CN101861384A

CN101861384A - 使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法

Info

Publication number: CN101861384A
Application number: CN200880020092A
Authority: CN
Inventors: 赵南仑; 朴民守; 李东炫; 郑皓丞; 金钟根
Original assignee: SK Corp; Amicogen Inc
Current assignee: SK Corp; Amicogen Inc; SK Energy Co Ltd
Priority date: 2007-05-04
Filing date: 2008-05-06
Publication date: 2010-10-13
Also published as: US20120295322A1; WO2008136632A1; KR101441613B1; KR20080098246A; US20100227370A1; US8232083B2; US8828697B2

Abstract

一种利用重组细菌菌株高生产率生产番茄红素的方法，包括制备含有番茄红素生物合成所需蛋白的编码基因的重组载体。参与番茄红素生物合成的基因是crtE、crtB和crtI，所述三个基因(crtE、crtB和crtI)中的至少一个选自序列表中的核苷酸序列1的crtE，核苷酸序列3的crtB，和核苷酸序列5的crtI。将所述重组载体转化到大肠杆菌中。对大肠杆菌转化体进行培养，从培养基中回收番茄红素。

Description

使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法

技术领域

本发明涉及利用细菌菌株生产高浓度番茄红素的方法，该菌株用含有参与番茄红素生物合成的蛋白的编码基因的载体进行转化。更详细来说，本发明涉及通过在特定条件下培养和发酵转化的大肠杆菌，生产率增加的番茄红素生产方法，该转化的大肠杆菌具有导入的载体，载体含有番茄红素生物合成所需的基因，其中载体通过合并下列新基因中的至少一个来制备：序列表中核苷酸序列1的crtE，核苷酸序列3的crtB，和核苷酸序列5的crtI。

背景技术

番茄红素具有化学结构1中显示的结构，可以1kg西红柿0.02g的产量获得。番茄红素造成了番茄、西瓜、葡萄等的红色，是极性非常低的脂溶性物质，并具有强抗氧化和抗癌效应。

[化学结构1]

下面是关于本技术领域现有研究的概述。在2000年，由底特律Carmanos癌症研究会(Carmanos Cancer institute)的Omer的团队报道了番茄红素抑制前列腺癌的转移(Omer Kucuk等，Cancer Epidemiology，10，861-869，2001)。番茄红素的专业制造商LycoRed和特拉维夫(TelAviv)Hasharon医院(Hasharon hospital)的过敏实验室证实，番茄红素在患有运动引发的哮喘的患者中具有缓解症状的效应(L Neuman等，Allergy，55，1184-1189)。根据芬兰Cuopio大学公共卫生研究所(Research Institute of Public Health of the University of Cuopio)进行的临床试验，番茄红素也显示出对于心肌病和动脉粥样硬化具有出色的防护效应(Tiina Rissanen等，Exp Biol Med(Maywood).，227，900-907，2002)。

由于类胡萝卜素的优越效应如以前所述得到了证明，因此对番茄红素的需求日益增长。番茄红素已经通过从天然来源直接提取或通过有机合成来生产，但是最近有研究积极地利用微生物对其进行生产。具体来说，有两种类型的方法涉及培养和发酵微生物来生产番茄红素：(1)包括将番茄红素生物合成所需的基因导入不产生番茄红素的细菌菌株的方法，(2)包括将产生番茄红素作为生物合成类胡萝卜素例如胡萝卜素或虾青素的中间代谢产物的细菌菌株的番茄红素环化酶失活的方法。

番茄红素生物合成的过程显示在图1中。

通过代谢途径例如2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(在后文中称为MEP途径)或甲羟戊酸途径(在后文中称为MVA途径)，葡萄糖或甘油被转化成异戊烯基焦磷酸(在后文中称为IPP)或二甲基烯丙基焦磷酸(在后文中称为DMAPP)。本发明采用了MVA途径来生物合成IPP。通过MVA途径，源自于葡萄糖或甘油的甘油醛-3-磷酸被转化成乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，它然后经历一系列转化，成为乙酰乙酰辅酶A、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(在后文中称为HMG-CoA)、甲羟戊酸、甲羟戊酸-5-磷酸、甲羟戊酸-5-二磷酸，并最终成为IPP。编码该过程所需的酶的基因是atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2和mvaD。这样合成的IPP经历了一系列转化，变成法呢基焦磷酸(在后文中称为FPP)，它是类异戊二烯途径的重要中间代谢产物。然后FPP被转化成香叶基香叶基焦磷酸(在后文中称为GGPP)，它然后转化成八氢番茄红素，然后最终转化成番茄红素。编码参与该过程的酶的基因是crtE、crtB和crtI。

如上所述，作为类胡萝卜素共同前体的IPP的生物合成途径，已经知道有甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径，并且已知甲羟戊酸途径存在于大多数真核生物(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、植物细胞的细胞质、一些细菌(例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和Paracoccus zeaxanthinifaciens)以及疟疾细胞中。非甲羟戊酸途径存在于大多数细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、以及植物细胞的质体中。因此，革兰氏阴性细菌大肠杆菌只通过非甲羟戊酸途径生物合成IPP。但是，野生型大肠杆菌不具有类胡萝卜素例如番茄红素的生物合成所需的基因，因此不能生产番茄红素。

关于从不产生番茄红素的菌株生产番茄红素，许多研究关注于发现参与番茄红素生物合成的新基因或重组目前已知的基因，焦点在于使用这些基因在大肠杆菌或酿酒酵母中生物合成番茄红素。RocheVitamins，Inc.通过导入来自于黄杆菌(Flavobacterium sp.)R1534的crtB、crtI和crtE基因，制备番茄红素含量是0.5mg/gDCW的大肠杆菌菌株(Luis Pasamontes和Yuri Tsygankov，US20040058410，2004)。AmocoCorporation通过使用来自于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的crtI基因，制备了番茄红素含量为0.1mg/gDCW的酿酒酵母菌株(Ausich，Rodney L.等，US5,530,189，1996)。Kirin Beer Kabushiki Kaisha通过使用来自噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的crtE、crtI和crtB基因，建立了番茄红素含量为2.0mg/gDCW的大肠杆菌菌株(Narihiko Misawa等，US 5,429,939，1995)。还有成功制备和培养了产朊假丝酵母(Candida utilis)转化菌株IFO 0988，番茄红素含量为2.9mg/gDCW；它具有来自噬夏孢欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因，以及编码产朊假丝酵母的HMG-CoA还原酶的基因(Narihiko Misawa等，J.ofBiotechnology，59，169-181，1998)。最近，通过用从橙黄土壤杆菌(Agrobacteriumaurantiacum)、草生欧文氏菌和噬夏孢欧文氏菌的细菌菌株克隆的类胡萝卜素基因crtE(编码GGPP合酶)、crtB(编码八氢番茄红素合酶)和crtI(编码八氢番茄红素去饱和酶)进行转化，获得了重组大肠杆菌菌株，已报道其具有生物合成番茄红素的能力(美国专利6706516；Misawa和Shimada，J.Biotechnol.，59：169-181，1998)。

但是，这些研究的产量非常低，阻碍了开发用于生产番茄红素的经济的工艺。为了解决这个问题，本发明使用了新的基因以及基因组合，提供了使用转化微生物，以改善的生产率生产番茄红素的方法，其中将大肠杆菌用atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2和mvaD转化，它们是参与甲羟戊酸途径的酶的编码基因。

因此，本发明是改进番茄红素生产率的努力的结果：为此，从海水宏基因组分离并克隆了一些参与番茄红素生物合成的基因crtE、crtB和crtI，并测定了它们的核苷酸序列；然后将这些基因导入载体，以便在不产生番茄红素的微生物中生产番茄红素，同时通过将新的基因与当前已知基因进行组合，改善了番茄红素的生产率。此外，通过将参与甲羟戊酸途径的基因导入大肠杆菌，由此使大肠杆菌能够利用甲羟戊酸途径，进一步增加了番茄红素的生产率。此外还开发并提供了发酵方法，用于在特定条件下在重组微生物中生产高浓度番茄红素；已经证实菌株与现有研究相比生产率更高，于是本发明得以完成。

发明内容

技术难题

相应地，本发明涉及从重组细菌菌株有效生产番茄红素的方法，该菌株使用含有编码番茄红素生物合成所需蛋白的新基因的重组载体来构建。

按照本发明的一个方面，生产番茄红素的方法包括下列步骤：制备含有番茄红素生物合成所需蛋白的编码基因的重组载体，其中参与番茄红素生物合成的基因是crtE、crtB和crtI，三个基因(crtE、crtB和crtI)中的至少一个选自序列列表中核苷酸序列1的crtE、核苷酸序列3的crtB、和核苷酸序列5的crtI；将重组载体转化到大肠杆菌中；以及培养大肠杆菌转化体并从培养基中回收番茄红素。

下面，将对本发明进行更详细的描述。

本发明包括从海水宏基因组克隆crtE、crtB和crtI，它们是编码番茄红素生物合成所需蛋白的3个新基因；建立包含这些基因的重组载体；以及用重组载体转化不产生番茄红素的大肠杆菌。

此外，通过对转化有含有至少一个新基因的重组载体的大肠杆菌进行发酵，证明了生产高浓度番茄红素的可能性；优选，新的crtB(序列3)和crtI(序列5)基因与目前已知的crtE基因的组合，被证明提供比现有研究更高的生产率；从而实现了本发明。

本发明的新基因是从海水宏基因组获得的，它们各以核苷酸序列序列1、序列3或序列5编码番茄红素生物合成所需的蛋白。序列1、序列3和序列5分别编码下面的氨基酸序列：序列2(GGPP合酶)，序列4(八氢番茄红素合酶)，序列6(八氢番茄红素去饱和酶)。

本发明提供的基因可以转化到通常用于番茄红素生产的各种不同的宿主细胞中。每个新基因可以单独使用，或者它们中的两个以上一起使用。例如，可以将本发明的crtI转化到只具有crtE和crtB的微生物中来生产番茄红素；此外，可以将本发明的crtE、crtB和crtI转化到生物合成类胡萝卜素例如虾青素的微生物中，以获得更好的产量。

通过使用番茄红素生物合成基因以及参与甲羟戊酸途径的基因，本发明提供了在大肠杆菌中经甲羟戊酸途径生产番茄红素的方法。

本发明的包括使用番茄红素生物合成基因在微生物中产生番茄红素的方法，包括下列3个步骤：(1)制备重组载体，所述载体除了番茄红素生物合成所需蛋白的编码基因之外，还含有mvaK1、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS和idi，其中参与番茄红素生物合成的基因是crtE、crtB和crtI，并且三个基因(crtE、crtB和crtI)中的至少一个选自下面的基因：序列列表中核苷酸序列1的crtE，核苷酸序列3的crtB，和核苷酸序列5的crtI；(2)将重组载体转化到大肠杆菌中；(3)培养大肠杆菌转化体并从培养基中回收番茄红素。

番茄红素生物合成所需的mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtI和idi基因，可用于构建至少一个或一个以上的独立的载体，其中每个载体含有选自这些基因中的至少一个基因；例如，每个mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtI和idi基因可以单独用于构建9个载体，或用于构建几个含有至少一个基因的载体，用于转化。但是，单独构建的载体的组合，其方式应该使转化的大肠杆菌具有所有的mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtI和idi基因。本公开的mvaE是在图2中所示的番茄红素生物合成过程中具有atoB和mvaA二者的功能的基因。

优选，准备转化到大肠杆菌中的载体可以被分别构建，以便一个载体具有mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE和mvaS基因，另一个载体具有crtE、crtB、crtI和idi；其中，mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE和mvaS基因可以来自当前已知的基因，而crtE、crtB和crtI基因中的至少一个可以来自海水宏基因组。

作为本发明的优选实践，含有crtE、crtB、crtI和idi基因的重组载体具有下列基因：序列7的crtE基因，序列3的crtB基因，序列5的crtI基因和大肠杆菌的idi基因。作为本发明的另一个优选实践，含有crtE、crtB、crtI和idi基因的重组载体具有下列基因：序列8的crtE基因，序列3的crtB基因，序列5的crtI基因和大肠杆菌的idi基因。作为本发明的另一个优选实践，含有crtE、crtB、crtI和idi基因的重组载体具有下列基因：来自草生欧文氏菌的crtE基因，序列3的crtB基因，序列5的crtI基因和大肠杆菌的idi基因。

本发明不限于通过构建某些类型的重组载体的基因组合，而是还包括构建具有mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtI和idi基因的大肠杆菌菌株的任何方法，其中crtE、crtB、crtI中的至少一个是从海水宏基因组获得的本发明的基因。

更详细来说，为了从重组菌株的培养物生产高浓度番茄红素，基本的培养条件被最适化如下：培养温度为25-35℃，高压灭菌前培养基的pH为7.0-7.5，振荡速度在200rpm到1,000rpm之间，溶解氧的浓度在20％到30％之间。

另一方面，为了提高细胞的生长和番茄红素的产量，适宜进行分批补料培养。当碳源耗尽时补充培养基；其中补料受到控制，使得每次补料加入0.4％的培养基，培养基的成分是70％甘油和2％MgSO₄·H₂O。

对于本发明来说，测量了按照方法转化的菌株产生的番茄红素的量：具有本发明提供的新的crtE、crtB和crtI基因组合的转化大肠杆菌是0.65mg/L/hr；而具有至少一个本发明的新基因与以前已知基因的组合的转化大肠杆菌则高达3.30mg/L/hr，如果采用补料分批培养则增加到9.7mg/L/hr，如果进行附加的IPTG诱导，则为36.5mg/L/hr。

为了实现本发明的目标，详细描述如下：引入甲羟戊酸途径；确定基因的最佳组合；通过对按照本发明制备的重组大肠杆菌进行发酵，对发酵条件进行最适化；以及建立比以前发明更高的生产率，提供了优于以前发明的优点。以前的发明提供高产量，但是需要很多时间，而本发明在短时间内提供高产量，使得开发经济的工艺成为可能。

附图简述

图1说明了番茄红素生物合成的过程。

图2是重组载体pSANF的结构。

图3是重组载体pT5-ErEBI的结构。

图4是重组载体pT5-LYC-idi的结构。

图5是重组载体pT5-ErBI的结构。

图6是重组载体pT-EF5的结构。

图7是重组载体pT-RF5的结构。

图8是重组载体pT-SF5的结构。

实施发明的最佳方式

本发明根据下面的实施例进行了更详细的描述。然而，下面的实施例仅仅是为了说明本发明，本发明的范围不受下面的实施例的限制。

实施例1：

参与番茄红素生物合成的基因的克隆以及重组载体pSANF的制备

野生型大肠杆菌不产生番茄红素，因此将参与甲羟戊酸、IPP和番茄红素生产的mvaK1、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtI和idi基因导入，以生产番茄红素。一开始，这些基因被导入到如下两个载体中：mvaK1、mvaD、mvaK2、mvaE和mvaS基因被导入pSTV28，而crtE、crtB、crtI和idi基因被导入pTrc99A。pSTV28具有氯霉素抗性，pTrc99A具有氨苄青霉素抗性，因此可以使用这两种抗生素选择同时含有两种载体的重组菌株。

在那些基因中，mvaK1、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS和idi基因来自其序列已经知道的基因，而crtB和crtI基因从海水宏基因组中筛选。来自宏基因组的crtE基因和来自以前已知基因的crtE基因被分别使用，以测量番茄红素的生产率。

mvaK1基因从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC35556克隆。将从金黄色葡萄球菌ATCC35556的基因组DNA扩增的DNA片段用EcoRI和SacI消化，然后插入到在同样的限制性位点被消化的pSTV28载体中，得到的重组载体被命名为pSTV28-SA1。

mvaD和mvaK2基因从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的基因组DNA克隆。将mvaD基因用SacI和KpnI限制性酶消化，然后插入到在同样的限制性位点被消化的pSTV28-SA1载体中，得到的重组载体被命名为pSTV28-SA1D。将mvaK2基因用KpnI和BamHI消化，然后插入到在同样的限制性位点被消化的pSTV28-SA1D载体中，得到的重组载体被命名为pSTV28-SA12D。

在插入mvaE和mvaS之前，检查启动子和转录终止序列的存在，以执行重叠延伸PCR，以便将含有启动子的DNA片段与含有转录终止序列的DNA片段连接成单个片段。将这样获得的DNA片段用BglII andNsiI消化，然后插入到用BamHI和PstI消化的pSTV28-SA12D载体中，得到的重组载体被命名为pSTV28-SA12D-Trc。

mvaE和mvaS基因从粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC700802的基因组DNA克隆，然后进行重叠延伸PCR。mvaE是在番茄红素生物合成过程中同时起atoB和mvaA二者功能的基因。将如上所述获得的含有mvaE和mvaS的DNA片段用BamHI和PstI消化，然后插入到在同样的限制性位点被消化的pSTV28-SA12D-Trc载体中，得到的重组载体被命名为pSANF(图2)。

在使用前，这5个基因都用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。

实施例2：

参与番茄红素生物合成的基因的克隆以及重组载体pT5-LYC-idi 的构建

2.1来自海水宏基因组的参与番茄红素生物合成的新基因crtE、crtB和crtI的克隆

为了获得参与番茄红素生物合成的基因crtE、crtB和crtI，从海水中直接获取基因组DNA(宏基因组)并用于构建文库；利用番茄红素的红色，选择带有红色的克隆，然后对克隆进行DNA分析。

为了从海水获得宏基因组DNA，首先通过膜过滤来浓缩大量海水，获得浓缩的微生物。因为大多数微生物的尺寸在0.2μm到10μm之间，因此最初将大量海水通过孔径为10μm的滤器，以除去尺寸大于10μm的各种漂浮物质，然后利用孔径为0.2μm的滤器，选择性收集尺寸大于0.2μm的微生物。通过使用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)的方法(Zhou等，Appl.Environm.Microbiol.62：316-322，1996)，从收集的微生物中分离染色体DNA。

使用拷贝控制F粘粒文库生产试剂盒(Epicenter)，按照制造商的说明书，从微生物获得的宏基因组DNA构建文库。用于文库构建的试剂盒是F粘粒载体拷贝控制pCC1FOS(Epicenter)。在待插入的DNA与拷贝控制载体pCC1FOS之间进行连接，并使用MaxPlaxλ包装提取物(Epicenter)，对连接的F粘粒克隆进行包装。通过该程序，可以获得超过10,000个克隆。

将如上所述获得的F粘粒克隆进行静置培养48小时，然后观察菌落的颜色，并筛选红色的菌落。为了通过PCR检查crt基因的存在，根据噬夏孢欧文氏菌、草生欧文氏菌、黄杆菌菌株ATCC21588、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和橙黄土壤杆菌的C-末端(crtIf)以及crtB的中间区域(crtBr)中的保守氨基酸序列，合成了引物。这些引物的核苷酸序列如下：

crtIf：

5′-GTNGGNGCRGGCACNCAYCC-3′

crtBr：

5′-TCGCGRGCRATRTTSGTSARRTG-3′

使用如上所述合成的引物扩增了crt基因，而模板F粘粒DNA从每个红色的菌落分离。详细来说，将100ng F粘粒DNA模板在94℃变性5分钟，然后进行20个循环的94℃30秒→50℃～60℃30秒→72℃1分钟，然后是15个循环的94℃30秒→50℃30秒→72℃1分钟。结果，从一个菌落获得了具有620bp大小的预期条带，将其插入到pST-Blue1载体(Novagen)中，然后进行核苷酸序列分析，并发现与以前报道的crtB基因的核苷酸序列具有同源性。

使用如上所述获得的crtB基因的片段作为探针，尝试利用southern印迹来获得包含crtB基因的完整番茄红素生物合成基因簇。用作探针的crtB片段具有通过PCR连接的DIG化合物，而模板DNA在southern印迹前用限制性酶BamHI、SalI和EcoRI进行消化。首先，将用每种不同限制性酶处理的DNA在0.9％的琼脂糖凝胶上进行电泳，按照它们的大小分离片段，然后，将片段通过毛细转移方法转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schuell，德国)。加入探针后，杂交在42℃下、在含有50％甲酰胺的标准溶液中(5XSSC，0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS、5％阻断试剂、50％甲酰胺)进行6小时以上。将膜与结合了碱性磷酸酶的抗DIG抗体进行结合；然后按照制造商的手册(Boehringer-Mannheim，德国)加入底物NBT和X-磷酸盐以诱导颜色显现。

将在southern印迹后在EcoRI片段DNA中给出信号的、尺寸为大约4kb的条带，插入到pBluescript II KS(+)载体(Stratagene)中，用于DNA序列分析。序列分析证明，该条带具有总共大约3.2kb的包含crtE、crtB和crtI的区域。

如上所述，crtE、crtB和crtI基因是从海水宏基因组克隆的，具有与目前已知基因不同的核苷酸序列。编码IPP异构酶的idi基因从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增。

2.2重组载体pT5-LYC-idi的构建

将如上所述获得的含有crtE基因的DNA片段，首先用EcoRI和BamHI消化，然后插入到在同样的限制性位点被消化的pTrc99A载体中，得到的重组载体被命名为pT-f5crtE。通过重叠延伸PCR反应获得含有完整的crtB和crtI基因的大约2.4kb的DNA片段，将它使用QiagenPCR纯化试剂盒进行纯化，然后用XhoI和SalI消化，然后插入到在同样的限制性位点被消化的pT-f5crtE中，得到的重组载体被命名为pT-f5EBI。将来自大肠杆菌MG 1655的idi基因用SacI和NotI消化，然后插入到在同样的限制性位点消化的pT-f5EBI中，得到的重组载体被命名为pT5-LYC-idi(图4)。

所有基因在使用前都用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。

实施例3：

评估用含有来自海水宏基因组的crtE、crtB和crtI基因与甲羟戊酸合成基因组合的载体所转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

测试了使用实施例1和实施例2的pSANF和pT5-LYC-idi载体转化的大肠杆菌的番茄红素生物合成。

首先，将MG1655用pSANF和pT5-LYC-idi载体转化。获得转化的大肠杆菌的单个菌落，接种到含有50ppm氨苄青霉素和20ppm氯霉素的5mL LB培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/LNaCl)，然后在37℃振荡培养12小时；然后将得到的培养基以600μl等份接种到含有1％甘油、50ppm氨苄青霉素和20ppm氯霉素的30mL2YT培养基中，然后在30℃主培养48小时。

培养完成后，取适当量的培养基来检查番茄红素生产率；通过计算细胞干重(gDCW/L)、产量(mg番茄红素/L，在后文中称为mg/L)、含量(mg番茄红素/gDCW，在后文中称为mg/gDCW)和生产率(mg番茄红素/L/hr，在后文中称为mg/L/hr)。

为了测量细胞干重，取5mL培养基，在50mL管中以8,000rpm离心10分钟，通过除去上清液来回收细胞。将回收的细胞悬浮在20mL无菌蒸馏水中，离心回收完全清除培养基成分的细胞；然后将回收的细胞完全悬浮在5mL无菌蒸馏水中，转移到重量已经称重过的铝称量盘中。这时，离心管用无菌蒸馏水清洗，清洗液也加入到称量盘中。将称量盘在干燥箱中在105℃干燥12小时以上，然后冷却，然后以mg的精度进行称量。细胞干重(gDCW/L)使用下面的公式1计算。

[公式1]

细胞干重(gDCW/L)＝{盘与干细胞的重量(mg)盘的重量(mg)}/5

番茄红素的产量如下进行测量：为了提取番茄红素，将从100μl培养基通过离心获得的细胞悬浮在400μl丙酮中，在55℃温育15分钟，然后向其中加入600μl丙酮，在55℃再次温育15分钟。将提取液以14,000rpm离心10分钟，然后使用分光光度计在474.5nm波长处测量取出的上清液的吸光度。将测量值代入根据标准曲线获得的方程，根据稀释率计算番茄红素的量。为了获得标准曲线，将从Sigma购买的标准番茄红素溶解在丙酮中，将得到的溶液在丙酮中稀释到不同的番茄红素浓度，然后使用分光光度计在474.5nm波长处测量稀释液的吸光度，将它用于制作标准曲线。

基于细胞干重和番茄红素的产量，使用公式2计算番茄红素的含量(mg/gDCW)。

[公式2]

番茄红素含量(mg/gDCW)＝番茄红素产量(mg/L)/细胞干重(gDCW/L)

通过使用公式3，将如上所述获得的番茄红素产量除以温育时间，计算番茄红素生产率(mg/L/hr)。

[公式3]

生产率(mg/L/hr)＝番茄红素产量(mg/L)/温育时间(hr)

按照本方法测定的用pSANF和pT5-LYC-idi转化的大肠杆菌的番茄红素生产率显示在表1中。

表1

[表1]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	5.11	31.2	6.1	0.65

实施例4：

评估用含有来自草生欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因或所述基因与甲羟戊酸合成基因的组合的载体所转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

4.1评估用含有来自草生欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因的载体转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

获得了来自草生欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因，构建了pT5-ErEBI(图3)，将其转化到大肠杆菌中，通过与实施例3相同的方法评估了番茄红素生产率。培养48小时后测量到的转化大肠杆菌的番茄红素生产率显示在表2中。

表2

[表2]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	3.7	12.7	3.5	0.3

4.2评估用含有来自草生欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因与甲羟戊酸合成基因的组合的载体转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

将含有来自草生欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因的pT5-ErEBI和实施例1的pSANF转化到大肠杆菌中，通过与实施例3相同的方法评估番茄红素生产率。培养48小时后测量到的转化大肠杆菌的番茄红素生产率显示在表3中。

表3

[表3]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	4.0	66.3	16.6	1.4

实施例5：

评估用含有来自海水宏基因组的crtE基因和来自草生欧文氏菌的 crtB和crtI基因与甲羟戊酸合成基因的组合的载体所转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

将实施例2的pT5-LYC-idi载体中的crtB和crtI基因用来自草生欧文氏菌的已知相同基因代替，构建了重组载体pT5-ErBI(图5)，将其转化到大肠杆菌中，通过与实施例3相同的方法评估番茄红素的生产率。

培养48小时后测量到的用pSANF和pT5-ErBI转化的大肠杆菌的番茄红素生产率显示在表4中。

表4

[表4]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	5.89	50.1	8.5	1.04

实施例6：

评估用含有来自草生欧文氏菌的crtE基因(AMOCO CORPORARION，美国专利5530189)和来自海水宏基因组的crtB和 crtI基因与甲羟戊酸合成基因的组合的载体所转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

将实施例2的pT5-LYC-idi载体中的crtE基因用来自草生欧文氏菌的相同基因取代，构建了重组载体pT-EF5(图6)，将其转化到大肠杆菌中，通过与实施例3相同的方法评估番茄红素的生产率。

培养48小时后测量到的用pSANF和pT-EF5转化的大肠杆菌的番茄红素生产率显示在表5中。

表5

[表5]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	5.19	134.1	25.8	2.79

实施例7：

评估用含有来自类球红细菌的crtE基因(序列7)和来自海水宏基因组的crtB和crtI基因与甲羟戊酸合成基因的组合的载体所转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

将实施例2的pT5-LYC-idi载体中的crtE基因用来自类球红细菌的相同基因取代，构建了重组载体pT-RF5(图7)，将其转化到大肠杆菌中，通过与实施例3相同的方法评估番茄红素的生产率。

用pSANF和pT-RF5转化的大肠杆菌的番茄红素生产率显示在表6中。

表6

[表6]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	5.63	106.4	18.9	2.22

实施例8：

评估用含有来自集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803的crtE基因 (序列8)和来自海水宏基因组的crtB和crtI基因与甲羟戊酸合成基因的组合的载体所转化的大肠杆菌的番茄红素生产率

将实施例2的pT5-LYC-idi载体中的crtE基因用来自集胞藻PCC6803的相同基因取代，构建了重组载体pT-SF5(图8)，将其转化到大肠杆菌中，通过与实施例3相同的方法评估番茄红素的生产率。

用pSANF和pT-SF5转化的大肠杆菌的番茄红素生产率显示在表7中。

表7

[表7]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	4.52	158.2	35.0	3.30

实施例9

评估用含有来自集胞藻PCC6803的crtE基因和来自海水宏基因组的crtB和crtI基因与甲羟戊酸合成基因的组合的载体所转化的分批补料培养的大肠杆菌的番茄红素生产率

将实施例8的用pSANF和pT-SF5转化的大肠杆菌进行分批补料培养。

Biostat B发酵罐(B.Brown Biotech International)用于分批补料培养。培养容器的总体积是5L，工作体积是2L。

发酵罐装备有用于监测质子浓度的pH计，用于监测溶解氧浓度的DO计，以及可以检测泡沫以便除去在发酵过程中出现的泡沫的泡沫传感器。

在发酵过程中，使用氨溶液和30％磷酸控制pH，控制注入发酵罐的压缩空气以维持流速为2L/min。发酵罐的温度保持在30℃，同时进行适当的维持，以保持振荡速度在200rpm到1,000rpm之间，溶解氧浓度在20％到30％之间。发酵罐含有2L用于番茄红素生产的无菌培养基。用于番茄红素生产的培养基是修改的Kortz培养基(D.J.Korz等，J.ofBiotechnology，39，59-65，1995)，在高压灭菌前将其pH调整到7.0，它的组成如下：甘油2％，KH₂PO₄ 1.33％，(NH₄)₂HPO₄ 0.4％，MgSO₄·7H₂O 0.12％，柠檬酸0.17％，EDTA 8.4mg/L，CoCl₂·6H₂O2.5mg/L，MnCl₂·4H₂O 15.0mg/L，CuCl₂·2H₂O 1.5mg/L，H₂BO₃ 3.0mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 2.5mg/L，Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 13.0mg/L，以及柠檬酸铁(III)100mg/L。将含有培养基的发酵罐在121℃高压灭菌15分钟，以消灭发酵罐内的任何微生物，然后在接种前加入抗生素氨苄青霉素和氯霉素，至浓度分别为50ppm和20ppm。

使用铂环，将实施例8的菌落接种在试管中的3mL LB培养基中，然后在振荡的发酵罐中在30℃下进行第一次预培养。在培养过程中，当通过分光光度计在600nm处测量到的光密度(在后文中称为O.D.)达到大约1.0时，取2mL培养基的等份试样，接种到500mL锥形瓶中的100mL新鲜培养基中。将接种过的培养基在30℃进行第二次预培养，然后当O.D.再次达到1.0时，接种到高压灭菌过的发酵罐中的全部培养基中，进行分批补料培养。在培养过程中，每当碳源耗尽，就通过每次补料加入0.4％的培养基来补充营养物；培养基含有70％甘油和2％MgSO₄·7H₂O。

在培养过程中定时间隔的几个时间点，取出培养基的等份试样测量O.D.和产量(mg/L)。在培养48小时后测量到的番茄红素生产率显示在表8中。

表8

[表7]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	39.8	466	11.7	9.7

实施例10：

通过IPTG诱导增加番茄红素生产率

使用铂环，将实施例8的菌落接种在试管中的3mL LB培养基中，然后在振荡的发酵罐中在30℃下进行第一次预培养。在培养过程中，当通过分光光度计在600nm处测量到的O.D.达到大约1.0时，取2mL培养基的等份试样，接种到500mL锥形瓶中的100mL新鲜培养基中。将接种过的培养基在30℃进行第二次预培养，然后当O.D.再次达到1.0时，接种到已高压灭菌过的发酵罐中的全部培养基中，按照与实施例9中相同的方法进行分批补料培养。

在培养过程中定时间隔的几个时间点，取出培养基的等份试样测量O.D.和产量(mg/L)。当通过分光光度计在600nm处测量到的O.D.达到70.0时，以0.025mM的浓度执行IPTG诱导。在培养48小时后测量到的番茄红素生产率显示在表9中。

表9

细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)
细胞干重(gDCW/L)	产量(mg/L)	含量(mg/gDCW)	生产率(mg/L/hr)	46.1	1754	38.1	36.5

crtE、crtB和crtI基因可以单独地或通过它们中的至少一个与以前已知基因的组合，用于番茄红素的生产；而含有本发明的基因组合的重组菌株与以前已知发明的菌株相比，能够提供增加的生产率。此外，通过导入甲羟戊酸途径所需的基因以便可以在大肠杆菌中经过甲羟戊酸途径生产番茄红素，可以进一步提高番茄红素的生产率。因此，本发明可以非常有效地应用于番茄红素的大量生产，由于番茄红素的抗氧化活性和抗癌症效应，最近对它的需求在不断增加。

序列表

序列1是来自海水宏基因组的基因crtE的核苷酸序列(867bp)。

序列2是由基因crtE编码的香叶基香叶基焦磷酸合酶的氨基酸序列(288个氨基酸)。

序列3是来自海水宏基因组的基因crtB的核苷酸序列(909bp)。

序列4是由基因crtB编码的八氢番茄红素合酶的氨基酸序列(302个氨基酸)。

序列5是来自海水宏基因组的基因crtI的核苷酸序列(1,485bp)。

序列6是由基因crtI编码的八氢番茄红素去饱和酶的氨基酸序列(494个氨基酸)。

序列7是类球红细菌的基因crtE的核苷酸序列。

序列8是集胞藻PCC6803的基因crtE的核苷酸序列。

序列表

<110>SK能源株式会社

阿美克生物科技株式公司

<120>使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法

<160>8

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>867

<212>DNA

<213>crtE of meta genome from sea water

<400>1

atgataagcc ctatatccac tgctgatgtg gcctttgagc gcctcgttga cagctgtgaa 60

cgatcgttga aagagtgtat agccgcgagc tgtccagccc ttcatcaagc ttggcagcat 120

cagttcgcag cgcgaggcaa gcgtttacgt atgcacctag ccttagaaag tagtctggcg 180

ctagggttga ccgaccatca atgccacacc attgcggtgg catgcgaatt agtccaccag 240

gcctcattga ttcacgatga tgtgcttgat gcggataccc accgaaatgg caaagcaacg 300

gtttggcacc agtatggagc tgccacagca atttgtctgg gtgacagttt attagttgag 360

gcaatgctgc aaatagcgtt gttggaaaat ttaccgagcg ccgttcggca gcagcttgtg 420

caattattta aagatgccat acaagccgcc gctgagggcc aaattgacga ttgtaatagc 480

gacaaaatag ccaactatag ccatgccgat tattgcactg cagtgcgcaa aaaatcaggc 540

gcgctgttcg gcttaccggt gttggcggct atgttaatga gtcaacagca tgcaattact 600

atcggggtag ccaaccgagc ctatgctgaa tttggtattg cctatcagtt actcgatgac 660

ctgcatgacc gtgacgttga tcagcagggt cggatgaacg gttattgggt attaagtcgg 720

gattatccga ccggggtaga agcagcactc tttgctgcgg ttgagcagca tctcggcgag 780

gccgagcgac tgatcgcatc attgccatcg agcttgcacc ccagctttta tgtggtgcat 840

gactcgctcc gagcgaagct cccatga 867

<210>2

<211>288

<212>PRT

<213>Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase

<400>2

Met Ile Ser Pro Ile Ser Thr Ala Asp Val Ala Phe Glu Arg Leu Val

1 5 10 15

Asp Ser Cys Glu Arg Ser Leu Lys Glu Cys Ile Ala Ala Ser Cys Pro

20 25 30

Ala Leu His Gln Ala Trp Gln His Gln Phe Ala Ala Arg Gly Lys Arg

35 40 45

Leu Arg Met His Leu Ala Leu Glu Ser Ser Leu Ala Leu Gly Leu Thr

50 55 60

Asp His Gln Cys His Thr Ile Ala Val Ala Cys Glu Leu Val His Gln

65 70 75 80

Ala Ser Leu Ile His Asp Asp Val Leu Asp Ala Asp Thr His Arg Asn

85 90 95

Gly Lys Ala Thr Val Trp His Gln Tyr Gly Ala Ala Thr Ala lle Cys

100 105 110

Leu Gly Asp Ser Leu Leu Val Glu Ala Met Leu Gln Ile Ala Leu Leu

115 120 125

Glu Asn Leu Pro Ser Ala Val Arg Gln Gln Leu Val Gln Leu Phe Lys

130 135 140

Asp Ala Ile Gln Ala Ala Ala Glu Gly Gln Ile Asp Asp Cys Asn Ser

145 150 155 160

Asp Lys Ile Ala Asn Tyr Ser Tyr Ala Asp Tyr Cys Thr Ala Val Arg

165 170 175

Lys Lys Ser Gly Ala Leu Phe Gly Leu Pro Val Leu Ala Ala Met Leu

180 185 190

Met Ser Gln Gln His Ala Ile Thr Ile Gly Val Ala Asn Arg Ala Tyr

195 200 205

Ala Glu Phe Gly Ile Ala Tyr Gln Leu Leu Asp Asp Leu His Asp Arg

210 215 220

Asp Val Asp Gln Gln Gly Arg Met Asn Gly Tyr Trp Val Leu Ser Arg

225 230 235 240

Asp Tyr Pro Thr Gly Val Glu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Val Glu Gln

245 250 255

His Leu Gly Glu Ala Glu Arg Leu Ile Ala Ser Leu Pro Ser Ser Leu

260 265 270

His Pro Ser Phe Tyr Val Val His Asp Ser Leu Arg Ala Lys Leu Pro

275 280 285

<210>3

<211>909

<212>DNA

<213>crtB of meta genome from sea water

<400>3

atgaagatag cgctggaccg gcctgagcat gctgccatta tgcagcagca tggcaagtca 60

ttttatttgg ctggtagctt tctcggtcgt gatgcctggc agcgtgcgtc agcgctttat 120

gcttttttac gccatatcga cgaccaaatt gatgaagctg aaacatctgc cgtagcagcg 180

caacgactgg cacagattcg tcagcagctg ttctcaagcg caatcatgac cgacgcagat 240

gagcagagct taagcattga gcaaagcacc ctggagcaat ttttgcgtgg catggcttat 300

gacattggtc acgttgctat tgctgatcag gctgagttag aagactactg ctattgtgtc 360

gccggcaccg tcggtgaaat gatgtgtcag gccttgcgct gtgatgaccc gcgcgcaatt 420

ggtcatgcta ttgatttggg tgtcgctatg caaatgacca atattgcccg cgatgttcat 480

gccgatagcg ccttagggcg ccgttattta cccgccacct gggttggtga tctcagtgct 540

gagagcatta ccacggcaac accagctatc tcggcacaga tagccgcggc aattatgcgg 600

ctgattgcgt tatctgagca gcgttatcaa tcagcgtatg cgggtatcgc actgttgccg 660

ttgcgctcgc gcttggcaat tttggcggca agtcaccttt atgccggtat tggtcgcgcc 720

attgcggcgg agcatgcgca atcatggcag caacggaagg tgttgtcagg gtcgcgtaag 780

gcggcaatta ctgccgccgc agtggcggaa tttgcgactc gaccgcgact atggcgttat 840

tacgcgcagc ctagcttcgg taagccggcc gagcggatcg ctgcgtctgt tggcagtgag 900

ggtttatga 909

<210>4

<211>302

<212>PRT

<213>Phytoene Synthase

<400>4

Met Lys Ile Ala Leu Asp Arg Pro Glu His Ala Ala Ile Met Gln Gln

1 5 10 15

His Gly Lys Ser Phe Tyr Leu Ala Gly Ser Phe Leu Gly Arg Asp Ala

20 25 30

Trp Gln Arg Ala Ser Ala Leu Tyr Ala Phe Leu Arg His Ile Asp Asp

35 40 45

Gln Ile Asp Glu Ala Glu Thr Ser Ala Val Ala Ala Gln Arg Leu Ala

50 55 60

Gln Ile Arg Gln Gln Leu Phe Ser Ser Ala Ile Met Thr Asp Ala Asp

65 70 75 80

Glu Gln Ser Leu Ser Ile Glu Gln Ser Thr Leu Glu Gln Phe Leu Arg

85 90 95

Gly Met Ala Tyr Asp Ile Gly His Val Ala Ile Ala Asp Gln Ala Glu

100 105 110

Leu Glu Asp Tyr Cys Tyr Cys Val Ala Gly Thr Val Gly Glu Met Met

115 120 125

Cys Gln Ala Leu Arg Cys Asp Asp Pro Arg Ala Ile Gly His Ala Ile

130 135 140

Asp Leu Gly Val Ala Met Gln Met Thr Asn Ile Ala Arg Asp Val His

145 150 155 160

Ala Asp Ser Ala Leu Gly Arg Arg Tyr Leu Pro Ala Thr Trp Val Gly

165 170 175

Asp Leu Ser Ala Glu Ser Ile Thr Thr Ala Thr Pro Ala Ile Ser Ala

180 185 190

Gln Ile Ala Ala Ala Ile Met Arg Leu Ile Ala Leu Ser Glu Gln Arg

195 200 205

Tyr Gln Ser Ala Tyr Ala Gly Ile Ala Leu Leu Pro Leu Arg Ser Arg

210 215 220

Leu Ala Ile Leu Ala Ala Ser His Leu Tyr Ala Gly Ile Gly Arg Ala

225 230 235 240

Ile Ala Ala Glu His Ala Gln Ser Trp Gln Gln Arg Lys Val Leu Ser

245 250 255

Gly Ser Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ala Ala Ala Val Ala Glu Phe Ala

260 265 270

Thr Arg Pro Arg Leu Trp Arg Tyr Tyr Ala Gln Pro Ser Phe Gly Lys

275 280 285

Pro Ala Glu Arg Ile Ala Ala Ser Val Gly Ser Glu Gly Leu

290 295 300

<210>5

<211>1485

<212>DNA

<213>crtI of meta genome from sea water

<400>5

atgcaaacag ttgttattgg tggaggctta ggtggtatcg cagcggcgtt gcgagcccgt 60

gcaaaaggcc atcaagtcac cctaatagaa aaaaatcagc agttaggtgg ccgtgcgcaa 120

gtatttgaac gtgagggttt tcgttttgat gccggcccca ccgtgattac tgcaccattc 180

ttgtttgatg agctatttga attatttggc aaaaaacgcc aagactatgt cgagtttatt 240

ccgctcaatc cgtggtacca attttactac agtgacgaca agtcgcgctt caactatggt 300

ggaagtgtcg atgacacctt gcaagaaatt gctaaaattg agccaagtga ccaggccaat 360

tatctgcgtt taatcgagca tagcaaaaag atctacaaaa tcggctttga gcaactcgcc 420

gatcagccgt ttcacaagct ttccaccatg ttaaagcaaa ttccccattt gggccggctg 480

cgcgctgacc gcacggtttg gaatatggtt agtcgctatc ttaaaaatga caaactacgc 540

caagcttttt ctattcagtc attgctagta ggtggtaacc catttgatac caccagtatt 600

tatggactga ttcattattt agagcgggaa tatggcattc atttcgccat gggcggcacc 660

ggtgccatta ttgatgcatt acacaagctg atgctcgaag agggtatcga ggtgcgcacg 720

aactgctgtg tcaccgactt tcatagcagc ccgagccgca ttgagagcgc agtgattaat 780

cagcacgagg tgctatctgc tgactacttt atttttaatg gcgacccact gtatttgtat 840

aaacacctgt tacctgaaag ttctgctaat ttgcaattac ggttgaaggt tgatcacagt 900

aaacgctcaa tgggtctata tgtgctgttt tttggcacca ccaaacaata tccagaggtt 960

gagcatcaca ctatttggct gggcaagcgt tatcagcaat tattagcaga aatttttgcc 1020

gaaaaatcat tacccgatga tttttcactt tatgtacata gaccaactgc ttcggatcca 1080

tcctttgcgc cggctggttg cgacagcttt tatgtgttag ctccggtgcc caatctgcgg 1140

gcagatatag attggcaggt tgaggaaccc aagttgcgac aacggatcat cgacgcgcta 1200

gcagatacct tattgccggg cttacatgac tgtattaccg ctgagtttgc gatgacccca 1260

gaacagttta aaagcgatta tttgagtgtc gatggcgctg gcttttccat tgcacccaaa 1320

tttactcagt cggcgtggtt ccgttttcat aatctgtcgg aaaaatatag caacttatta 1380

ctcgctggtg ccggaacgca cccaggtgct ggcatgccgg gcgtactctg ttcggcaaaa 1440

gtcattgaaa aactgctccc tgtggtgact gcggagcagc catga 1485

<210>6

<211>494

<212>PRT

<213>Phytoene Desaturase

<400>6

Met Gln Thr Val Val Ile Gly Gly Gly Leu Gly Gly Ile Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Arg Ala Arg Ala Lys Gly His Gln Val Thr Leu Ile Glu Lys Asn

20 25 30

Gln Gln Leu Gly Gly Arg Ala Gln Val Phe Glu Arg Glu Gly Phe Arg

35 40 45

Phe Asp Ala Gly Pro Thr Val Ile Thr Ala Pro Phe Leu Phe Asp Glu

50 55 60

Leu Phe Glu Leu Phe Gly Lys Lys Arg Gln Asp Tyr Val Glu Phe Ile

65 70 75 80

Pro Leu Asn Pro Trp Tyr Gln Phe Tyr Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Arg

85 90 95

Phe Asn Tyr Gly Gly Ser Val Asp Asp Thr Leu Gln Glu Ile Ala Lys

100 105 110

Ile Glu Pro Ser Asp Gln Ala Asn Tyr Leu Arg Leu Ile Glu His Ser

115 120 125

Lys Lys Ile Tyr Lys Ile Gly Phe Glu Gln Leu Ala Asp Gln Pro Phe

130 135 140

His Lys Leu Ser Thr Met Leu Lys Gln Ile Pro His Leu Gly Arg Leu

145 150 155 160

Arg Ala Asp Arg Thr Val Trp Asn Met Val Ser Arg Tyr Leu Lys Asn

165 170 175

Asp Lys Leu Arg Gln Ala Phe Ser Ile Gln Ser Leu Leu Val Gly Gly

180 185 190

Asn Pro Phe Asp Thr Thr Ser Ile Tyr Gly Leu Ile His Tyr Leu Glu

195 200 205

Arg Glu Tyr Gly Ile His Phe Ala Met Gly Gly Thr Gly Ala Ile Ile

210 215 220

Asp Ala Leu His Lys Leu Met Leu Glu Glu Gly Ile Glu Val Arg Thr

225 230 235 240

Asn Cys Cys Val Thr Asp Phe His Ser Ser Pro Ser Arg Ile Glu Ser

245 250 255

Ala Val Ile Asn Gln His Glu Val Leu Ser Ala Asp Tyr Phe Ile Phe

260 265 270

Asn Gly Asp Pro Leu Tyr Leu Tyr Lys His Leu Leu Pro Glu Ser Ser

275 280 285

Ala Asn Leu Gln Leu Arg Leu Lys Val Asp His Ser Lys Arg Ser Met

290 295 300

Gly Leu Tyr Val Leu Phe Phe Gly Thr Thr Lys Gln Tyr Pro Glu Val

305 310 315 320

Glu His His Thr Ile Trp Leu Gly Lys Arg Tyr Gln Gln Leu Leu Ala

325 330 335

Glu Ile Phe Ala Glu Lys Ser Leu Pro Asp Asp Phe Ser Leu Tyr Val

340 345 350

His Arg Pro Thr Ala Ser Asp Pro Ser Phe Ala Pro Ala Gly Cys Asp

355 360 365

Ser Phe Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro Asn Leu Arg Ala Asp Ile Asp

370 375 380

Trp Gln Val Glu Glu Pro Lys Leu Arg Gln Arg Ile Ile Asp Ala Leu

385 390 395 400

Ala Asp Thr Leu Leu Pro Gly Leu His Asp Cys Ile Thr Ala Glu Phe

405 410 415

Ala Met Thr Pro Glu Gln Phe Lys Ser Asp Tyr Leu Ser Val Asp Gly

420 425 430

Ala Gly Phe Ser Ile Ala Pro Lys Phe Thr Gln Ser Ala Trp Phe Arg

435 440 445

Phe His Asn Leu Ser Glu Lys Tyr Ser Asn Leu Leu Leu Ala Gly Ala

450 455 460

Gly Thr His Pro Gly Ala Gly Met Pro Gly Val Leu Cys Ser Ala Lys

465 470 475 480

Val Ile Glu Lys Leu Leu Pro Val Val Thr Ala Glu Gln Pro

485 490

<210>7

<211>867

<212>DNA

<213>crtE of Rhodobacter sphaeroides

<400>7

atggcgtttg aacagcggat tgaagcggca atggcagcgg cgatcgcgcg gggccagggc 60

tccgaggcgc cctcgaagct ggcgacggcg ctcgactatg cggtgacgcc cggcggcgcg 120

cgcatccggc ccacgcttct gctcagcgtg gccacgcgct gcggcgacag ccgcccggct 180

ctgtcggacg cggcggcggt ggcgcttgag ctgatccatt gcgcgagcct cgtgcatgac 240

gatctgccct gcttcgacga tgccgagatc cggcgcggca agcccacggt gcatcgcgcc 300

tattccgagc cgctggcgat cctcaccggc gacagcctga tcgtgatggg cttcgaggtg 360

ctggccggcg ccgcggccga ccgaccgcag cgggcgctgc agctggtgac ggcgctggcg 420

gtgcggacgg ggatgccgat gggcatctgc gcggggcagg gctgggagag cgagagccag 480

atcaatctct cggcctatca tcgggccaag accggcgcgc tcttcatcgc cgcgacccag 540

atgggcgcca ttgccgcggg ctacgaggcc gagccctggg aagagctggg agcccgcatc 600

ggcgaggcct tccaggtggc cgacgacctg cgcgacgcgc tctgcgatgc cgagacgctg 660

ggcaagcccg cggggcagga cgagatccac gcccgcccga gcgcggtgcg cgaatatggc 720

gtcgagggcg cggcgaaggg gctgaaggac atcctcggcg gcgccatcgc ctcgatcccc 780

tcctgcccgg ccgaggcgat gctggccgag atggtccgcc gctatgccga caagatcgtg 840

ccggcgcagg tcgcggcccg cgtctga 867

<210>8

<211>909

<212>DNA

<213>crtE of Synechocystis sp.PCC 6803

<400>8

atggttgccc aacaaacacg aaccgacttt gatttagccc aatacttaca agttaaaaaa 60

ggtgtggtcg aggcagccct ggatagttcc ctggcgatcg cccggccgga aaagatttac 120

gaagccatgc gttattctct gttggcgggg ggcaaacgat tgcgaccgat tttatgcatt 180

acggcctgcg aactgtgtgg cggtgatgaa gccctggcct tgcccacggc ctgtgccctg 240

gaaatgatcc acaccatgtc cctcatccat gatgatttgc cctccatgga taatgacgat 300

ttccgccggg gtaaacccac taaccacaaa gtgtacgggg aagacattgc cattttggcc 360

ggggatggac tgctagccta tgcgtttgag tatgtagtta cccacacccc ccaggctgat 420

ccccaagctt tactccaagt tattgcccgt ttgggtcgca cggtgggggc cgccggttta 480

gtggggggac aagttctaga cctggaatcg gaggggcgca ctgacatcac cccggaaacc 540

ctaactttta tccataccca taaaaccggg gcattgctgg aagcttccgt gctcacaggc 600

gcaattttgg ccggggccac tggggaacaa caacagagac tggcccgcta tgcccagaat 660

attggcttag cttttcaagt ggtggatgac atcctcgaca tcaccgccac ccaggaagag 720

ttgggtaaaa ccgctggtaa agatgtcaaa gcccaaaaag ccacctatcc cagtctcctc 780

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gaaccctttg gcccctccgc cgagcccctc caggcgatcg ccgaatatat tgttgccaga 900

aaatattga 909

Claims

1.生产番茄红素的方法，包括：

制备含有番茄红素生物合成所需蛋白的编码基因的重组载体，其中参与番茄红素生物合成的基因是crtE、crtB和crtI，并且所述三个基因中的至少一个选自序列表中核苷酸序列1的crtE，核苷酸序列3的crtB，和核苷酸序列5的crtI；

将重组载体转化到大肠杆菌中；以及

培养大肠杆菌转化体，并从培养基中回收番茄红素。

2.权利要求1的方法，其中重组载体除参与番茄红素生物合成的基因之外，还含有mvaK1、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS和idi，其中参与番茄红素生物合成的基因是crtE、crtB和crtI，并且所述三个基因中的至少一个选自核苷酸序列1的crtE，核苷酸序列3的crtB，和核苷酸序列5的crtI。

3.权利要求2的方法，其中分别构建至少一个或一个以上的重组载体，每个载体含有选自crtE、crtB、crtI、mvaK1、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS和idi的至少一个基因；其中分别的载体的组合包括crtE、crtB、crtI、mvaK1、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS和idi基因全部。

4.权利要求3的方法，其中分别构建各含有mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE和mvaS基因或crtE、crtB、crtI和idi基因的载体，并转化到大肠杆菌中。

5.权利要求4的方法，其中在重组载体中包含的crtE、crtB、crtI和idi基因如下：核苷酸序列7的crtE，核苷酸序列3的crtB，核苷酸序列5的crtI和大肠杆菌的idi。

6.权利要求4的方法，其中在重组载体中包含的crtE、crtB、crtI和idi基因如下：核苷酸序列8的crtE，核苷酸序列3的crtB，核苷酸序列5的crtI和大肠杆菌的idi。

7.权利要求4的方法，其中在重组载体中包含的crtE、crtB、crtI和idi基因分别是来自草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的crtE，核苷酸序列3的crtB，核苷酸序列5的crtI和大肠杆菌的idi。

8.权利要求1的方法，其中crtB和crtI基因的序列分别为序列3和序列5，和crtE基因的序列为序列7或序列8或是来自草生欧文氏菌。

9.前述权利要求1到8任一项的方法，其中转化体在下列条件下培养：培养温度在25到35℃的范围内，培养基在高压灭菌前的pH在7.0到7.5的范围内，振荡速度在200rpm到1,000rpm的范围内，和溶解氧的浓度在20％到30％的范围内。

10.前述权利要求1到8任一项的方法，其中转化体通过分批补料培养进行培养，用于大量生产番茄红素。