CN113416662B

CN113416662B - 一种产西柏三烯一醇的酿酒酵母及应用

Info

Publication number: CN113416662B
Application number: CN202110621208.5A
Authority: CN
Inventors: 杨海泉; 陈献忠; 张坤杰; 刘万隆; 董田田; 沈微; 夏媛媛; 陈磊; 曹钰
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2041-06-03
Also published as: CN113416662A

Abstract

本发明公开了一种产西柏三烯一醇的酿酒酵母及应用，属于代谢工程和微生物工程领域。本发明通过将关键酶西柏三烯醇合成酶基因、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶基因、法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)基因整合至酿酒酵母菌株基因组上，并利用启动子P_hxt1替换角鲨烯合成酶(ERG9)原来的启动子来敲低竞争途径麦角固醇途径，还将含有关键酶基因ggpp基因和cbts基因的游离质粒转入该酿酒酵母中，进一步提高了西柏三烯一醇产量。本发明还采用线粒体区室化方法，将GGPP合酶和西柏三烯醇合成酶定位到线粒体中，使西柏三烯一醇产量提高至283.98μg/L，在5L发酵罐发酵水平，西柏三烯一醇产量可达15mg/L。

Description

一种产西柏三烯一醇的酿酒酵母及应用

技术领域

本发明涉及一种产西柏三烯一醇的酿酒酵母及应用，属于代谢工程和微生物工程领域。

背景技术

在全球杀虫剂市场的背景下，化学合成的活性化合物，如人造除虫菊衍生物和最显着的新烟碱类(如吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺；价值18.9亿美元)，其可快速作用害虫但非目标判别产品。新烟碱类是通过与烟碱乙酰胆碱受体不可逆结合而介导所有昆虫神经毒性作用的主要杀虫剂类别。化学农药具有诸多缺点，例如：易造成环境污染、目标种群逐渐养成抗药性、其对非目标种群具有负面性等。因此，这些化合物会影响害虫以及蜜蜂和熊蜂等有益昆虫，从而对农村地区的农作物和生物多样性的授粉产生负面影响。化学杀虫剂甚至危及工业农业活动和仍在增长的人口的可持续性。此外，这些化学品的生物降解性很差，导致环境积累，对陆地和水生生态系统的生物多样性产生负面影响。新烟碱类的广泛环境影响最近引发欧洲委员会严格限制这些化合物在农业活动中的适用性。

生物农药亦称为天然农药，是来自天然的化学物质或者生命体，具有杀菌农药和杀虫农药的作用。相比而言，生物农药具有诸多优点：选定的天然杀虫化合物对脱靶昆虫无毒、确保仅对农业活动和作物产量产生积极影响、对人畜安全、对生态环境影响小、诱发害虫患病、可利用农副产品加工生产、易被陆地微生物或光迅速降解、不会积累等。我国生物农业类型主要包括微生物农药、植物源农药、农用抗生素、天敌昆虫农药、生物化学农药、植物生长调节剂类农药等六大类型。西柏三烯一醇作为一种重要的二萜类化合物，是植物的分泌物成分，代表植物防御昆虫、病原微生物和食草动物的主要成分，在生物防治方面具有重要作用与意义。西柏三烯一醇只能在植物中以痕量检测到，但其具有显著的杀虫活性，且在自然降解过程中不会在生态圈中积累。

同时，西柏三烯一醇也是烟草中香味物质之一，对于烟草的品质具有重要影响与作用意义。虽然近年来西柏三烯一醇受到了一定关注，但相关报道与数据较少。西柏三烯一醇可以从植物中提取获得，但由于其在植物中只能以痕量检测到，含量较少。所以，通过从植物中提取的方法获得西柏三烯一醇具有一定的挑战，且生产成本太高，不利于其在农业生产中的应用。西柏三烯一醇具有复杂的化学结构又难以化学合成。因此，利用微生物生物合成西柏三烯一醇具有很大的前景及价值。研究表明萜类化合物在生物合成中可通过甲羟戊酸途径(MEV)合成，这为通过合成生物学方法在微生物宿主(如酿酒酵母)中生产西柏三烯一醇奠定了基础。作为真核微生物的酿酒酵母菌株，具有遗传信息清晰、生长快速、不易污染湿菌体、培养基廉价、对于化学物质(如萜类)具有较高耐受性等优点，适合用于精细化学品的高效生产。但单一的重组菌株构建方式，不利于重组微生物高效工业化生产西柏三烯一醇。

发明内容

本发明提供了西柏三烯一醇高产酿酒酵母菌株的构建、系统调控方法及应用，可高效生产西柏三烯醇，促进其在农业及烟草等领域中的应用。

本发明的第一个目的是提供西柏三烯一醇高产酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株整合表达了西柏三烯醇合酶、香叶基焦磷酸(GGPP)合酶和法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)；所述西柏三烯醇合酶含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述香叶基焦磷酸(GGPP)合酶含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述法尼基焦磷酸合成酶含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母还用诱导型启动子P_hxt1替换了基因erg9原有的启动子，以敲低竞争途径麦角固醇途径。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母还用质粒过表达了西柏三烯醇合酶、香叶基焦磷酸合酶和法尼基焦磷酸合成酶。

在一种实施方式中，所述质粒连接了西柏三烯醇合酶基因、香叶基焦磷酸合酶基因和法尼基焦磷酸合成酶基因。

在一种实施方式中，所述法尼基焦磷酸合成酶以启动子P_GAP调控表达。

在一种实施方式中，所述重组质粒以质粒pY26TEF-GPD或pYX212为质粒骨架。

在一种实施方式中，所述西柏三烯醇合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述香叶基焦磷酸合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述法尼基焦磷酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述西柏三烯醇合酶和香叶基焦磷酸合酶上游还分别有SEQID NO.9所示的信号肽。

在一种实施方式中，所述信号肽通过SEQ ID NO.10所示的基因编码。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母以酿酒酵母W303-1A或酿酒酵母BY4741为宿主。

在一种实施方中，所述酿酒酵母是采用区室化方法将两种酶(西柏三烯醇合成酶、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶基因)分别通过特异信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.9)定位到线粒体中进行表达。

在一种实施方式中，在线粒体区室化表达时，西柏三烯醇合成酶和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶采用串连表达。

本发明还提供所述酿酒酵母在生产西柏三烯一醇中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述酿酒酵母接种至培养基中，于25-35℃培养1-5d。

在一种实施方式中，所述应用是将酿酒酵母接种至YPD培养基中，于25-35℃、100-300rpm培养1-5d。

在一种实施方式中，所述应用是将所述酿酒酵母的单菌落接入10-100mL新鲜的YPD培养基(250mL摇瓶)，25-35℃、100-300rpm条件下进行摇瓶培养6-20h。然后将种子液按0.5-10％(v/v)的接种量转接到含有10-100mL新鲜的YPD培养基(或改进的YPD培养基)的500mL摇瓶中，25-35℃、100-300rpm条件下培养1-5d。

在一种实施方式中，所述应用是将酿酒酵母种子液，按0.5-10％(v/v)的接种量转接到发酵罐中，在转速为200-900rpm，通气量为0.5-2ppv，培养温度为25-35℃的条件下发酵；当溶解氧降低至低于30％时，调节搅拌转速(最高至900rpm)，使溶解氧控制在30％以上；当葡萄糖浓度降低至10-20g/L时，补加葡萄糖(母液浓度300-850g/L)，补加的方式采用溶氧关联方式(DO-stat，控制溶氧为20-50％)，培养时间是3-5d。

本发明还提供所述酿酒酵母在农业、烟草领域生产含西柏三烯一醇的产品方面的应用。

在一种实施方式中，所述产品为农药或烟草添加剂。

本发明的有益效果是：

本发明采用基因工程、代谢工程技术和发酵工程领域，通过在酿酒酵母基因组上整合异源表达西柏三烯一醇合成的2个关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶基因和西柏三烯醇合酶基因，实现了西柏三烯一醇在酿酒酵母中的从头生产。利用启动子P_hxt1替换角鲨烯合成酶(ERG9)原来的启动子来敲低竞争途径麦角固醇途径，使碳代谢流更好的流向目的产物，显著提高西柏三烯一醇产量。并进一步将含有2个关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶基因和西柏三烯醇合酶基因的游离质粒转入上述在基因组上整合表达2个关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶基因和西柏三烯醇合酶基因的酿酒酵母菌株，显著提高了西柏三烯一醇产量。基于区室化方法，将关键酶基因2个关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶基因和西柏三烯醇合酶基因串连后，定位到线粒体中，显著提高西柏三烯一醇产量。本发明还提供了上述方法在制备含西柏三烯一醇的产品中的应用。采用本发明获得的西柏三烯一醇高产量酿酒酵母菌株及方法可高效生产西柏三烯一醇，可促进其在农业及烟草等领域中的应用。

附图说明

图1为关键酶整合表达实现西柏三烯一醇在酿酒酵母中生产图；

图2为竞争途径敲低增强西柏三烯一醇生产图；

图3为游离与整合共表达关键酶增强西柏三烯一醇生产图。

图4为关键酶基因ggpps和cbts的线粒体区室化表达增强西柏三烯一醇生产图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

西柏三烯一醇的测定：

西柏三烯一醇采用GC-MS测定，条件为：流速1.2mL/min，分流比为5，进样温度280℃，升温速度10℃/min，扫描离子范围29-550m/z，扫描时间5min。

YPD培养基(1L)：

葡萄糖20g、胰蛋白胨20g、酵母提取物10g，固体培养基添加2％(w/v)的琼脂。

PCR扩增的条件：

预变性98℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃(酶的延伸速度为1kb/min，具体时间根据扩增片段的长度来设置)；设置循环30次；再延伸72℃，10min；最后16℃保温。

PCR扩增的体系：

实施例1：

本实施例采用整合表达方式，将SEQ ID NO.4所示的ggpps、SEQ ID NO.6所示的erg20、SEQ ID NO.2所示的cbts基因整合到酿酒酵母S.cerevisiae BY4741基因组，构建获得了可生产西柏三烯一醇的关键酶整合表达重组菌株S24。具体构建方法如下：采用引物：

HO-FW：CCTTAATTAAATGCTTTCTGAAAACACGACTA；

HO-RS：CCTTAATTAATTAGCAGATGCGCGCACCTGCG，

以S.cerevisiae W303-1A基因组为模板PCR获得基因ho，利用DNA连接酶将其链接到pMD19T上构建了质粒pMD19T-ho；将标记基因gdaURA3，通过sma I和bgl II限制性内切酶酶切连接到质粒pMD19T-ho，构建获得了重组质粒pMD19T-ho-gdaURA3；将erg20-ggpps通过spe I和xho I限制性内切酶酶切连接到质粒pY26TEF-GPD，获得了重组质粒pY26TEF-GPD-erg20-ggpps；将ggpps-cbts通过not I和Bstx I限制性内切酶酶切连接到质粒pY26TEF-GPD-erg20-ggpps获得重组质粒pY26-GPD-erg20-ggpps-TEF-ggpps-cbts；

采用引物：

Adh-f2：TCAGTAGATAGCTTGGATCCGAGCGACCTCATGCTATACT；

R：ATGGCGAGTATTGATAATGACTCACTAAAGGGAACAAAAG；

F：CTTTTGTTCCCTTTAGTGAGTCATTATCAATACTCGCCAT；

Cyc1r2：TCAAAGGGCGAAAACCCGGGGCAAATTAAAGCCTTCGAGC，

PCR扩增获得基因GPD-erg20-ggpps-TEF-ggpps-cbts，通过一步克隆获得质粒pMD19T-ho-gdaURA3-GPD-erg20-ggpps-TEF-ggpps-cbts，将采用限制性内切酶pac I酶切获得整合框ho-gdaURA3-GPD-erg20-ggpps-TEF-ggpps-cbts，将其电转化至S.cerevisiaeBY4741中，筛选整合到S.cerevisiae BY4741基因组上的阳性克隆，命名为重组酿酒酵母S24。

挑取S24单菌落接入20mL新鲜的YPD培养基，30℃、200rpm条件下进行摇瓶培养12h。然后将种子液按1％(v/v)的接种量转接到含有50mL新鲜的YPD培养基的锥形瓶中，30℃、200rpm条件下培养3d，检测西柏三烯一醇产量。

如图1所示，重组菌株S24的西柏三烯一醇产量为4.01μg/L。西柏三烯一醇转化率为0.20μg/g，生产强度为5.57×10^-2μg/(L·h)。

实施例2：

本实施例利用诱导型启动子P_hxt1来表达SEQ ID NO.11所示的基因erg9，以达到敲低麦角固醇途径的目的，构建获得菌株S25。

具体构建方法为：采用引物：

Phxt1-FW：TCACATATCACACACACACATGCAGGTCTCATCTGGAATATA；

Phxt1-RS：AATTGTAATAGCTTTCCCATGATTTTACGTATATCAACTAGT；

erg9-FW：TAGTTGATATACGTAAAATCATGGGAAAGCTATTACAATTGG；

erg9-RS：TGACATAACTAATTACATGATCACGCTCTGTGTAAAGTGTAT

分别扩增SEQ ID NO.7所示的启动子Phxt1和SEQ ID NO.11所示的erg9基因，并采用引物：

erg9-up-FW：CCCAAGCTTCTCAGAGCCCCCAGCACCAGTA；

erg9-up-RS：TATTCCAGATGAGACCTGCATGTGTGTGTGTGATATGTGACG；

erg9-down-FW：GCTCGAAGGCTTTAATTTGCCGGGATCCTCGCTTTTAGACAGAAGATCTAGTCTGCGCCAAATAACATAAA；

erg9-down-RS：CCCAAGCTTGAAAAAAGAATTATCACTATCA，

扩增获得整合基因上下2条同源臂。基于上述引物，采用融合PCR方式，获得整合框up-P_hxt1-erg9-down。将整合框电转化至酿酒酵母细胞中，筛选获得含有启动子P_hxt1的阳性克隆S25。按照实施例1的方法培养，如图2所示，菌株S25的西柏三烯一醇的产量与转化率分别为7.22μg/L和0.36μg/g，与实施例1构建的菌株S24相比产量和转化率均提高了1.8倍，西柏三烯一醇生产强度为1.0×10^-1μg/(L·h)。

实施例3：

本实施例中采用引物：

ggpp_tc_fusion_FW：CGGGATCCATGGCTTATACTGCTATGGCT；

ggpp_tc_fusion_RS：TGATAATGATAAACTGAGCTTTAATTTTGTCTAAAAGCGA；

GAP_g_G_t__FW：GTCGAATCTGTCGACATATGAGAGGGTTAATTGCGCGCCG；

g_G_t_fusion_2_RS：CGGCGCGCAATTAACCCTCTCATATGTCGACAGATTCGA。

将SEQ ID NO.4所示的基因ggpps与SEQ ID NO.8所示的启动子P_GAP、SEQ ID NO.2所示的基因cbts融合PCR后，用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，连接到质粒pY26TEF-GPD，获得重组质粒pY26TEF-GPD-ggpps-P_GAP-cbts。

采用引物ERG20-1-FW:ATGGCATATACTGCAATGGCG；

ERG20-1-RS:TTAATTTTGTCTGAACGCGAT，

PCR获得SEQ ID NO.6所示的法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20，经一步克隆，连接pY26TEF-GPD-ggpps-P_GAP-cbts，获得重组质粒pY26TEF-GPD-ggpps-P_GAP-cbts-P_GAP-erg20，将其转化至实施例2构建的菌株S25中，获得菌株S26。按照实施例1的方法培养，测定产量发现菌株S26的西柏三烯一醇的产量达188.20μg/L(图3)，与只整合表达的菌株S25相比产量提高了26.07倍。同时西柏三烯一醇的生产强度为2.61μg/(L·h)，菌株S26的转化率为9.52μg/g，与对照菌株相比有了显著提高。

实施例4：

本实施例中将SEQ ID NO.10所示的信号肽(酵母细胞色素c氧化酶亚基IV)基因与SEQ ID NO.4所示的GGPP合酶基因和SEQ ID NO.2所示的西柏三烯醇合酶基因(ggpps和cbts)串联在线粒体中区室化表达，构建获得了重组菌株S27。具有构建方法包括：

采用引物：

mt-ggpps-FW：CGGAATTCATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTC；

mt-ggpps-FW2：ACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTATGGCTTATACTGCTATGGC；

mt-ggpps-RS：CCGCTCGAGTTAATTTTGTCTAAAAGCGA；

mt-t1a-FW：GAAGATCTATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTC；

mt-t1a-FW2：ACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTATGAATCGAGCAATGGATCT；

mt-t1a-RS：CCTTAATTAATCATATGTCGACAGATTCGA，

进行PCR获得含有线粒体区室化表达所需的信号肽的mtggpps和mtcbts基因，将其与质粒连接、转化至实施例2中构建的酿酒酵母菌株S25中，获得重组菌株S27。按照实施例1的方法培养，如图4所示，菌株S27的西柏三烯一醇的产量为283.98μg/L，生产强度为3.94μg/(L·h)，其西柏三烯一醇转化率为14.43μg/g，与菌株S26相比较，西柏三烯一醇产量和转化率分别提高了1.51倍和1.52倍。

实施例5：

将实施例4构建的重组菌株S27在高葡萄糖浓度的改进YPD培养基中发酵产西柏三烯一醇，培养基成分为：葡萄糖180g/L、酵母粉20g/L、蛋白胨50g/L。

将实施例4构建的重组菌株S27接种至培养基，使接种后的菌体数量级达1×10⁶CFU/mL，在500mL的发酵体系中发酵80h时，西柏三烯一醇产量可达1.5mg/L。

采用5L发酵罐发酵时，装液量为3L，接种后的菌体数量级达1×10⁶CFU/mL，控制转速为600rpm，通气量为1ppv，培养温度为30℃。发酵过程中溶解氧降低至30％以下时，调节搅拌转速，最高至800rpm。当葡萄糖浓度降低至10-20g/L时，开始补加葡萄糖(补料液的葡萄糖浓度为600g/L)，补加的方式采用溶氧关联方式(DO-stat，控制溶氧为25％)，发酵培养80h时，西柏三烯一醇产量可达15mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产西柏三烯一醇的酿酒酵母及应用

<130> BAA210799A

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Leu Ser Ser Ser Ser Arg His Leu Ala Asp Phe Pro Ser Thr

1 5 10 15

Ile Trp Gly Asp His Phe Leu Ser Tyr Asn Ser Glu Ile Thr Glu Ile

20 25 30

Thr Thr Gln Glu Lys Asn Glu His Glu Met Leu Lys Glu Ile Val Arg

35 40 45

Lys Met Leu Val Glu Thr Pro Asp Asn Ser Thr Gln Lys Leu Val Leu

50 55 60

Ile Asp Thr Ile Gln Arg Leu Gly Leu Ala Tyr His Phe Asn Asp Glu

65 70 75 80

Ile Glu Asn Ser Ile Gln Asn Ile Phe Asn Leu Ser Gln Asn Ser Glu

85 90 95

Asp Asp Asp Glu His Asn Leu Tyr Val Ala Ala Leu Arg Phe Arg Leu

100 105 110

Ala Arg Gln Gln Gly Tyr Tyr Met Ser Ser Asp Val Phe Lys Gln Phe

115 120 125

Thr Asn His Asp Gly Lys Phe Lys Glu Asn His Thr Asn Asp Val Gln

130 135 140

Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ala His Met Arg Val His Asp Glu

145 150 155 160

Glu Ile Leu Glu Glu Ala Leu Ile Phe Thr Thr Thr His Leu Glu Ser

165 170 175

Val Ile Pro Asn Leu Ser Asn Ser Leu Lys Val Gln Val Thr Glu Ala

180 185 190

Leu Ser His Pro Ile Arg Lys Ala Ile Pro Arg Val Gly Ala Arg Lys

195 200 205

Tyr Ile His Ile Tyr Glu Asn Ile Gly Thr His Asn Asp Leu Leu Leu

210 215 220

Lys Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met Leu Gln Lys Leu His Arg Lys

225 230 235 240

Glu Leu Asn Glu Leu Thr Ser Trp Trp Lys Asp Leu Asp Arg Ala Asn

245 250 255

Lys Phe Pro Tyr Ala Lys Asp Arg Leu Val Glu Ala Tyr Phe Trp Thr

260 265 270

Val Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Arg Ser Arg Ser Leu Val

275 280 285

Thr Lys Val Val Lys Met Asn Ser Ile Ile Asp Asp Thr Tyr Asp Ala

290 295 300

Tyr Ala Thr Phe Asp Glu Leu Val Leu Phe Thr Asp Ala Ile Gln Arg

305 310 315 320

Trp Asp Glu Gly Ala Met Asp Leu Leu Pro Thr Tyr Leu Arg Pro Ile

325 330 335

Tyr Gln Gly Leu Leu Asp Val Phe Asn Glu Met Glu Glu Val Leu Ala

340 345 350

Lys Glu Gly Lys Ala Asp His Ile Tyr Tyr Ala Lys Lys Glu Met Lys

355 360 365

Lys Val Ala Glu Val Tyr Phe Lys Glu Ala Glu Trp Leu Asn Ala Asn

370 375 380

Tyr Ile Pro Lys Cys Glu Glu Tyr Met Lys Asn Gly Leu Val Ser Ser

385 390 395 400

Thr Gly Pro Met Tyr Gly Ile Ile Ser Leu Val Val Met Glu Glu Ile

405 410 415

Ile Thr Lys Glu Ala Phe Glu Trp Leu Thr Asn Glu Pro Leu Ile Leu

420 425 430

Arg Ala Ala Ser Thr Ile Cys Arg Leu Met Asp Asp Met Ala Asp His

435 440 445

Glu Val Glu Gln Gln Arg Gly His Val Ala Ser Phe Val Glu Cys Tyr

450 455 460

Met Lys Glu Tyr Gly Val Ser Lys Gln Glu Thr Tyr Val Glu Met Arg

465 470 475 480

Lys Lys Ile Thr Asn Ala Trp Lys Asp Ile Asn Lys Glu Leu Leu Arg

485 490 495

Pro Thr Ala Val Pro Met Phe Ile Leu Glu Arg Ser Leu Asn Phe Ser

500 505 510

Arg Leu Ala Asp Thr Phe Leu Lys Asp Asp Asp Gly Tyr Thr Asn Pro

515 520 525

Lys Ser Lys Val Lys Asp Leu Ile Ala Ser Leu Phe Val Glu Ser Val

530 535 540

Asp

545

<210> 2

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggacttgt ccagtagcag taggcatcta gcagactttc cgagtaccat ctggggcgac 60

catttcttgt catacaactc cgagatcaca gagataacca cacaggagaa aaacgagcac 120

gaaatgttaa aagagattgt acgtaagatg cttgtcgaga ctcccgataa cagtacccaa 180

aaattagtac ttatcgacac tatccagcgt ttaggactgg cttaccactt taatgacgag 240

attgagaact ccatacaaaa catattcaac ttgtcccaga actctgagga tgacgatgag 300

cacaacctgt acgtggcagc actaaggttt cgtctagcgc gtcaacaggg atattatatg 360

tcaagtgatg ttttcaagca gtttacgaac cacgacggca aattcaaaga gaaccacaca 420

aacgatgtgc aggggcttct aagcctatat gaagcggcac atatgagagt ccacgatgaa 480

gagattcttg aggaagctct gatcttcacc actacccacc tggaatctgt gataccaaat 540

ttaagtaact ccttaaaggt tcaagtgacc gaggcgctgt cccacccgat acgtaaagcg 600

ataccgcgtg taggagcgag aaagtacatt catatttacg agaacatcgg aactcacaac 660

gatctacttt taaagtttgc gaagttggac tttaacatgt tacagaaact tcatagaaag 720

gagctaaacg agttaacgtc atggtggaag gacctagata gggcgaataa attcccgtat 780

gcgaaagaca gactggtaga ggcttatttt tggactgttg gtatttactt cgaaccgcag 840

tacagcagat ccagatctct agtcaccaaa gtcgtgaaaa tgaactcaat catcgacgac 900

acgtatgacg cctatgcaac atttgatgaa ctagtgctgt ttacagatgc tattcaacgt 960

tgggatgagg gggcgatgga tttactaccg acctacctaa gaccgatcta tcaaggtctt 1020

cttgatgttt ttaacgaaat ggaagaagta ttggcgaagg agggcaaagc agaccacatc 1080

tattacgcca agaaggaaat gaagaaagta gcggaggtgt attttaagga agcagagtgg 1140

ttaaacgcga attacatacc taaatgtgaa gaatacatga aaaatgggct tgtcagttcc 1200

acgggaccga tgtacggaat tattagcttg gttgttatgg aagagattat taccaaggaa 1260

gcttttgaat ggttgactaa tgagccgtta attctgaggg cagcctctac tatctgtagg 1320

ctaatggacg atatggcaga ccatgaggtt gagcaacaga ggggccacgt tgctagcttc 1380

gttgaatgtt acatgaaaga gtatggcgta tctaaacaag aaacctacgt cgagatgcgt 1440

aaaaaaatta cgaacgcgtg gaaagacatc aacaaagaac tattaagacc gacggcagtt 1500

cccatgttta ttttggagag gtctctgaac ttttctaggc tggccgacac attcttgaaa 1560

gacgatgacg ggtacacgaa cccgaaatca aaagtaaaag atttgatagc cagccttttc 1620

gtcgaatcag ttgactaa 1638

<210> 3

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Tyr Pro Phe Ile Arg Thr Ala Arg Met Thr Val Cys Ala Lys Lys

1 5 10 15

His Val His Leu Thr Arg Asp Ala Ala Glu Gln Leu Leu Ala Asp Ile

20 25 30

Asp Arg Arg Leu Asp Gln Leu Leu Pro Val Glu Gly Glu Arg Asp Val

35 40 45

Val Gly Ala Ala Met Arg Glu Gly Ala Leu Ala Pro Gly Lys Arg Ile

50 55 60

Arg Pro Met Leu Leu Leu Leu Thr Ala Arg Asp Leu Gly Cys Ala Val

65 70 75 80

Ser His Asp Gly Leu Leu Asp Leu Ala Cys Ala Val Glu Met Val His

85 90 95

Ala Ala Ser Leu Ile Leu Asp Asp Met Pro Cys Met Asp Asp Ala Lys

100 105 110

Leu Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ile His Ser His Tyr Gly Glu His Val

115 120 125

Ala Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Leu Ser Lys Ala Phe Gly Val Ile

130 135 140

Ala Asp Ala Asp Gly Leu Thr Pro Leu Ala Lys Asn Arg Ala Val Ser

145 150 155 160

Glu Leu Ser Asn Ala Ile Gly Met Gln Gly Leu Val Gln Gly Gln Phe

165 170 175

Lys Asp Leu Ser Glu Gly Asp Lys Pro Arg Ser Ala Glu Ala Ile Leu

180 185 190

Met Thr Asn His Phe Lys Thr Ser Thr Leu Phe Cys Ala Ser Met Gln

195 200 205

Met Ala Ser Ile Val Ala Asn Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asp Cys Leu

210 215 220

His Arg Phe Ser Leu Asp Leu Gly Gln Ala Phe Gln Leu Leu Asp Asp

225 230 235 240

Leu Thr Asp Gly Met Thr Asp Thr Gly Lys Asp Ser Asn Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Leu Leu Gly Pro Arg Ala Val Glu Glu

260 265 270

Arg Leu Arg Gln His Leu His Leu Ala Ser Glu His Leu Ser Ala Ala

275 280 285

Cys Gln His Gly His Ala Thr Gln His Phe Ile Gln Ala Trp Phe Asp

290 295 300

Lys Lys Leu Ala Ala Val Ser

305 310

<210> 4

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcatata ctgcaatggc ggctggcaca caaagtcttc aattacgtac cgtagcgtca 60

tatcaggagt gcaatagcat gcgtagttgc tttaagctaa ctccatttaa gtccttccac 120

ggcgtcaatt tcaacgttcc atctcttgga gcagcaaatt gtgaaataat gggacaccta 180

aagctgggat ctttgcccta taagcagtgt tctgttagtt ctaaatctac aaagactatg 240

gcgcagttag tcgatctggc tgaaaccgag aaggcagagg gaaaagacat cgagttcgat 300

tttaatgaat acatgaaaag taaagcggtc gctgtagatg cggcccttga caaagctatt 360

cccctggagt atcccgagaa aatacacgag tctatgcgtt actctttact tgcgggtggc 420

aaacgtgtca ggcctgcgtt gtgcatagca gcttgcgagc tggtaggtgg cagtcaggac 480

ttggcaatgc caactgcctg cgcaatggaa atgatccaca caatgagtct aatacacgac 540

gaccttccgt gtatggataa cgatgatttt cgtcgtggga agcccacgaa ccataaagtg 600

tttggcgaag atacagcagt gctagcgggt gatgcgctgt tgagctttgc attcgagcac 660

atcgccgtcg ccacctcaaa gactgtgcca tctgatagga cgcttagagt aatatctgaa 720

ttaggaaaaa ctatagggag ccaggggtta gtaggcggcc aagttgtcga tattacctct 780

gagggggacg cgaacgttga cctgaaaacg cttgagtgga tacatataca taaaactgcc 840

gtcttgctag agtgctcagt agttagcgga gggattctgg gtggagccac cgaggatgaa 900

attgctagga tcaggcgtta tgctcgttgt gtgggtttgt tgttccaggt cgttgatgac 960

atactagacg ttactaaaag ttccgaagag ctggggaaaa cggcaggaaa ggatctgctt 1020

acagacaaag caacctaccc aaagctaatg ggacttgaaa aagcgaagga atttgcggct 1080

gaactagcga ctagggcgaa ggaagagtta tctagctttg atcaaatcaa agcagcacct 1140

ttactggggc tagccgatta catcgcgttc agacaaaatt aa 1182

<210> 5

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe

1 5 10 15

Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met

20 25 30

Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr

35 40 45

Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala

50 55 60

Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe

85 90 95

Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln

100 105 110

Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp

115 120 125

Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe

130 135 140

Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val

145 150 155 160

Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro

165 170 175

Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe

180 185 190

Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala

195 200 205

Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln

210 215 220

Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp

225 230 235 240

Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly

245 250 255

Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu

260 265 270

Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly

275 280 285

Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp

290 295 300

Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys

305 310 315 320

Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys

325 330 335

Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys

340 345 350

<210> 6

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180

gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059

<210> 7

<211> 1123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgcaggtctc atctggaata taattccccc ctcctgaagc aaatttttcc tttgagccgg 60

aatttttgat attccgagtt ctttttttcc attcgcggag gttattccat tcctaaacga 120

gtggccacaa tgaaacttca attcatatcg accgactatt tttctccgaa ccaaaaaaat 180

agcagggcga gattggagct gcggaaaaaa gaggaaaaaa ttttttcgta gttttcttgt 240

gcaaattagg gtgtaaggtt tctagggctt attggttcaa gcagaagaga caacaattgt 300

aggtcctaaa ttcaaggcgg atgtaaggag tattggtttc gaaagttttt ccgaagcggc 360

atggcaggga ctacttgcgc atgcgctcgg attatcttca tttttgcttg caaaaacgta 420

gaatcatggt aaattacatg aagaattctc tttttttttt tttttttttt ttttttacct 480

ctaaagagtg ttgaccaact gaaaaaaccc ttcttcaaga gagttaaact aagactaacc 540

atcataactt ccaaggaatt aatcgatatc ttgcactcct gatttttctt caaagagaca 600

gcgcaaagga ttatgacact gttgcattga gtcaaaagtt tttccgaagt gacccagtgc 660

tctttttttt tttccgtgaa ggactgacaa atatgcgcac aagatccaat acgtaatgga 720

aattcggaaa aactaggaag aaatgctgca gggcattgcc gtgccgatct tttgtctttc 780

agatatatga gaaaaagaat attcatcaag tgctgataga agaataccac tcatatgacg 840

tgggcagaag acagcaaacg taaacatgag ctgctgcgac atttgatggc ttttatccga 900

caagccagga aactccacca ttatctaatg tagcaaaata tttcttaaca cccgaagttg 960

cgtgtccccc tcacgttttt aatcatttga attagtatat tgaaattata tataaaggca 1020

acaatgtccc cataatcaat tccatctggg gtctcatgtt ctttccccac cttaaaatct 1080

ataaagatat cataatcgtc aactagttga tatacgtaaa atc 1123

<210> 8

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcattatcaa tactcgccat ttcaaagaat acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct 60

aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa 120

tagggggcgg gttacacaga atatataaca tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc 180

tggcatccac taaatataat ggagcccgct ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa 240

tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc aaccatcagt tcataggtcc attctcttag 300

cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg 360

atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac aaggcaattg acccacgcat gtatctatct 420

cattttctta caccttctat taccttctgc tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa 480

aggttgaaac cagttccctg aaattattcc cctacttgac taataagtat ataaagacgg 540

taggtattga ttgtaattct gtaaatctat ttcttaaact tcttaaattc tacttttata 600

gttagtcttt tttttagttt taaaacacca gaacttagtt tcga 644

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Lys Lys Pro Ala Thr Thr

1 5 10 15

Arg Leu Cys Ser Arg Arg Tyr Leu Leu

20 25

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgttgtccc tgaggcaatc cataagattc aaaaaaccgg cgacaacacg tttatgttct 60

agaagatatc tgttg 75

<210> 11

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60

aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120

cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180

catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240

atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300

gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360

gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420

caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480

gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540

tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600

aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660

accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720

gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780

ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840

ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900

gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960

gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020

tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080

ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140

taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200

aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260

ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320

ttacacagag cgtga 1335

Claims

1.一种生产西柏三烯一醇的酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母为，在酿酒酵母BY4741基因组上的HO基因位点整合表达了氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的西柏三烯醇合酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的香叶基焦磷酸合酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示法尼基焦磷酸合成酶，并且在酿酒酵母BY4741基因组上的erg9基因位点整合表达了采用SEQ ID NO.7所示的启动子Phxt1过表达的SEQ ID NO.11所示的erg9基因；

同时，将SEQ ID NO.10所示的信号肽分别与SEQ ID NO.4所示的GGPP合酶基因、SEQ IDNO.2所示的西柏三烯醇合酶基因串联后，以质粒pY26TEF-GPD为质粒骨架，在线粒体中进行表达。

2.一种生产西柏三烯一醇的方法，其特征在于，将权利要求1所述的酿酒酵母接种至培养基中，于25-35℃培养1-5d。

3.权利要求1所述酿酒酵母或权利要求2所述的方法在农业、烟草领域生产含西柏三烯一醇的产品方面的应用。