CN112695003A

CN112695003A - 一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112695003A
Application number: CN201911012486.XA
Authority: CN
Inventors: 李依婷; 张汝兵; 程涛; 咸漠; 杨爱国; 王元英
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: CN112695003B

Abstract

一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程学领域。为了实现高产、高效率、低成本合成西柏三烯一醇，本发明将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烟草西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a与表达载体连接，然后转化到含用MVA途径及GGPP高能量合成途径的工程菌中，得到生产西柏三烯一醇的基因工程菌。本发明的基因工程菌经过发酵培养46小时，西柏三烯一醇的产量可高达500mg/L。本发明的基因工程菌可以直接从菌体中获得高产量、高纯度的西柏三烯一醇，具有良好的工业应用前景。

Description

一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程学领域，具体涉及一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

西柏三烯一醇是由烟草叶面腺毛分泌的西柏烷类化合物。在烟叶烘烤调制和陈化过程中，西柏类化合物降解产生茄酮及衍生物等香味成分，是影响烟叶品质的重要成分。此外西柏三烯一醇对抵抗昆虫的侵袭具有良好的抗性，而且具备易于生物降解等特性，近年来作为生态友好且可快速生物降解的杀虫剂代表越来越受到人们的关注。同时，西柏三烯一醇也可以作为一些抗肿瘤、抗生素以及神经保护药物的前体物质。由于植物中含量较低，且存在较多官能化衍生物，大规模纯化生产西柏三烯一醇的技术难度较大，且成本高、效率低、对环境有较大污染。利用微生物合成法生产西柏三烯一醇，具有成本低、产量高、工艺简单、易于放大等优点，并且不受季节、气候条件的限制。模式微生物大肠杆菌，具有生长速度快，遗传背景清楚，易于分子操作等特点，是理想的宿主。

在烟草中，萜类代谢前体物IPP与DMAPP是由甲羟戊酸(MVA)代谢途径和丙酮酸/3-磷酸甘油醛代谢(MEP)合成。IPP与DMAPP在牻牛儿基焦磷酸缩合成GPP，然后再与2个IPP在牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的作用下缩合成牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。GGPP在西柏三烯一醇合成酶CBTS的作用下环化形成西柏三烯一醇。在大肠杆菌内，IPP与DMAPP是通过MEP代谢途径合成，在法尼烯焦磷酸合成酶(FPPS)的作用下，DMAPP与2个IPP缩合形成C15骨架FPP，本身并不能合成GGPP，需要引入外源牻牛儿基焦磷酸合成酶(CrtE)催化形成GGPP。同时，大肠杆菌本身MEP途径通量较低，近年来，大部分文献报道，通过需要引入异源MVA途径加强IPP与DMAPP的供应，极大的提高了萜类化合物的产量。Wolfgang Mischko等通过引入CBTs，同时过表达MEP途径中DXS与IDI两个酶，构建了一株可以生产西柏三烯一醇的菌株，最终在50L的发酵罐中发酵120h，产量达到78.9mg/L(Wolfgang Mischko,et al.Modularbiomanufacturing for a sustainable production of terpenoid-based insectdeterrents.Green Chemistry.2018,20,5374)。但是该工程菌仍然存在发酵周期长，产物产量低等问题。

发明内容

为了实现高产、高效率、低成本合成西柏三烯一醇，本发明提供了一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌，所述基因工程菌表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI、法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE和西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，所述西柏三烯一醇合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地限定，所述西柏三烯一醇合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地限定，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录号为No.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS,GenBank登录号为No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank登录号为No.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank登录号为NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank登录号为NO.X97557.1；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI，GenBank登录号为NO NM_001183931.1；所述法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，GenBank登录号为NO.NM_001181600.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE，GenBank登录号为No.M87280.1。

本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)克隆烟草西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)表达载体的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE连接到中间载体I上，得到重组质粒I；将西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a克隆到中间载体II载体上得到重组质粒II；

(3)重组菌转化：将pYJM14质粒、步骤(2)所得重组质粒I与重组质粒II转化E.coli感受态细胞，得到用于生产西柏三烯一醇的工程菌。

进一步地限定，步骤(2)所述中间载体I为pACYC-Duet-1；所述中间载体II为pET28a+载体。

进一步地限定，步骤(3)所述pYJM14质粒携带有来源于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank No.NM_001182715.1，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBankNO.X97557.1和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI，GenBank NO.NM_001183931.1。

本发明还提供了上述基因工程菌在生产西柏三烯一醇中的应用。

进一步地限定，所述应用是指将获得的基因工程菌株经发酵培养基培养后，加入IPTG诱导，继续培养后所得培养液依次经萃取、蒸馏得到西柏三烯一醇。

进一步地限定，所述发酵培养条件为37℃，180rpm，培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入IPTG，然后在30℃，180rpm培养24-48小时。

进一步地限定，所述萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯，所述蒸馏为减压蒸馏。

有益效果

本发明利用在植物代谢途径中，西柏三烯一醇的合成需要西柏三烯一醇合成酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的催化作用，在大肠杆菌内构建了完整的西柏三烯一醇的合成代谢途径，实现了以葡萄糖为原料生物合成西柏三烯一醇。对本发明的生产西柏三烯一醇的基因工程菌发酵培养46小时，西柏三烯一醇的产量可高达500mg/L，是摇瓶产量的15倍。本发明的基因工程菌可以直接从菌体中获得高产量、高纯度的西柏三烯一醇，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1是目的基因CBTS2a的PCR电泳图，其中DNA marker为DNA marker Tran2K plusII，CBTS2a为目的基因；

图2西柏三烯一醇标准品GC图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为峰高；

图3工程大肠杆菌合成的西柏三烯一醇样品GC图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为峰高；

图4西柏三烯一醇标准品分子碎片质谱图图，横坐标为离子碎片分子量，纵坐标为离子碎片强度；

图5工程大肠杆菌合成的西柏三烯一醇分子碎片质谱图，横坐标为离子碎片分子量，纵坐标为离子碎片强度；

图6西柏三烯一醇高密度发酵菌体生长趋势及西柏三烯一醇合成趋势，横坐标为菌体发酵时间(h)，纵坐标分别为OD₆₀₀值、西柏三烯一醇的产量(mg/L)。

具体实施方式

通过如下施实例对本发明进行进一步的详细描述，但不以任何方式限制本发明。

以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

西柏三烯一醇的提取与检测方法：取发酵液2mL，加入等体积的乙酸乙酯，涡旋振荡器上混匀5min，然后13000×g离心20min，取上层有机相进行过滤后放置在液相小瓶中待测。检测条件：GC-MS仪器型号：岛津TQ8050；离子源：EI；检测器：四级杆；样品检测：取液相小瓶中液体进行检测。GC仪器型号：岛津GC 2010Pro；分离柱型号：Rtx-5MS；进样量：1μl；检测器：氢火焰检测器(FID)；柱温：50℃保温2。5min，然后以10℃/min的速度升温至320℃，保持5min。

一级种子培养基即LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，发酵液中氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素的终浓度分别为100μg/mL、34μg/mL和50μg/mL，pH7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。抗生素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌。

二级种子培养基为M9液体培养基(或称M9种子培养基)，包括：20g/L葡萄糖，15.2g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，0.5g/L NaCl，0.4g/L MgSO₄，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL，pH 7.0。其中：Na₂HPO₄·12H₂O，KH₂PO₄，NH₄Cl，NaCl混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/L，115℃，30min单独灭菌；MgSO₄·7H₂O储液为200g/L，121℃，20min单独灭菌；抗生素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O和抗生素。

发酵培养基：0.5g/L酵母粉，9.8g/L K₂HPO₄·3H₂O，2.1g/L citric acid·H₂O，0.3g/L柠檬酸铁铵，20g/L葡萄糖，0.4g/L MgSO₄·7H₂O；1ml/L的1000×微量元素((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 3.7g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.9g/L，H₃BO₃ 24.7g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，MnCl₂·4H₂O 15.8g/L)，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL，pH7.0。其中：K₂HPO₄·3H₂O 9.8g/L，Citric acid·H₂O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。1000×微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素储液及抗生素。

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1.高产西柏三烯一醇的基因工程菌的构建。

本实施例所述的生产西柏三烯一醇的基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌，过表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI、法尼基焦磷酸合成酶Erg20、牻牛儿基焦磷酸合成酶CrtE和西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录号为No.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录号为No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank登录号为No.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank登录号为NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank登录号为NO.X97557.1；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI，GenBank登录号为NO.NM_001183931.1；所述法尼基焦磷酸合成酶Erg20，GenBank登录号为NO.NM_001181600.1、所述牻牛儿基焦磷酸合成酶CrtE,GenBank登录号为No.M87280.1；所述西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a来源于普通烟草品种红花大金元，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体构建方法如下所述：

1)克隆烟草西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a。

提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5’-ATGAATCGAGCAATGGATCTTTCTTC-3’，反向引物为：5’-TATGTCGACAGATTCGACAAACAAC-3’，利用Takara公司PrimeSTAR Max DNA聚合酶进行PCR扩增；PCR条件为：98℃2min；98℃10s，56℃15s，72℃30s，32个循环；72℃延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图1的Maker为DNA marker Tran2K plus II，目的基因CBTs片段大小约为1600bp，符合预期的大小。

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，将目的片段西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a进行TA克隆，连接到载体

克隆载体中，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，转化条件为：在100μL感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀后冰浴30min；迅速放入42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2-3min；加入900μL LB培养基，37℃摇床培养1h；将菌液4000rpm离心1min，弃800μL上清，悬浮菌体，涂布于含有氨苄抗生素(Amp，100mg/L)的LB平板上，37℃倒置暗培养12～16h。采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，挑选阳性单克隆菌落，提取质粒后送交测序。经测序分析，克隆得到烟草的西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1653个碱基，编码的蛋白命名为西柏三烯一醇合成酶，共551个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并由此得到将西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a插入到

克隆载体的重组质粒，命名为pEASY-CBTS2a。

2)表达载体的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，法尼基焦磷酸合成酶基因ispA，牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE连接到中间载体I上，得到重组质粒I；将西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a克隆到中间载体II载体上得到重组质粒II；具体方法如下：

a.重组质粒I-表达载体pESEC的构建。

①扩增Erg20与CrtE基因：

以酿酒酵母基因组为模版，采用正向引物Erg20_F_BglII(5’-GGAAGATCTCATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAGAGAGAG-3’)和反向引物Erg20_R(5’-GCTCTCGCCAGGTTCTGAAGCAGTTCTATTTGCTTCTCTT-3’)PCR扩增基因Erg20；采用正向引物CrtE-F(5’-AACTGCTTCAGAACCTGGCG-3’)和反向引物CrtE-R_XhoI(5’-CCCTCGAGTCAGGCGATTTTCATGACCG-3’)PCR扩增基因CrtE。

PCR扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸30s，以上变性、退火、延伸三步重复进行32个循环后，72℃再延伸5min。利用胶回收试剂盒(购自Omega)回收目的基因片段。

将片段Erg20与CrtE利用Overlap PCR扩增将两片段连接，PCR扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸30s；32个循环，利用胶回收试剂盒回收目的基因片段Erg20-CrtE。

②构建pACY-ES质粒：

pACY-ES质粒即pACYC-mvaE-mvaS质粒，为携带有来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，GenBankNo.AAG02438)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS，GenBank No.AAG02439)的pACYCDuet-1质粒，具体构建方法如下：

来自于粪肠球菌的基因mvaE与基因mvaS由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得，之后分别与载体pGH连接获得pGH/mvaE，pGH/mvaS。以pGH/mvaE，pGH/mva S质粒载体为模板，以mvaE_F(:5‘-CATGCCATGGAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTA-3’)/mvaE_R(5’-CGCGGATCCTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGCGCGGA-3’)、mvaS_F(5’-CCAGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAAATTA-3’)/mvaS_R(5’-CAACTGCAGTTAGTTTCGATAAGAGCGAACG-3’)分别为引物分别扩增基因mvaE及mvaS片段，并在两端添加NcoI/BamHI或SacI/PstI酶切位点。PCR片段琼脂凝胶电泳回收后，mvaE片段与载体pACYDuet-1使用内切酶NcoI/BamH在37℃下酶切1h，酶切产物经凝胶回收后采用Fermentas公司的T₄ DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜后取适量体积连接液转化大肠杆菌感受态细胞，活化后，取100μL涂布LB平板(Cm抗性)，37℃培养过夜。挑取30个转化子37℃，180rpm振荡培养8h，各取2μL菌液为模板进行菌落PCR扩增鉴定，筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒酶切验证，正确的质粒便是pACY-mvaE。

基因mvaS片段与载体pACY-mvaE使用内切酶SacI/PstI在37℃下酶切1h，酶切产物经凝胶回收后采用T₄ DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜后取适量体积连接液转化大肠杆菌感受态细胞，活化后，取100μL涂布LB平板(Cm抗性)，37℃培养过夜。挑取30个转化子37℃,180rpm振荡培养8h，各取2μL菌液为模板进行菌落PCR扩增鉴定，筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒酶切验证，正确的质粒便是pACY-mvaE-mvaS(简称pACY-ES)。

具体构建方法还可参见文献Yang J,et al.Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E.coli.PLoS One,2012,7(4):e33509。

③将基因片段Erg20-CrtE与载体pACY-ES用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段Erg20-CrtE按摩尔比1:1的比例使用Takara公司的DNA Ligation Kit Ver.2.1进行连接，16℃连接30min，重组产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34mg/L氯霉素(Cm)的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pESEC(pACYC-mvaE-mvaS-Erg20-CrtE)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

b.表达载体pET-CBTS2a的构建

以步骤1)得到的质粒pEASY-CBTS2a为模板，采用正向引物CBTS2a_F_BglII(5’-CGGGATCCATGAATCGAGCAATGGATCTTTCTTC-3’)和反向引物CBTS2a_R_SacI(5’-CGAGCTCTATGTCGACAGATTCGACAAACAAC-3’)进行PCR扩增基因，PCR扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸30s；32个循环，利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。将基因CBTS2a片段与载体pET-28a(+)用BglII和SaI进行双酶切，载体与外源片段CBTS2a按摩尔比1:1的比例使用Takara公司的DNA Ligation Kit Ver.2.1进行连接，16℃连接30min，重组产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50mg/L卡那霉素(Kan)的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-CBTS2a后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

pYJM14(又称pTrc-low)，是携带有来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBank No.NM_001182715.1)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBankNO.X97557.1)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI，GenBank NO.NM_001183931.1)的pTrcHis2B质粒，该质粒记载在Yang J,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli forthe biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60(具体构建方法还可参见已公开的专利申请CN104120148A)，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。

c.E.coli重组菌株的构建

将pESEC、pET-CBTs和pYJM14共同热激转化E.coli MG1655(DE3)感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素素和氯霉素抗生素的LB固体平板，获得含有pESEC、pET-CBTs和pYJM14的基因工程大肠杆菌CBT1。

实施例2.摇瓶发酵生产西柏三烯一醇。

(1)挑取实施例1中步骤(3)获得的单克隆接种于3ml LB培养基中培养，待种子长至OD₆₀₀为1左右，按1％比例接种于100ml M9种子培养基中，37℃180rpm培养至OD600为0.4-0.6左右，加入终浓度为0.5mM IPTG的诱导剂诱导。30℃180rpm培养48小时。

(2)西柏三烯一醇分离

摇瓶发酵结束后，取50ml发酵液，超声波破碎(功率70％，工作时间3s,停3s，6min)，将发酵液破壁后，加入等体积的乙酸乙酯萃取发酵液中的西柏三烯一醇。

(3)西柏三烯一醇检测

结果如下附图2-附图5所示，样品在21.5min出现高峰，与标准品出峰时间一致，通过样品与标准品的MS碎片峰进行对比，其出现的各碎片峰的比例一致，说明我们成功的生物合成了西柏三烯一醇。

实施例3.高密度发酵生产西柏三烯一醇。

(1)E.coli重组菌株的构建

按照实施例1重组质粒的构建方法，得到生产西柏三烯一醇的大肠杆菌工程菌。

(2)发酵生产西柏三烯一醇

将构建的用于生产的西柏三烯一醇工程菌接种于一级种子培养基中，培养为一级种子液，一级种子液接种于二级种子培养基中，培养为二级种子液，二级种子液接种于发酵培养基中，发酵培养。具体方法如下：

将步骤(1)获得的产西柏三烯一醇的单菌落接种于含100ml LB培养基的500ml三角瓶中，并加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素、34μg/mL氯霉素和50μg/mL的卡那霉素，37℃220rpm摇床培养至OD₆₀₀长至1左右(培养时间为8-12h)，得到一级种子液；将得到的一级种子液按5％(质量分数)的接种量接种至含有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，通气量1-2vvm，溶氧控制在20-40％左右，转速400-1000rpm，37℃培养至OD₆₀₀约为20时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，30℃诱导表达，继续发酵48h用氨水调pH，控制pH在7.0。得到的西柏三烯一醇产物通过GC-MS对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中残余葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓度为600g/L的糖液，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5g/L以下。

(3)西柏三烯一醇检测

发酵结果如附图6所示，发酵周期为70小时，当发酵至46小时，菌体浓度OD₆₀₀最高可以达到120，此时西柏三烯一醇的产量可达到500mg/L。本发明菌株较Wolfgang Mischko,et al等2018年公布的基因工程菌具有较大的提升，其菌株在发酵120h后西柏三烯一醇的产量仅达到78.9mg/L，而本发明基因工程菌在发酵46h后西柏三烯一醇产量可以达到500mg/L。本发明基因工程菌株在西柏三烯一醇合成能力及发酵周期上均有较大的改善。

以上所述仅为本发明的实施例，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

核苷酸和氨基酸序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所,中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> 西柏三烯一醇合成酶基因

<400> 1

atgaatcgag caatggatct ttcttcaagc tctcgtcatt tggcagattt tccctcaaca 60

atttggggtg accattttct ctcctacaat tctgaaataa cagaaattac tacccaagag 120

aaaaatgaac atgaattgct aaaagaaata gttcgaaaaa tgttggtaga aactctagat 180

aatagtacac aaaaactagt cttgattgac acaattcaaa gattgggatt agcatatcat 240

ttcaattatg agattgaaaa ctccattcaa aacatctttt atttgtctca aaatagtgaa 300

gataacgatg aacacaacct ttatgtggct gctcttcgtt ttcgacttgc gaggcaacaa 360

ggaaattaca tgtcttcaga tgtgttcaag caattcacta accatgacgg aaaattcaag 420

gaaaatcata ctaatgatgt tcaaggatta ctgagtttgt atgaagcagc acatatgaga 480

gtgcacgacg aggaaattct agaagaagct cttatattta ccacgactca tctcgagtcc 540

gtgatcccga atttgagcaa ctcgcttaag gtacaagtta ctgaagcctt aagccatcct 600

attcgcaaaa ctataccaag ggtgggagca aggaaataca tatacatata tgaaaacatt 660

ggaacacata atgatttgct tttgaaattt gcaaagttgg acttcaacat gttacaaaag 720

cttcatctaa aagagcttaa cgagctaaca agctggtgga aagatttgga ttgtgcaaac 780

aaatttccat atgcgaagga cagattagta gaagcttact tttggacggt gggaatatat 840

tttgaacctc aatatagtcg ttcaagaagt atgataacaa aagtagtcaa aatgaactcc 900

attattgatg acacttatga tgcttatgca acttttgatg agcttgtgct tttcacggat 960

gcgatccaaa gatgggacga aggtgccatg gattcattac cgacatatct gagatctatt 1020

tatcaaggtc ttctcgacgt tttcaatgaa atggaagaag tattggctaa agaaggtaaa 1080

gcagatcgaa tctactatgc aaaaaaagag atgaaaaagt tggtggcagc ctattttaag 1140

gaagctcaat ggttgaatgc taactacatt ccaaaatgtg aggagtatat gaaaaatgga 1200

gttgtaacct ctaccggtac gatgtatgga ataatttctt tggttgttat ggaggaaatt 1260

ataacaaaag aggcttttga atggttggca aatgaacctt tgattcttcg agctgcatca 1320

acaatctgta gattaatgga tgatatggct gatcatgaag ttgaacaaca aagagaacac 1380

gttgcttcat ttgttgagtg ctacatggaa gaatatggag tttcaaagca agaagcatat 1440

gttgagatgc ggaaaaaaat cacaaatgcg tgtaaagata taaataagga actcctgcgc 1500

cctactgcag taccaatgtt tatcctcgaa cgaactttaa attttatcag attggtcggc 1560

acatttttga aggatgatga tggatacaca aatcccaaat cccaagttaa agacttgatt 1620

gctttgttgt ttgtcgaatc tgtcgacata tga 1653

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 西柏三烯一醇合成酶氨基酸

<400> 2

Met Asn Arg Ala Met Asp Leu Ser Ser Ser Ser Arg His Leu Ala Asp

1 5 10 15

Phe Pro Ser Thr Ile Trp Gly Asp His Phe Leu Ser Tyr Asn Ser Glu

20 25 30

Ile Thr Glu Ile Thr Thr Gln Glu Lys Asn Glu His Glu Leu Leu Lys

35 40 45

Glu Ile Val Arg Lys Met Leu Val Glu Thr Leu Asp Asn Ser Thr Gln

50 55 60

Lys Leu Val Leu Ile Asp Thr Ile Gln Arg Leu Gly Leu Ala Tyr His

65 70 75 80

Phe Asn Tyr Glu Ile Glu Asn Ser Ile Gln Asn Ile Phe Tyr Leu Ser

85 90 95

Gln Asn Ser Glu Asp Asn Asp Glu His Asn Leu Tyr Val Ala Ala Leu

100 105 110

Arg Phe Arg Leu Ala Arg Gln Gln Gly Asn Tyr Met Ser Ser Asp Val

115 120 125

Phe Lys Gln Phe Thr Asn His Asp Gly Lys Phe Lys Glu Asn His Thr

130 135 140

Asn Asp Val Gln Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ala His Met Arg

145 150 155 160

Val His Asp Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ala Leu Ile Phe Thr Thr Thr

165 170 175

His Leu Glu Ser Val Ile Pro Asn Leu Ser Asn Ser Leu Lys Val Gln

180 185 190

Val Thr Glu Ala Leu Ser His Pro Ile Arg Lys Thr Ile Pro Arg Val

195 200 205

Gly Ala Arg Lys Tyr Ile Tyr Ile Tyr Glu Asn Ile Gly Thr His Asn

210 215 220

Asp Leu Leu Leu Lys Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met Leu Gln Lys

225 230 235 240

Leu His Leu Lys Glu Leu Asn Glu Leu Thr Ser Trp Trp Lys Asp Leu

245 250 255

Asp Cys Ala Asn Lys Phe Pro Tyr Ala Lys Asp Arg Leu Val Glu Ala

260 265 270

Tyr Phe Trp Thr Val Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Arg Ser

275 280 285

Arg Ser Met Ile Thr Lys Val Val Lys Met Asn Ser Ile Ile Asp Asp

290 295 300

Thr Tyr Asp Ala Tyr Ala Thr Phe Asp Glu Leu Val Leu Phe Thr Asp

305 310 315 320

Ala Ile Gln Arg Trp Asp Glu Gly Ala Met Asp Ser Leu Pro Thr Tyr

325 330 335

Leu Arg Ser Ile Tyr Gln Gly Leu Leu Asp Val Phe Asn Glu Met Glu

340 345 350

Glu Val Leu Ala Lys Glu Gly Lys Ala Asp Arg Ile Tyr Tyr Ala Lys

355 360 365

Lys Glu Met Lys Lys Leu Val Ala Ala Tyr Phe Lys Glu Ala Gln Trp

370 375 380

Leu Asn Ala Asn Tyr Ile Pro Lys Cys Glu Glu Tyr Met Lys Asn Gly

385 390 395 400

Val Val Thr Ser Thr Gly Thr Met Tyr Gly Ile Ile Ser Leu Val Val

405 410 415

Met Glu Glu Ile Ile Thr Lys Glu Ala Phe Glu Trp Leu Ala Asn Glu

420 425 430

Pro Leu Ile Leu Arg Ala Ala Ser Thr Ile Cys Arg Leu Met Asp Asp

435 440 445

Met Ala Asp His Glu Val Glu Gln Gln Arg Glu His Val Ala Ser Phe

450 455 460

Val Glu Cys Tyr Met Glu Glu Tyr Gly Val Ser Lys Gln Glu Ala Tyr

465 470 475 480

Val Glu Met Arg Lys Lys Ile Thr Asn Ala Cys Lys Asp Ile Asn Lys

485 490 495

Glu Leu Leu Arg Pro Thr Ala Val Pro Met Phe Ile Leu Glu Arg Thr

500 505 510

Leu Asn Phe Ile Arg Leu Val Gly Thr Phe Leu Lys Asp Asp Asp Gly

515 520 525

Tyr Thr Asn Pro Lys Ser Gln Val Lys Asp Leu Ile Ala Leu Leu Phe

530 535 540

Val Glu Ser Val Asp Ile

545 550

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 3

atgaatcgag caatggatct ttcttc 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

tatgtcgaca gattcgacaa acaac 25

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 正向引物Erg20_F_BglII

<400> 5

ggaagatctc atggcttcag aaaaagaaat taggagagag ag 42

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 反向引物Erg20_R

<400> 6

gctctcgcca ggttctgaag cagttctatt tgcttctctt 40

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向引物CrtE-F

<400> 7

aactgcttca gaacctggcg 20

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 反向引物CrtE-R_XhoI

<400> 8

ccctcgagtc aggcgatttt catgaccg 28

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> mvaE_F

<400> 9

catgccatgg aggaggtaaa aaaacatgaa aacagta 37

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> mvaE_R

<400> 10

cgcggatcct tattgttttc ttaaatcatt taaaatagcg cgga 44

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> mvaS_F

<400> 11

ccagagctca ggaggtaaaa aaacatgaca attgggattg ataaaatta 49

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> mvaS_R

<400> 12

caactgcagt tagtttcgat aagagcgaac g 31

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 正向引物CBTS2a_F_BglII

<400> 13

cgggatccat gaatcgagca atggatcttt cttc 34

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 反向引物CBTS2a_R_SacI

<400> 14

cgagctctat gtcgacagat tcgacaaaca ac 32

Claims

1.一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE和西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，宿主菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述西柏三烯一醇合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述西柏三烯一醇合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录号为No.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录号为No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank登录号为No.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank登录号为NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank登录号为NO.X97557.1；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI，GenBank登录号为NO.NM_001183931.1；所述法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，GenBank登录号为NO.NM_001181600.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE,GenBank登录号为No.M87280.1。

4.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)表达载体的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE连接到中间载体I上，得到重组质粒I；将西柏三烯一醇合成醇基因CBTS2a，克隆到中间载体II载体上得到重组质粒II；

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述中间载体I为pACYC-Duet-1；所述中间载体II为pET28a(+)载体。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述pYJM14质粒携带有来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank No.NM_001182715.1，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank NO.X97557.1和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GenBankNO.NM_001183931.1。

7.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌在生产西柏三烯一醇中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是指将获得的基因工程菌株经发酵培养基培养后，加入IPTG诱导，继续培养后所得培养液依次经萃取、蒸馏得到西柏三烯一醇。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养条件为37℃，180rpm，培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入IPTG，然后在30℃，180rpm培养24-48小时。

10.根据权利要求8所述的应用，所述萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯；所述蒸馏为减压蒸馏。