CN107119001B - 基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法。本发明通过将来自于鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因转化到类球红细菌能够在胞内表达，并产生具有活性的磷酸酶PgpB，从而可以直接催化类球红细菌MEP途径积累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。

Description

基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种类球红细菌以及利用类球红细菌生产法尼醇的方法。
背景技术
法尼醇(Farnesol)是一种无环倍半萜醇，化学式C15H26O，痕量存在于巴西檀木、黄葵子、金合欢、香茅、柠檬草、麝香、茉莉及橙花的香精油中。长期以来法尼醇作为一种香精成分广泛应用于化妆品行业，近年来的研究发现法尼醇还具有抑菌、抗炎和抗肿瘤等多种生物活性。除此之外法尼醇作为药物成分可以显著增加多种病原微生物(如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、变形链球菌、禾谷镰刀菌等)对药物的易感性。
目前在国内外法尼醇的生产和提取方法还是从植物中提取为主。例如，中国专利申请CN102675398A公开了一种从罗汉果中提取罗汉果昔V和法尼醇的方法。干罗汉果经破壳、减压浓缩、陶瓷膜过滤、大孔树脂吸附、梯度乙醇洗脱等步骤，将不同洗脱液进行脱色，采用结晶重结晶的方法分别得到罗汉果昔V和法尼醇纯品。由于在植物中的含量极少，导致法尼醇的提取和纯化都非常困难，因此此类方法的生产成本居高不下。
利用微生物合成并生产法尼醇是近几年发展起来的技术，微生物生产方法具有培养过程简单、生产周期短、提取和纯化步骤少等优势，是目前工业化大规模生产法尼醇等萜烯类化合物的理想途径。
中国专利申请CN103571763A公开了一株从白酒酒醅中筛到的酿酒酵母，这种酿酒酵母能够自身从头合成多种萜烯醇，该酵母除了能够生产法尼醇之外还可以合成里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇等萜烯类化合物，但是包括法尼醇在内的多种萜烯类化合物的产量均较低。
美国专利US 6689593公开了一种利用酵母或者大肠杆菌生产法尼醇的方法。该方法利用基因工程手段对酵母或大肠杆菌进行改造，降低了微生物胞内鲨烯合成酶的活性，同时过表达HMG-CoA还原酶基因和焦磷酸法尼脂合成酶基因，从而强化了HMG-CoA还原酶和焦磷酸法尼脂合成酶的活性。利用这种改造方法可以积累足够多的焦磷酸法尼脂，能够实现法尼醇和香叶醇在微生物胞内的合成。
综上所述，目前国内外利用微生物生产法尼醇的报道很少。本领域内仍然需要微生物合成法尼醇的新方法。
发明内容
本发明发现将来自于鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因转化到类球红细菌能够在胞内表达，并产生具有活性的磷酸酶PgpB，从而可以直接催化类球红细菌MEP途径积累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。至少基于上述部分发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的一方面，提供基因工程化类球红细菌，其包含来自鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因，且所述磷酸酶PgpB基因能够在所述类球红细菌的胞内表达，形成具有活性的磷酸酶PgpB。
在示例性实施方案中，所述类球红细菌的胞内包含焦磷酸法尼酯。优选地，所述焦磷酸法尼酯通过在胞内利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛为起始物质合成二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP，异戊二烯焦磷酸异构体)，进而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成。
在示例性实施方案中，所述类球红细菌为Rhodobacter sphaeroides 2.4.1，其菌种编号ATCC17023。
在示例性实施方案中，所述磷酸酶PgpB基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的另一方面，提供基因工程化类球红细菌的制备方法，其包括：
构建重组质粒并转化的步骤；和
通过细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤。
在示例性实施方案中，所述构建重组质粒并转化的步骤包括：
使用PgpB-F(SEQ ID NO:2)和PgpB-R(SEQ ID NO:3)所示的引物从鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的基因组中克隆磷酸酶PgpB1基因；
以pBBR1MCS2载体为模板，使用pBBR1MCS2-F(SEQ ID NO:4)和pBBR1MCS2-R(SEQID NO:5)所示的引物克隆得到所述pBBR1MCS2载体的拼接片段，回收所述拼接片段；
使用吉布森组装方法将所述PgpB基因和所述拼接片段混合，40～60℃反应10～60分钟，反应完毕之后转化大肠杆菌T1细胞，挑取阳性克隆，提取质粒pBBR1MCS2-PgpB，将提取的质粒pBBR1MCS2-PgpB转化大肠杆菌S17-1，挑取能够在含Kan抗性的培养基上生长的阳性菌株，提取质粒验证，获得含有pBBR1MCS2-PgpB正确序列的大肠杆菌S17-1克隆作为供体菌。
在示例性实施方案中，细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤包括：
在含有Kan抗生素的液体培养基中培养所述供体菌，在供体菌的OD600在0.4-0.6之间时停止培养并收集菌体；
在液体培养基中培养受体菌类球红细菌，在受体菌的OD600在0.3-0.6之间时停止培养并收集菌体；
将所述供体菌和受体菌分别用培养基稀释重悬，并将供体菌和受体菌混合后均匀涂布到固体无抗性平板培养基上培养，取平板上生长的菌落洗涤重悬；
将重悬后的菌落涂布在含亚碲酸钾和Kan的平板上培养后，挑取黑色接合子，即为pBBR1MCS2-PgpB重组质粒转化成功的类球红细菌菌落。
本发明的再一方面，提供法尼醇的生产方法，其包括使用本发明的类球红细菌的步骤。优选地，进一步包括类球红细菌的发酵培养步骤，和/或法尼醇的检测步骤。
本发明通过将鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92基因组中获得的磷酸酶PgpB转化到类球红细菌胞内表达，磷酸酶PgpB可以直接催化类球红细菌MEP途径积累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。本发明利用类球红细菌来生产法尼醇，方法简单，且产物易于提取。
本发明通过基因工程手段改造类球红细菌生产法尼醇，对法尼醇以及其他萜烯醇类化合物的工业化生产具有重要意义。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。例如，“样品”包括一种或多种样品和为本领域技术人员所已知的其等同物等等。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。
本发明中，生产法尼醇的菌株优选为类球红细菌。优选地，类球红细菌为基因工程化菌株，其为通过基因重组技术改造的菌株。更优选地，通过基因重组技术在例如不具有足够或缺少磷酸酶PgpB活性的野生型或其它人工改造菌株中引入外来物种的基因等遗传物质来使其表达、产生或带来增加量的磷酸酶PgpB活性的类球红细菌。在某些实施方案中，类球红细菌为在胞内包含焦磷酸法尼酯或包含可转化为焦磷酸法尼酯的物质的细菌。作为可转化为焦磷酸法尼酯的物质包括丙酮酸、3-磷酸甘油醛、二甲基丙烯焦磷酸酯，以及用于催化上述物质进行反应的法尼基焦磷酸合成酶等，这些物质可为细菌胞内天然存在的，或通过人工操作引入的。在某些实施方案中，类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1，其可购自ATCC(菌种编号ATCC17023)。
本发明中所述的类球红细菌是一种原核光合细菌，属于细菌域中紫色细菌群的α亚群，这种细菌广泛分布于自然界之中。类球红细菌在不同条件下既可进行光自养也可进行光异养，具有广泛的代谢方式，菌体不含毒素，且含有多种营养物质，在工业上常用于辅酶Q10的生产。
研究表明，类球红细菌胞内2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸合成途径(MEP途径)可以利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛为起始物质合成二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)，进而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成焦磷酸法尼酯(FPP)进入其他代谢途径。已知二甲基丙烯焦磷酸酯是合成萜烯类化合物的前体。发明人意外的地发现，当在类球红细菌胞内过表达磷酸酶或焦磷酸酶时，过量的酶活性并未对细菌内的其他代谢途径产生较大影响，细菌活性保持正常，并且能够在类球红细菌胞内直接转化焦磷酸法尼酯生成法尼醇，如下所示：
将来自于鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因转化到类球红细菌能够在胞内表达，并产生具有活性的磷酸酶PgpB，从而可以直接催化类球红细菌MEP途径积累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。
本发明中，所述磷酸酶PgpB是指在类球红细菌内具有活性的磷酸酶的任何酶。优选地，所述磷酸酶PgpB来源于细菌，优选地来源于与宿主细菌不同物种的细菌，例如，鼠疫耶尔辛杆菌。作为鼠疫耶尔辛杆菌的实例包括，但不限于Yersinia pestis CO92。在某些实施方案中，磷酸酶PgpB为全长基因产生的酶。在某些实施方案中，磷酸酶PgpB为其截短形式、突变形式等，只要具有或保持其酶活性即可。磷酸酶PgpB可以在类球红细菌内表达获得，或者在体外表达并引入细菌内。优选直接在细菌内表达产生磷酸酶PgpB。在细菌内表达产生磷酸酶PgpB的情况下，其基因的碱基序列优选如SEQ ID NO:1所示。
本发明的基因工程化类球红细菌的制备方法包括构建重组质粒并转化的步骤和通过细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤。
在示例性实施方案中，所述构建重组质粒并转化的步骤包括：
从鼠疫耶尔辛杆菌CO92的基因组中克隆磷酸酶PgpB1基因；以pBBR1MCS2载体为模板，克隆得到所述pBBR1MCS2载体的拼接片段，回收所述拼接片段；将所述PgpB基因和所述拼接片段混合反应，之后转化大肠杆菌T1细胞，挑取阳性克隆，提取质粒pBBR1MCS2-PgpB，将其转化到宿主细胞，挑取阳性菌株，提取质粒验证，获得供体菌。
在示例性实施方案中，细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤包括：在含抗生素的液体培养基中培养所述供体菌，在供体菌的OD600在0.4-0.6之间，例如0.45-0.55，或0.50时停止培养并收集菌体；在液体培养基中培养受体菌类球红细菌，在受体菌的OD600在0.3-0.6之间，优选0.4-0.5之间时停止培养并收集菌体；将供体菌和受体菌混合后均匀涂布到固体无抗性平板培养基上培养，取平板上生长的菌落洗涤重悬；将重悬后的菌落涂布在含亚碲酸钾和Kan的平板上培养后，挑取黑色接合子。
本发明的构建pBBR1MCS2-PgpB重组质粒并转化E.coli S17-1(供体菌)的更具体的示例性步骤如下：
构建pBBR1MCS2-PgpB重组质粒，用基因组提取试剂盒提取鼠疫耶尔辛杆菌(Yersinia pestis)CO92的基因组。以基因组为模板，使用引物从基因组中克隆得到磷酸酶PgpB1基因；以pBBR1MCS2载体为模板，用引物克隆得到pBBR1MCS2载体的拼接片段。
将克隆得到的PgpB基因和pBBR1MCS2载体的拼接片段回收，将PgpB基因和pBBR1MCS2载体的拼接片段混合，50℃反应30分钟。反应完毕之后用热激法转化大肠杆菌T1细胞，LB培养基过夜培养后，挑取阳性克隆质粒pBBR1MCS2-PgpB备用。再次使用热激法将提取出来的重组质粒pBBR1MCS2-PgpB转化大肠杆菌E.coli S17-1(供体菌)，挑取能够在含Kan抗性的LB培养基上生长的阳性菌株，提取质粒测序验证。
本发明的细菌接合转化重组载体pBBR1MCS2-PgpB至类球红细菌Rhodobactersphaeroides 2.4.1(受体菌)的更具体地示例性步骤如下：
将含有pBBR1MCS2-PgpB正确序列的E.coli S17-1克隆与类球红细菌Rhodobactersphaeroides 2.4.1进行细菌结合转化质粒pBBR1MCS2-PgpB。供体菌S17-1(含质粒pBBR1MCS-2-pcak)在含有Kan抗生素的LB液体培养基的摇瓶中过夜培养，之后转接至新鲜的LB液体培养基，在供体菌完全达到对数生长期(OD600:0.4-0.6)的时候停止培养并收集菌体；受体菌类球红细菌Rhodobacter sphaeroides在LB液体培养基中接种过夜培养，后转接至新鲜的LB培养基继续培养，控制培养时间直至受体菌完全处于对数生长期状态(OD600:0.3-0.6)，停止培养并收集菌体。分别取2-5μl菌液，离心并用新鲜的LB培养基洗涤2次，供体菌和受体菌分别用50μl及100μl的LB培养基稀释重悬。供体菌和受体菌按照一定比例混合后均匀涂布到固体无抗性LB平板上，培养20-24h至有明显菌落出现，再将平板上的菌落用1ml预冷的溶液洗脱收集至EP管中；离心弃上清液，再次加入500μl预冷的溶液，吹吸混匀，重复洗涤1-2次；再重悬菌落后涂布在终浓度200mg/l亚碲酸钾(K2TeO3)和50mg/ml Kan的双抗性溶液平板上，待32℃培养3-5天后，挑取平板上的黑色接合子，即为pBBR1MCS2-PgpB重组质粒转化成功的类球红细菌菌落。
本发明的法尼醇的生产方法包括使用本发明所述的类球红细菌的步骤。在某些实施方案中，进一步包括类球红细菌的发酵培养步骤，和/或法尼醇的检测步骤。
本发明的类球红细菌的发酵培养步骤可示例性说明如下：
将本发明的类球红细菌从保种管中取1-3μl接种至LB固体培养基上活化，然后将菌落转接至25ml的LB种子培养基，32℃，220rpm培养24h。培养后的菌液按10％的接种量转接至含有50-250ml的类球红细菌发酵培养基，32℃，220rpm培养培养48h后停止发酵，收集菌体破碎后检测法尼醇的含量。
本发明的法尼醇的含量的检测步骤可示例性说明如下：
首先取一定量的类球红细菌发酵液，8000rpm离心5min后弃上清，沉淀用乙酸乙酯重悬至5-10ml，用超声破碎法将细胞破碎，12000rpm离心10min。加入2-4ml的癸烷，充分混匀后，吸取癸烷层溶液，12000rpm离心8min后取上清用气质(GC-MS)检测法尼醇。GC-MS检测条件：仪器型号为安捷伦6890N-5975C，19091J HP-5非极性毛细管柱(0.32mm×250μm×30m)；FID检测器；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；分流比10：1；进样量1μL；进样口温度260℃；检测器温度260℃；升温程序：80℃保持1min，10℃/min升温至250℃。250℃后运行3min，溶剂延迟时间1min。
本发明中所述的具体方法、步骤以及其中所使用的试剂、材料等，除非另作说明，否则均为本领域内通常已知的，并且也容易地通过公开出版物获知或通过购买获得。具体出版物可参见，例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。
实施例1
通过在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1胞内异源表达鼠疫耶尔辛杆菌磷酸酶PgpB，可以将类球红细菌MEP途径积累的法尼酯转化为法尼醇，从而实现利用类球红细菌来生产法尼醇。具体步骤如下：
1.构建pBBR1MCS2-PgpB重组质粒并转化E.coli S17-1(供体菌)：
使用Gibson Assembly(NEB公司，美国)无缝连接的方法构建pBBR1MCS2-PgpB重组质粒。先用基因组提取试剂盒(全氏金公司，北京)提取鼠疫耶尔辛杆菌(Yersinia pestis)CO92的基因组。以基因组为模板，使用引物PgpB-F(SEQ ID NO:2)和PgpB-R(SEQ ID NO:3)从基因组中克隆得到磷酸酶PgpB1基因；以pBBR1MCS2载体为模板，用引物pBBR1MCS2-F(SEQID NO:4)和pBBR1MCS2-R(SEQ ID NO:5)克隆得到pBBR1MCS2载体的拼接片段。
使用基因回收试剂盒(Omega公司，美国)将克隆得到的PgpB基因和pBBR1MCS2载体的拼接片段回收，按照Gibson Assembly的方法将PgpB基因和pBBR1MCS2载体的拼接片段混合，50℃反应30分钟。反应完毕之后将混合液42℃热激1min转化大肠杆菌T1细胞，37℃过夜培养，将能够在含Kan抗性的LB培养基上生长的阳性菌株挑选出来培养，提取阳性克隆质粒pBBR1MCS2-PgpB备用。再次使用热激法将提取出来的重组质粒pBBR1MCS2-PgpB转化大肠杆菌E.coli S17-1(供体菌)，挑取能够在含Kan抗性的LB培养基上生长的阳性菌株，提取质粒测序验证。
2.细菌接合转化重组载体pBBR1MCS2-PgpB至类球红细菌Rhodobactersphaeroides 2.4.1(受体菌)：
将含有pBBR1MCS2-PgpB正确序列的E.coli S17-1克隆与类球红细菌Rhodobactersphaeroides 2.4.1进行细菌结合转化质粒pBBR1MCS2-PgpB。类球红细菌Rhodobactersphaeroides 2.4.1菌株购自ATCC(菌种编号ATCC17023)，供体菌S17-1(含质粒pBBR1MCS-2-pcak)在含有Kan抗生素的LB液体培养基的摇瓶中37℃过夜培养，次日以1:10的转接量转接至新鲜的LB液体培养基，控制时间继续培养约1-2h左右，在供体菌完全达到对数生长期(OD600:0.4-0.6)的时候停止培养，收集菌体；受体菌类球红细菌Rhodobacter sphaeroides在LB液体培养基中30℃接种过夜培养，后转接至新鲜的LB培养基继续培养，控制培养时间直至受体菌完全处于对数生长期状态(OD600:0.3-0.6)，停止培养并收集菌体。分别取2-5μl菌液，离心并用新鲜的LB培养基洗涤2次，供体菌和受体菌分别用50μl及100μl的LB培养基稀释重悬。供体菌和受体菌按照一定比例混合后均匀涂布到固体无抗性LB平板上，培养20-24h至有明显菌落出现，再将平板上的菌落用1ml预冷的溶液1(细菌接合专用培养基)洗脱收集至0.5ml EP管中；4℃8000rpm离心5min，弃上清液，再次加入500μl预冷的溶液1，吹吸混匀，重复洗涤1-2次；再用0.1ml的溶液1重悬菌落后涂布在终浓度200mg/l亚碲酸钾(K2TeO3)和50mg/ml Kan的双抗性溶液1平板上，待32℃培养3-5天后，平板上出现黑色接合子，即为pBBR1MCS2-PgpB重组质粒转化成功的类球红细菌菌落。
(溶液1的成分：(NH4)2SO4 0.8g/l，谷氨酸钠0.10g/l，天冬氨酸0.04g/l，尼克酸1.0mg/l，维生素B1 0.50mg/l，生物素0.010mg/l，NaCl 2.5g/l，MgCl2·6H2O 2.44g/l，CaCl2·H2O 0.3g/l，FeSO4·7H2O 0.02g/l，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.2ml(1％Solution)，配好后用盐酸调pH 4.5-4.9)
3.重组类球红细菌发酵培养与法尼醇产量的检测：
将含有pBBR1MCS2-PgpB重组质粒的类球红细菌从保种管中取1-3μl接种至LB固体培养基上活化，然后将菌落转接至25ml的LB种子培养基，32℃，220rpm培养24h。培养后的菌液按10％的接种量转接至含有50-250ml的类球红细菌发酵培养基，32℃，220rpm培养48h后停止发酵，收集菌体破碎后检测法尼醇的含量。
类球红细菌发酵培养基组分为：葡萄糖7g/l，蛋白胨3.2g/l，NH4Cl 3.8g/l，FeCl30.25g/L，MgSO4 6g/L，玉米浆1.2g/l，Na2HPO4 1.8g/l，NaH2PO4 2g/l，KCl 2.4g/l，CuSO40.06g/l，Ca(HCO3)2 7.2g/l，维生素B1 20g/l，核黄素3g/l，叶酸1g/l，烟酸胺25g/l。
法尼醇的含量的检测方法为：首先取一定量的类球红细菌发酵液，8000rpm离心5min后弃上清，沉淀用乙酸乙酯重悬至5-10ml，用超声破碎法将细胞破碎，超声20s，停20s，处理时间10min，然后12000rpm离心10min。加入2-4ml的癸烷，充分混匀后，吸取癸烷层溶液，12000rpm离心8min后取上清用气质(GC-MS)检测法尼醇。GC-MS检测条件：仪器型号为安捷伦6890N-5975C，19091J HP-5非极性毛细管柱(0.32mm×250μm×30m)；FID检测器；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；分流比10：1；进样量1μL；进样口温度260℃；检测器温度260℃；升温程序：80℃保持1min，10℃/min升温至250℃。250℃后运行3min，溶剂延迟时间1min。
经过检测发现表达外源磷酸酶PgpB的重组类球红细菌Rhodobacter sphaeroides2.4.1能够产生法尼醇，产量为84.75±2.06mg/l，而未经过转化的野生型类球红细菌则不能合成法尼醇。
本发明通过简单的基因工程改造方法可以使类球红细菌合成法尼醇。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建师范大学
<120> 基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法
<130> YC12017040001-B
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 762
<212> DNA
<213> Yersinia pestis
<400> 1
atgtataaca tggcaaaacg agtcactatc ggaacggtta ttttattatt gccaacgtta 60
gcgatatggc tttccgattg gcagtggcaa ccagggggaa ataacacgtg gttaaaaggt 120
tttttttggg tgacagaaac ggtaactgca ccttggggca tactgaccag tgtgttgctt 180
tgtagttggt tcttgtggtg cttgcgggtt cgctttaagc ctgccgttgg gctgtttgtg 240
gtattaggcg cggtgattgt tctcgggcaa ggtgtaaaat cgttgattaa agagcaggta 300
caggaacctc ggccatttgt tgcctggctt gaagccgagc atcatattaa taatcgcctt 360
ttctattctt taccgcgtgc cgaacgcagt gagttagtca ggcagcagtt acaagaccaa 420
ttgattattc ctgtgtggtt gagccgtcac tggcagtttg agaccgggtt ctctttcccg 480
tcaggacata ctgtatttgc cgccacttgg gcattattag ccgttgggct gctatggcca 540
cggcgacatt ataaaacggt cgttttactg atgttatggg cacaaggtgt gatggcgagc 600
cgcttatttt taggtatgca ctggccgcag gacctgattg ccgcgacgct catcagtggc 660
gtcttggccg ctgtggcgtg tggactcctc cagcatgggt tcggccttct ggatatcccg 720
caatcagaac aaaaagagag cgaaaaacgg gggcatgagt aa 762
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtaacagga ggaattaacc atgtataaca tggcaaaacg ag 42
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agaccgagct caccgaattc ttactcatgc ccccgttttt c 41
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggttaattcc tcctgttacg cgc 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaattcggtg agctcggtct g 21

Claims (7)

1.一种基因工程化类球红细菌，其包含来自鼠疫耶尔辛杆菌CO92的磷酸酶PgpB基因，且所述磷酸酶PgpB基因能够在所述类球红细菌的胞内表达，形成具有活性的磷酸酶PgpB；
其中，在所述类球红细菌的胞内包含焦磷酸法尼酯或可转化为所述焦磷酸法尼酯的物质；
其中，所述焦磷酸法尼酯通过在胞内利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛为起始物质合成二甲基丙烯焦磷酸酯，进而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成。
2.根据权利要求1所述的基因工程化类球红细菌，其中，所述类球红细菌的菌种编号为ATCC17023。
3.根据权利要求1所述的基因工程化类球红细菌，其中，所述磷酸酶PgpB基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种基因工程化类球红细菌的制备方法，其包括：
构建重组质粒并转化的步骤；和
通过细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤；
其中，所述构建重组质粒并转化的步骤包括：
使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物从鼠疫耶尔辛杆菌CO92的基因组中克隆磷酸酶PgpB1基因；
以pBBR1MCS2载体为模板，使用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物克隆得到所述pBBR1MCS2载体的拼接片段，回收所述拼接片段；
将所述PgpB基因和所述拼接片段混合，40-60℃反应10-60分钟，反应完毕之后转化大肠杆菌T1细胞，挑取阳性克隆，提取质粒pBBR1MCS2-PgpB，将提取的质粒pBBR1MCS2-PgpB转化大肠杆菌S17-1，挑取能够在含Kan抗性的培养基上生长的阳性菌株，提取质粒验证，获得含有pBBR1MCS2-PgpB正确序列的大肠杆菌S17-1克隆作为供体菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程化类球红细菌的制备方法，其中，所述通过细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤包括：
在含有Kan抗生素的液体培养基中培养所述供体菌，在所述供体菌的OD600达到0.4-0.6之间时停止培养并收集菌体；
在液体培养基中培养所述类球红细菌，在其OD600达到0.3-0.6之间时停止培养并收集菌体作为受体菌；
将收集的所述供体菌和所述受体菌分别稀释重悬，并将所述供体菌和所述受体菌混合后涂布到固体无抗性平板培养基上培养，取平板上生长的菌落洗涤、重悬；
将重悬后的菌落涂布在含亚碲酸钾和Kan的平板上培养后，挑取黑色接合子，即为所述基因工程化的类球红细菌。
6.一种法尼醇的生产方法，其包括使用根据权利要求1-3任一项所述的基因工程化类球红细菌的步骤。
7.根据权利要求6所述的法尼醇的生产方法，其进一步包括所述基因工程化类球红细菌的发酵培养步骤，和/或法尼醇的检测步骤。
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