可能なタンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの大規模なコレクションを指す：ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ （Ｗｅｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ， Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）； ｐｆａｍ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／ （Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）およびｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／ （Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ， Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。Ｐｆａｍの最新リリースは、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅｓに基づくＰｆａｍ ３２．０（２０１８年９月）である（El-Gebali S. et al, 2019, Nucleic Acids Res. 47, Database issue D427-D432）。Ｐｆａｍドメインおよびファミリーは、多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて同定される。Ｐｆａｍ－Ａファミリーまたはドメインアサインメントは、タンパク質ファミリーの代表的なメンバーおよびシードアラインメントに基づくプロファイル隠れマルコフモデルを用いる、精選されたシードアラインメントにより生成される高品質のアサインメントである。（特に指定のない限り、Ｐｆａｍドメインまたはファミリーとの照会されたタンパク質の一致は、Ｐｆａｍ－Ａの一致である）次いで、このファミリーに属するすべての同定された配列を使用して、このファミリーの完全なアラインメントを自動的に生成する（Sonnhammer (1998) Nucleic Acids Research 26, 320-322; Bateman (2000) Nucleic Acids Research 26, 263-266; Bateman (2004) Nucleic Acids Research 32, Database Issue, D138-D141; Finn (2006) Nucleic Acids Research Database Issue 34, D247-251; Finn (2010) Nucleic Acids Research Database Issue 38, D211-222）。例えば上記のウェブサイトのいずれかを使用して、Ｐｆａｍデータベースにアクセスすることにより、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３、またはより新しいバージョン、ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／）を使用してＨＭＭに対してタンパク質配列を照会することができる。照会されたタンパク質がｐｆａｍファミリー内にある（またはある特定のＰｆａｍドメインを有する）ことを確認する有意な一致は、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上である一致である。期待値（ｅ値）も、照会されたタンパク質がＰｆａｍに含まれるかの基準として、または照会されたタンパク質が、ある特定のＰｆａｍドメインを有するかどうか判断するための基準として使用することができる（１．０よりもはるかに小さい、例えば０．１未満またはより小さい、小さいｅ値の場合）。
「Ｅ値」（期待値）とは、単なる偶然でこの値に等しいまたはこの値よりも良いスコアを有するであろうと期待されるヒット数である。これは、信頼できる予測を与える良好なＥ値は１よりもはるかに小さいことを意味する。およそ１のＥ値は、偶然に期待される値である。したがって、Ｅ値が小さいほど、ドメインの検索はより具体的になるであろう。正数のみ許容される。（Ｐｆａｍによる定義））「テルペニル二リン酸ホスファターゼ」または「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド」または「テルペニル二リン酸ホスファターゼタンパク質」または「テルペンアルコールを産生する能力を有する」という用語は、二リン酸部分または一リン酸部分の除去を（ある特定の酵素機構に関係なく）触媒して、脱リン酸化化合物、特に前記テルペニル部分の対応するアルコール化合物を生成することができるポリペプチドに関する。テルペンアルコールは、その立体異性体のいずれかで、またはその混合物として生成物中に存在してよい。テルペンアルコールは、唯一の生成物であってよく、または例えば前記テルペニル二リン酸のそれぞれの（例えば非環式）テルペニル二リン酸前駆体の脱リン酸化類似体のような他のテルペン化合物との混合物の一部であってよい。上記の定義は、「二環式テルペニル二リン酸ホスファターゼ」の群にも適用され、これは、コパロールまたはラブデンジオールのような二環式テルペンアルコールを産生する。上述のホスファターゼのそれぞれは「二リン酸除去酵素」を例示する。
このような「テルペニル二リン酸ホスファターゼ」酵素の例として、コパリル二リン酸ホスファターゼ（ＣＰＰホスファターゼ）に言及することができる。コパロールは、唯一の生成物であってよく、または例えばファルネソールおよび／またはゲラニルゲラニオールのような脱リン酸化前駆体との混合物の一部であってよく、かつ／あるいはこのようなアルコールまたは他の環式もしくは非環式のジテルペンのエステルまたはアルデヒドのような反応混合物中の酵素副活性の結果生じる副生成物との混合物の一部であってよい。
このような「テルペニル二リン酸ホスファターゼ」酵素の別の例として、ラブデンジオール二リン酸ホスファターゼ（ＬＰＰホスファターゼ）に言及することができる。ラブデンジオールは、唯一の生成物であってよく、または例えばファルネソールおよび／またはゲラニルゲラニオールのような脱リン酸化前駆体との混合物の一部であってよく、かつ／あるいはこのようなアルコールまたは他の環式もしくは非環式のジテルペンのエステルまたはアルデヒドのような反応混合物中の酵素副活性の結果生じる副生成物との混合物の一部であってよい。
（ＣＰＰまたはＬＰＰホスファターゼ活性のような）「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性」は、本明細書において以下に記載の「標準条件」下で決定される：これらの活性は、１～１００μＭ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５～５０μＭ、特に３０～４０μＭの範囲内の初期濃度で加えられた、または宿主細胞により内因的に産生された参照基質、この場合例えばＣＰＰまたはＬＰＰの存在下、約２５～４０℃、好ましくは２５～３２℃のような約２０～４５℃の範囲内の温度で、６～１１、好ましくは７～９の範囲内のｐＨを有する、好ましくは緩衝された、培養培地中または反応媒体中で、組換えテルペニル二リン酸ホスファターゼ発現宿主細胞、破壊テルペニル二リン酸ホスファターゼ発現細胞、これらの、または濃縮もしくは精製されたテルペニル二リン酸ホスファターゼ酵素の画分を使用して決定することができる。テルペニル二リン酸を生成する変換反応は、１０分～５時間、好ましくは約１～２時間実施される。次いで、例えば酢酸エチルのような有機溶媒で抽出後、テルペンアルコールを従来の方法で測定することができる。
適した標準条件の特定の例は、以下の実験の部から理解することができる。
本発明の文脈における「アルコールデヒドロゲナーゼ」（ＡＤＨ）は、補因子としてのＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下でアルコールを対応するアルデヒドに酸化する能力を有するポリペプチドを指す。このような酵素は、Ｅ．Ｃ．ファミリー１．１．１．１（ＮＡＤ＋依存性）または１．１．１．２（ＮＡＤＰ＋依存性）のメンバーである。とりわけ、本発明のＡＤＨは、コパロールをコパラールに、かつ／またはラブデンジオールをそれぞれのアルデヒドに酸化する能力を有する。
本明細書において使用される「コパロール」は、（Ｅ）－５－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチリデン－３，４，４ａ，６，７，８－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ナフタレン－１－イル］－３－メチルペンタ－２－エン－１－オール；ＣＡＳ登録番号１０３９５－４３－４を指す。
本明細書において使用される「コパラール」は、（２Ｅ）－３－メチル－５－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレンデカヒドロ－１－ナフタレニル］－２－ペンテナールを指す。
本明細書において使用される「ラブデンジオール」は、（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）－１－［（Ｅ）－５－ヒドロキシ－３－メチルペンタ－３－エニル］－２，５，５，８ａ－テトラメチル－３，４，４ａ，６，７，８－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ナフタレン－２－オール；ＣＡＳ登録番号１０２６７－３１－９を指す。
本明細書において使用される「マノオールは、５－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチリデン－３，４，４ａ，６，７，８－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ナフタレン－１－イル］－３－メチルペンタ－１－エン－３－オールを指す
本明細書において使用される（＋）－マノオールオキシは、４－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレンデカヒドロ－１－ナフタレニル］－２－ブタノンを指し、
本明細書において使用される「Ｚ－１１」は、（３Ｓ，５ａＲ，７ａＳ，１１ａＳ，１１ｂＲ）－３，８，８，１１ａ－テトラメチルドデカヒドロ－３，５ａ－エポキシナフト［２，１－ｃ］オキセピンを指す。
本明細書において使用される「γ－アンブロール」は、２－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレンデカヒドロ－１－ナフタレニル］エタノールを指す。および
本明細書において使用されるＡｍｂｒｏｘ（登録商標）は、３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）－３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フランを指す。
本明細書において使用される「スクラレオリド」は、３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フラン－２（１Ｈ）－オンを指す
本明細書において使用される「ＤＯＬ」は、（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）－１－（２－ヒドロキシエチル）－２，５，５，８ａ－テトラメチル－３，４，４ａ，６，７，８－ヘキサヒドロ－１Ｈ－ナフタレン－２－オール…ＣＡＳ番号３８４１９－７５－９を指す
本明細書において使用される「ファルネソール」は、（２Ｅ，６Ｅ）－３，７，１１－トリメチルドデカ－２，６，１０－トリエン－１－オールを指す
本明細書において使用される「ゲラニルゲラニオール」は、（２Ｅ，６Ｅ，１０Ｅ）－３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデカ－２，６，１０，１４－テトラエン－１－オールを指す。
より一般的には以下の意味が適用される：
Ｚ１１様化合物の場合、一般式：
Figure 2024029002000003
 の８，１３：１３，２０－ジエポキシ－１５，１６－ジノルラブダン（またはジエポキシ－ジノルラブダン）
Ａｍｂｒｏｘ（登録商標）様化合物の場合、一般式
Figure 2024029002000004
 の８，１２－エポキシ－１３，１４，１５，１６－テトラノルラブダン（またはエポキシ－テトラノルラブダン）
テルペニルシンターゼの「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」という用語は、対応する前駆体テルペンからの少なくとも１種のテルペニル二リン酸の生成を触媒する本明細書に記載のテルペニル二リン酸シンターゼの能力を指す。
テルペニル二リン酸ホスファターゼの「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」という用語は、前記テルペニル化合物からの二リン酸基の除去を触媒して、対応するテルペンアルコールを生成する本明細書に記載のテルペニル二リン酸ホスファターゼの能力を指す。
「イソプレノイド経路」または「ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ経路」としても公知の「メバロン酸経路」は、真核生物、古細菌、および一部の細菌に存在する必須の代謝経路である。メバロン酸経路はアセチル－ＣｏＡから始まり、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）と呼ばれる炭素５個の２種のビルディングブロックを生成する。鍵酵素は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼ（ａｔｏＢ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（ｍｖａＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ｍｖａＡ）、メバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ２）、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（ＭｖａＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）である。特にＦＰＰシンターゼ（ＥＲＧ２０）のように、テルペン前駆体ＧＰＰ、ＦＰＰまたはＧＧＰＰを生成する酵素活性とメバロン酸経路とを組み合わせると、テルペンの組換え細胞産生が可能になる。
本明細書において使用されるとき、「宿主細胞」または「形質転換細胞」という用語は、少なくとも１種の核酸分子を持つように変更された細胞（または生物）を指し、例えば、転写時に本発明の少なくとも１種の機能的ポリペプチド、ｉ．ｐ．本明細書で先に定義されたテルペニル二リン酸シンターゼタンパク質またはテルペニル二リン酸ホスファターゼ酵素を与える、所望のタンパク質または核酸配列をコードする組換え遺伝子を持つように改変された細胞（または生物）を指す。宿主細胞は、特に細菌細胞、真菌細胞または植物細胞または植物である。宿主細胞は、宿主細胞の核ゲノムまたは細胞小器官ゲノムに組み込まれた、例えばオペロンとして組織化された、組換え遺伝子またはいくつかの遺伝子を含んでよい。あるいは、宿主は、組換え遺伝子を染色体外に含んでよい。
「生物」という用語は、植物または微生物などの任意の非ヒト多細胞生物または単細胞生物を指す。特に、微生物は、細菌、酵母、藻類または真菌である。
「植物」という用語は、植物プロトプラスト、植物組織、再生植物を生じる植物細胞組織培養物、または植物の一部、または根、茎、葉、花、花粉、胚珠、胚、果実および同種のものなどの植物器官を含む植物細胞を含むために交換可能に使用される。本明細書における実施形態の方法を行うために任意の植物を使用することができる。
ある特定の生物または細胞は、ＦＰＰを天然に産生する場合、またはＦＰＰを天然に産生しないが、ＦＰＰを産生するように本明細書に記載の核酸で形質転換される場合、「ＦＰＰを産生することができる」ことが意図される。天然に存在する生物または細胞よりも多くの量のＦＰＰを産生するように形質転換された生物または細胞も「ＦＰＰを産生することができる生物または細胞」により包含される。
ある特定の生物または細胞は、ＧＧＰＰを天然に産生する場合、またはＧＧＰＰを天然に産生しないが、ＧＧＰＰを産生するように本明細書に記載の核酸で形質転換される場合、「ＧＧＰＰを産生することができる」ことが意図される。天然に存在する生物または細胞よりも多くの量のＧＧＰＰを産生するように形質転換された生物または細胞も「ＧＧＰＰを産生することができる生物または細胞」により包含される。
ある特定の生物または細胞は、本明細書に定義されたテルペニル二リン酸を天然に産生する場合、または前記二リン酸を天然に産生しないが、前記二リン酸を産生するように本明細書に記載の核酸で形質転換される場合、「テルペニル二リン酸を産生することができる」ことが意図される。天然に存在する生物または細胞よりも多くの量のテルペニル二リン酸を産生するように形質転換された生物または細胞も「テルペニル二リン酸を産生することができる生物または細胞」により包含される。
ある特定の生物または細胞は、本明細書に定義されたテルペンアルコールを天然に産生する場合、または前記アルコールを天然に産生しないが、前記アルコールを産生するように本明細書に記載の核酸で形質転換される場合、「テルペンアルコールを産生することができる」ことが意図される。天然に存在する生物または細胞よりも多くの量のテルペンアルコールを産生するように形質転換された生物または細胞も「テルペンアルコールを産生することができる生物または細胞」により包含される。
本明細書における説明および添付の特許請求の範囲に関して、「または」の使用は、特に記載のない限り「および／または」を意味する。同様に、「を含む（comprise）」、「を含む（comprises）」、「を含む（comprising）」、「を含む（include）」、「を含む（includes）」、および「を含む（including）」は交換可能であり、限定するためのものではない。
様々な実施形態の説明に「を含む（comprising）」という用語が使用される場合、いくつかの具体例では、「から実質的になる」または「からなる」という言葉を使用して、ある実施形態を代替的に説明することができることを当業者なら理解するであろうことがさらに理解されるべきである。
本明細書において使用される「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、本発明の化合物がその天然状態で通常会合する他の異なる化合物がない状態を指し、したがって、「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」対象は、重量で所与のサンプルの質量の少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、または２０％、または少なくとも５０％もしくは７５％を含む。１つの実施形態において、これらの用語は、重量で所与のサンプルの質量の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含む本発明の化合物を指す。本明細書において使用されるとき、「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、（１種の）核酸もしくはタンパク質または（複数種の）核酸もしくはタンパク質を参照するとき、例えば細菌細胞内もしくは真菌細胞内、または哺乳類生物内、特に人体内のような例えば原核生物または真核生物環境中で自然に起こるものとは異なる精製または濃縮の状態も指す。（１）他の会合する構造または化合物からの精製、または（２）前記原核生物または真核生物環境中で通常会合しない構造または化合物との会合を含む自然に起こる程度を超える任意の程度の精製または濃縮は、「単離された」の意味の範囲内である。本明細書に記載される（１種の）核酸もしくはタンパク質または（複数種の）核酸もしくはタンパク質のクラスは、当業者に公知の様々な方法およびプロセスにしたがって単離されてよく、あるいは性質上通常は会合しない構造または化合物と会合させてよい。
「約」という用語は、記載した値の±２５％、特に±１５％、±１０％、とりわけ±５％、±２％または±１％の可能性のあるばらつきを示す。
「実質的に」という用語は、例えば８５～９９．９％、特に９０～９９．９％、とりわけ９５～９９．９％、または９８～９９．９％、特に９９～９９．９％などの約８０～１００％の値の範囲を表す。
「主に」は、例えば５１～１００％の範囲内、特に７５～９９，９％、とりわけ８５～９８，５％、９５～９９％のような範囲内のような５０％を上回る範囲内の比率を指す。
本発明の文脈における「主生成物」は、単一の化合物または２種、３種、４種、５種もしくはそれ以上の、特に２種もしくは３種の化合物のような少なくとも２種の化合物の群を指し、この単一の化合物または化合物の群は、本明細書に記載の反応により「主に」製造され、かつ前記反応により生成された生成物の構成成分の総量に基づいて主な比率で前記反応に含まれる。前記比率は、モル比率、重量比率、または好ましくはクロマトグラフィー分析論に基づく、反応生成物の対応するクロマトグラムから計算された面積比率であってよい。
本発明の文脈における「副生成物」は、単一の化合物または２種、３種、４種、５種もしくはそれ以上の、特に２種もしくは３種の化合物のような少なくとも２種の化合物の群を指し、この単一の化合物または化合物の群は、本明細書に記載の反応により「主に」製造されない。
酵素反応の可逆性のために、本発明は、他に記載されていない限り、反応の両方向の本明細書に記載される酵素反応または生体触媒反応に関する。
本明細書に記載されるポリペプチドの「機能的突然変異体」には、以下で定義されるようなポリペプチドの「機能的等価体」が含まれる。
「立体異性体」という用語は、配座異性体、特に配置異性体を含む。
本発明によれば、概して含まれるのは、「構造異性体」および「立体異性体」などの、本明細書に記載される化合物のすべての「立体異性型」である。
「立体異性型」は、特に、「立体異性体」およびその混合物、例えば鏡像異性体などの配置異性体（光学異性体）、またはＥ－およびＺ－異性体などの幾何異性体（ジアステレオマー）、ならびにそれらの組合せを包含する。１つまたは複数の不斉中心が１つの分子内に存在する場合、本発明は、これらの不斉中心の異なる配座のすべての組合せ、例えば鏡像異性体対を包含する
「立体選択性」は、立体異性的に純粋な形態の化合物のある特定の立体異性体を産生する能力、または複数の立体異性体から本明細書に記載の酵素触媒法においてある特定の立体異性体を特異的に変換する能力を表す。さらに具体的には、これは、本発明のある生成物が、ある特定の立体異性体に対して濃縮されること、またはある遊離体を、ある特定の立体異性体に対して減少させることができることを意味する。これは、以下の式にしたがって計算された純度％ｅｅ－パラメータにより定量化することができる：
％ｅｅ＝［ＸＡ－ＸＢ］／［ＸＡ＋ＸＢ］×１００
［式中、ＸＡおよびＸＢは、立体異性体ＡおよびＢのモル比（モル分率）を表す］。
「を選択的に変換する」または「選択性を高める」という用語は概して、前記反応の全過程の間（すなわち反応の開始から終了の間）に、前記反応のある時点で、または前記反応の「期間」中に、不飽和炭化水素の、例えばＥ型のようなある特定の立体異性型が、（モル基準で比べて）例えばＺ型のような対応する他の立体異性型よりも高い比率またはよりも多い量で変換されることを意味する。特に、基質の初期量の１～９９％、２～９５％、３～９０％、５～８５％、１０～８０％、１５～７５％、２０～７０％、２５～６５％、３０～６０％、または４０～５０％変換に対応する前記選択性を「期間」中に観察することができる。前記より高い比率またはより多い量は、例えば、以下によって表すことができる：
－反応の全過程の間またはその前記期間中に観察されるある異性体のより高い最大収率；
－基質の定義された％変換度値におけるある異性体のより多い相対量；および／または
－より高い％変換度値におけるある異性体の同一相対量；
これらのそれぞれは好ましくは標準法と比べて観察され、前記標準法は、その他は同一の条件下、公知の化学的または生化学的手段により実施される。
本発明にしたがって概して同じく含まれるのは、構造異性体および特に立体異性体ならびにこれらの混合物など、例えば光学異性体またはＥ－およびＺ－異性体などの幾何異性体ならびにこれらの組合せなど、本明細書に記載される化合物のすべての「異性型」である。いくつかの不斉中心が、ある分子内に存在する場合は、本発明は、これらの不斉中心の異なる配座のすべての組合せ、例えば鏡像異性体の対、または立体異性型の任意の混合物などを含む。
本発明による反応の「収率」および／または「変換率」は、反応が起こる例えば４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３６時間または４８時間の定義された期間にわたって決定される。特に、反応は、厳密に定義された条件下で、例えば本明細書に定義された「標準条件」で行われる。
様々な収率パラメータ（「収率」またはＹＰ／Ｓ；「比生産性収率」；または空時収率（ＳＴＹ））が当技術分野において周知であり、文献に記載の通り決定される。
（生成された生成物の質量／消費された材料の質量でそれぞれ表された）「収率」および「ＹＰ／Ｓ」は、本明細書において同義語として使用される。
比生産性－収率は、バイオマス１ｇ当たり、１時間および発酵ブロス１Ｌ当たりに産生される生成物の量を表す。ＷＣＷとして記載される湿潤細胞重量の量は、生化学反応において生物学的に活性な微生物の量を表す。この値は、ＷＣＷ １ｇ当たり、１時間当たりの生成物（ｇ）（すなわちｇ／ｇＷＣＷ－１ｈ－１）として示される。あるいは、バイオマスの量をＤＣＷとして記載される乾燥細胞重量の量として表すこともできる。さらに、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）を測定し、実験的に決定された相関係数を使用して対応する湿潤細胞重量または乾燥細胞重量それぞれを推定することにより、バイオマス濃度をより容易に決定することができる。
「発酵産生」または「発酵」という用語は、インキュベーションに加えられた少なくとも１種の炭素源を利用する細胞培養において化合物を産生する微生物の（前記微生物に含まれる、または前記微生物により生じる酵素活性により支援された）能力を指す。
「発酵ブロス」という用語は、ワークアップを行っていない、または例えば本明細書に記載の通りワークアップを行った、発酵プロセスに基づく液体、特に水性溶液または水性／有機溶液を意味すると理解される。
「酵素的に触媒された」または「生体触媒的」方法は、前記方法が、本明細書に定義された酵素突然変異体を含む酵素の触媒作用下で実施されることを意味する。したがって、これらの方法は、単離（精製、濃縮）された形態または粗製形態の前記酵素の存在下で、または細胞系、特に、活性型の前記酵素を含み、かつ本明細書に開示の変換反応を触媒する能力を有する天然または組換え微生物細胞の存在下で実施することができる。
本開示が、選好度が異なる特徴、パラメータおよびその範囲（一般的な、非明示的に好ましい特徴、パラメータおよびその範囲を含む）を指す場合は、他に記載されていない限り、２つ以上のこのような特徴、パラメータおよびその範囲の任意の組合せが、それらのそれぞれの選好度に関係なく、本明細書の開示により包含される。
詳細な説明
ａ．本発明の特定の実施形態
本発明は、以下の特定の実施形態に関する：
１．第１の主な実施形態は、一般式１
Figure 2024029002000005
 ［式中、
Ｒは、Ｈを表し、またはとりわけ、好ましくは５で割り切れる総炭素数、特に５、１０、１５または２０、とりわけ１０または１５を有する、環式または非環式の、線状または分枝状の、飽和または不飽和の、任意選択で置換されたヒドロカルビル残基を表す］
のテルペンアルコール化合物の生体触媒的な製造方法であって、
（１）式（１）の前記テルペン化合物の対応するテルペニル二リン酸前駆体を、テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有する、例えばモノ－、セスキ－またはジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するようなポリペプチドと接触させて、前記テルペンアルコールを生成するステップと、
（２）ステップ（１）のテルペンアルコールを任意選択で単離するステップと
を含み、前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの二リン酸除去酵素メンバーから選択される、方法に関する。
「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性」を有するこの実施形態のポリペプチドは、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーとして、特にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１３３５０を有するＹ＿ホスファターゼ３ファミリーのメンバーとして同定される。
２．本発明の第２の主な実施形態は、二環式ジテルペンアルコール化合物の生体触媒的な製造方法であって、
ａ）前記二環式ジテルペン化合物の対応する二環式ジテルペニル二リン酸前駆体を、テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有する、例えばジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性またはとりわけ、二環式ジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するようなポリペプチドと接触させて、前記二環式ジテルペンアルコールを生成するステップと、
ｂ）ステップ（１）の二環式ジテルペンアルコールを任意選択で単離するステップと
を含む、方法に関する。
「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性」を有するこの実施形態のポリペプチドは、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーとして、特にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１３３５０を有するＹ＿ホスファターゼ３ファミリーのメンバーとして同定される。
３．前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの二リン酸除去酵素メンバーから選択される、実施形態２記載の方法。
４．前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、以下の活性部位シグネチャーモチーフ：
ＨＣｘｘＧｘｘＲ（配列番号５７）
［ここで、
各ｘは互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す］
を有するアミノ酸配列によって特徴付けられる二リン酸除去酵素の一クラスから選択される、実施形態１または３記載の方法。
５．前記活性部位シグネチャーモチーフが、
ＨＣ（Ｔ／Ｓ）ｘＧＫＤＲＴＧ（配列番号５８）
［ここで、
ｘは、任意の天然アミノ酸残基を表し、例えば、Ｌ、Ａ、ＧおよびＶ残基から選択される］
である、実施形態４記載の方法。
別の実施形態において、前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドは、図１６ｂに示されているアミノ酸コンセンサス配列モチーフを含む。
６．前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、以下のポリペプチド：
ａ）配列番号２にしたがうアミノ酸配列を含むＴａｌＶｅＴＰＰ、
ｂ）配列番号６にしたがうアミノ酸配列を含むＡｓｐＷｅＴＰＰ、
ｃ）配列番号１０にしたがうアミノ酸配列を含むＨｅｌＧｒｉＴＰＰ、
ｄ）配列番号１３にしたがうアミノ酸配列を含む、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、
ｅ）配列番号１６にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、
ｆ）配列番号１９にしたがうアミノ酸配列を含む、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、
ｇ）配列番号２２にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、
ｈ）配列番号２５にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＭａＴＰＰ１、
ｉ）配列番号２８にしたがうアミノ酸配列を含むＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１、および
ｊ）配列番号３１にしたがうアミノ酸配列を含むＰｅＳｕｂＴＰＰ１、ならびに
ｋ）テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有し、かつａ）～ｊ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１項記載の方法。
７．一般式１［式中、Ｒは、Ｈを表し、またはとりわけ、好ましくは５で割り切れる、例えば５、１０、１５または２０のような総炭素数を有する、非環式の、線状または分枝状の、飽和または不飽和のヒドロカルビル残基を表す］のテルペンアルコール化合物を製造する、実施形態１および実施形態４から６までのいずれか１項記載の方法。
８．式１のテルペンアルコールが、ファルネソールおよびゲラニルゲラニオールから選択される、実施形態７記載の方法。
９．ステップ（１）が、非環式テルペニル二リン酸前駆体を、二環式ジテルペニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、前記二環式ジテルペニル二リン酸前駆体を生成するステップをも含む、実施形態２から６までのいずれか１項記載の方法。
１０．前記二環式ジテルペニル二リン酸シンターゼが、
ａ）配列番号３４にしたがうアミノ酸配列を含むＳｍＣＰＳ２、
ｂ）配列番号４０にしたがうアミノ酸配列を含むＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９、
ｃ）配列番号３８にしたがうアミノ酸配列を含むＳｓＬＰＳ、および
ｄ）二環式ジテルペニル二リン酸シンターゼ活性を有し、かつａ）、ｂ）およびｃ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、実施形態９記載の方法。
１１．生体触媒的に製造された前記二環式ジテルペンアルコールが、それぞれ実質的に純粋な立体異性体の形態または少なくとも２種の立体異性体の混合物の形態のいずれかのコパロール、特に（＋）－コパロールおよびラブデンジオールから選択される、実施形態２から６まで、実施形態９および１０のいずれか１項記載の方法。
１２．ステップ（３）として、化学合成もしくは生体触媒合成またはその両方の組合せを用いた、アルコール誘導体へのステップ（１）またはステップ（２）のテルペンアルコールの加工をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１項記載の方法。
１３．アルコール誘導体が、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルである、実施形態１２記載の方法。
１４．前記テルペンアルコールを生体触媒的に酸化させる、実施形態１２または１３記載の方法。
１５．前記テルペンアルコールを、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と接触させることにより変換する、実施形態１４記載の方法。
１６．前記ＡＤＨが、
ａ）配列番号４２にしたがうアミノ酸配列を含むＣｙｍＢ；
ｂ）配列番号４４にしたがうアミノ酸配列を含むＡｓｐＷｅＡＤＨ１；
ｃ）配列番号４６にしたがうアミノ酸配列を含むＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１；
ｄ）配列番号４８にしたがうアミノ酸配列を含むＡｚＴｏｌＡＤＨ１；
ｅ）配列番号５０にしたがうアミノ酸配列を含むＡｒｏＡｒｏＡＤＨ１；
ｆ）配列番号５２にしたがうアミノ酸配列を含むＴｈＴｅｒｐＡＤＨ１；
ｇ）配列番号５４にしたがうアミノ酸配列を含むＣｄＧｅｏＡ；
ｈ）配列番号５６にしたがうアミノ酸配列を含むＶｏＡＤＨ１；および
ｉ）ＡＤＨ活性を有し、かつａ）～ｈ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、実施形態１５記載の方法。
１７．
（１）コパリル二リン酸を、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）ホスファターゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、実質的に純粋な立体異性体の形態、特に（＋）－コパロール、または少なくとも２種の立体異性体の混合物の形態のいずれかのコパロールを生成するステップと、
（２）ステップ（１）のコパロールを任意選択で単離するステップと
を含む、コパロールを生体触媒的に製造するための、実施形態２から６までおよび実施形態９から１１までのいずれか１項記載の方法。
１８．コパリル二リン酸ホスファターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、以下のポリペプチド：
ａ）配列番号２にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＶｅＴＰＰ、
ｂ）配列番号６にしたがうアミノ酸配列を含む、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、
ｃ）配列番号１０にしたがうアミノ酸配列を含む、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ、
ｄ）配列番号１３にしたがうアミノ酸配列を含む、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、
ｅ）配列番号１６にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、
ｆ）配列番号１９にしたがうアミノ酸配列を含む、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、
ｇ）配列番号２２にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、
ｈ）配列番号２５にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＭａＴＰＰ１、
ｉ）配列番号２８にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１、および
ｊ）配列番号３１にしたがうアミノ酸配列を含む、ＰｅＳｕｂＴＰＰ１、ならびに
ｋ）コパリル二リン酸ホスファターゼ活性を有し、かつａ）～ｊ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、実施形態１７記載の方法。
１９．ステップ（１）が、コパリルピロリン酸シンターゼ（ＣＰＳ）の触媒作用による、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）への例えばゲラニルゲラニル－ピロリン酸（ＧＧＰＰ）、またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）との混合物のようなテルペンピロリン酸の生体触媒変換も含む、実施形態１７または１８記載の方法。
２０．前記ＣＰＳが、
ａ）配列番号３４にしたがうアミノ酸配列を含むＳｍＣＰＳ２、
ｂ）配列番号４０にしたがうアミノ酸配列を含むＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９、および
ｃ）コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有し、かつａ）およびｂ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、実施形態１９記載の方法。
２１．ステップ（３）として、化学合成もしくは生体触媒合成またはその両方の組合せを用いた、コパロール誘導体へのステップ（１）またはステップ（２）のコパロールの加工をさらに含む、実施形態１７から２０までのいずれか１項記載の方法。
２２．コパロール誘導体が、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルである、実施形態２１記載の方法。
２３．コパロールが生体触媒的に酸化される、実施形態２１または２２記載の方法。
２４．コパロールが、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と接触させられることにより酸化される、実施形態２３記載の方法。
２５．前記ＡＤＨが、
ａ）配列番号４２にしたがうアミノ酸配列を含むＣｙｍＢ；
ｂ）配列番号４４にしたがうアミノ酸配列を含むＡｓｐＷｅＡＤＨ１；
ｃ）配列番号４６にしたがうアミノ酸配列を含むＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１；
ｄ）配列番号４８にしたがうアミノ酸配列を含むＡｚＴｏｌＡＤＨ１；
ｅ）配列番号５０にしたがうアミノ酸配列を含むＡｒｏＡｒｏＡＤＨ１；
ｆ）配列番号５２にしたがうアミノ酸配列を含むＴｈＴｅｒｐＡＤＨ１；
ｇ）配列番号５４にしたがうアミノ酸配列を含むＣｄＧｅｏＡ；
ｈ）配列番号５６にしたがうアミノ酸配列を含むＶｏＡＤＨ１；および
ｉ）ａ）～ｈ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含む、ＡＤＨ活性を有するポリペプチド
から選択される、実施形態２４記載の方法。
２６．
（１）ラブデンジオール二リン酸（ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸または８α－ヒドロキシコパリル二リン酸とも呼ばれる）を、ラブデンジオール二リン酸（ＬＰＰ）ホスファターゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、実質的に純粋な立体異性体の形態または少なくとも２種の立体異性体の混合物の形態のいずれかのラブデンジオールを生成するステップと、
（２）ステップ（１）のラブデンジオールを任意選択で単離するステップと
を含む、ラブデンジオールを生体触媒的に製造するための、実施形態１記載の方法。
２７．ＬＰＰホスファターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、以下のポリペプチド：
ａ）配列番号２にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＶｅＴＰＰ、
ｂ）配列番号６にしたがうアミノ酸配列を含む、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、
ｃ）配列番号１０にしたがうアミノ酸配列を含む、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ、
ｄ）配列番号１３にしたがうアミノ酸配列を含む、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、
ｅ）配列番号１６にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、
ｆ）配列番号１９にしたがうアミノ酸配列を含む、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、
ｇ）配列番号２２にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、
ｈ）配列番号２５にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＭａＴＰＰ１、
ｉ）配列番号２８にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１、および
ｊ）配列番号３１にしたがうアミノ酸配列を含む、ＰｅＳｕｂＴＰＰ１、ならびに
ｋ）ＬＰＰホスファターゼ活性を有し、かつａ）～ｊ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、実施形態２６記載の方法。
２８．ステップ（１）が、ラブデンジオールピロリン酸シンターゼ（ＬＰＳ）の触媒作用による、ラブデンジオール二リン酸（ＬＰＰ）への例えばゲラニルゲラニル－ピロリン酸（ＧＧＰＰ）、またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）との混合物のようなテルペンピロリン酸の生体触媒変換をも含む、実施形態２６および２７のいずれか１項記載の方法。
２９．前記ＬＰＳが、
ａ）配列番号３８にしたがうアミノ酸配列を含むＳｓＬＰＳ、および
ｂ）ラブデンジオールピロリン酸シンターゼ活性を有し、かつａ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、実施形態２８記載の方法。
３０．ステップ（３）として、化学合成もしくは生体触媒合成またはその両方の組合せを用いた、ラブデンジオール誘導体へのステップ（１）またはステップ（２）のラブデンジオールの加工をさらに含む、実施形態２６から２９までのいずれか１項記載の方法。
３１．ラブデンジオール誘導体が、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルである、実施形態３０記載の方法。
３２．ラブデンジオールが生体触媒的に酸化される、実施形態３０または３１記載の方法。
３３．ラブデンジオールを、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と接触させることにより酸化させる、実施形態３２記載の方法。
３４．前記ＡＤＨが、
ａ）配列番号４２にしたがうアミノ酸配列を含むＣｙｍＢ；
ｂ）配列番号４４にしたがうアミノ酸配列を含むＡｓｐＷｅＡＤＨ１；
ｃ）配列番号４６にしたがうアミノ酸配列を含むＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１；
ｄ）配列番号４８にしたがうアミノ酸配列を含むＡｚＴｏｌＡＤＨ１；
ｅ）配列番号５０にしたがうアミノ酸配列を含むＡｒｏＡｒｏＡＤＨ１；
ｆ）配列番号５２にしたがうアミノ酸配列を含むＴｈＴｅｒｐＡＤＨ１；
ｇ）配列番号５４にしたがうアミノ酸配列を含むＣｄＧｅｏＡ；
ｈ）配列番号５６にしたがうアミノ酸配列を含むＶｏＡＤＨ１；
ｉ）配列番号６８にしたがうアミノ酸配列を含むＳＣＨ２３－ＡＤＨ１
ｊ）配列番号７０にしたがうアミノ酸配列を含むＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ；および
ｋ）ａ）～ｊ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含む、ＡＤＨ活性を有するポリペプチド
から選択される、実施形態３３記載の方法。
３５．ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）の触媒作用による、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からのＧＧＰＰの生体触媒生成をも含む、実施形態１９または２８記載の方法。
３６．前記ＧＧＰＳが、
ａ）配列番号３６にしたがうアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｂ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有し、かつａ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、実施形態３５記載の方法。
３７．イン・ビトロまたはイン・ビボで実施される、先行する実施形態のいずれか１項記載の方法。
３８．ステップ（１）の前に、それぞれの生体触媒変換ステップを実施するために必要な酵素活性を有する１種または複数種のポリペプチドをコードする１種または複数種の核酸分子を、それぞれのゲノムに任意選択で安定して組み込まれた、非ヒト宿主生物または細胞に導入するステップを含む、イン・ビボで実施される、先行する実施形態のいずれか１項記載の方法。
３９．前記非ヒト宿主生物または細胞に導入された前記核酸が、
ａ）テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性、特に二環式ジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド；および任意選択で
ｂ）テルペニル－二リン酸シンターゼ活性、特に二環式ジテルペニル－二リン酸シンターゼ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド、および／または
ｃ）ＡＤＨ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド；および／または
ｄ）非環状テルペニル－二リン酸シンターゼ活性、特に非環状ジテルペニル－二リン酸シンターゼ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド
をコードする、実施形態３８記載の方法。
４０．前記非ヒト宿主生物または細胞に導入された前記核酸が、
ａ）実施形態６に定義されたポリペプチド；または配列番号１、３、４、５、７、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０および３２から選択されるヌクレオチド配列；もしくは前記配列のいずれか１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドから選択される、二環式ジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド、および任意選択で以下の
ｂ）実施形態１０に定義されたポリペプチド；または配列番号３３、３７および３９から選択されるヌクレオチド配列；もしくは前記配列のいずれか１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドから選択される、二環式ジテルペニル－二リン酸シンターゼ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド
ｃ）実施形態１６に定義されたポリペプチド；または配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、および５５から選択されるヌクレオチド配列；もしくは前記配列のいずれか１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドから選択される、ＡＤＨ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド
ｄ）実施形態３６に定義された、非環状ジテルペニル－二リン酸シンターゼ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド；または配列番号３５から選択されるヌクレオチド配列もしくは前記配列との少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、非環状ジテルペニル－二リン酸シンターゼ活性を有する少なくとも１種のポリペプチド
のうちの少なくとも１つをコードする、実施形態３９記載の方法。
４１．ＦＰＰおよび／もしくはＧＧＰＰ；またはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を内因的に産生する非ヒト宿主生物もしくは細胞；または増量したＦＰＰおよび／もしくはＧＧＰＰおよび／もしくはＩＰＰとＤＭＡＰＰの混合物を産生するように遺伝子改変されている非ヒト宿主生物を適用することにより実施される、実施形態３８から４０までのいずれか１項記載の方法。
これらの宿主細胞または生物のいくつかは、ＦＰＰもしくはＧＧＰＰもしくはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を天然に産生せず、または少なすぎると見なされ、したがって増やすべき量のＦＰＰもしくはＧＧＰＰもしくはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を内因的に産生しない。本明細書に記載の実施形態の方法を行うのに適切であるために、非環状テルペンピロリン酸前駆体、例えばＦＰＰもしくはＧＧＰＰもしくはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を天然に産生しない生物もしくは細胞、または準最適量の前記化合物を産生する生物もしくは細胞が、前記前駆体を産生するように遺伝子改変される。それらは、例えば、上記の実施形態のいずれかにしたがって記載された核酸による改変の前にまたは同時にそのように形質転換することができる。生物が非環状テルペンピロリン酸前駆体、例えばＦＰＰまたはＧＧＰＰまたはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を産生するように生物を形質転換する方法は、当技術分野において既知である。例えば、メバロン酸経路、イソプレノイド経路またはＭＥＰ経路、特にメバロン酸経路の酵素活性の導入は、生物にＦＰＰまたはＧＧＰＰまたはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を産生させる適切な戦略である。
４２．前記非ヒト宿主生物または細胞が、真核生物または原核生物、特に植物、細菌または真菌、特に酵母である、実施形態３８から４１までのいずれか１項記載の方法。
４３．前記細菌がエシェリキア（Escherichia）属のもの、特にＥ．コリ（E.coli）であり、前記酵母がサッカロミセス（Saccharomyces）属のもの、特にＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）である、実施形態４２記載の方法。
４４．前記細胞が植物細胞である、実施形態４２記載の方法。
４５．実施形態３８から４４までのいずれか１項に定義された非ヒト宿主生物または細胞。
４６．実施形態３８から４４までのいずれか１項に定義された少なくとも１種の核酸分子を含む組換え核酸構築物。
４７．実施形態４６記載の少なくとも１種の核酸構築物を含む発現ベクター。
４８．原核生物ベクター、ウイルスベクター、真核生物ベクター、または１種もしくは複数種のプラスミドである、実施形態４７記載の発現ベクター。
４９．実施形態４６記載の少なくとも１種の核酸構築物または実施形態４７もしくは４８記載の少なくとも１種のベクターで形質転換された、実施形態４５に定義された組換え非ヒト宿主生物または細胞。
５０．タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの二リン酸除去酵素メンバーおよびその突然変異体または変異体から選択される、テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性、特に二環式ジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドであって、それぞれのテルペンアルコールへのテルペニル二リン酸の変換を好ましくは例えば６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超または９９％超のような５０％超の選択性で触媒する、ポリペプチド。特にこのポリペプチドは、ＣＰＰおよびＬＰＰから選択される少なくとも１種のテルペニル二リン酸の、それぞれのテルペンアルコールであるコパロールおよびラブデンジオールへの変換を好ましくは例えば６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超または９９％超のような５０％超の選択性で触媒する。
「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性」を有するこの実施形態のポリペプチドは、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーとして、特にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１３３５０を有するＹ＿ホスファターゼ３ファミリーのメンバーとして同定される。
特に、「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性」を有する本発明のポリペプチドは、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上である場合、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーとして、特にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１３３５０を有するＹ＿ホスファターゼ３ファミリーのメンバーとして同定される。期待値（ｅ値）も、照会されたタンパク質がＰｆａｍファミリーに含まれるかの基準または照会されたタンパク質が、ある特定のＰｆａｍドメインを有するかどうか判断するための基準として使用することができる。前記ドメインとの一致は、例えば１×１０－４０～７．４０×１０－８０の範囲内または３．５０×１０－５０～７．４０×１０－６６のような１×１０－４５～１×１０－７０の範囲内のような、１×１０－５未満または１×１０－１０未満、または１×１０－２０未満のｅ値を有する。問い合わせ配列として、「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性」を有するポリペプチドの配列が適用される。
例えば、以下のウェブサイトが検索およびこのようなｅ値の計算に適用されてよい：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ＃ｔａｂｖｉｅｗ＝ｔａｂ０またはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｈｍｍｅｒ／。
１つの好ましい代替において、このようなホスファターゼ酵素はまた、ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰを、それぞれのアルコールであるファルネソールおよびゲラニルゲラニオールに変換する。
別の好ましい代替において、このようなホスファターゼ酵素は、ＣＰＰおよびＬＰＰから選択された少なくとも１種の二環式ジテルペニル二リン酸を、それぞれのテルペンアルコールであるコパロールおよびラブデンジオールに変換する能力を保持しながらも、ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰを、それぞれのアルコールであるファルネソールおよびゲラニルゲラニオールに変換しない。
別の好ましい代替において、このようなホスファターゼ酵素は、コパロールおよびラブデンジオールから選択された少なくとも１種のアルコールを主生成物として産生する。その場合は、このような酵素は、ＣＰＰおよびＬＰＰから選択された少なくとも１種の二環式ジテルペニル二リン酸を、それぞれのテルペンアルコールであるコパロールおよびラブデンジオールに変換するそれらの能力と比べてより低いモル収率で、ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰを、それぞれのアルコールであるファルネソールおよびゲラニルゲラニオールに変換する。コパロールおよびラブデンジオールから選択された少なくとも１種の二環式ジテルペンアルコールの相対的なモル収率は、非環式テルペンアルコールであるファルネソールおよびゲラニルゲラニオールのうちの少なくとも１つの収率と比べて、例えば２～１．０００倍または５～１００倍、または１０～５０倍のように、２倍以上さらに高いこともある。
５１．以下の活性部位シグネチャーモチーフ：
ＨＣｘｘＧｘｘＲ（配列番号５７）
［ここで、
各ｘは互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す］
を有するアミノ酸配列によって特徴付けられる、実施形態５０記載のポリペプチド。
５２．前記活性部位シグネチャーモチーフが、
ＨＣ（Ｔ／Ｓ）ｘＧＫＤＲＴＧ（配列番号５８）
［ここで、
ｘは、任意の天然アミノ酸残基を表す］
である、実施形態５１記載のポリペプチド。
５３．前記二環式ジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、以下のポリペプチド：
ａ）配列番号２にしたがうアミノ酸配列を含むＴａｌＶｅＴＰＰ、
ｂ）配列番号６にしたがうアミノ酸配列を含むＡｓｐＷｅＴＰＰ、
ｃ）配列番号１０にしたがうアミノ酸配列を含むＨｅｌＧｒｉＴＰＰ、
ｄ）配列番号１３にしたがうアミノ酸配列を含む、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、
ｅ）配列番号１６にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、
ｆ）配列番号１９にしたがうアミノ酸配列を含む、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、
ｇ）配列番号２２にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、
ｈ）配列番号２５にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＭａＴＰＰ１、
ｉ）配列番号２８にしたがうアミノ酸配列を含むＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１、
ｊ）配列番号３１にしたがうアミノ酸配列を含むＰｅＳｕｂＴＰＰ１、および
ｋ）ジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有し、かつａ）～ｊ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、実施形態５０から５２までのいずれか１項記載のポリペプチド。
別の特定の実施形態は、配列番号２、６、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８および３１の特定のアミノ酸配列のいずれか１つにより上記で識別した、二環式ジテルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有する本発明の新規なポリペプチドのポリペプチド変異体を指し、ここで、ポリペプチド変異体は、配列番号２、６、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８および３１のいずれか１つとの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、かつ非改変配列番号２、６、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８および３１のいずれか１つに対して少なくとも１つの置換改変を含む。
５４．
ａ）実施形態５０から５３までのいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸配列；
ｂ）ａ）の相補的核酸配列；または
ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列
を含む核酸分子。
５５．請求項５４記載の少なくとも１種の核酸分子を含む発現構築物。
５６．請求項５４記載の少なくとも１種の核酸分子を含むベクター。
５７．原核生物ベクター、ウイルスベクターまたは真核生物ベクターである、請求項５６記載のベクター。
５８．発現ベクターである、実施形態５６または５７記載のベクター。
５９．プラスミドベクターである、実施形態５６から５８までのいずれか１項記載のベクター。
６０．
ａ）ゲノムに任意選択で安定して組み込まれた、実施形態５４記載の少なくとも１種の単離された核酸分子；または
ｂ）ゲノムに任意選択で安定して組み込まれた、実施形態５５記載の少なくとも１種の発現構築物；または
ｃ）実施形態５６から５９までのいずれか１項記載の少なくとも１種のベクター
を含む組換え宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物。
６１．原核微生物もしくは真核微生物、またはそれらに由来する細胞から選択される、実施形態６０記載の宿主細胞または宿主生物。
６２．細菌細胞、真菌細胞および植物細胞または植物から選択される、実施形態６１記載の宿主細胞または宿主生物。
６３．前記真菌細胞が酵母細胞である、実施形態６２記載の宿主細胞または宿主生物。
６４．前記細菌細胞が、エシェリキア（Escherichia）属から、特にＥ．コリ（E.coli）種から選択され、前記酵母細胞が、サッカロミセス（Saccharomyces）属またはピキア（Pichia）属から、特にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）種から選択される、実施形態６３記載の宿主細胞または宿主生物。
６５．
（１）実施形態５０から５３までのいずれか１項記載の少なくとも１種のポリペプチドを発現または過剰発現させるために、実施形態請求項６０から６４までのいずれか１項記載の非ヒト宿主生物または宿主細胞を培養するステップと、
（２）ステップ（１）において培養された非ヒト宿主細胞または生物からポリペプチドを任意選択で単離するステップと
を含む、実施形態５０から５３までのいずれか１項記載の触媒活性のある少なくとも１種のポリペプチドを製造するための方法。
６６．ステップａ）の前に、実施形態５０から５３までのいずれか１項記載のポリペプチドを発現または過剰発現させるように、実施形態５４記載の少なくとも１種の核酸、実施形態５５記載の少なくとも１種の構築物、または実施形態５６から５９までのいずれか１項記載の少なくとも１種のベクターで非ヒト宿主生物または細胞を形質転換するステップをさらに含む、実施形態６５記載の方法。
６７．
（１）実施形態５４記載の核酸分子を選択するステップと、
（２）選択された核酸分子を改変して、少なくとも１種の突然変異核酸分子を得るステップと、
（３）宿主細胞または単細胞宿主生物を突然変異核酸配列で形質転換して、突然変異核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させるステップと、
（４）テルペンシンターゼ活性、特にテルペニル二リン酸シンターゼ活性を備える少なくとも１つの突然変異体を求めて発現産物をスクリーニングするステップと、
（５）任意選択で、ポリペプチドが所望の突然変異活性を持たない場合、所望の突然変異活性を有するポリペプチドが得られるまでプロセスステップ（１）～（４）を繰り返すステップと、
（６）任意選択で、所望の突然変異活性を有するポリペプチドがステップ（４）において同定された場合、ステップ（３）において得られた対応する突然変異核酸を単離するステップと
を含む、テルペンシンターゼ活性、特にテルペニル二リン酸シンターゼ活性を備える突然変異ポリペプチドを製造するための方法。
６８．コパロール誘導体が、コパラール、マノオール、（＋）－マノオールオキシ、Ｚ－１１、γ－アンブロールおよびアンブロックスならびに特に立体化学がそれらとは異なる構造的に関連する化合物からなる群から選択される、実施形態２２記載の方法。
６９．ラブデンジオール誘導体が、スクラレオリド、ＤＯＬおよびアンブロックスならびに特に立体化学がそれらとは異なる構造的に関連する化合物からなる群から選択される、実施形態３１記載の方法。
７０．
ａ）実施形態１から４４までのいずれか１項に定義された生体触媒プロセスを実施し、ラブデンジオールまたはコパロール化合物を任意選択で単離することにより前記ラブデンジオールまたはコパロール化合物を提供するステップと、
ｂ）化学合成および／または生化学合成を用いてステップ（１）の前記ラブデンジオールまたはコパロール化合物をアンブロックスまたはアンブロックス様化合物に変換するステップと
を含む、上記で定義されたアンブロックスまたはアンブロックス様化合物の製造方法。
７１．本発明はさらに、オドラント、フレーバーまたはフレグランス成分、特にＡｍｂｒｏｘを製造するための、上記の実施形態のいずれか１項に定義されたポリペプチドの使用；ならびにオドラント、フレーバーまたはフレグランス成分、特にＡｍｂｒｏｘを製造するための、上記の実施形態のいずれか１項にしたがって製造されたテルペンアルコールの使用にも関する。
ｂ．本発明にしたがって適用可能なポリペプチド
この文脈において以下の定義が適用される：
交換可能に使用することができる「ポリペプチド」または「ペプチド」という一般名は、約１０～最大１．０００超の残基を含むペプチド結合した連続したアミノ酸残基の天然または合成の線状鎖または配列を指す。最大３０の残基を含む短鎖ポリペプチドは「オリゴペプチド」とも呼ばれる。
「タンパク質」という用語は、１種または複数種のポリペプチドからなる高分子構造を指す。そのポリペプチドのアミノ酸配列がタンパク質の「一次構造」となる。このアミノ酸配列はまた、ポリペプチド鎖内に形成されるαヘリックス構造およびβシート構造など、特殊な構造要素の形成によりタンパク質の「二次構造」をあらかじめ決定する。複数のこのような二次構造要素の配置は、「三次構造」、すなわちタンパク質の空間配置を画定する。タンパク質が、１本を超えるポリペプチド鎖を含む場合、前記鎖は空間的に配置されて、タンパク質の「四次構造」を形成する。タンパク質の正確な空間配置、すなわち「フォールディング」は、タンパク質機能の前提条件である。変性またはアンフォールディングはタンパク質機能を破壊する。このような破壊が可逆的である場合、リフォールディングによりタンパク質機能を回復することができる。
本明細書において言及される典型的なタンパク質機能は「酵素機能」であり、すなわち、タンパク質は生体触媒として基質、例えば化合物に作用し、生成物への前記基質の変換を触媒する。酵素が、高度または低度な基質特異性および／または生成物特異性を示してよい。
したがって、本明細書においてある特定の「活性」を有すると表される「ポリペプチド」は暗黙的に、例えばある特異的酵素活性のような示された活性を示す正しくフォールディングされたタンパク質を指す。
したがって、特に記載のない限り「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」および「酵素」という用語も包含する。
同様に、「ポリペプチド断片」という用語は、「タンパク質断片」および「酵素断片」という用語を包含する。
「単離されたポリペプチド」という用語は、当技術分野において公知であり、かつ組換え法、生化学的方法および合成法を含む任意の方法または方法の組合せにより、その自然環境から取り出されたアミノ酸配列を指す。
「標的ペプチド」は、タンパク質、または細胞内オルガネラ、すなわちミトコンドリアもしくはプラスチドに対するポリペプチド、または細胞外空間に対するポリペプチド（分泌シグナルペプチド）を標的とするアミノ酸配列を指す。標的ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端、例えばＮ－末端をコードする核酸配列に融合されてよく、または天然の標的ポリペプチドを置き換えるために使用されてよい。
本発明は、本明細書に具体的に記載されたポリペプチドの「機能的等価体」（「類似体」または「機能的突然変異」とも呼ばれる）にも関する。
例えば、「機能的等価体」は、酵素的テルペニル二リン酸シンターゼ活性またはテルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を測定するために用いられる試験において、本明細書に具体的に記載されたポリペプチドよりも少なくとも１～１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％高い活性または低い活性を示すポリペプチドを指す。
本発明によれば、「機能的等価体」は、本明細書に記載されるアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に記載されたアミノ酸とは異なるが、それでも例えば酵素活性のような前述の生物学的活性のうちの１つを持つアミノ酸を有する特定の突然変異体も包含する。したがって「機能的等価体」は、１～２０個、特に１～１５個または５～１０個のような１個以上のアミノ酸付加、置換、特に保存的置換、欠失および／または逆位により得ることができ、記載した変化が本発明による特性のプロファイルを有する突然変異体をもたらすことを条件として任意の配列位置で起こり得る突然変異体を含む。特に、活性パターンが突然変異体と未変化のポリペプチドとの間で定性的に一致すれば、すなわち、例えば速度は異なるが同じアゴニストまたはアンタゴニストまたは基質との相互作用（すなわちＥＣ５０値もしくはＩＣ５０値または本技術分野において適したその他の任意のパラメータによって表される）が観察されれば、機能的等価性が同じく与えられる。適した（同類）アミノ酸置換の例を以下の表に示す：
Figure 2024029002000006
上記の意味での「機能的等価体」は、本明細書に記載されるポリペプチドの「前駆体」、ならびにこのポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
その場合は、「前駆体」は、所望の生物学的活性があるまたはないポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
「塩」という表現は、本発明によるタンパク質分子のカルボキシル基の塩ならびにアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は公知の方法で生成することができ、無機塩、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩および亜鉛塩、ならびに有機塩基、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンおよび同種のものなどのアミンとの塩が含まれる。酸付加塩、例えば塩酸または硫酸などの無機酸との塩、ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩も本発明により包含される。
本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」は、官能基のアミノ酸側基上で、またはそのＮ－末端またはＣ－末端において公知の技法を用いて生成することもできる。このような誘導体には、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応により得ることができるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応により生成される遊離アミノ基のＮ－アシル誘導体；またはアシル基との反応により生成される遊離ヒドロキシル基のＯ－アシル誘導体が含まれる。
「機能的等価体」には天然に、他の生物から得ることができるポリペプチド、ならびに天然に存在する変異体も含まれる。例えば、相同配列領域の部分は配列比較により確立することができて、本発明の具体的なパラメータに基づいて等価なポリペプチドを決定することができる。
「機能的等価体」は、個々のドメインまたは配列モチーフのような、本発明によるポリペプチドの「断片」、またはＮ－および／またはＣ－末端切断型も含み、これらは、所望の生物学的機能を示しても、示さなくてもよい。好ましくは、このような「断片」は、所望の生物学的機能を少なくとも定性的に保持する。
「機能的等価体」はさらに融合タンパク質であり、これは、本明細書に記載されるポリペプチド配列のうちの１つまたはそれに由来する機能的等価体と、官能基のＮ－末端またはＣ－末端会合に（すなわち融合タンパク質部分の実質的な相互機能障害なしに）少なくとも１つのさらなる、機能的に異なる異種配列とを有する。これらの異種配列の非限定的な例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
本発明にしたがって同じく含まれる「機能的等価体」は、具体的に開示されたポリペプチドの相同体である。これらは、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムにより計算された、具体的に開示されたアミノ酸配列のうちの１つとの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０％または８５％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの相同性（または同一性）を有する。百分率として表される本発明による相同ポリペプチドの相同性または同一性は、特に、本明細書に具体的に記載のアミノ酸配列のうちの１つの全長に基づいて百分率として表されるアミノ酸残基の同一性を意味する。
百分率として表される同一性データは、ＢＬＡＳＴアラインメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）を利用して、または本明細書において以下で指定するクラスタル設定を適用することにより決定することもできる。
可能性のあるタンパク質グリコシル化の場合、本発明による「機能的等価体」には、脱グリコシル化またはグリコシル化された形態ならびにグリコシル化パターンを変更することにより得ることができる改変された形態の本明細書に記載のポリペプチドが含まれる。
本発明によるポリペプチドの機能的等価体または相同体は、突然変異誘発、例えばタンパク質の点突然変異、延長もしくは短縮により、または以下でより詳しく説明する通り生成することができる。
本発明によるポリペプチドの機能的等価体または相同体は、突然変異体、例えば短縮突然変異体のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることにより同定することができる。例えば、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素連結により、タンパク質変異体の多様なデータベースを生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な相同体のデータベースを生成するために使用することができる方法は非常に多く存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、次いで、合成遺伝子を適した発現ベクター内で連結することができる。縮重ゲノムを使用すると、所望のセットの潜在的なタンパク質配列をコードするすべての配列を混合物で供給することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は当業者に公知である。
先行技術において、点突然変異または短縮により生成されたコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物をスクリーニングするための技法および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技法がいくつか公知である。これらの技法を、本発明による相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により作成された遺伝子バンクを迅速にスクリーニングするように適合させることができる。ハイスループット分析に基づく大規模な遺伝子バンクをスクリーニングするために最も頻繁に用いられる技法は、複製可能な発現ベクターに遺伝子バンクをクローニングすることと、得られたベクターデータベースで適した細胞を形質転換することと、所望の活性を検出することにより、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件でコンビナトリアル遺伝子を発現させることとを含む。相同体を同定するために、データベース中の機能的突然変異体の頻度を増加させる技法である帰納的集合突然変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニング試験と組み合わせて使用することができる。
本明細書に記載の実施形態は、本明細書に開示のポリペプチドのオーソログおよびパラログならびにこのようなオーソログおよびパラログを同定および単離するための方法を提供する。「オーソログ」および「パラログ」という用語の定義は以下に示され、アミノ酸配列および核酸配列に適用される。
ｃ．本発明にしたがって適用可能なコード核酸配列
この文脈において以下の定義が適用される：
「核酸配列」、「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、ヌクレオチドの配列を意味する。核酸配列は、一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、または任意の長さのリボヌクレオチドであってよく、遺伝子のコード配列および非コード配列、エクソン、イントロン、センスおよびアンチセンス相補的配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、組換え核酸配列、単離および精製された天然に存在するＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ配列、合成ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列、断片、プライマーならびに核酸プローブが含まれる。ＲＮＡの核酸配列はＤＮＡ配列と同一であるがチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置き換えられているという違いがあることを当業者は認識している。「ヌクレオチド配列」という用語は、別々の断片の形態で、またはより大きい核酸の構成要素として、ポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を含むことも理解されるべきである。
「単離された核酸」または「単離された核酸配列」は、核酸または核酸配列が天然に存在する環境とは異なる環境中にあり、かつ内因性材料の汚染が実質的にないものを含むことができる核酸または核酸配列に関する。
本明細書において使用される「天然に存在する」という用語は、核酸に適用されるとき、生物の細胞に天然に見出される、実験室において人間によって意図的に改変されていない核酸を指す。
ポリヌクレオチドまたは核酸配列の「断片」は、本明細書における実施形態のポリヌクレオチドの長さが特に少なくとも１５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐおよび／または少なくとも６０ｂｐである連続するヌクレオチドを指す。特にポリヌクレオチドの断片は、本明細書における実施形態のポリヌクレオチドの少なくとも２５個、とりわけ少なくとも５０個、とりわけ少なくとも７５個、とりわけ少なくとも１００個、とりわけ少なくとも１５０個、とりわけ少なくとも２００個、とりわけ少なくとも３００個、とりわけ少なくとも４００個、とりわけ少なくとも５００個、とりわけ少なくとも６００個、とりわけ少なくとも７００個、とりわけ少なくとも８００個、とりわけ少なくとも９００個、とりわけ少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドを含む。限定されることなく、ポリヌクレオチドの断片は本明細書において、ＰＣＲプライマーおよび／もしくはプローブとして、またはアンチセンス遺伝子サイレンシングもしくはＲＮＡｉのために使用され得る。
本明細書において使用されるとき、ある条件下の「ハイブリダイゼーション」またはハイブリダイズという用語は、互いに有意に同一または相同なヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を表すことを意図している。この条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、および例えば少なくとも約８５％、９０％、または９５％同一である配列が互いに結合したままであるようなものであり得る。低ストリンジェンシー、中、および高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義は本明細書において以下で記載する。Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, sections 2, 4, and 6)に例示の通り最小限の実験で適切なハイブリダイゼーション条件を当業者が選択することもできる。加えて、ストリンジェンシー条件はSambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, chapters 7, 9, and 11)に記載されている。
「組換え核酸配列」は、実験室的方法（例えば分子クローニング）を使用して１つを超える源から遺伝子材料を集め、天然に存在せず、それ以外の条件では生物学的生物に見出されないであろう核酸配列を作製または改変することにより得られる核酸配列である。
「組換えＤＮＡ技術」は、例えばLaboratory Manuals edited by Weigel and Glazebrook, 2002, Cold Spring Harbor Lab Press；およびSambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の通り組換え核酸配列を製造する分子生物学の手順を指す。
「遺伝子」という用語は、適した調節領域、例えばプロモーターに作動可能に結合された、ＲＮＡ分子内、例えば細胞内のｍＲＮＡ内に転写される領域を含むＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、いくつかの作動可能に結合された配列、例えばプロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのコード領域、イントロン、エクソン、および／または例えば転写終結点を含む３’非翻訳配列を含み得る。
「ポリシストロニック」は、同じ核酸分子内で１つを超えるポリペプチドを別々にコードすることができる核酸分子、特にｍＲＮＡを指す
「キメラ遺伝子」は、ある種において通常天然に存在しない任意の遺伝子、特に、性質上互いに会合しない核酸配列の１つまたは複数の部分が存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、転写領域の一部もしくはすべてと、または別の調節領域と性質上会合しない。「キメラ遺伝子」という用語は、１つ以上のコード配列に、またはアンチセンス、すなわちセンス鎖の逆相補鎖または逆方向反復配列（センスおよびアンチセンス、それによってＲＮＡ転写物が転写時に二本鎖ＲＮＡを形成する）にプロモーターまたは転写調節配列が作動可能に結合されている発現構築物を含むと理解される。「キメラ遺伝子」という用語は、新しい遺伝子を作製するために１つ以上のコード配列の部分を組み合わせることにより得られた遺伝子も含む。
「３’ＵＴＲ」または「３’非翻訳配列」（「３’非翻訳領域」または「３’末端」とも呼ばれる）は、遺伝子のコード配列の下流に見出される核酸配列を指し、これは、例えば、転写終結点および（すべてではないがほとんどの真核生物ｍＲＮＡにおける）ポリアデニル化シグナル、例えばＡＡＵＡＡＡまたはその変異体を含む。転写終結後、ｍＲＮＡ転写物がポリアデニル化シグナルの下流で切断されてよく、さらにポリ（Ａ）テールが付加されてよく、これは、翻訳部位、例えば細胞質へのｍＲＮＡの輸送に関与する。
「プライマー」という用語は、鋳型核酸配列にハイブリダイズされ、鋳型に相補的な核酸配列の重合に使用される短い核酸配列を指す。
「選択可能なマーカー」という用語は、選択可能なマーカーを含む細胞を選択するために発現時に使用することができる任意の遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例を以下に記載する。様々な抗生物質、殺真菌剤、栄養要求性または除草剤の選択可能なマーカーが、様々な標的種に適用可能であることが当業者には分かるであろう。
本発明は、本明細書に定義されたポリペプチドをコードする核酸配列にも関する。
特に、本発明は、上記のポリペプチドおよびそれらの機能的等価体のうちの１つをコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ）にも関し、この核酸配列は、例えば人工ヌクレオチド類似体を使用して得ることができる。
本発明は、本発明によるポリペプチドまたはその生物学的に活性なセグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明によるコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸断片との両方に関する。
本発明は、本明細書に具体的に開示された配列とのある程度の「同一性」を有する核酸にも関する。２つの核酸の間の「同一性」は、それぞれの場合における核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味する。
２つのヌクレオチド配列の間の「同一性」（同じことがペプチド配列またはアミノ酸配列に当てはまる）は、ヌクレオチド残基（またはアミノ酸残基）の数の関数であり、または２つの配列のアラインメントが生成されたときにこれら２つの配列において同一であるヌクレオチド残基（またはアミノ酸残基）の数の関数である。同一の残基は、アラインメントの所与の位置にある２つの配列において同じである残基と定義される。配列同一性の百分率は、本明細書において使用されるとき、２つの配列間で同一の残基の数を最も短い配列の残基の総数で割って１００を掛けることにより、最適なアラインメントから計算される。最適なアラインメントは、同一性の百分率が可能な限り高いアラインメントである。最適なアラインメントを得るためにギャップをアラインメントの１つまたは複数の位置で片方または両方の配列に導入することができる。次いで、このギャップは、配列同一性の百分率の計算のために、同一でない残基として考慮される。アミノ酸または核酸の配列同一性の百分率を決定するためのアラインメントは、コンピュータプログラムおよび例えばワールドワイドウェブ上で入手可能な公的に利用可能なコンピュータプログラムを使用する様々な方法で実現することができる。
特に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉにあるウェブサイトから入手可能なデフォルトパラメータに設定されたＢＬＡＳＴプログラム（Tatiana et al, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250, 1999）を使用してタンパク質配列または核酸配列の最適なアラインメントを得、配列同一性の百分率を計算することができる。
別の例では、同一性は、Informax社（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１プログラムにより、クラスタル法（Higgins DG, Sharp PM. ((1989))）を用いて、以下の設定で計算することができる：
マルチプルアラインメントパラメータ：
ギャップオープニングペナルティ １０
ギャップ伸長ペナルティ １０
ギャップ長ペナルティ範囲 ８
ギャップ長ペナルティ オフ
アラインメント遅延に対する％同一性 ４０
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション重み付け ０
ペアワイズアラインメントパラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム オン
Ｋ－タプルサイズ １
ギャップペナルティ ３
ウィンドウサイズ ５
ベストダイアゴナルの数 ５
あるいは、同一性は、Chenna, et al. (2003)、ウェブページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃および以下の設定にしたがって決定することができる
ＤＮＡギャップオープンペナルティ １５．０
ＤＮＡギャップ伸長ペナルティ ６．６６
ＤＮＡ行列 同一性
タンパク質ギャップオープンペナルティ １０．０
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ ０．２
タンパク質行列 Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク質／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ －１
タンパク質／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ ４
本明細書で述べるすべての核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドビルディングブロックから化学合成することにより、例えば、二重らせんの個々のオーバーラップする、相補的な核酸ビルディングブロックを断片縮合することにより、公知の方法で作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法により、公知の方法で実施することができる（Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press, New York, pages 896-897）。合成オリゴヌクレオチドの蓄積およびＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によるギャップの充填および連結反応ならびに一般的なクローニング技法は、Sambrook et al. (1989)に記載されている（下記参照）。
本発明による核酸分子は加えて、コード遺伝子領域の３’および／または５’末端からの非翻訳配列を含むことができる。
本発明はさらに、具体的に記載されるヌクレオチド配列またはそのセグメントに相補的である核酸分子に関する。
本発明によるヌクレオチド配列によって、他の細胞型および生物において相同配列を同定および／またはクローニングするために使用することができるプローブおよびプライマーの作製が可能になる。このようなプローブまたはプライマーは一般に、本発明による核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、例えば約４０個、５０個または７５個の連続するヌクレオチドに（本明細書の他の場所に定義された）「ストリンジェントな」条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
「相同」配列には、オーソロガス配列またはパラロガス配列が含まれる。系統発生法、配列類似法およびハイブリダイゼーション法を含むオーソログまたはパラログを同定する方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。
「パラログ」は、類似配列および類似機能を有する２つ以上の遺伝子を生じる遺伝子重複から生じる。パラログは典型的には、互いにクラスター形成し、関連する植物種内で遺伝子の重複により形成される。パラログは、ペアワイズＢｌａｓｔ解析を使用して類似の遺伝子の群に見出され、またはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用した遺伝子ファミリーの系統発生解析中に見出される。パラログでは、関連する遺伝子内の配列および遺伝子の類似機能を有する配列に対して特徴的なコンセンサス配列を同定することができる。
「オーソログ」、またはオーソロガス配列は共通祖先の子孫である種に見出されることから、互いに類似する配列である。例えば、共通祖先を有する植物種は、類似する配列および機能を有する多くの酵素を含むことが公知である。当業者は、オーソロガス配列を同定することができ、例えばＣＬＵＳＴＡＬプログラムまたはＢＬＡＳＴプログラムを使用して１つの種の遺伝子ファミリーのポリジーン系図を構築することにより、オーソログの機能を予測することができる。相同配列の間で類似機能を同定または確認するための方法は、（ノックアウト／ノックダウンにおいて）関連するポリペプチドを過剰発現させる、または欠く、植物または微生物などの宿主細胞または生物において転写プロファイルを比較することによるものである。５０％を超える共通の調節転写物、または７０％を超える共通の調節転写物、または９０％を超える共通の調節転写物を有する類似の転写プロファイルを有する遺伝子が類似機能を有するであろうことを当業者なら理解するであろう。本明細書における配列の相同体、パラログ、オーソログおよびその他の任意の変異体は、テルペンシンターゼタンパク質を産生する植物または微生物などの宿主細胞、生物を作製することにより同様に機能すると予想される。
「選択可能なマーカー」という用語は、選択可能なマーカーを含む細胞を選択するために発現時に使用することができる任意の遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例を以下に記載する。様々な抗生物質、殺真菌剤、栄養要求性または除草剤の選択可能なマーカーが、様々な標的種に適用可能であることが当業者には分かるであろう。
「単離された」核酸分子は、その核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されており、さらに、組換え技法により生成される場合、他の細胞材料または培養培地が実質的にないものにすることができ、または化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質がないものにすることができる。
本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的な技法および本発明により提供される配列情報により単離することができる。例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして具体的に開示された全配列のうちの１つまたはそのセグメントおよび標準的なハイブリダイゼーション技法（例えばSambrook, (1989)に記載）を用いて、ｃＤＮＡを適したｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。
加えて、開示の配列のうちの１つまたはそのセグメントを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる。このようにして増幅された核酸は、適したベクターにクローニングすることができ、ＤＮＡ配列決定により特徴付けることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して作製することもできる。
本発明による核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体または一部は、例えば、通常のハイブリダイゼーション技法またはＰＣＲ技法により、例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを介して他の細菌から単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、標準条件で本発明による配列とハイブリダイズする。
「ハイブリダイズ」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがほぼ相補的な配列と標準条件で結合できるが、非特異的結合が非相補的なパートナー間ではこの条件で起こらないことを意味する。このために、配列は９０～１００％相補的であり得る。互いに特異的に結合することができる相補的な配列の特性は、例えばノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティングにおいて、またはＰＣＲもしくはＲＴ－ＰＣＲのプライマー結合において利用される。
保存領域の短いオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに有利に使用される。しかし、本発明による核酸のより長い断片または全配列をハイブリダイゼーションに使用することも可能である。使用される核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片または全配列）に応じて、またはどちらのタイプの核酸－ＤＮＡまたはＲＮＡ－がハイブリダイゼーションに使用されるかに応じてこの「標準条件」は様々である。例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約１０℃低い。
例えば、特定の核酸に応じて、標準条件は、０．１～５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の間の濃度を有する緩衝水溶液中の４２～５８℃の間の温度を意味し、または加えて５０％ホルムアミドが存在する条件、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中の４２℃を意味する。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件が０．１×ＳＳＣおよび約２０℃～４５℃の間の、好ましくは約３０℃～４５℃の間の温度であることが有利である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣおよび約３０℃～５５℃の間の、好ましくは約４５℃～５５℃の間の温度である。ハイブリダイゼーションための記載したこれらの温度は、ホルムアミド不在下の長さ約１００ヌクレオチドおよびＧ＋Ｃ含量５０％の核酸について計算された融解温度値の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばSambrook et al., 1989に記載されており、当業者に公知である式を用いて、例えば核酸の長さ、ハイブリッドのタイプまたはＧ＋Ｃ含量に応じて計算することができる。当業者は、ハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を以下の教科書から得ることができる：Ausubel et al. (eds), (1985)、Brown (ed) (1991)。
「ハイブリダイゼーション」は特にストリンジェントな条件下で行うことができる。このようなハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook (1989)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
本明細書において使用されるとき、ある条件下のハイブリダイゼーションまたはハイブリダイズという用語は、互いに有意に同一または相同なヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を表すことを意図している。この条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、および例えば少なくとも約８５％、９０％、または９５％同一である配列が互いに結合したままであるようなものであり得る。低ストリンジェンシー、中、および高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義は本明細書に記載される。
Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, sections 2, 4, and 6)に例示の通り最小限の実験で適切なハイブリダイゼーション条件を当業者が選択することができる。加えて、ストリンジェンシー条件はSambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, chapters 7, 9, and 11)に記載されている。
本明細書において使用されるとき、低ストリンジェンシーの定義された条件は以下の通りである。ＤＮＡを含むフィルターが、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４０℃で６時間前処理される。ハイブリダイゼーションは、以下の改変を加えた同じ溶液中で行われる：０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸、および５～２０×１０６ ３２Ｐ標識プローブが使用される。フィルターは、ハイブリダイゼーション混合物中、４０℃で１８～２０時間インキュベートされ、次いで、５５℃で１．５時間洗浄される。２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳを含む溶液中。この洗浄溶液が新鮮な溶液に交換され、６０℃でさらに１．５時間インキュベートされる。フィルターを拭き取り乾燥し、オートラジオグラフィーのために露出させる。
本明細書において使用されるとき、中ストリンジェンシーの定義された条件は以下の通りである。ＤＮＡを含むフィルターが、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、５０℃で７時間前処理される。ハイブリダイゼーションは、以下の改変を加えた同じ溶液中で行われる：０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸、および５～２０×１０６ ３２Ｐ標識プローブが使用される。フィルターは、ハイブリダイゼーション混合物中、５０℃で３０時間インキュベートされ、次いで、５５℃で１．５時間洗浄される。２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤＳを含む溶液中。この洗浄溶液が新鮮な溶液に交換され、６０℃でさらに１．５時間インキュベートされる。フィルターを拭き取り乾燥し、オートラジオグラフィーのために露出させる。
本明細書において使用されるとき、高ストリンジェンシーの定義された条件は以下の通りである。ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションが、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中、６５℃で８時間～一晩行われる。フィルターは、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５～２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で４８時間ハイブリダイズされる。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％ Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ ＢＳＡを含む溶液中、３７℃で１時間行われる。この後、０．１×ＳＳＣ中、５０℃で４５分間の洗浄が続く。
上記の条件が不適切である場合（例えば異種間ハイブリダイゼーションに使用されるとき）、当技術分野において周知の低、中、および高ストリンジェンシーの他の条件（例えば異種間ハイブリダイゼーションに使用されるとき）が使用されてよい。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列のための検出キットは、このポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブ、ならびにサンプル中のポリペプチドをコードする核酸配列を検出するためにこのプライマーおよび／またはプローブを使用する関連プロトコールを含んでよい。このような検出キットを使用して、植物、生物、微生物または細胞が改変されたかどうか、すなわち、ポリペプチドをコードする配列で形質転換されたかどうかを判定することができる。
本明細書における実施形態にしたがって変異ＤＮＡ配列の機能を試験するために、対象の配列が、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に作動可能に結合され、前記レポーター遺伝子の発現が、例えば微生物またはプロトプラストを用いて、または安定形質転換植物において、一過性発現アッセイで試験される。
本発明は、具体的に開示された核酸配列または誘導可能な核酸配列の誘導体にも関する。
したがって、本発明によるさらなる核酸配列を本明細書に具体的に開示された配列から誘導することができ、このさらなる核酸配列は、１個または数個（例えば１～１０個など）のヌクレオチドの１～２０個、特に１～１５個または５～１０個のような１個または複数個の付加、置換、挿入または欠失が本明細書に具体的に開示された配列とは異なり得、さらに、特性の所望のプロファイルを有するポリペプチドをコードすることができる。
本発明は、いわゆるサイレント突然変異を含む核酸配列、または特殊な元の生物または宿主生物のコドン使用頻度にしたがって、具体的に記載された配列と比較して変更された核酸配列も包含する。
本発明のある特定の実施形態によれば、変異核酸が、そのヌクレオチド配列をある特異的発現系に適合させるために製造されてよい。例えば、細菌発現系は、アミノ酸が特定のコドンによってコードされる場合、ポリペプチドをより効率的に発現させることが公知である。遺伝暗号の縮重のために、１つを超えるコドンが同じアミノ酸配列をコードする場合があり、複数の核酸配列が同じタンパク質またはポリペプチドをコードすることができ、これらのＤＮＡ配列はすべて本明細書における実施形態により包含される。適切な場合、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主細胞における発現を増加させるために最適化されてよい。例えば、本明細書における実施形態の核酸が、発現を改善するために宿主に特別なコドンを使用して合成されてよい。
本発明は、本発明に記載の配列の天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体またはアレル変異体も包含する。
アレル変異体は、全配列範囲にわたり誘導アミノ酸のレベルにおける少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、特に非常に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し得る（アミノ酸レベルにおける相同性に関して、ポリペプチドについて上述した詳細を参照すべきである）。相同性が配列の部分領域にわたってより高くなることが有利であり得る。
本発明は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、その結果として当該アミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解性のアミノ酸で置き換えられる）により得ることができる配列にも関する。
本発明は、具体的に開示の核酸から配列多型により誘導された分子にも関する。このような遺伝子多型は、自然のアレル変異のために異なる集団からの細胞内または集団内の細胞内に存在し得る。アレル変異体は機能的等価体も含み得る。これらの自然変異は通常、遺伝子のヌクレオチド配列に１～５％の変動を生じる。前記多型は、本明細書に開示のポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらし得る。アレル変異体は機能的等価体も含み得る。
さらに、誘導体はまた、本発明による核酸配列の相同体、例えば動物、植物、真菌または細菌の相同体、短縮配列、コードおよび非コードＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであると理解されるべきである。例えば、相同体は、ＤＮＡレベルにおいて、本明細書に具体的に開示の配列内に与えられた全ＤＮＡ領域にわたり少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、特に非常に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
さらに、誘導体は、例えばプロモーターとの融合体と理解されるべきである。記載したヌクレオチド配列に付加されるプロモーターは、プロモーターの機能性または有効性を損なうことなく、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、逆位および／または欠失により改変することができる。さらに、プロモーターの有効性は、その配列を変更することにより高めることができ、または異なる属の生物のより効果的なプロモーターとすら完全に交換することができる。
ｄ．機能的ポリペプチド突然変異体の生成
さらに、当業者は、機能的突然変異体、すなわち、本明細書に開示のアミノ酸関連配列番号のいずれか１つとの少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチド、および／または本明細書に開示のヌクレオチド関連配列番号のいずれか１つとの少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成するための方法に精通している。
使用される技法に応じて、当業者は、完全にランダムな突然変異、そうでなければより定方向な突然変異を遺伝子、そうでなければ（例えば発現の調節に重要な）非コード核酸領域に導入し、続いて遺伝子ライブラリーを作製することができる。この目的のために必要な分子生物学の方法は、当業者に公知であり、例えばSambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001に記載されている。
例えば以下のような遺伝子を改変するための方法、したがって遺伝子によってコードされるポリペプチドを改変するための方法が長い間当業者に公知である。
－部位特異的突然変異誘発（この場合、遺伝子の個々または数個のヌクレオチドが定方向に置き換えられる）（Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、
－飽和突然変異誘発（この場合、任意のアミノ酸のコドンが遺伝子の任意の点において交換または付加され得る）（Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1）、
－エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（この場合、ヌクレオチド配列がエラープローンＤＮＡポリメラーゼにより突然変異される）（Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739）；
－ＳｅＳａＭ法（配列飽和法）（この場合、好ましい交換がポリメラーゼによって妨げられる）。Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279
－ミューテーター株における遺伝子の継代（この場合、例えば不完全なＤＮＡ修復機構のために、ヌクレオチド配列の突然変異率が増加する）（Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、または
－ＤＮＡシャッフリング（この場合、密接に関連した遺伝子のプールが形成および消化され、その断片がポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、ここで鎖分離および再会合が繰り返されることにより、全長のモザイク遺伝子が最終的に生成される）（Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747）。
いわゆる定向進化（とりわけ、Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial polypeptides by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyに記載されている）を使用して、当業者は、機能的突然変異体を定方向かつ大規模に作製することができる。この目的のために、第１のステップにおいて、それぞれのポリペプチドの遺伝子ライブラリーが、例えば上述の方法を使用して、まず作製される。遺伝子ライブラリーは、適した方法で、例えば細菌またはファージディスプレイ系により発現される。
所望の特性に概ね対応する特性を有する機能的突然変異体を発現する宿主生物の関連する遺伝子は、別の突然変異サイクルに供することができる。突然変異および選択またはスクリーニングのステップは、存在する機能的突然変異体が十分な程度に所望の特性を有するまで反復して繰り返すことができる。この反復手順を用いて、限られた数の突然変異、例えば１回、２回、３回、４回または５回の突然変異を段階的に実施し、当該活性に対するそれらの影響に関して評価および選択することができる。次いで、選択された突然変異体をさらなる突然変異ステップに同じように供することができる。このようにして、調査すべき個々の突然変異体の数を大幅に減少させることができる。
本発明による結果はまた、所望の改変された特性を有するさらなるポリペプチドを標的として生成するのに必要な、関連するポリペプチドの構造および配列に関する重要な情報を提供する。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち、標的突然変異を導入することによりある特性を改変するのに潜在的に適している配列セグメントを明確にすることが可能である。
その領域において、おそらく活性にほとんど影響を及ぼさないはずである突然変異を行うことができ、潜在的な「サイレント突然変異」と呼ぶことができる、アミノ酸配列位置に関する情報も推定することができる。
ｅ．本発明のポリペプチドを発現させるための構築物
この文脈において以下の定義が適用される：
「遺伝子の発現」は、「異種発現」および「過剰発現」を包含し、遺伝子の転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を含む。過剰発現は、類似の遺伝的背景の非形質転換細胞または生物における産生のレベルを超える、トランスジェニック細胞または生物におけるｍＲＮＡ、ポリペプチドおよび／または酵素活性のレベルにより測定される遺伝子産物の産生を指す。
本明細書において使用される「発現ベクター」は、宿主細胞内に外来性または外因性ＤＮＡを送達するための分子生物学の方法および組換えＤＮＡ技術を使用して操作された核酸分子を意味する。発現ベクターは典型的には、ヌクレオチド配列の適切な転写に必要な配列を含む。コード領域は通常、対象のタンパク質をコードするが、ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび同種のものもコードすることができる。
本明細書において使用される「発現ベクター」は、これらに限定されないがウイルスベクター、バクテリオファージおよびプラスミドを含む任意の線状または環状の組換えベクターを含む。当業者は、発現系にしたがって適したベクターを選択することができる。１つの実施形態において、発現ベクターは、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサーなどの、転写、翻訳、開始および終結を制御する少なくとも１つの「調節配列」に作動可能に結合された本明細書における実施形態の核酸またはｍＲＮＡリボソーム結合部位を含み、任意選択で少なくとも１つの選択マーカーを含む。調節配列が本明細書における実施形態の核酸に機能的に関連するとき、ヌクレオチド配列は「作動可能に結合され」ている。
本明細書において使用される「発現系」は、所与の発現宿主のイン・ビボでの、またはイン・ビトロでの１種のポリペプチドの発現または２種以上のポリペプチドの同時発現に必要な核酸分子の任意の組合せを包含する。それぞれのコード配列は、単一の核酸分子上、もしくは例えば複数のクローニング部位を含むベクターのような単一のベクター上、もしくはポリシストロニック核酸上に位置し得、または２つ以上の物理的に異なるベクターにわたって分布し得る。特定の例として、本明細書に記載の酵素をそれぞれコードする１つのプロモーター配列、１つまたは複数のオペレーター配列および１つまたは複数の構造遺伝子を含むオペロンに言及することができる
本明細書において使用されるとき、「を増幅する」および「増幅」という用語は、以下で詳しく説明する通り、天然に発現された核酸の組換えを生じる、または検出するための任意の適した増幅手法の使用を指す。例えば、本発明は、本発明の天然に発現された（例えばゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ）核酸または組換え（例えばｃＤＮＡ）核酸をイン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・ビトロで（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲにより）増幅するための方法および試薬（例えば特異的縮重オリゴヌクレオチドプライマー対、オリゴｄＴプライマー）を提供する。
「調節配列」は、本明細書における実施形態の核酸配列の発現レベルを決定し、かつ調節配列に作動可能に結合された核酸配列の転写速度を調節することができる核酸配列を指す。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、転写因子、プロモーターエレメントおよび同種のものが含まれる。
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」は、本発明によれば、転写される核酸に機能的に結合されたとき、前記核酸の転写を調節する核酸を意味すると理解される。「プロモーター」は特に、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ならびにこれらに限定されないが転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位を含む、適切な転写に必要な他の因子の結合部位を提供することによりコード配列の発現を制御する核酸配列を指す。プロモーターという用語の意味は、「プロモーター調節配列」という用語も含む。プロモーター調節配列は、関連するコード核酸配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性に影響し得る上流および下流のエレメントを含み得る。プロモーターには天然由来配列および合成配列が含まれる。コード核酸配列は、通常、転写開始点から開始する転写の方向に対してプロモーターの下流に位置する。
この文脈において、「機能的」または「作動的」結合は、例えば、調節配列を含む核酸のうちの１つの逐次配置を意味すると理解される。例えば、プロモーター活性を有する配列と、転写される核酸配列および任意選択でさらなる調節エレメントの配列、例えば、核酸の転写を確実にする核酸配列、ならびに例えばターミネーターが、核酸配列の転写時に調節エレメントのそれぞれがその機能を果たすことができるように結合される。これは化学的意味での直接結合を必ずしも必要としない。遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列は、より離れた位置から、またはさらに他のＤＮＡ分子から標的配列に対してその機能を発揮することさえできる。好ましい配置は、２つの配列が互いに共有結合されるように転写される核酸配列がプロモーター配列の後ろ（すなわち３’－末端）に位置する配置である。プロモーター配列と、組換え発現される核酸配列の間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対未満または５０塩基対未満であり得る。
プロモーターおよびターミネーターに加えて、他の調節エレメントの例として以下に言及することができる：ターゲティング配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製開始点および同種のもの。適した調節配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
「構成的プロモーター」という用語は、これが作動可能に結合されている核酸配列の連続的な転写を可能にする未調節のプロモーターを指す。
本明細書において使用されるとき、「作動可能に結合され」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの結合を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれているとき、「作動可能に結合され」ている。例えば、プロモーター、またはむしろ転写調節配列は、もしコード配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作動可能に結合されている。作動可能に結合とは、結合されているＤＮＡ配列が典型的には連続することを意味する。プロモーター配列に関連するヌクレオチド配列は、形質転換される植物に関して同種または異種起源のものでよい。この配列はまた、完全にまたは部分的に合成であってよい。起源に関わらず、プロモーター配列に関連する核酸配列は、本明細書における実施形態のポリペプチドに結合した後にこれが結び付けられるプロモーター特性にしたがって発現またはサイレンシングされることになる。関連する核酸は、生物全体にわたり常にあるいはある特定の時間にまたは特定の組織、細胞もしくは細胞区画で発現または抑制されることが望ましいタンパク質をコードすることができる。このようなヌクレオチド配列は特に、それにより変更または形質転換された宿主細胞または生物に望ましい表現型特性を与えるタンパク質をコードする。とりわけ、関連するヌクレオチド配列は、細胞または生物において、本明細書に定義された対象の生成物の産生をもたらす。特に、ヌクレオチド配列は、本明細書に定義された酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
本明細書において上記のヌクレオチド配列は、「発現カセット」の一部であってよい。「発現カセット」および「発現構築物」という用語は同義で使用される。（好ましくは組換え）発現構築物は、本発明によるポリペプチドをコードし、かつ調節核酸配列の遺伝子制御下にあるヌクレオチド配列を含む。
本発明にしたがって適用されるプロセスにおいて、発現カセットは、「発現ベクター」の、特に組換え発現ベクターの一部であってよい。
「発現ユニット」は、本発明によれば、本明細書に定義されたプロモーターを含み、かつ発現される核酸、または遺伝子と機能的結合した後、発現、すなわち前記核酸または前記遺伝子の転写および翻訳を調節する、発現活性を有する核酸を意味すると理解される。したがって、これに関連して、発現ユニットは「調節核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加えて、他の調節エレメント、例えばエンハンサーも存在することができる。
「発現カセット」または「発現構築物」は、本発明によれば、発現される核酸または発現される遺伝子に機能的に結合されている発現ユニットを意味すると理解される。したがって、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果タンパク質として発現される核酸配列も含む。
「発現」または「過剰発現」という用語は、本発明の文脈において、対応するＤＮＡによってコードされる微生物中の１種または複数種のポリペプチドの細胞内活性の生成または増加を表す。この目的のために、例えば、遺伝子を生物に導入すること、既存の遺伝子を別の遺伝子で置き換えること、遺伝子のコピー数を増加させること、強いプロモーターを使用すること、または高い活性を有する、対応するポリペプチドをコードする遺伝子を使用することが可能であり、任意選択で、これらの手段を組み合わせることができる。
好ましくは、本発明によるこのような構築物は、それぞれの場合においてコード配列と作動的に結合された、それぞれのコード配列の５’上流のプロモーターおよび３’下流のターミネーター配列、ならびに任意選択で他の通常の調節エレメントを含む。
本発明による核酸構築物は、特に、例えば本発明に記載のアミノ酸関連配列番号またはその逆相補鎖から誘導されるポリペプチドまたはその誘導体および相同体をコードする配列を含み、これらは、遺伝子発現を制御するために、例えば増加させるために有利に、１つまたは複数の調節シグナルと動作可能にまたは機能的に結合されている。
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節が実際の構造遺伝子の前に依然として存在してよく、さらに任意選択で、自然調節がスイッチオフされ、遺伝子の発現を増加させるように遺伝子改変されていてよい。しかし、核酸構築物は、より単純な構成のものでもよく、すなわち、追加の調節シグナルがコード配列の前に挿入されておらず、天然のプロモーターがその調節により除去されていないものでもよい。その代わり、調節がもはや起こらず、遺伝子発現が増加するように、天然の調節配列が突然変異される。
好ましい核酸構築物は有利に、プロモーターと機能的に結合された既に述べた「エンハンサー」配列のうちの１つまたは複数も含み、この配列は、核酸配列の発現の向上を可能にする。さらなる調節エレメントまたはターミネーターなど、追加の有利な配列がＤＮＡ配列の３’－末端において挿入されてもよい。本発明による核酸の１つまたは複数のコピーが構築物中に存在してよい。構築物中、この構築物を選択するような、栄養要求性または抗生物質耐性を補完する遺伝子などの他のマーカーが任意選択で存在してもよい。
適した調節配列の例は、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ－ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ－ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ラムダ－ＰＲなどのプロモーター中またはラムダ－ＰＬプロモーター中に存在し、これらはグラム陰性細菌内で有利に使用される。さらなる有利な調節配列は、例えばグラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２中、酵母または真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ－６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ中に存在する。人工プロモーターも調節に使用されてよい。
宿主生物における発現のために、核酸構築物が例えばプラスミドまたはファージなどのベクターに有利に挿入され、これは、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする。ベクターは、プラスミドおよびファージに加えて、当業者に公知であるすべての他のベクター、すなわち例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミドおよび線状もしくは環状のＤＮＡまたは人工染色体も意味すると理解される。これらのベクターは、宿主生物において自律複製が可能であり、そうでなければ染色体複製が可能である。これらのベクターは、本発明のさらなる展開である。バイナリーベクターまたはｃｐｏ－組込みベクターも適用可能である。
適したプラスミドは、例えば、Ｅ．コリ（E.coli）においてｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１またはｐＢｄＣＩ、ストレプトミセス（Streptomyces）においてｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１、バチルス（Bacillus）においてｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム（Corynebacterium）においてｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７、真菌においてｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２またはｐＢＢ１１６、酵母において２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ－１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３または植物においてｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４またはｐＤＨ５１である。上述のプラスミドは、可能性のあるプラスミドを少数選択したものである。さらなるプラスミドは当業者に周知であり、例えば書籍Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に見出すことができる。
ベクターのさらなる展開において、本発明による核酸構築物または本発明による核酸を含むベクターは有利に、線状ＤＮＡの形態で微生物に導入し、非相同組換えまたは相同組換えにより宿主生物のゲノムに組み込むこともできる。この線状ＤＮＡは、プラスミドなどの線状化ベクターから、または本発明による核酸構築物もしくは核酸のみからなり得る。
生物における異種遺伝子の最適な発現のためには、この生物において使用される特定の「コドン使用頻度」に合わせて核酸配列を改変することが有利である。「コドン使用頻度」は、当該生物の他の公知の遺伝子をコンピュータ評価することにより容易に決定することができる。
本発明による発現カセットは、適したプロモーターを適したコードヌクレオチド配列およびターミネーターまたはポリアデニル化シグナルに融合させることにより生成される。この目的のために、例えばT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)およびT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)およびAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されているような通例の組換え技法およびクローニング技法が使用される。
適した宿主生物における発現のために、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに組換え核酸構築物または遺伝子構築物が有利に挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば“cloning vectors” (Pouwels P. H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見出すことができる。
本明細書における実施形態の代替の実施形態は、宿主細胞における「遺伝子発現を改変する」方法を提供する。例えば、本明細書における実施形態のポリヌクレオチドを宿主細胞または宿主生物において、ある文脈において（例えば、ある温度または培養条件に曝露時に）強化または過剰発現または誘導することができる。
本明細書において提供されるポリヌクレオチドの発現の変化はまた、変更された生物および対照または野生型生物における異なる発現パターンである異所性発現をもたらし得る。発現の変化は、本明細書における実施形態のポリペプチドと外因性または内因性モジュレーターとの相互作用により、またはポリペプチドの化学修飾の結果として生じる。この用語は、検出レベル未満に変化した、本明細書における実施形態のポリヌクレオチドの変更された発現パターン、または完全に抑制された活性も指す。
１つの実施形態では、本明細書において提供されるのは、さらに、本明細書において提供されるポリペプチドまたは変異ポリペプチドをコードする単離、組換えまたは合成ポリヌクレオチドである。
１つの実施形態において、核酸配列をコードするいくつかのポリペプチドは、単一の宿主内で、特に異なるプロモーターの制御下で同時発現される。別の実施形態において、核酸配列をコードするいくつかのポリペプチドは、単一の形質転換ベクター上に存在することができ、または別々のベクターを使用し、かつ両方のキメラ遺伝子を含む形質転換体を選択して、同時に同時形質転換することができる。同様に、１つまたはポリペプチドをコードする遺伝子を他のキメラ遺伝子と共に単一の植物、細胞、微生物または生物において発現させることができる。
ｆ．本発明に適用される宿主
文脈に応じて、「宿主」という用語は、野生型宿主もしくは遺伝子変更された組換え宿主またはその両方を意味し得る。
原則として、すべての原核生物または真核生物を本発明による核酸または核酸構築物のための宿主生物または組換え宿主生物と見なしてよい。
本発明によるベクターを使用して、例えば本発明による少なくとも１種のベクターで形質転換されており、かつ本発明によるポリペプチドを産生するために使用することができる組換え宿主を作製することができる。上述の本発明による組換え構築物が適した宿主系に導入されて発現されることが有利である。好ましくは、記載した核酸をそれぞれの発現系において発現させるための当業者に公知の一般的なクローニング法およびトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションおよび同種のものが使用される。適した系は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
細菌、真菌または酵母などの微生物が宿主生物として使用されることが有利である。グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくは腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、シュードモナス（Pseudomonas）科、リゾビウム科（Rhizobiaceae）、ストレプトミセス科（Streptomycetaceae）、連鎖球菌科（Streptococcaceae）またはノカルジア科（Nocardiaceae）の細菌、特に好ましくはエシェリキア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ノカルジア（Nocardia）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、サルモネラ（Salmonella）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、クロストリジウム（Clostridium）属またはロドコッカス（Rhodococcus）属の細菌が使用されることが有利である。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）属および種が特に非常に好ましい。さらに、他の有利な細菌は、α－プロテオバクテリア、β－プロテオバクテリアまたはγ－プロテオバクテリアの群に見出される。有利に、サッカロミセス（Saccharomyces）またはピキア（Pichia）のような科の酵母も適した宿主である。
あるいは、全植物または全植物細胞が天然または組換え宿主となり得る。非限定的な例として、以下の植物またはそれに由来する細胞に言及することができる。ニコチアナ（Nicotiana）属、特にニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）およびニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）（タバコ）；ならびにアラビドプシス（Arabidopsis）、特にアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）。
宿主生物に応じて、本発明による方法において使用される生物は、当業者に公知の方法で増殖または培養される。培養は、バッチ式、半バッチ式または連続式であり得る。栄養素は、発酵開始時に存在してよく、または後に半連続的にもしくは連続的に供給されてよい。これは以下でより詳しく説明する。
ｇ．本発明によるポリペプチドの組換え産生
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドまたはその生物学的に活性な機能的断片の組換え産生のための方法であって、ポリペプチドを産生する微生物が培養され、任意選択でポリペプチドの発現が、遺伝子発現を誘導する少なくとも１つの誘導因子を適用することにより誘導され、発現されたポリペプチドが培養物から単離される、方法に関する。ポリペプチドは、希望するならば工業的規模でこのように産生することもできる。
本発明にしたがって作製される微生物は、バッチ法または流加法もしくは反復流加法で連続的にまたは不連続的に培養することができる。公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教科書（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはＳｔｏｒｈａｓによる教科書（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)）に見出すことができる。
使用される培養培地は、それぞれの株の要件を適切に満たさなければならない。様々な微生物のための培養培地の説明はマニュアル”Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)に記載されている。
本発明にしたがって使用可能なこれらの培地は通常、１種または複数種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
好ましい炭素源は、単糖、二糖または多糖などの糖である。非常に良好な炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖は、糖蜜などの複合化合物、または精糖の他の副生成物を介して培地に加えることもできる。異なる炭素源の混合物を加えることも有利であり得る。その他の可能な炭素源は、油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸、アルコール、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノールならびに有機酸、例えば酢酸または乳酸である。
窒素源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例には、アンモニアガス、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、ナイトレート、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどの複合窒素源およびその他が含まれる。窒素源は、単独で、または混合物として使用することができる。
培地中に存在してよい無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン塩または硫酸塩が含まれる。
無機硫黄含有化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物、ならびにメルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物を硫黄源として使用することができる。
リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩をリン源として使用することができる。
金属イオンを溶液中に保つためにキレート剤を培地に加えることができる。特に適したキレート剤には、カテコールもしくはプロトカテクエートなどのジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸が含まれる。
本発明にしたがって使用される発酵培地は通常、ビタミンなどの他の増殖因子、または例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む成長促進物質も含む。増殖因子および塩はしばしば、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーおよび同種のものなどの複合培地の成分に由来する。さらに、適した前駆体を培養培地に加えることができる。培地中の化合物の厳密な組成は、それぞれの実験に強く依存し、具体的な場合毎に個々に決定される。培地の最適化に関する情報は、教科書”Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に見出すことができる。Ｓｔａｎｄａｒｄ １（Merck）またはＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン、DIFCO）および同種のものなどの増殖培地を市販業者から得ることもできる。
培地のすべての成分が熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分）または滅菌濾過により滅菌される。これらの成分は、一緒に、または必要であれば別々に滅菌することができる。培地のすべての成分が培養開始時に存在してよく、または連続的にまたはバッチ式で加えられてよい。
培養温度は、通常、１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃の間であり、実験の間に変えたり、一定に保ったりすることができる。培地のｐＨは、５～８．５の範囲内、好ましくはおよそ７．０であるべきである。成長のためのｐＨは、成長中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸化合物を加えることにより制御することができる。起泡を抑えるために消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、適した選択的物質、例えば抗生物質を培地に加えることができる。好気条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲空気が培養物中に供給される。培養物の温度は、通常２０℃～４５℃の範囲内である。培養は、所望の生成物が最大限産生されるまで継続される。この目標には、通常１０時間～１６０時間以内で到達する。
次いで、発酵ブロスがさらに加工される。要件に応じて、分離技法、例えば遠心分離、濾過、デカンティングまたはこれらの方法の組合せにより、発酵ブロスからバイオマスを完全にまたは部分的に除去することができ、またはバイオマスを発酵ブロス中に完全に残すことができる。
ポリペプチドが培養培地中に分泌されない場合、細胞を溶解することもできて、タンパク質を単離するための公知の方法により溶解物から生成物を得ることができる。細胞は、任意選択で、高周波超音波、高圧（例えばフレンチプレス内）により、オスモリシスにより、界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、または前述の方法のうちのいくつかの組合せにより破壊することができる。
ポリペプチドは、公知のクロマトグラフ技法、例えばモレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばＱ－セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィー、ならびに他の通常の技法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析および非変性ゲル電気泳動により精製することができる。適した方法は、例えばCooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical processes], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New YorkまたはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
組換えタンパク質を単離するためには、定義されたヌクレオチド配列によりｃＤＮＡを延長し、したがって、例えばより容易な精製に役立つ、変更されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得る。このタイプの適した改変は、例えば、アンカーとして機能するいわゆる「タグ」、例えば、抗体の抗原として認識され得るヘキサヒスチジンアンカーまたはエピトープとして公知の改変である（例えばHarlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載されている）。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラム内の充填剤として使用することができる固体担体、例えばポリマーマトリックスにタンパク質を結合させる役目を果たすことができ、またはマイクロタイタープレート上もしくはいくつかの他の担体上で使用することができる。
同時に、これらのアンカーは、タンパク質を認識するために使用することもできる。タンパク質を認識するために、さらに、通常のマーカー、例えば蛍光色素、酵素マーカー（これは、基質との反応後に検出可能な反応生成物を生成する）、または放射性マーカーを単独で、またはタンパク質を誘導体化するためのアンカーと組み合わせて使用することも可能である。
ｈ．ポリペプチド固定化
本発明による酵素またはポリペプチドは、本明細書に記載の方法において遊離で、または固定化されて使用することができる。固定化酵素は、不活性担体に固定化された酵素である。適した担体材料およびその上に固定化された酵素は、欧州特許出願公開第１１４９８４９号明細書、欧州特許出願公開第１０６９１８３号明細書および独国特許出願公開第１００１９３７７３号明細書およびその中で引用された参考文献により公知である。この点に関して、これらの文書の開示全体が参照される。適した担体材料には、例えば、粘土、粘土鉱物、例えばカオリナイト、珪藻土、パーライト、シリカ、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換体材料、合成ポリマー、例えばポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリオレフィン、例えばポリエチレンおよびポリプロピレンが含まれる。担持された酵素を製造するために、担体材料は、細分された粒子状で通常使用され、多孔質型が好ましい。担体材料の粒径は、通常５ｍｍ以下であり、特に２ｍｍ以下である（粒径分布曲線）。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼを使用する場合、遊離型または固定化型を選択することができる。担体材料は、例えばアルギン酸Ｃａ、およびカラギーナンである。酵素ならびに細胞は、グルタルアルデヒドで直接架橋することもできる（ＣＬＥＡへの架橋）。対応する他の固定化技法は、例えばJ. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimに記載されている。本発明による方法を行うための生体内変換およびバイオリアクターに関するさらなる情報は、例えばRehm et al. (Ed.) Biotechnology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17, VCH, Weinheimにも記載されている。
ｉ．本発明の生体触媒的な製造方法のための反応条件
本発明の反応は、イン・ビボまたはイン・ビトロ条件下で実施することができる。
本発明の方法または本明細書で先に定義された多段階の方法の個々のステップの間に存在する少なくとも１種のポリペプチド／酵素は、酵素を天然にまたは組換えにより産生する生細胞内に、収集細胞内に、すなわちイン・ビボ条件下で、または死細胞内に、透過処理細胞内に、粗細胞抽出物中に、精製抽出物中に、または実質的に純粋な形態もしくは完全に純粋な形態で、すなわちイン・ビトロ条件下で存在することができる。少なくとも１種の酵素は、溶液中にまたは担体上に固定化された酵素として存在してよい。１種または複数種の酵素が可溶型および／または固定化型で同時に存在してよい。
本発明による方法は、当業者に公知である一般的な反応器内で、例えば実験室規模（数ミリリットル～数十リットルの反応体積）から工業的規模（数リットル～数千立方メートルの反応体積）までの様々な範囲の規模で実施することができる。ポリペプチドを、任意選択で透過処理された非生細胞によりカプセル化された形態で、ある程度精製された細胞抽出物の形態で、または精製された形態で使用される場合、化学反応器を使用することができる。化学反応器は通常、少なくとも１種の酵素の量、少なくとも１種の基質の量、ｐＨ、温度および反応媒体の循環の制御を可能にする。少なくとも１種のポリペプチド／酵素が生細胞内に存在する場合、このプロセスは発酵になるであろう。この場合、生体触媒的な製造はバイオリアクター（発酵槽）内で起こることになり、ここで生細胞に適した生存条件に必要なパラメータ（例えば、栄養素を含む培養培地、温度、通気、酸素または他のガスの有無、抗生物質および同種のもの）を制御することができる。当業者は、化学反応器またはバイオリアクターに精通しており、例えば、化学的または生物工学的方法を実験室規模から工業的規模へとスケールアップするための手順、またはプロセスパラメータを最適化するための手順に精通しており、これらは文献にも詳しく記載されている（生物工学的方法については、例えばCrueger und Crueger, Biotechnologie - Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 2. Ed., R. Oldenbourg Verlag, Muenchen, Wien, 1984を参照されたい）。
少なくとも１種の酵素を含む細胞は、物理的もしくは機械的手段、例えば超音波もしくは高周波パルス、フレンチプレス、または化学的手段、例えば培地中に存在する低張媒体、溶解酵素および界面活性剤、またはこのような方法の組合せにより透過処理することができる。界面活性剤の例は、ジギトニン、ｎ－ドデシルマルトシド、オクチルグリコシド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、デオキシコール酸塩、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０（エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）および同種のものである。
生細胞の代わりに、本発明の生体内変換反応に必要な生体触媒を含む非生細胞のバイオマスが同様に適用されてよい。
少なくとも１種の酵素が固定化されている場合、これは、上述の通り不活性担体に結合されている。
変換反応は、バッチ式、半バッチ式で、または連続的に行うことができる。反応物（および任意選択で栄養素）は、反応開始時に供給されてよく、またはその後に半連続的にもしくは連続的に供給されてよい。
本発明の反応は、特定の反応タイプに応じて、水性、水性－有機性または非水性反応媒体中で実施されてよい。
水性または水性－有機性媒体は、ｐＨを６～１０のような５～１１の範囲内の値に調整するために、適した緩衝液を含んでよい。
水性－有機性媒体において、水と混和する、部分的に混和する、または混和しない有機溶媒が適用されてよい。適した有機溶媒の非限定的な例を以下に挙げる。さらなる例は、一価もしくは多価の芳香族または脂肪族アルコール、特に、グリセロールのような多価脂肪族アルコールである。
非水性媒体は、水を含んでよく、水を実質的に含まず、すなわち約１ｗｔ．－％または０．５ｗｔ．－％未満の水を含むことになる。
生体触媒的方法は有機性非水性媒体中で実施されてもよい。適した有機溶媒として、ペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンまたはシクロオクタンのような、例えば５～８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレン類、クロロベンゼンまたはジクロロベンゼンのような芳香族炭水化物、ジエチルエーテル、メチル－ｔｅｒｔ．－ブチルエーテル、エチル－ｔｅｒｔ．－ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテルのような脂肪族非環状エーテル；またはそれらの混合物に言及することができる。
反応物／基質の濃度は、最適な反応条件に適合させてよく、適用された特定の酵素に依存し得る。例えば、初期基質濃度は、例えば１０～１００ｍＭのような０，１～０，５Ｍ内であり得る。
反応温度は、最適な反応条件に適合させてよく、適用された特定の酵素に依存し得る。例えば、反応は、例えば２０～５０℃または２５～４０℃のような０～７０℃の範囲内の温度で実施されてよい。反応温度の例は、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃および約６０℃である。
プロセスは、基質と、次いで生成物の間の平衡が達成されるまで進行し得るが、それより早く停止してよい。通常のプロセス時間は、例えば１時間～４時間、特に１．５時間～３．５時間の範囲内のような、１分～２５時間、特に１０分～６時間の範囲内である。これらのパラメータは、適したプロセス条件の非限定的な例である。
宿主がトランスジェニック植物である場合、例えば最適な光、水および栄養素の条件など、最適な増殖条件を提供することができる。
ｋ．生成物単離
本発明の手法は、任意選択で立体異性的または鏡像異性的に実質的に純粋な形態の、最終生成物または中間生成物を回収するステップをさらに含むことができる。「回収する」という用語は、培養培地または反応媒体からの化合物を抽出、収集、単離または精製することを含む。化合物の回収は、これらに限定されないが、従来の樹脂（例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンおよび同種のものなどの従来の溶媒による）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、ｐＨ調整、凍結乾燥および同種のものを含む、当技術分野において公知の任意の従来の単離または精製手法にしたがって実施することができる。
単離された生成物の同一性および純度は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、スペクトロスコピー（ＩＲ、ＵＶ、ＮＭＲなど）、着色法、ＴＬＣ、ＮＩＲＳ、酵素または微生物アッセイのような公知の技法により決定することができる。（例えば、Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32;およびSchmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581およびS. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17を参照されたい。）
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて産生される環式テルペン化合物は、これらに限定されないが、炭化水素、エステル、アミド、グリコシド、エーテル、エポキシド、アルデヒド、ケトン、アルコール、ジオール、アセタールまたはケタールなどの誘導体に変換することができる。テルペン化合物誘導体は、これらに限定されないが、酸化、還元、アルキル化、アシル化および／または転位などの化学的方法により得ることができる。あるいは、テルペン化合物誘導体は、テルペン化合物を、これらに限定されないがオキシドレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、トランスフェラーゼなどの酵素と接触させることにより、生化学的方法を使用して得ることができる。生化学的変換は、単離された酵素、溶解細胞からの酵素を使用してイン・ビトロで、または全細胞を使用してイン・ビボで実施することができる。
ｌ．テルペンアルコールの発酵産生
本発明は、テルペンアルコールの発酵産生のための方法にも関する。
本発明にしたがって使用される発酵は、例えば、撹拌された発酵槽内、気泡塔内およびループ型反応器内で実施することができる。撹拌機タイプを含む可能な方法タイプおよび幾何学的設計の包括的な概観は”Chmiel: Bioprozesstechnik: Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1”に見出すことができる。本発明のプロセスにおいて、利用可能な典型的な変種は、バイオマスのリサイクルありとなしのバッチ発酵、流加発酵、反復流加発酵、そうでなければ連続発酵など、当業者に公知の、または例えば”Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering”に説明された以下の変種である。産生株に応じて、良好な収率（ＹＰ／Ｓ）を達成するために空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素または適切なガス混合物によるスパージングが行われてよい。
使用される培養培地は、特定の株の要件を適切に満たさなければならない。様々な微生物のための培養培地の説明はハンドブック”Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)に記載されている。
本発明にしたがって使用することができるこれらの培地は、１種または複数種の炭素の源、窒素の源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含んでよい。
炭素の好ましい源は、単糖、二糖または多糖などの糖である。炭素の非常に良好な源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖は、糖蜜などの複合化合物、または精糖からの他の副生成物を介して培地に加えることもできる。様々な炭素の源の混合物を加えることも有利であり得る。その他の可能な炭素の源は、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油などの油および脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸などの脂肪酸、グリセロール、メタノールまたはエタノールなどのアルコールならびに酢酸または乳酸などの有機酸である。
窒素の源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物またはこれらの化合物を含む材料である。窒素の源の例には、アンモニアガス、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、ナイトレート、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどの窒素の複合源およびその他が含まれる。窒素の源は、別々に、または混合物として使用することができる。
培地中に存在してよい無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩が含まれる。
無機硫黄含有化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物はさることながら、メルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物も硫黄の源として使用することができる。
リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩をリンの源として使用することができる。
金属イオンを溶液中に保つためにキレート剤を培地に加えることができる。特に適したキレート剤には、カテコールもしくはプロトカテクエートなどのジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸が含まれる。
本発明にしたがって使用される発酵培地は、ビタミンなどの他の増殖因子、または例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む成長促進物質も含んでよい。増殖因子および塩はしばしば、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーおよび同種のものなどの培地の複合成分に由来する。加えて、適した前駆体を培養培地に加えることができる。培地中の化合物の精密な組成は、特定の実験に強く依存し、具体的な場合毎に個々に決定されなければならない。培地の最適化に関する情報は、教科書”Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (1997)に見出すことができる。例えばＳｔａｎｄａｒｄ １（Merck）またはＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン、DIFCO）などの成長培地を市販業者から得ることもできる。
培地のすべての成分が加熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分）または滅菌濾過により滅菌される。これらの成分は、一緒に、または必要であれば別々に滅菌することができる。培地のすべての成分が成長開始時に存在してよく、または任意選択で連続的にまたはバッチ供給により加えられてよい。
培養物の温度は、通常、１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃の間であり、実験の間に一定に保ったり、変えたりすることができる。培地のｐＨ値は、５～８．５の範囲内、好ましくはおよそ７．０であるべきである。成長のためのｐＨ値は、成長中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸化合物を加えることにより制御することができる。起泡を抑えるために消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択的作用を有する適した物質、例えば抗生物質を培地に加えることができる。好気条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲空気が培養物中に供給される。培養物の温度は、通常２０℃～４５℃である。培養は、所望の生成物が最大限産生されるまで継続される。これは、通常１時間～１６０時間以内に達成される。
本発明の手法は、前記テルペンアルコールを回収するステップをさらに含むことができる。
「回収する」という用語は、培養培地からの化合物を抽出、収集、単離または精製することを含む。化合物の回収は、これらに限定されないが、従来の樹脂（例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンおよび同種のものなどの従来の溶媒による）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、ｐＨ調整、凍結乾燥および同種のものを含む、当技術分野において公知の任意の従来の単離または精製手法にしたがって実施することができる。
所期の単離の前に、ブロスのバイオマスを除去することができる。このバイオマスを除去するためのプロセス、例えば濾過、沈降および浮選は当業者に公知である。したがって、このバイオマスは、例えば、遠心分離機、分離器、デカンター、フィルターにより、または浮選装置内で除去することができる。価値のある生成物を最大限回収するために、例えばダイアフィルトレーションの形でバイオマスを洗浄することが得策であることが多い。この方法の選択は、発酵槽ブロス中のバイオマス含量およびバイオマスの特性、ならびにバイオマスと価値のある生成物との相互作用に依存する。
１つの実施形態において、発酵ブロスを滅菌または低温殺菌することができる。さらなる実施形態において、発酵ブロスは濃縮される。必要性に応じて、この濃縮は、バッチ式で、または連続的に行うことができる。圧力および温度範囲は、第１に生成物の損傷が生じず、第２に必要な装置およびエネルギーの使用が最小限になるように選択されるべきである。多段階蒸発の圧力および温度レベルを巧みに選択することにより特に、エネルギーの節約が可能になる。
以下の例は単なる例示であり、本明細書に記載の実施形態の範囲を限定するものではない。
本明細書に記載の開示を考慮した後に当業者には直ちに明らかになるであろう多数の可能な変形も本発明の範囲内に入る。
実験の部
ここで本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明する。
材料：
他に記載されていない限り、本明細書において使用されるすべての化学的および生化学的材料ならびに微生物または細胞は市販の製品である。
特に指定のない限り、組換えタンパク質は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989により記述されているような標準的な方法によりクローニングおよび発現される。
一般的な方法：
コパリル二リン酸ホスファターゼ活性を測定するための標準的なアッセイ
Ｅ．コリ（E.coli）細胞（ＤＰ１２０５株）は２種のプラスミド
－コパリル二リン酸（ＣＰＰ）の生合成に必要な酵素をコードする遺伝子を保有するプラスミド、例えばｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｍＣＰＳ２プラスミド
－テルペニル－リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を保有するプラスミド、例えばｐＪ４０１－ＴａｌＶｅＴＰＰまたはｐＪ４０１－ＡｓｐＷｅＴＰＰプラスミド
で形質転換される。
以下に記載の通り、この細胞は培養され、コパロールの産生がＧＣ－ＭＳにより分析される。
８－ヒドロキシ－コパリル二リン酸ホスファターゼ活性を測定するための標準的なアッセイ
Ｅ．コリ（E.coli）細胞（ＤＰ１２０５株）は２種のプラスミド
－８－ヒドロキシ－コパリル二リン酸（ＬＰＰ）の生合成に必要な酵素をコードする遺伝子を保有するプラスミド、例えばｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｓＬＰＳプラスミド
－テルペニル－リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を保有するプラスミド、例えばｐＪ４０１－ＴａｌＶｅＴＰＰまたはｐＪ４０１－ＡｓｐＷｅＴＰＰプラスミド
で形質転換される。
以下に記載の通り、この細胞は培養され、ラブデンジオールの産生がＧＣ－ＭＳにより分析される。
コパロールデヒドロゲナーゼ活性を測定するための標準的なアッセイ
Ｅ．コリ（E.coli）細胞（ＤＰ１２０５株）は２種のプラスミド
－コパロールの生合成に必要な酵素をコードする遺伝子を保有するプラスミド、例えばｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－２プラスミド、
－例えばｐＪ４２３をバックグラウンドプラスミドとして使用して、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保有するプラスミド
で形質転換される。
以下に記載の通り、この細胞は培養され、コパラールの産生がＧＣ－ＭＳにより分析される。
ラブデンジオールデヒドロゲナーゼ活性を測定するための標準的なアッセイ
Ｅ．コリ（E.coli）細胞（ＤＰ１２０５株）は２種のプラスミド
－ラブデンジオールの生合成に必要な酵素をコードする遺伝子を保有するプラスミド、例えばｐＪ４０１－ＬＯＨ－２プラスミド、
－例えばｐＪ４２３をバックグラウンドプラスミドとして使用して、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保有するプラスミド
で形質転換される。
以下に記載の通り、この細胞は培養され、生成物の産生がＧＣ－ＭＳにより分析される。
ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）
Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７５質量検出器に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０シリーズＧＣシステムを使用して、ＧＣ－ＭＳによりテルペン含量を分析した。このＧＣには、内径０．２５ｍｍ×３０ｍのＨＰ－５ＭＳキャピラリーカラム（Agilent）が備え付けられていた。キャリヤーガスは、一定流量１ｍＬ／ｍｉｎのヘリウムであった。入口温度を２５０℃に設定した。初期オーブン温度は１分間１００℃であり、その後１０℃／ｍｉｎの勾配が３００℃まで続いた。生成物の同定は、質量スペクトルおよび保持指標と、基準標準および独自の質量スペクトルデータベースとの比較に基づいた。濃度は、内部標準に基づいて推定した。
メバロン酸経路酵素をコードする遺伝子の染色体組込みによる組換え細菌株の製造
メバロン酸経路酵素をコードする組換え遺伝子の染色体組込みにより、テルペン前駆体ファルネシル－ピロリン酸（ＦＰＰ）を産生するようにＥ．コリ（E.coli）株を操作した。図１５に示された構築スキームおよび組換え現象も参照されたい。
アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼをコードする、Ｅ．コリ（E.coli）由来のａｔｏＢ遺伝子ならびにＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼおよびＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをそれぞれコードする、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のｍｖａＡ遺伝子およびｍｖａＳ遺伝子からなる上流経路オペロン（アセチル－ＣｏＡからメバロン酸までのオペロン１）を設計した。
下流メバロン酸経路オペロン（メバロン酸からファルネシルピロリン酸までのオペロン２）として、メバロン酸キナーゼ（ｍｖａＫ１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ｍｖａＫ２）、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ｍｖａＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｆｎｉ）をコードする、グラム陰性細菌であるストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来の天然オペロンを選択した。
コドン最適化サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ２０）を上流経路オペロンの３’－末端において導入して、イソペンテニル－二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル－二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をＦＰＰに変換した。
上記のオペロンをＤＮＡ２．０により合成し、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）株ＢＬ２１（ＤＥ３）のａｒａＡ遺伝子に組み込んだ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム操作システムを使用して、２つの別々の組換えステップにおいて異種経路を導入した。組み込まれる第１のオペロン（下流経路；オペロン２）は、Ｓｐｅｃ耐性候補組込み体を求めてスクリーニングするために使用したスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）マーカーを保有する。あらかじめ組み込まれたオペロンのＳｐｅｃマーカーを置換するよう第２のオペロンを設計し、それに応じて、第２の組換え現象にしたがってＳｐｅｃ候補組込み体を求めてスクリーニングした（図１５参照）。ａｒａＡ遺伝子を標的にするガイドＲＮＡ発現ベクターを設計し、ＤＮＡ ２．０により合成した。ＰＣＲを使用して、ａｒａＡ遺伝子組込み標的および組込み体の組換え接合部にわたって増幅するＰＣＲプライマーを設計することにより、オペロン組込みを検証した。次いで、正確なＰＣＲ結果を与える１つのクローンを完全に配列決定し、ＤＰ１２０５株として記録した。
細菌細胞の培養およびテルペン産生の解析
テルペン生合成遺伝子を保有する１種または２種の発現プラスミドでＥ．コリ（E.coli）細胞を形質転換し、この形質転換細胞を、適切な抗生物質（カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および／またはクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を用いてＬＢ－アガロースプレート上で培養した。単一コロニーを使用して、同じ抗生物質、４ｇ／ｌグルコースおよび１０％（ｖ／ｖ）ドデカンを追加した液体ＬＢ培地５ｍＬに接種した。翌日、同じ抗生物質および１０％（ｖ／ｖ）ドデカンを追加したＴＢ培地２ｍＬに一夜培養物０．２ｍＬを接種した。この培養物を、光学密度が３に達するまで３７℃でインキュベートした。１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることにより組換えタンパク質の発現を誘導し、この培養物を２０℃で７２時間インキュベートした。
次いで、この培養物をｔｅｒｔ．－ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）で抽出し、内部標準（α－ロンギピネン（Aldrich））を有機相に加えた。有機相のテルペン含量を上述の通りＧＣ－ＭＳにより分析した。
実施例１：ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＶｅＴＰＰのコパリル－二リン酸ホスファターゼ活性の同定および特徴付け。
ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰタンパク質は、タラロミセス・ヴェルキュロサス（Talaromyces verruculosus）およびアスペルギルス・ウェンティ（Aspergillus wentii）それぞれのゲノム中の２つの予測された遺伝子によってコードされる。ＴａｌＶｅＴＰＰをコードする遺伝子は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＬＨＣＬ０１００００１０．１を有するタラロミセス・ヴェルキュロサス（Talaromyces verruculosus）ゲノム骨格配列の１５００９５．．１５１０３０領域内に位置する。コードされたタンパク質は、機能的特徴付けのない推定タンパク質として報告されている（ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＬ８９３３４．１）。ＡｓｐＷｅＴＰＰをコードする遺伝子は、アスペルギルス・ウェンティ（Aspergillus wentii）ＤＴＯ １３４Ｅ９非定置ゲノム骨格ＡＳＰＷＥｓｃａｆｆｏｌｄ＿５（ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＶ８７８２１３．１）の２４８２７７６．．２４８３６２７領域内に位置する。コードされたタンパク質は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＯＪＪ３４５８５．１を有し、同じく機能的特徴付けのない推定タンパク質として報告されている。
ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰをコードする遺伝子は、オキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子など、二次代謝産物の生合成に潜在的に関与する遺伝子、特に、Mitsuhashi et al, Chembiochem. 2017 Nov 2;18(21):2104-2109に報告された、単機能性コパリル－二リン酸シンターゼまたは二機能性コパリル－二リン酸シンターゼとの強い相同性を有する遺伝子に隣接するゲノム内に位置する。タンパク質ファミリードメインシグネチャーの存在を検索することによりＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰアミノ酸配列を機能解析（例えばｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／のＩｎｔｅｒｐｒｏ配列解析ツールまたはＰｆａｍデータベース検索ツールｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ＃ｔａｂｖｉｅｗ＝ｔａｂ０もしくはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｆａ／ｐｆａｍｓｃａｎ／を使用）したところ、２種のタンパク質がタンパク質チロシンホスファターゼシグネチャーを含むと予測されることが明らかになった。チロシンホスファターゼファミリーからの酵素は様々なリン酸化分子、特にタンパク質からリン酸基を除去することが記述されている。しかし、このタンパク質ファミリーからの酵素がコパリル－二リン酸などの化合物に作用することは示されたことがない。しかし、ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰをコードする遺伝子のゲノム局在を考え、本発明者らは、ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰはコパリル－二リン酸または他のイソプレノイド－二リン酸化合物の二リン酸基の切断を触媒することができると仮定した（図１）。
ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰをコードするｃＤＮＡ（それぞれ配列番号３および７）をコドン最適化し（それぞれ配列番号１および５）、発現プラスミドｐＪ４０１（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で個々にクローニングして、プラスミドｐＪ４０１－ＴａｌＶｅＴＰＰおよびｐＪ４０１－ＡｓｐＷｅＴＰＰを得た。
ゲラニルゲラニル－ピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）をコードする遺伝子およびコパリル－ピロリン酸シンターゼ（ＣＰＳ）をコードする遺伝子を保有する別の発現プラスミドを構築した。ＣＰＳ遺伝子の場合、サルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）由来の、ＣＰＳをコードするｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１）を、Ｅ．コリ（E.coli）細胞内の最適な発現のためにコドン最適化した。加えて、最初の５８個のコドンを除去し、ＡＴＧ開始コドンを付加した。切断型サルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）ＣＰＳ（ＳｍＣＰＳ２）をコードする最適化ｃＤＮＡ（配列番号３３）をイン・ビトロで合成し、まず、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限酵素認識部位と隣接するｐＪ２０８プラスミド（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中でクローニングした。ＧＧＰＳの場合、ＧＧＰＰシンターゼ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＡ２４８１９．１）をコードする、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来のＣｒｔＥ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッションＭ３８４２４．１）を使用した。コドン最適化（配列番号３５）ならびに３’末端および５’末端におけるＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位の付加（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を伴うＣｒｔＥ遺伝子を合成し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（商標）－１プラスミド（Merck）のＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間を連結して、ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥプラスミドを得た。改変ＳｍＣＰＳ２をコードするｃＤＮＡをＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥプラスミド内に連結し、したがってｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｍＣＰＳ２構築物を得た。
２種のプラスミド、ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｍＣＰＳ２プラスミドおよびｐＪ４０１－ＴａｌＶｅＴＰＰまたはｐＪ４０１－ＡｓｐＷｅＴＰＰでＥ．コリ（E.coli）細胞（上記で製造したＤＰ１２０５株）を形質転換した。この細胞を方法のセクションに記載の通り培養し、テルペン化合物の産生を分析した。図２は、組換えＥ．コリ（E.coli）細胞により産生されたコパロールの典型的なＧＣ－ＭＳを示す。メバロン酸経路酵素およびＳｍＣＰＳ２のみを発現させる細胞は、内因性アルカリホスファターゼ酵素によるＣＰＰの加水分解のために、少量のコパロール（６．７ｍｇ／ｌ、図３）を産生した。加えてＴａｌＶｅＴＰＰまたはＡｓｐＷｅＴＰＰを発現させるように形質転換されたＥ．コリ（E.coli）細胞は、ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰそれぞれについて、著しく多量のコパロール：４６２ｍｇ／ｌおよび２９８ｍｇ／ｌを産生する（図２および図３）。この実験は、ＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＷｅＴＰＰが（＋）－ＣＰＰを効率的に加水分解して、（＋）－コパロールを産生することができることを示す。このコパロールは高純度（９５％超）で産生される。ＧＣ－ＭＳ分析において観察された、より少量のコパリルアセテート（図２）は、細胞の内因性アセチルトランスフェラーゼ活性に起因する。
実施例２：コパリル－ピロリン酸ホスファターゼ活性を有するＴａｌＶｅＴＰＰおよびＡｓｐＶｅＴＰＰの変異体の同定および特徴付け。
ＴａｌＶｅＴＰＰ配列およびＡｓｐＶｅＴＰＰ配列を使用して、公開データベース内の相同配列を検索した。Ｐｆａｍタンパク質チロシンホスファターゼタンパク質ファミリーＰＦ１３３５０のシグネチャーを有する以下の８種の新しい配列を選択した：ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、仮想タンパク質ヘリコカーパス・グリセウス（Helicocarpus griseus）（配列番号１０）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＰＧＧ９５９１０．１）；ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ウンビリカリア・プスツラータ（Umbilicaria pustulata）由来のチロシンホスファターゼ（配列番号１３）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＳＬＭ３４７８７．１）；ＴＡｌＶｅＴＰＰ２、タラロミセス・ヴェルキュロサス（Talaromyces verruculosus）由来の仮想タンパク質（配列番号１６）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵＬ９２３１４．１）；ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ヒドノメルリウス・ピナストリ（Hydnomerulius pinastri）由来の仮想タンパク質（配列番号１９）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＩＪ６９７８０．１）；ＴａｌＣｅＴＰＰ１、タラロミセス・セルロリティカス（Talaromyces cellulolyticus）由来の仮想タンパク質（配列番号２２）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＭ４２０００．１）；ＴａｌＭａＴＰＰ１、タラロミセス・マルネッフェイ（Talaromyces marneffei）由来の仮想タンパク質（配列番号２５）（ＮＣＢＩ ＸＰ＿００２１５２９１７．１）；ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１、タラロミセス・アトロロセウス（Talaromyces atroroseus）由来の仮想タンパク質（配列番号２８）（ＮＣＢＩ ＸＰ＿０２０１１７８４９．１）；ＰｅＳｕｂＴＰＰ１、ＰｅＳｕｂＴＰＰ１、ペニシリウム・サブルベスセンス（Penicillium subrubescens）由来の仮想タンパク質（配列番号３１）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＯＫＰ１４３４０．１）。タンパク質ファミリーシグネチャーの検索は、８種のアミノ酸配列がＰｆａｍタンパク質チロシンホスファターゼタンパク質ファミリーＰＦ１３３５０のメンバーであることを示した。
１０種のアミノ酸配列の配列比較は、２４％～９３％の範囲の配列同一性を示す（表１）。
Figure 2024029002000007
ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１（配列番号１１）、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１（配列番号１４）、ＴａｌＶｅＴＰＰ２（配列番号１７）、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１（配列番号２０）、ＴａｌＣｅＴＰＰ１（配列番号２３）、ＴａｌＭａＴＰＰ１（配列番号２６）、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１（配列番号２９）およびＰｅＳｕｂＴＰＰ１（配列番号３２）をコードするｃＤＮＡ配列をＥ．コリ（E.coli）発現のためにコドン最適化し、ｐＪ４０１発現プラスミド（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で個々にクローニングした。
ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｍＣＰＳ２プラスミドならびにＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１（配列番号９）、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１（配列番号１２）、ＴａｌＶｅＴＰＰ２（配列番号１５）、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１（配列番号１８）、ＴａｌＣｅＴＰＰ１（配列番号２１）、ＴａｌＭａＴＰＰ１（配列番号２４）、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１（配列番号２７）およびＰｅＳｕｂＴＰＰ１（配列番号３０）をコードする最適化ｃＤＮＡを保有するｐＪ４０１プラスミドのうちの１つでＤＰ１２０５ Ｅ．コリ（E.coli）細胞を形質転換した。この細胞を方法のセクションに記載の条件で培養し、コパロールの産生を分析した。ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳａＬＰＳプラスミドおよび空のｐＪ４０１プラスミドで形質転換された細胞を対照株として使用した。組換えＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１タンパク質を発現させるすべての株が３２～２４０ｍｇ／ｌの範囲の量のコパロールを蓄積し、これらすべての組換え酵素によるＣＰＰからコパロールへの酵素変換が確認された（図４）。
この実施例は、ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１およびＰｅＳｕｂＴＰＰ１を使用して、ＣＰＰをコパロールに酵素変換でき、操作された細胞内でコパロールを産生することができることを示す。
実施例３：Ｅ．コリ（E.coli）細胞内のラブデンジオールの産生。
ゲラニルゲラニル－ピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ）をコードする遺伝子およびラブデンジオール－フィロリン酸シンターゼ（ＬＰＳ）をコードする遺伝子を保有する発現プラスミドを構築した。ＧＧＰＳの場合、実施例１に記載のＰ．アグロメランス（P.agglomerans）由来のＣｒｔＥ遺伝子を使用した。ＬＰＳ遺伝子の場合、サルビア・スクラレア（Salvia sclarea）由来のＳｓＬＰＳをコードするｃＤＮＡ（国際公開第２００９０９５３６６号、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＴ２１２４６．１）を使用した。ＳｓＬＰＳをコードするｃＤＮＡ配列を国際公開第２００９０９５３６６号に記載の通り最適化し（配列番号３７）、ｐＡＣＹＣ－Ｃｒｔｅプラスミド中、ＮｄｅＩ部位とＫｐｎＩ部位の間でクローニングして、ＧＧＰシンターゼ遺伝子およびＬＰＰシンターゼ遺伝子を保有するプラスミドｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳａＬＰＳを得た。ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｓＬＰＳで形質転換されたＤＰ１２０５株などのＥ．コリ（E.coli）細胞は、ジテルペン前駆体化合物としてＬＰＰを蓄積する（図５）。
ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｓＬＰＳプラスミドおよびＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１をコードする最適化ｃＤＮＡを保有するｐＪ４０１プラスミドのうちの１つで（上記で製造した）ＤＰ１２０５ Ｅ．コリ（E.coli）細胞を形質転換した（上記の実施例１および２参照）。この細胞を方法のセクションに記載の条件で培養し、ラブデンジオールの産生を分析した。空のｐＪ４０１プラスミドおよびｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｓＬＰＳで形質転換された対照細胞と比べて、組換えＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１タンパク質のいずれかを産生するように形質転換されたすべての細胞は、著しく増量したラブデンジオール（５～２５倍に増加）を産生した（図６）。細胞培養中のラブデンジオール濃度は、培養期間の最後に５０～２７２ｇ／ｌの間であった。
図７は、ラブデンジオール細胞を産生する典型的なＥ．コリ（E.coli）のＧＣ－ＭＳ分析を示す。全イオンクロマトグラムは、これらの条件で産生されたラブデンジオールが少なくとも９８％の純度を有することを示す。
実施例４：Ｅ．コリ（E.coli）細胞内のファルネソールおよびゲラニルゲラニオールの産生。
組換えタンパク質ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１およびＰｅＳｕｂＴＰＰ１をファルネシル－ピロリン酸（ＦＰＰ）およびゲラニルゲラニル－ピロリン酸（ＧＧＰＰ）などの線状基質上での酵素活性についても評価した。実施例１および２と類似した、方法のセクション中の条件でアッセイを実施した。ただし、ｉｎ－ｖｉｖｏ ＦＰＰおよびＧＧＰＰを産生するようにｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（商標）－１プラスミドを適合させたことを除く。Ｅ．コリ（E.coli）細胞を蓄積するＦＰＰの場合、空のｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（商標）－１プラスミドを使用した。空のプラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（商標）－１（Merck）で形質転換されたＤＰ１２０５株などのＥ．コリ（E.coli）細胞は、テルペン前駆体化合物としてＦＰＰを蓄積することになる（図８）。Ｅ．コリ（E.coli）細胞を蓄積するＧＧＰＰの場合、プラスミドｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ（実施例１）を使用した。ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥプラスミドで形質転換されたＤＰ１２０５株などのＥ．コリ（E.coli）細胞は、テルペン前駆体化合物としてＧＧＰＰを蓄積することになる（図５および図８）。
ｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥまたはｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（商標）－１プラスミドおよびＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１をコードする最適化ｃＤＮＡを保有するｐＪ４０１プラスミドのうちの１つでＤＰ１２０５ Ｅ．コリ（E.coli）細胞を形質転換した（実施例１および２参照）。この細胞を方法のセクションに記載の条件で培養し、ファルネソールおよびゲラニルゲラニオールの産生を分析した。空のｐＪ４０１で形質転換された対照細胞と比べて、組換えＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１タンパク質を産生するように形質転換された細胞の一部は、著しく増量したファルネソールおよびゲラニルゲラニオールを産生した（図９）。例えば、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＴａｌＣｅＴＰＰ１およびＴａｌＶｅＴＰＰを発現させる細胞は、多量（７６３～９７６ｍｇ／ｍｌ）のファルネソールを産生する。同様に、ＰｅＳｕｂＴＰＰ１およびＴａｌＶｅＴＰＰを発現させる細胞は、多量（１９６～１９８ｍｇ／ｍｌ）のゲラニルゲラニオールを産生する。対照的に、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１またはＴａｌＭａＴＰＰ１は、低いＦＰＰおよびＧＧＰＰホスファターゼ活性を示す。
実施例５：ホスファターゼの基質選択性。
４種の異なる基質による先の実施例において観察された酵素活性の比較は、ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１、ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１またはＰｅＳｕｂＴＰＰ１に対して異なる基質選択性を明らかにする（図１０）。したがって、このアプローチによって、ホスファターゼ活性を有する酵素をその基質選択性に基づいて選択することが可能になる。例えば、ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１またはＡｓｐＷｅＴＰＰは、記載の他の酵素と比べて相対的に、ＣＰＰおよびＬＰＰに対してより高い活性を、ＦＰＰおよびＧＧＰに対してより低い活性を示す。したがって、これらの酵素を使用して、経路中間体に対する副活性が限られた、コパロールまたはラブデンジオールの最も効果的な産生が可能である。ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、ＴａｌＭａＴＰＰ１およびＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１もＦＰＰおよびＧＧＰＰに対して限られた副活性を示すが、これらは、より少量のラブデンジオールおよびコパロールを産生する。
実施例６：ＧＧＰＰシンターゼ、ジテルペンシンターゼおよびホスファターゼを含むオペロンを使用するコパロールおよびラブデンジオールの産生。
ＴａｌＶｅＴＰＰ；ＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９およびＧＧＰＰシンターゼをコードする３種のｃＤＮＡを含むオペロンを構築した。ＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９は、トリチカム・エスチバム（Triticum aestivum）由来のＮ－末端切断型ＣＰＰシンターゼである（ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＨ５６５５９．１）。ＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９をコードするｃＤＮＡをコドン最適化した（配列番号３９）。ＧＧＰＰシンターゼの場合、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来のＣｒｔＥ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッションＭ３８４２４．１）のコドン最適化型を使用した（配列番号３５）。オペロンをｐＪ４０１発現プラスミド（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中でクローニングし、構築物ｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－２を得た。
上記のＣＰＯＬ－２と類似の組織化により別のオペロンを構築した。ただし、ＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９をコードする遺伝子を、ＳａＬＰＳをコードする最適化遺伝子（配列番号３７）で置き換えたことを除く。このオペロンをプラスミドｐＪ４０１（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内にクローニングして、構築物ｐＪ４０１－ＬＯＨ－２を得た
上記で製造したＤＰ１２０５ Ｅ．コリ（E.coli）細胞をプラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－２またはｐＪ４０１－ＬＯＨ－２で形質転換した。この細胞を記載の通り培養し、ジテルペンの産生を方法のセクションに記載の通り分析した。並行して、空のＰＪ４０１プラスミドおよびｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｓＬＰＳまたはｐＡＣＹＣ－ＣｒｔＥ－ＳｍＣＰＳプラスミドで形質転換された細胞を対照として使用した。
プラスミドＣＰＯＬ－２で形質転換された細胞は、コパロールおよびファルネソールそれぞれについて平均濃度２００ｍｇ／ｌおよび３００ｍｇ／ｌでコパロールおよびファルネソールを産生した。プラスミドＬＯＨ－２で形質転換された細胞は、コパロールおよびファルネソールそれぞれについて平均濃度１２６０ｍｇ／ｌおよび８３０ｍｇ／ｌでラブデンジオールおよびファルネソールを産生した（図１１）。これら２種の構築物を使用して産生された著しい量のファルネソールは、ＦＰＰプールからＧＧＰＰへの不完全な変換、およびＣＰＰに加えてＦＰＰに対するＴａｌＶｅＴＰＰの酵素活性に起因する（図１０参照）。対応する実験、例えばＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１（およびより高い特異性を有する図１０に示されたその他）による実験は、より少ないファルネソールを産生するであろう。
実施例７：対応するα，β－不飽和アルデヒドを産生するための、組換えホスファターゼにより産生されたテルペン化合物の酵素的酸化。
以下のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を使用して、先の実施例に記載のホスファターゼにより産生されたテルペン化合物を酸化することができる：
－シュードモナスｓｐ．（Pseudomonas sp.）１９－ｒｌｉｍ株由来のＣｙｍＢ（配列番号４２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＥＯ２７３６２．１）；
－アスペルギルス・ウェンティ（Aspergillus wentii）ＤＴＯ １３４Ｅ９非定置ゲノム骨格ＡＳＰＷＥｓｃａｆｆｏｌｄ＿５（ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＶ８７８２１３．１）の２４８７３３３．．２４８８６２７領域内に位置する遺伝子によってコードされるＡｓｐＷｅＡＤＨ１（配列番号４４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＯＪＪ３４５８８．１）；
－シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）由来のＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１（配列番号４６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＷＰ＿０７９８６８２５９．１）；
－アゾアルカス・トルクラスチクス（Azoarcus toluclasticus）由来のＡｚＴｏｌＡＤＨ１（配列番号４８）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＷＰ＿０１８９９０７１３．１）；
－アロマトレウム・アロマティクム（Aromatoleum aromaticum）由来のＡｒｏＡｒｏＡＤＨ１（配列番号５０）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＫＭ１０５８７５．２）。
－タウエラ・テルペニカ（Thauera terpenica）由来のＴｈＴｅｒｐＡＤＨ１（配列番号５２）（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＷＰ＿０２１２５０５７７．１）。
－カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）由来のＣｄＧｅｏＡ（配列番号５４）（ＮＣＢＩアクセッションＷＰ＿０４３６８３９１５．１）。
－バレリアナ・オフィシナリス（Valeriana officinalis）由来のＶｏＡＤＨ１（配列番号５６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＶＸ３２６１４．１）。
上記のＡＤＨのそれぞれをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し（それぞれ配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３および５５参照）、ｐＪ４２３発現プラスミド（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中でクローニングした。
上記で製造したＤＰ１２０５ Ｅ．コリ（E.coli）細胞をプラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－２およびこれらのｐＪ４２３－ＡＤＨプラスミドのうちの１つで形質転換した。この細胞を記載の通り培養し、ジテルペンの産生を方法のセクションに記載の通り分析した。並行して、ｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－２プラスミドおよび空のｐＪ４２３プラスミドで形質転換された細胞を対照として使用した（図１２）。コパラールの生成がすべての細胞に対して観察され、これは、タンパク質チロシンホスファターゼを含む、コパロール生合成経路の酵素と、上記のＡＤＨから選択されるＡＤＨの組合せを用いて、コパラールを効率的に産生することができることを示す。ＡｓｐＷｅＡＤＨ１およびＶｏＡＤＨ１をのぞき、細胞内のコパロールからコパラールへの変換は少なくとも９０％であった。ＡＤＨにより産生されたｔｒａｎｓ－コパラールの非酵素的異性化のために、コパラールのｃｉｓ異性体とｔｒａｎｓ異性体の混合物が観察された。同じＡＤＨを使用して、ファルネソールからファルネサールへの変換も観察した（図１３）。
ｐＪ４０１－ＬＯＨ－２およびｐＪ４２３－ＡＤＨプラスミドのうちの１つで同時形質転換されたＥ．コリ（E.coli）細胞に対して、ラブデンジオールの２種の酸化生成物の生成が観察された（図１４）。ＮＭＲ解析により、２種の化合物が図１７のスキームに示す８，１３－エポキシ－ラブダン－１５－アールの２種の異性体（（１３Ｒ）および（１３Ｓ））であることが確認された。これら２種の化合物は、ラブデンジオールの酸化により産生されたα，β－不飽和アルデヒドである８－ヒドロキシ－ラブダ－１３－エン－１５－アールの不安定性により生じる。アルデヒドから前記異性体への脱水および転位の想定される機構を以下のスキームに示す。
実施例８：多機能性ＣＰＰシンターゼを使用するコパロールの産生のための組換え細菌細胞の操作
以下をコードする２種のｃＤＮＡを含むオペロンを構築した：
－アスペルギルス・ウェンティ（Aspergillus wentii）由来のＡｓｐＷｅＴＰＰ（配列番号６）、
－ＰｖＣＰＳ、タラロミセス・ヴェルキュロサス（Talaromyces verruculosus）由来の、プレニル－トランスフェラーゼ活性およびコパリル－二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質（配列番号５９）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＢＢＦ８８１２８．１）。ＰｖＣＰＳは、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからのコパリルＰＰの産生を触媒する。
ＡｓｐＷｅＴＰＰおよびＰｖＣＰＳをコードするｃＤＮＡをコドン最適化した（配列番号：８および６０）。２種のｃＤＮＡ、および各ｃＤＮＡの上流に配置されたＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ）（配列番号６１を含むオペロンを設計した。オペロンを合成し、ｐＪ４０１発現プラスミド（ATUM、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内にクローニングして、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４を得た。
プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４でＤＰ１２０５ Ｅ．コリ（E.coli）細胞を形質転換した。この形質転換細胞を記載の通り培養し、ジテルペンの産生を方法のセクションに記載の通り分析した。これらの条件で、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４で形質転換された細胞は、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－２で形質転換された細胞よりもはるかに高い濃度（最高１ｍｇ／ｌ）を有する主生成物としてコパロールを産生した。この実験は、プレニルトランスフェラーゼ活性およびＣＰＰシンターゼ活性を持つ多機能性タンパク質を使用して、複数の単機能性タンパク質と比べてより高濃度のコパロールを得ることができることを示す。
実施例９：コパリル－ピロリン酸ホスファターゼおよび様々なアルコールデヒドロゲナーゼを使用する、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞内のイン・ビボでのコパロールおよびコパラール産生。
コパロールおよびコパラールを産生するために、ＧＧＰＰシンターゼＣｒｔＥ（配列番号６１）（パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来、ＮＣＢＩアクセッションＭ３８４２４．１）、コパリル－ピロリン酸シンターゼＳｍＣＰＳ２（配列番号６３）（サルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）由来、ＮＣＢＩアクセッションＡＢＶ５７８３５．１）、コパリル－ピロリン酸ホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ（配列番号６５）および様々なアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（酵母内の発現のために最適化されたｃＤＮＡ）を、内因性ファルネシル－二リン酸（ＦＰＰ）のレベルを増加させた操作されたサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞内で発現させた。
４種のアルコールデヒドロゲナーゼを評価した。
－ＡｚＴｏｌＡＤＨ１（配列番号４８）（酵母最適化ｃＤＮＡ配列番号６６）
－ＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１（配列番号４６）、（酵母最適化ｃＤＮＡ配列番号６７）
－ハイホジーマ・ロゼオニグラ（Hyphozyma roseonigra）由来のＳＣＨ２３－ＡＤＨ１（配列番号：６９）（酵母最適化ｃＤＮＡ配列番号６８）
－クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）由来のＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ（配列番号：７１）（酵母最適化ｃＤＮＡ配列番号７０）
Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）細胞内の内因性ファルネシル－二リン酸（ＦＰＰ）プールのレベルを増加させるために、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＥＲＧ１０からＦＰＰシンテターゼをコードするＥＲＧ２０までの、メバロン酸経路に関与するすべての酵母内在性遺伝子の余分なコピーをPaddon et al., Nature, 2013, 496:528-532の記載と同様に、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）株ＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｃ（Euroscarf、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のゲノムに組み込んだ。簡潔には、３つのカセットをＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３遺伝子座それぞれに組み込んだ。ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向性プロモーターならびに遺伝子ＥＲＧ１９およびＥＲＧ１３の制御下、同じくＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下の遺伝子ＥＲＧ２０および切断型ＨＭＧ１（Donald et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 109:E111-8に記載のｔＨＭＧ１）を含む第１のカセット、このカセットは、ＬＥＵ２の上流部位および下流部位に対応する２つの１００ヌクレオチド領域に隣接していた。遺伝子ＩＤＩ１およびｔＨＭＧ１がＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下、遺伝子ＥＲＧ１３がＧＡＬ７のプロモーター領域の制御下であった第２のカセット、このカセットは、ＴＲＰ１の上流部位および下流部位に対応する２つの１００ヌクレオチド領域に隣接していた。すべてＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下の遺伝子ＥＲＧ１０、ＥＲＧ１２、ｔＨＭＧ１およびＥＲＧ８を含む第３のカセット、このカセットは、ＵＲＡ３の上流部位および下流部位に対応する２つの１００ヌクレオチド領域に隣接していた。３つのカセット内のすべての遺伝子が、２００ヌクレオチドのそれ自体のターミネーター領域を含んでいた。また、Griggs and Johnston, Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:8597-8601に記載の通り、それ自体のプロモーターの突然変異型の制御下のＧＡＬ４の余分なコピーをＥＲＧ９プロモーター領域の上流に組み込んだ。加えて、ＥＲＧ９の発現をプロモーター交換により改変した。それ自体のプロモーターおよびターミネーターを含むＨＩＳ３遺伝子を含むカセットを使用してＧＡＬ７、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ１遺伝子を欠失させた。得られた株をＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄ株（Euroscarf、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と交配させて、ＹＳＴ０４５と名付けた二倍体株を得、これをSolis-Escalante et al, FEMS Yeast Res, 2015, 15:2にしたがって胞子形成に誘導した。ザイモリアーゼ（１０００Ｕ ｍＬ－１、Zymo research、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）２μＬを含む０．５Ｍソルビトール２００μＬ中に子嚢を再懸濁させることにより胞子分離を達成し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、この混合物を、２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキスおよび２０ｇ／Ｌ寒天を含む培地上にプレーティングし、１種の発芽胞子を単離し、ＹＳＴ０７５と名付けた。
アルコールデヒドロゲナーゼをコードする異なる遺伝子を発現させるために、ＹＳＴ０７５株へのゲノム組込みを実施した。各組込みカセットを４つの断片により構成した。
１）ＢＵＤ９遺伝子の上流部位に対応する２６１ｂｐおよび配列５’－ＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＧ－３’（配列番号７２）を含む断片、この断片を、ＹＳＴ０７５株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲにより得た；
２）配列５’－ＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＧ－３’（配列番号７２）、ＧＡＬ１遺伝子のプロモーター領域、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化された、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうちの１つ、ＰＧＫ１遺伝子のターミネーター領域および配列５’－ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴ－３’（配列番号７３）を含む断片、この断片をＤＮＡ合成により得た（ATUM、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ９４０２５）、
３）配列５’－ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴ－３’（配列番号７３）、それ自体のプロモーターおよびターミネーター領域を含むＴＲＰ１遺伝子ならびに配列５’－ＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＣＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＧＡ－３’（配列番号７４）を含む断片、この断片を、ｐＥＳＣ－ＴＲＰ１（Agilent Technologies、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を鋳型として用いてＰＣＲにより得た；および
４）配列５’－ＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＣＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＧＡ－３’（配列番号７４）およびＢＵＤ９遺伝子に対応する３４４ｂｐを含む断片、この断片を、ＹＳＴ０７５株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲにより得た。
評価されたアルコールデヒドロゲナーゼそれぞれのゲノム組込みに必要な４つの断片でＹＳＴ０７５を形質転換した。Gietz and Woods, Methods Enzymol., 2002, 350:87-96に記載の酢酸リチウムプロトコールにより酵母形質転換を実施した。アミノ酸を含まない６．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（BD Difco、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）、ロイシンを含まない１．９２ｇ／Ｌドロップアウトサプリメント（Sigma Aldrich、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）、２０ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／Ｌ寒天を含むＳｍＴｒｐ－培地上に形質転換混合物をプレーティングした。プレートを３０℃で３～４日間インキュベートした。正確な組込みを含む単一コロニーを単離し、ＹＳＴ１４９（ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１を含む）、ＹＳＴ１５０（ＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａを含む）、ＹＳＴ１５１（ＡｚＴｏｌＡＤＨ１を含む）およびＹＳＴ１５２（ＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１を含む）と名付けた。
ＹＳＴ１４９、ＹＳＴ１５０、ＹＳＴ１５１およびＹＳＴ１５２においてＣｒｔＥ、ＳｍＣＰＳ２およびＴａｌＶｅＴＰＰを発現させるために、Kuijpers et al., Microb Cell Fact., 2013, 12:47に以前に記載の酵母の内因性相同組換えを使用してプラスミドをイン・ビボで構築した。プラスミドは、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）の同時形質転換に使用した６つのＤＮＡ断片から構成される。これらの断片は以下の通りであった：
ａ）プライマー５’ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＴＣＧＴＡＡＧＧＣＣ－３’（配列番号７５）および５’ＴＣＧＴＧＧＴＣＡＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＧＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴ－３’（配列番号７６）を、鋳型としてのプラスミドｐＥＳＣ－ＬＥＵ（Agilent Technologies、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）と共に使用してＰＣＲにより構築されたＬＥＵ２酵母マーカー；
ｂ）プライマー５’－ＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＣＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ－３’（配列番号７７）および５’－ＡＡＣＧＣＧＴＡＣＣＣＴＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡ－３’（配列番号７８）を、鋳型としてのプラスミドｐＥＳＣ－ＵＲＡと共に使用してＰＣＲにより構築されたＡｍｐＲ Ｅ．コリ（E.coli）マーカー；
ｃ）プライマー５’－ＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＴＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴＡＣＴＴＡＧＧＧＴＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡ－３’（配列番号７９）および５’－ＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＡＴＡＧＧＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴ－３’（配列番号８０）を、鋳型としてのｐＥＳＣ－ＵＲＡと共に使用してＰＣＲにより得られた酵母複製開始点；
ｄ）プライマー５’－ＡＴＧＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号８１）および５’－ＣＴＣＡＧＡＴＧＴＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡ－３’（配列番号８２）を、鋳型としてのプラスミドｐＥＳＣ－ＵＲＡと共に使用してＰＣＲにより得られたＥ．コリ（E.coli）複製開始点；
ｅ）断片「ｄ」の最後の６０ヌクレオチド、酵母遺伝子ＰＧＫ１の終止コドン下流の２００ヌクレオチド、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内のその発現のためにコドン最適化されたＧＧＰＰシンターゼコード配列ＣｒｔＥ（配列番号６２）、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向性酵母プロモーター、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内のその発現のためにコドン最適化されたＴａｌＶｅＴＰＰのコード配列（配列番号６５）、酵母遺伝子ＣＹＣ１の終止コドン下流の２００ヌクレオチドおよび配列５’－ＡＴＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＴＡＣＡＣＧＡＴＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＧ－３’（配列番号８３）で構成された断片、この断片をＤＮＡ合成により得た（ATUM、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ９４０２５）および
ｆ）断片「ｅ」の最後の６０ヌクレオチド、酵母遺伝子ＣＹＣ１の終止コドン下流の２００ヌクレオチド、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内のその発現のためにコドン最適化されたＳｍＣＰＳ２シンターゼコード配列（配列番号６３）、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向性酵母プロモーターおよび断片「ａ」の最初に対応する６０ヌクレオチドで構成された断片、この断片をＤＮＡ合成により得た（ATUM、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ９４０２５）。
イン・ビボでのプラスミドアセンブリに必要な断片ですべての株を形質転換した。Gietz and Woods, Methods Enzymol., 2002, 350:87-96に記載の酢酸リチウムプロトコールにより酵母形質転換を実施した。アミノ酸を含まない６．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース（BD Difco、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）、ロイシンを含まない１．６ｇ／Ｌドロップアウトサプリメント（Sigma Aldrich、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）、２０ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／Ｌ寒天を含むＳｍＬｅｕ－培地上に形質転換混合物をプレーティングした。プレートを３０℃で３～４日間インキュベートした。個々のコロニーを使用して、Westfall et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:E111-118に記載の培地２ｍＬおよび有機オーバーレイとしてのドデカンが入ったガラス管内でコパロールおよびコパラールを産生した。
これらの培養条件下で、コパロールの最も高い平均濃度は、コパロール生合成プラスミドを含むＹＳＴ１５２株により産生された１５３．５１ｍｇ／Ｌであった。コパラールの最も高い平均濃度は、コパロール生合成プラスミドを含むＹＳＴ１４９株により産生された９８．４７ｍｇ／Ｌであった。コパロール生合成プラスミドを含むＹＳＴ１４９株、ＹＳＴ１５０株、ＹＳＴ１５１株およびＹＳＴ１５２株におけるコパロールからコパラールへの変換の平均百分率は、それぞれ６１．６％、３９．９％、３０．１％および２２．１％であった。コパロールおよびコパラールの産生を同定し、ＧＣ－ＭＳ分析（図１８）を内部標準と共に用いて定量化した。
Figure 2024029002000008
Figure 2024029002000009
ＴａｌＶｅＴＰＰ最適化ｃＤＮＡ ＯＲＦのみ－配列番号１
Figure 2024029002000010
ＴａｌＶｅＴＰＰアミノ酸配列－配列番号２
Figure 2024029002000011
ＴａｌＶｅＴＰＰ野生型ｃＤＮＡ－配列番号３
Figure 2024029002000012
非コード配列を含むＴａｌＶｅＴＰＰ最適化ｃＤＮＡ－配列番号４
Figure 2024029002000013
ＡｓｐＷｅＴＰＰ最適化ｃＤＮＡ－配列番号５
Figure 2024029002000014
ＡｓｐＷｅＴＰＰアミノ酸配列－配列番号６
Figure 2024029002000015
ＡｓｐＷｅＴＰＰ野生型ｃＤＮＡ－配列番号７
Figure 2024029002000016
非コード端を含むＡｓｐＷｅＴＰＰ最適化ｃＤＮＡ－配列番号８
Figure 2024029002000017
ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１最適化ｃＤＮＡ－配列番号９
Figure 2024029002000018
ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１アミノ酸配列－配列番号１０
Figure 2024029002000019
ＨｅｌＧｒｉＴＰＰ１野生型ｃＤＮＡ－配列番号１１
Figure 2024029002000020
ＵｍｂＰｉＴＰＰ１最適化ｃＤＮＡ－配列番号１２
Figure 2024029002000021
ＵｍｂＰｉＴＰＰ１アミノ酸配列－配列番号１３
Figure 2024029002000022
ＵｍｂＰｉＴＰＰ１野生型ｃＤＮＡ－配列番号１４
Figure 2024029002000023
ＴａｌＶｅＴＰＰ２最適化ｃＤＮＡ－配列番号１５
Figure 2024029002000024
ＴａｌＶｅＴＰＰ２アミノ酸配列－配列番号１６
Figure 2024029002000025
ＴａｌＶｅＴＰＰ２野生型ｃＤＮＡ－配列番号１７
Figure 2024029002000026
ＨｙｄＰｉＴＰＰ１最適化ｃＤＮＡ－配列番号１８
Figure 2024029002000027
ＨｙｄＰｉＴＰＰ１アミノ酸配列－配列番号１９
Figure 2024029002000028
ＨｙｄＰｉＴＰＰ１野生型ｃＤＮＡ－配列番号２０
Figure 2024029002000029
ＴａｌＣｅＴＰＰ１最適化ｃＤＮＡ－配列番号２１
Figure 2024029002000030
ＴａｌＣｅＴＰＰ１アミノ酸配列－配列番号２２
Figure 2024029002000031
ＴａｌＣｅＴＰＰ１野生型ｃＤＮＡ－配列番号２３
Figure 2024029002000032
ＴａｌＭａＴＰＰ１最適化ｃＤＮＡ－配列番号２４
Figure 2024029002000033
ＴａｌＭａＴＰＰ１アミノ酸配列－配列番号２５
Figure 2024029002000034
ＴａｌＭａＴＰＰ１野生型ｃＤＮＡ－配列番号２６
Figure 2024029002000035
ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１最適化ｃＤＮＡ－配列番号２７
Figure 2024029002000036
ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１アミノ酸配列－配列番号２８
Figure 2024029002000037
ＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１野生型ｃＤＮＡ－配列番号２９
Figure 2024029002000038
ＰｅＳｕｂＴＰＰ１最適化ｃＤＮＡ－配列番号３０
Figure 2024029002000039
ＰｅＳｕｂＴＰＰ１アミノ酸配列－配列番号３１
Figure 2024029002000040
ＰｅＳｕｂＴＰＰ１野生型ｃＤＮＡ－配列番号３２
Figure 2024029002000041
ＳｍＣＰＳをコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列－配列番号３３
Figure 2024029002000042
ＳｍＣＰＳ、サルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）由来のＣＰＰシンターゼ、アミノ酸配列。－配列番号３４
Figure 2024029002000043
パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来のＧＧＰＰシンターゼをコードするコドン最適化ｃＤＮＡ。－配列番号３５
Figure 2024029002000044
パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来のＧＧＰＰシンターゼ、アミノ酸配列－配列番号３６
Figure 2024029002000045
ＳｓＬＰＳをコードする最適化ｃＤＮＡ－配列番号３７
Figure 2024029002000046
 ＳｓＬＰＳアミノ酸配列。－配列番号３８
Figure 2024029002000047
ＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９をコードする最適化ｃＤＮＡ－配列番号３９
Figure 2024029002000048
ＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９、トリチカム・エスチバム（Triticum aestivum）由来の切断型コパリル二リン酸シンターゼ。－配列番号４０
Figure 2024029002000049
ＣｙｍＢ、最適化ｃＤＮＡ－配列番号４１
Figure 2024029002000050
ＣｙｍＢ、アミノ酸配列－配列番号４２
Figure 2024029002000051
ＡｓｐＷｅＡＤＨ１、最適化ｃＤＮＡ－配列番号４３
Figure 2024029002000052
ＡｓｐＷｅＡＤＨ１、アミノ酸配列－配列番号４４
Figure 2024029002000053
ＰｓＡｅｒＡＤＨ１、最適化ｃＤＮＡ－配列番号４５
Figure 2024029002000054
ＰｓＡｅｒＡＤＨ１、アミノ酸配列－配列番号４６
Figure 2024029002000055
ＡｚＴｏｌＡＤＨ１、最適化ｃＤＮＡ－配列番号４７
Figure 2024029002000056
ＡｚＴｏｌＡＤＨ１、アミノ酸配列－配列番号４８
Figure 2024029002000057
ＡｒｏＡｒｏＡＤＨ１、最適化ｃＤＮＡ－配列番号４９
Figure 2024029002000058
ＡｒｏＡｒｏＡＤＨ１、アミノ酸配列－配列番号５０
Figure 2024029002000059
ＴｈＴｅｒｐＡＤＨ１、最適化ｃＤＮＡ－配列番号５１
Figure 2024029002000060
ＴｈＴｅｒｐＡＤＨ１、アミノ酸配列－配列番号５２
Figure 2024029002000061
ＣｄＧｅｏＡ最適化ｃＤＮＡ－配列番号５３
Figure 2024029002000062
ＣｄＧｅｏＡ、アミノ酸配列－配列番号５４
Figure 2024029002000063
ＶｏＡＤＨ１、最適化ｃＤＮＡ－配列番号５５
Figure 2024029002000064
ＶｏＡＤＨ１、アミノ酸配列－配列番号５６
Figure 2024029002000065
活性部位シグネチャーモチーフ－配列番号５７
ＨＣｘｘＧｘｘＲ
［ここで、
各ｘは互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す］。
活性部位シグネチャーモチーフ－配列番号５８
ＨＣ（Ｔ／Ｓ）ｘＧＫＤＲＴＧ
［ここで、
ｘは、任意の天然アミノ酸残基を表す］。
ＰｖＣＰＳ、プレニル－トランスフェラーゼおよびコパリル－二リン酸シンターゼを有する多機能性タンパク質、コドン最適化ｃＤＮＡ－配列番号５９
Figure 2024029002000066
Figure 2024029002000067
ＰｖＣＰＳ、プレニル－トランスフェラーゼおよびコパリル－二リン酸シンターゼを有する多機能性タンパク質、アミノ酸配列－配列番号６０
Figure 2024029002000068
リボソーム結合部位－配列番号６１
ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ
ＣｒｔＥ、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化された、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来のＧＧＰＰシンターゼ－配列番号６２
Figure 2024029002000069
ＳｍＣＰＳ２、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化された、サルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）由来のコパリル－ピロリン酸シンターゼ－配列番号６３
Figure 2024029002000070
Figure 2024029002000071
ＳｍＣＰＳ２、サルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）由来のコパリル－ピロリン酸シンターゼ、アミノ酸配列－配列番号６４
Figure 2024029002000072
ＴａｌＶｅＴＰＰ、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化されたコパリル－ピロリン酸ホスファターゼ－配列番号６５
Figure 2024029002000073
ＡｚＴｏｌＡＤＨ１、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化された、アゾアルカス・トルクラスチクス（Azoarcus toluclasticus）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ－配列番号６６
Figure 2024029002000074
ＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化された、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ。－配列番号６７
Figure 2024029002000075
ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化された、ハイホジーマ・ロゼオニグラ（Hyphozyma roseonigra）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ。－配列番号６８
Figure 2024029002000076
ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、ハイホジーマ・ロゼオニグラ（Hyphozyma roseonigra）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸配列－配列番号６９
Figure 2024029002000077
ＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）内の発現のためにコドン最適化された、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ－配列番号７０
Figure 2024029002000078
ＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸配列－配列番号７１
Figure 2024029002000079
相同組換え１用配列－配列番号７２
Figure 2024029002000080
相同組換え２用配列－配列番号７３
Figure 2024029002000081
相同組換え３用配列－配列番号７４
Figure 2024029002000082
ＬＥＵ２酵母マーカー１用プライマー－配列番号７５
Figure 2024029002000083
ＬＥＵ２酵母マーカー２用プライマー－配列番号７６
Figure 2024029002000084
ＡｍｐＲ細菌マーカー１－用プライマー－配列番号７７
Figure 2024029002000085
ＡｍｐＲ細菌マーカー２用プライマー－配列番号７８
Figure 2024029002000086
酵母複製開始点１用プライマー－配列番号７９
Figure 2024029002000087
酵母複製開始点２用プライマー－配列番号８０
Figure 2024029002000088
Ｅ．コリ（E.coli）複製開始点１用プライマー－配列番号８１
Figure 2024029002000089
Ｅ．コリ（E.coli）複製開始点２用プライマー－配列番号８２
Figure 2024029002000090
相同組換え４用配列－配列番号８３
Figure 2024029002000091

Claims (17)

  1. 一般式１
    Figure 2024029002000092
     ［式中、
    Ｒは、Ｈを表し、または環式もしくは非環式の、線状もしくは分枝状の、飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されたヒドロカルビル残基を表す］
    のテルペンアルコール化合物の生体触媒的な製造方法であって、
    （１）式（１）の前記テルペン化合物の対応するテルペニル二リン酸前駆体を、テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、前記テルペンアルコールを生成するステップと、
    （２）ステップ（１）の前記テルペンアルコールを任意選択で単離するステップと
    を含み、前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの二リン酸除去酵素メンバーから選択される、方法。
  2. 二環式ジテルペンアルコール化合物の生体触媒的な製造方法であって、
    ａ）前記二環式ジテルペン化合物の対応する二環式ジテルペニル二リン酸前駆体を、テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、前記二環式ジテルペンアルコールを生成するステップと、
    ｂ）ステップａ）の前記二環式ジテルペンアルコールを任意選択で単離するステップと
    を含む、方法。
  3. 前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、前記タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの二リン酸除去酵素メンバーから選択される、請求項２記載の方法。
  4. 前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、以下の活性部位シグネチャーモチーフ：
    ＨＣｘｘＧｘｘＲ（配列番号５７）
    ［ここで、
    各ｘは互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す］
    を有するアミノ酸配列によって特徴付けられる二リン酸除去酵素の一クラスから選択される、請求項１または３記載の方法。
  5. 前記活性部位シグネチャーモチーフが、
    ＨＣ（Ｔ／Ｓ）ｘＧＫＤＲＴＧ（配列番号５８）
    ［ここで、
    ｘは、任意の天然アミノ酸残基を表す］
    である、請求項４記載の方法。
  6. 前記テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、以下のポリペプチド：
    ａ）配列番号２にしたがうアミノ酸配列を含むＴａｌＶｅＴＰＰ、
    ｂ）配列番号６にしたがうアミノ酸配列を含むＡｓｐＷｅＴＰＰ、
    ｃ）配列番号１０にしたがうアミノ酸配列を含むＨｅｌＧｒｉＴＰＰ、
    ｄ）配列番号１３にしたがうアミノ酸配列を含む、ＵｍｂＰｉＴＰＰ１、
    ｅ）配列番号１６にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＶｅＴＰＰ２、
    ｆ）配列番号１９にしたがうアミノ酸配列を含む、ＨｙｄＰｉＴＰＰ１、
    ｇ）配列番号２２にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＣｅＴＰＰ１、
    ｈ）配列番号２５にしたがうアミノ酸配列を含む、ＴａｌＭａＴＰＰ１、
    ｉ）配列番号２８にしたがうアミノ酸配列を含むＴａｌＡｓｔｒｏＴＰＰ１、および
    ｊ）配列番号３１にしたがうアミノ酸配列を含むＰｅＳｕｂＴＰＰ１、ならびに
    ｋ）テルペニル－二リン酸ホスファターゼ活性を有し、かつａ）～ｊ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
    からなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 前記式（１）［式中、Ｒは、Ｈ、または非環式の、線状もしくは分枝状の、飽和もしくは不飽和のヒドロカルビル残基を表す］のテルペンアルコール化合物を製造する、請求項１および請求項４から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. 前記式（１）のテルペンアルコールが、ファルネソールおよびゲラニルゲラニオールから選択される、請求項７記載の方法。
  9. ステップ（１）が、非環式テルペニル二リン酸前駆体を、二環式ジテルペニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、前記二環式ジテルペニル二リン酸前駆体を生成するステップをも含む、請求項２から６までのいずれか１項記載の方法。
  10. 前記二環式ジテルペニル二リン酸シンターゼが、
    ａ）配列番号３４にしたがうアミノ酸配列を含むＳｍＣＰＳ２、
    ｂ）配列番号４０にしたがうアミノ酸配列を含むＴａＴｐｓ１－ｄｅｌ５９、
    ｃ）配列番号３８にしたがうアミノ酸配列を含むＳｓＬＰＳ、および
    ｄ）二環式ジテルペニル二リン酸シンターゼ活性を有し、かつａ）、ｂ）およびｃ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも６０％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
    から選択される、請求項９記載の方法。
  11. 生体触媒的に製造された前記二環式ジテルペンアルコールが、それぞれ実質的に純粋な立体異性体の形態または少なくとも２種の立体異性体の混合物の形態のいずれかのコパロールおよびラブデンジオールから選択される、請求項２からまで６、請求項９および１０のいずれか１項記載の方法。
  12. ステップ（３）として、化学合成もしくは生体触媒合成またはその両方の組合せを用いた、アルコール誘導体へのステップ（１）またはステップ（２）の前記テルペンアルコールの加工をさらに含む、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
  13. 前記アルコール誘導体が、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルである、請求項１２記載の方法。
  14. 前記テルペンアルコールを、生体触媒的に酸化させる、請求項１２または１３記載の方法。
  15. 前記テルペンアルコールを、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と接触させることにより変換する、請求項１４記載の方法。
  16. 前記ＡＤＨが、
    ａ）配列番号４２にしたがうアミノ酸配列を含むＣｙｍＢ；
    ｂ）配列番号４４にしたがうアミノ酸配列を含むＡｓｐＷｅＡＤＨ１；
    ｃ）配列番号４６にしたがうアミノ酸配列を含むＰｓＡｅｒｏＡＤＨ１；
    ｄ）配列番号４８にしたがうアミノ酸配列を含むＡｚＴｏｌＡＤＨ１；
    ｅ）配列番号５０にしたがうアミノ酸配列を含むＡｒｏＡｒｏＡＤＨ１；
    ｆ）配列番号５２にしたがうアミノ酸配列を含むＴｈＴｅｒｐＡＤＨ１；
    ｇ）配列番号５４にしたがうアミノ酸配列を含むＣｄＧｅｏＡ；
    ｈ）配列番号５６にしたがうアミノ酸配列を含むＶｏＡＤＨ１；
    ｉ）配列番号６８にしたがうアミノ酸配列を含むＳＣＨ２３－ＡＤＨ１
    ｊ）配列番号７０にしたがうアミノ酸配列を含むＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ；および
    ｋ）ＡＤＨ活性を有し、かつａ）～ｊ）にしたがう前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも６０％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
    から選択される、請求項１５記載の方法。
  17. 一般式
    Figure 2024029002000093
     のアンブロックス様化合物の製造方法であって、
    （１）請求項１から１６までのいずれか１項に定義された生体触媒プロセスを実施し、ラブデンジオールまたはコパロール化合物を任意選択で単離することにより前記ラブデンジオールまたはコパロール化合物を提供するステップと、
    （２）化学合成および／または生化学合成を用いてステップ（１）の前記ラブデンジオールまたはコパロール化合物をアンブロックス様化合物に変換するステップと
    を含む、方法。
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