CN109689857A - 重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法 - Google Patents

重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109689857A
CN109689857A CN201780052483.1A CN201780052483A CN109689857A CN 109689857 A CN109689857 A CN 109689857A CN 201780052483 A CN201780052483 A CN 201780052483A CN 109689857 A CN109689857 A CN 109689857A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
recombinant cell
amino acid
leu
synzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780052483.1A
Other languages
English (en)
Inventor
古谷昌弘
松岛加奈
川端一史
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sekisui Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sekisui Chemical Co Ltd filed Critical Sekisui Chemical Co Ltd
Publication of CN109689857A publication Critical patent/CN109689857A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/26—Methylomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01088—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (1.1.1.88)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/07—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with an iron-sulfur protein as acceptor (1.2.7)
    • C12Y102/07004—Carbon-monoxide dehydrogenase (ferredoxin) (1.2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01009—Acetyl-CoA C-acetyltransferase (2.3.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/0301—Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (2.3.3.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01021—Squalene synthase (2.5.1.21), i.e. farnesyl-disphosphate farnesyltransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01032—15-Cis-phytoene synthase (2.5.1.32)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01036—Mevalonate kinase (2.7.1.36)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04026—Isopentenyl phosphate kinase (2.7.4.26)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01033—Diphosphomevalonate decarboxylase (4.1.1.33), i.e. mevalonate-pyrophosphate decarboxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03027—Isoprene synthase (4.2.3.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03102—Sesquithujene synthase (4.2.3.102)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种重组细胞，其是作为厌氧性古生菌的重组细胞，其具有下述基因作为所述第一外源基因：编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码双萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因、或编码八氢番茄红素合成酶的基因，该第一外源基因表达，所述重组细胞能够生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。

Description

重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法
技术领域
本发明涉及重组细胞、及异戊二烯或萜的生产方法，更具体而言，本发明涉及能够生产异戊二烯或萜的作为古生菌的重组细胞，以及将该重组细胞用于生产异戊二烯或萜的方法。
背景技术
近年来，正在进行着使用微生物来由废弃物等的燃烧气体即合成气(CO、CO2、H2的混合气体)制造石化替代化学品的技术开发。其中，构建作为轮胎原料的异戊二烯的石化替代工艺是相当重要的，并且已经研究了使用属于梭菌(Clostridium)属的重组合成气体利用性细菌的异戊二烯和萜的生产技术(例如专利文献1～3)。然而，在现有技术中，尽管在强力的组成型表达启动子下表达外源靶合成基因，但由于受到宿主细胞的负控制，故仅能获得低生产性。
另一方面，过去也尝试过通过野生型枯草菌、重组大肠杆菌、重组酵母等来生产异戊二烯或萜，然而它们仍然是昂贵的并且目前难以投入实际使用。此外，异戊二烯和萜的合成代谢在大多数生物体中受到严谨控制，并且没有例子证明重组微生物生产的异戊二烯和萜已经达到了与商业化相称的水平。在专利文献1和3中，已经证明了使用组成型表达系统的异戊二烯生产，但其生产率极低，与野生型相比相差数倍。
通过导入了异源甲羟戊酸途径基因和异戊二烯合成酶基因的重组大肠杆菌，由葡萄糖大量地生产异戊二烯(收率：60g/L)也已经被证实(非专利文献1)。在该技术中，基于IPTG的诱导促进了由葡萄糖生产异戊二烯。然而，使用葡萄糖作为原料的工艺中，存在限制原料供给这样的缺点。此外，就使用诱导型表达系统的物质生产而言，其碳转化率低(15％以下)，并且是分批式工艺而不是持续式工艺，因此在商业上不适于生产异戊二烯。
此外，报道了，当通过作为甲基营养菌(Methylotroph)的Methonobacteriumextroquence，组成型地表达包含异源甲羟戊酸途径基因和α-葎草萜(C15环状萜)合成酶基因的操纵子基因时，由于本途径基因表达引起的毒性而不能获得转化体，并且仅能通过具有严谨控制活性的诱导型表达法来有效地生产α-葎草萜(非专利文献2)。
如上所述，尽管已经对通过微生物来生产异戊二烯和萜进行了大量研究，但是达到了实际应用水平的生产性的情况很少，因而需要建立更有效的微生物工艺。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]国际公开第2013/180584号
[专利文献2]国际公开第2013/181647号
[专利文献3]国际公开第2014/065271号
非专利文献
[非专利文献1]Whited GM et al.,Industrial biotechnology 2010,6(3),152-163
[非专利文献2]Sonntag F.et al.,Metabolic Engineering 2015,32,82-94
发明内容
发明所解决的技术问题
另一方面，仍没有关于使用天然古生菌、古生菌突变体、古生菌重组体等古生菌生产异戊二烯或萜的技术的具体报道。因此，本发明提供了一种能够从合成气、甲醇、甲烷等丰富且廉价的原料出发来有效地生产异戊二烯或萜的重组古细胞、以及使用了该重组古生菌的异戊二烯或萜的生产方法。
解决技术问题的技术手段
本发明的一个方案为一种重组细胞，其是厌氧性古生菌的重组细胞，所述重组细胞具有下述基因作为所述第一外源基因：编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码双萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因、或编码八氢番茄红素合成酶的基因，该第一外源基因表达，所述重组细胞能够生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
重组细胞优选其能够以选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种作为唯一碳源进行生长。
重组细胞优选具有一氧化碳脱氢酶。
重组细胞优选具有由甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及CoA来合成乙酰CoA的功能。
重组细胞优选具有甲烷生成能力。
重组细胞优选能够将二氧化碳作为唯一碳源，将氢作为能源进行生长。
重组细胞优选能够将甲醇作为唯一碳源进行生长。
重组细胞优选能够将甲烷作为唯一碳源进行生长。
重组细胞优选属于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、产甲烷热球菌(Methanothermococcus)属、甲烷热杆菌(Methanothermobacter)属、甲烷丝菌(Methanothrix)属、热球菌(Thermococcus)属、热丝菌(Thermofilum)属、或古生球菌(Archaeoglobus)属。
重组细胞优选属于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、或产甲烷热球菌(Methanothermococcus)属。
重组细胞优选为巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、梅氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)、万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)或Methanothermococcus(Methanococcus)thermolithotrophicus。
重组细胞优选还含有编码一氧化碳脱氢酶的基因作为第二外源基因。
重组细胞，其优选所述第一外源基因是编码异戊二烯合成酶的基因，所述重组细胞能够生产异戊二烯，所述异戊二烯合成酶源于植物。
重组细胞，中优选所述异戊二烯合成酶是下述(a-1)、(a-2)或(a-3)的蛋白质：
(a-1)是包含序列编号1所示的氨基酸序列的蛋白质；
(a-2)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(a-3)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号1所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第三外源基因。
重组细胞，其优选，所述第一外源基因是编码倍半萜合成酶的基因，所述重组细胞能够生产碳原子数为15的萜，所述倍半萜合成酶是法呢烯合成酶。
重组细胞，其优选所述第一外源基因是编码倍半萜合成酶的基因，所述重组细胞能够生产碳原子数为15的萜，所述倍半萜合成酶是环状倍半萜合成酶。
重组细胞，其优选所述法呢烯合成酶是下述(d-1)、(d-2)或(d-3)的蛋白质：
(d-1)是包含序列编号4所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d-2)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(d-3)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号4所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第四外源基因。
重组细胞优选还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因和编码法呢基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第五外源基因。
重组细胞，其优选所述第一外源基因是编码单萜合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产碳原子数为10的萜，所述单萜合成酶是环状单萜合成酶。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第六外源基因。
重组细胞优选还含有编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因作为第七外源基因。
重组细胞优选还含有编码橙花基二磷酸合成酶的基因作为第八外源基因。
重组细胞，其优选所述环状单萜合成酶是水芹烯合成酶。
重组细胞，其优选所述水芹烯合成酶是下述(b-1)、(b-2)或(b-3)的蛋白质：
(b-1)是包含序列编号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b-2)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(b-3)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同源。
重组细胞，其优选所述水芹烯合成酶是下述(c-1)、(c-2)或(c-3)的蛋白质：
(c-1)是包含序列编号3所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c-2)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(c-3)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与由序列编号3所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
重组细胞，其优选所述第一外源基因是编码双萜合成酶的基因，所述重组细胞能够生产碳原子数为20的萜，所述双萜合成酶是环状双萜合成酶。
重组细胞优选还含有编码柯巴基二磷酸合成酶的基因作为第九外源基因。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十外源基因。
重组细胞优选还具有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因、编码法呢基二磷酸合成酶的基因以及编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第十一外源基因。
重组细胞，其优选所述第一外源基因是编码角鲨烯合成酶的基因，所述重组细胞能够生产碳原子数为30的萜，所述重组细胞还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十二外源基因。
重组细胞优选还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因及编码法呢基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第十三外源基因。
重组细胞，其优选，所述第一外源基因是编码八氢番茄红素合成酶的基因，所述重组细胞能够生产碳原子数为40的萜，所述重组细胞还包含编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十四外源基因。
重组细胞优选还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因、编码法呢基二磷酸合成酶的基因及牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶中的至少一种基因作为第十五外源基因。
重组细胞优选具有选自乙酰乙酰CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸-5-激酶、5-磷酸甲羟戊酸脱羧酶及异戊烯磷酸激酶中的至少一种基因作为第十六外源基因。
重组细胞，其优选所述第一外源基因在组成型表达启动子下进行了表达。
本发明的另一方案为一种异戊二烯或萜的生产方法，其包括：使权利要求1～37中任一项所述的重组细胞与选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇及乙酸中的至少一种碳源接触，在所述重组细胞中由所述碳源生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
所述方法，其优选用选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇及乙酸中的至少一种碳源来培养所述重组细胞，并且从该培养物中取得异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
所述方法，其优选生长稳定期的培养液的细胞浓度为1g干细胞/L以上，持续地进行培养基的供应和培养液的排出。
所述方法，其优选在培养槽中培养所述重组细胞，并且将包含一氧化碳、二氧化碳及氢气的混合气体供给至所述培养槽。
所述方法，其优选所述混合气体的一氧化碳浓度为20％以上。
所述方法，其优选所述混合气体的二氧化碳浓度为5％以上。
所述方法，其优选所述混合气体的硫化氢浓度为10ppm以下。
所述方法，其优选进一步向培养液中添加甲醇和/或乙酸。
发明的效果
根据本发明，可以高效地进行使用了重组细胞的异戊二烯或萜的生产。
附图说明
图1是表示古生菌中的甲羟戊酸途径和膜脂质合成途径的说明图。
图2是表示由甲羟戊酸合成异戊烯基二磷酸酯的途径的多样性的说明图。
图3是表示甲烷生成古生菌噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)的一氧化碳和乙酸利用代谢途径的说明图。
图4是表示古生菌中甲醇和甲烷利用途径的说明图。
图5是表示用于生产异戊二烯的穿梭载体pAC:Pmcr-IDI-IspS的构成的说明图。
图6是表示用于生产法呢烯的穿梭载体pAC:Pmcr-IDI-FnS的构成的说明图。
图7是表示用于生产法呢烯的穿梭载体pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS的构成的说明图。
图8是表示用于生产异戊二烯的穿梭载体pAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspS的构成的说明图。
具体实施方式
在下文中，对本发明的实施例进行说明。需要说明的是，在本发明中，术语“基因”可以全部用术语“核酸”或“DNA”来代替。
本发明的重组细胞属于厌氧性古生菌。通常，古生菌的膜脂质是包含异戊二烯骨架的烃(碳原子数为20～40)醚键合到甘油骨架上而得到的醚型极性脂质。如图1所示，就该古生菌特有的膜脂质而言，由作为C20的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate(GGPP))及甘油-1-磷酸(sn-glycerol1-phosphate)生成牻牛儿基牻牛儿基甘油磷酸酯(3-O-geranylgeranyl sn-glycerol-1-phosphate(GGGP))，然后通过两步反应合成上述膜脂质。如图1所示，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(碳原子数20)是经过通过古生菌具有的内源性甲羟戊酸途径提供的异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate(IPP)，碳原子数5)、牻牛儿基二磷酸(geranyl diphosphate(GPP)，碳原子数10)、以及法呢基二磷酸(farnesyl diphosphate(FPP)，碳原子数15)而合成的。因此，与其他生物不同，在古生菌中，总是通过甲羟戊酸途径提供大量的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸以用于随生长进行的膜脂质合成。本发明利用上述古生菌特有的主要代谢，通过重组细胞有效地生产异戊二烯或碳原子数为10～40的萜。
厌氧性古生菌是指，在几乎不存在分子氧(100ppm以下)的条件下可以生长的古生菌。本发明中的厌氧性古生菌包含绝对厌氧性和兼性厌氧性古生菌这两者。
在本发明中，具有异戊二烯合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞可以生产异戊二烯。此外，具有单萜合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产单萜(碳原子数为10的萜)。此外，具有倍半萜合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产倍半萜(碳原子数为15的萜)。此外，具有双萜合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产双萜(碳原子数为20的萜)。此外，具有角鲨烯合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产三萜(碳原子数为30的萜)。此外，具有八氢番茄红素合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞可以生产四萜(碳原子数为40的萜)。各酶和基因将在下面依次说明。
<异戊二烯合成酶>
异戊二烯合成酶(异戊二烯合成酶、isoprene synthase、IspS)具有将作为异戊烯基二磷酸(IPP)异构体的二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯的作用。需要说明的是，异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸之间的结构转化由异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase(IDI))进行催化。异戊烯基二磷酸异构酶存在于所有生物体中。
用于本发明的异戊二烯合成酶(IspS)没有特别限制，例如可以使用源于植物等真核生物的异戊二烯合成酶。作为源于植物的异戊二烯合成酶，通常可举出源于黑杨(Populus nigra)、黧豆、野葛的异戊二烯合成酶，但不限于这些。作为异戊二烯合成酶的具体实例，可举出Q50L36、Q6EJ97、Q9AR86、Q7XAS7、A0PFK2、A0A0M4UQH9、A0A0M5MSL0(以上为UniProtKB entry)等。
序列编号1表示编码源于黑杨的异戊二烯合成酶(GenBank Accession No.:AM410988.1)的核酸(DNA)的核苷酸序列和相应的氨基酸序列、序列编号2仅表示氨基酸序列。
关于本发明中使用的异戊二烯合成酶，除了在自然界中发现并且分离的异戊二烯合成酶之外，还可以是其改性体。例如，可以是现有的异戊二烯合成酶的部分片段；或是其氨基酸取代突变体并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质。
例如，本发明中使用的异戊二烯合成酶中至少包含下述(a-1)、(a-2)或(a-3)的蛋白质：
(a-1)是包含序列编号1所示的氨基酸序列的蛋白质；
(a-2)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(a-3)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号1所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(a-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
在优选的实施方案中，除异戊二烯合成酶基因外，还具有编码异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)的基因作为外源基因。通过导入IDI基因，增强了从IPP向DMAPP的转化，并且可以增强异戊二烯合成能力。本发明中使用的IDI没有特别限制，其实例可举出P61615、Q13907、Q46822、P50740、Q8TT35、P15496、Q10132、Q9KWG2(以上为UniProtKB entry)等。此外，在本发明中，可以使用源于古生菌的IDI，优选使用例如源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属菌的Q8TT35、Q8PW37、Q46CL4、A0A0E3LM81、A0A0E3QQI3(以上为UniProtKB entry)等。
<单萜合成酶>
单萜是碳原子数为10的萜，其包含两个异戊二烯单元。单萜有非环状和环状。非环状单萜包含牻牛儿醇、桂叶烯、柠檬醛、芳樟醇、橙花醇等。环状单萜包含柠檬烯、α-水芹烯、β-水芹烯、薄荷醇、百里酚、α-蒎烯、β-蒎烯、蒈烯、香芹酮、桉油醇、樟脑等。
单萜合成酶是将牻牛儿基二磷酸(GPP)或橙花基二磷酸(neryl diphosphate(NPP))转化为单萜的酶的总称。作为单萜的合成途径，可举出：通过GPP合成酶(GPPsynthase(GPPS))或NPP合成酶(NPP synthase(NPPS))的作用，由异戊烯基二磷酸(IPP)合成GPP或NPP。随后，通过单萜合成酶的作用，由GPP或NPP合成单萜。
在优选的实施方案中，单萜合成酶是环状单萜合成酶。更优选的是，环状单萜合成酶是水芹烯合成酶，具体而言，是α-水芹烯合成酶或β-水芹烯合成酶。
作为α-水芹烯合成酶，可以使用任何酶，只要其具有由作为底物的GPP或NPP生成α-水芹烯的活性即可。α-水芹烯合成酶的实例包含G5CV35、E5GAG2(以上为UniProtKBentry)、GN65-37361(SolCyc GeneID)等，但不限定于这些。
作为β-水芹烯合成酶，可以使用任何酶，只要其具有由作为底物的GPP或NPP生成β-水芹烯的活性即可。β-水芹烯合成酶的实例包含Q9M7D1、C1K5M3、Q1XBU4、R9QMW3、R9QMR4、R9QMW7、E9N3U9、C0PTH8、F2XFA5、F2XFA1、F2XFA4、A0A0B0P314(以上为UniProtKBentry)等，但不限定于这些。
至于本发明中使用的单萜合成酶，除了在自然界中发现且分离的单萜合成酶外，还可以使用它们的修饰体。例如，可以是现有单萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有单萜合成酶活性的蛋白质。
例如，本发明中使用的水芹烯合成酶(单萜合成酶的一个实例)至少包含下述(b-1)～(b-3)的蛋白质。
(b-1)是包含序列编号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b-2)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(b-3)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(b-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
此外，本发明中使用的水芹烯合成酶(单萜合成酶的一个实例)至少包含下述(c-1)～(c-3)的蛋白质。
(c-1)是包含序列编号3所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c-2)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(c-3)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号3所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(c-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
在优选的实施方案中，除了单萜合成酶基因外，还具有编码异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)作为外源基因的基因。通过导入IDI基因，可以增强从由IPP向DMAPP的转化，并且增强GPP合成能力或NPP合成能力。其结果，可以增强单萜合成能力。
在优选的实施方案中，除了单萜合成酶基因等外，还具有编码GPP合成酶(GPPS)或NPP合成酶(NPPS)基因作为外源基因的基因。通过导入这些基因，可以增强由GPP或NPP合成单萜的能力。GPPS的实例包含S4S927、S4S8D9、D8LHY4、H6VLF6、H6VLF3、D8RV97、Q6V4K1、Q8LKJ3、Q8LKJ2、Q8LKJ1、Q9FSW8、H6VLF7、V5REB1、Q58GE8(以上为UniProtKB entry)。NPPS的实例包含源于番茄的NDPS1(Schilmiller AL et al.,PNAS 2009,106(26),10865-10870)等。需要说明的是，在GPPS的情况下，可以使用源于古生菌的GPPS，特别优选使用例如源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属菌的MSBRM_0487、MA_0606、MM_1767、MSBRW_3310、Mbar_A1417(KEGG entry)等。
<倍半萜合成酶>
倍半萜是碳原子数为15的萜，其由三个异戊二烯单元组成。倍半萜有非环状、单环状、双环状、以及三环状的。非环状倍半萜包含法呢烯、法呢醇等。单环状倍半萜包含姜烯(zingiberene)、蛇麻烯(Humulene)、脱落酸等。双环状倍半萜包含石竹烯(Caryophyllene)、桉叶烷(Eudesman)、Eremophilan、缬草萜类(Valeran)、杜松烷(Cadinan)、杜松烯(Cadinene)、Guajan、Driman、雪松醇(Cedrol)、诺卡酮(Nootkatone)等。三环状倍半萜包含Illudan、Prezizaan、Marasman、Cedran、Thujopsan、Hirsutan等。
倍半萜合成酶是将法呢基二磷酸(FPP)转化为倍半萜的酶的总称。作为倍半萜的合成路线，可举出：通过GPP合成酶的作用，由IPP合成GPP。随后，通过FPP合成酶的作用，由GPP合成FPP。接着，通过倍半萜合成酶的作用，由FPP合成倍半萜。
在优选的实施方案中，倍半萜合成酶是环状倍半萜合成酶。在另一优选的实施方案中，倍半萜合成酶是法呢烯合成酶。
作为法呢烯合成酶，可以使用具有由作为底物的法呢基二磷酸(FPP)生成法呢烯的活性的任何酶。法呢烯合成酶的实例包含：用于合成法呢烯的α体((3E，6E)-alpha-farnesene)的Q84LB2,B9RXW0、B2KSJ6、Q84KL5(以上为UniProtKB entry)等；用于合成法呢烯的β体((E)-beta-farnesene)的Q9FXY7、O48935、Q2NM15、C7E5V9、C7E5V7、Q94JS8、C7E5W0、C7E5V8(以上为UniProtKB entry)等，但不限于此。
关于本发明中使用的倍半萜合成酶，除了天然发现和分离的倍半萜合成酶外，还可以使用其修饰体。例如，可以为是现有倍半萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有倍半萜合成酶活性的蛋白质。
例如，本发明中使用的法呢烯合成酶(倍半合成酶的一个实例)至少包含下述(d-1)～(d-3)的蛋白质。
(d-1)是包含序列编号4所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d-2)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(d-3)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号4所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
需要说明的是，(d-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为98％以上。
在优选的实施方案中，除了倍半萜合成酶基因外，还具有编码IDI作为外源基因的基因。通过导入IDI基因，可以增强GPP合成能力。其结果，FPP合成能力增强，并且可以提高倍半萜合成能力。
在优选的实施方案中，除了倍半萜合成酶基因等之外，还具有编码GPP合成酶(GPPS)的基因和/或FPP合成酶(FPPS)基因作为外源基因。通过导入这些基因，增强了GPP和/或FPP的合成能力，其结果，可以提高倍半萜的合成能力。GPPS的实例包含上述例举的那些。FPPS的实例包含P08524、P09152、P49349、P14324、P05369、O014230(以上为UniProtKBentry)等。需要说明的是，可以使用源于古生菌的FPPS，特别优选使用例如源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属菌的MSBRM_0487、MA_0606、MM_1767、MSBRW_3310、Mbar_A1417(KEGGentry)等。对于GPPS基因和FPPS基因，可以导入任一种，也可以导入这两种。
<双萜合成酶>
双萜是碳原子数为20的萜，其包含四个异戊二烯单元。双萜有非环状、单环状、双环状、以及三环状的双萜。非环状双萜包含α-生育酚、视黄醇、植醇等。环状双萜包含枞烷(Abietane)、松香酸(Abietic acid)、新松香酸(Neoabietic acid)、Levomaric acid、杉皮酸(Sapietic acid)、Atisane、Beyerane、赤霉素烷(Gibbane)、赤霉酸(Gibberellicacid)、贝壳杉烷(Kaurane)、卡哈苡苷的非糖部分(Steviol)、半日花烷(Labdane)、Picrasane、海松烷(Pimarane)、罗汉松烷(Podocarpane)、Rosane、紫杉烷(Taxane)、视黄醛，视黄酸，视黄醇等。
双萜合成酶是将牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)转化为双萜的酶的总称。作为双萜的合成途径，可举出：通过GPP合成酶的作用，由IPP合成GPP。随后，通过FPP合成酶的作用，由GPP合成FPP。随后，通过GGPP合成酶(GGPP synthase(GGPPS))的作用，由FPP合成GGPP。随后，通过双萜合成酶的作用，由GGPP合成双萜。
作为双萜合成酶，可以使用具有由GGPP生成双萜的活性的任何酶。双萜合成酶的实例包含Q38710、P9WJ61、G9MAN7、M4HY05、H8ZM70、M1VDX3、A2PZA5、Q675L5、Q0E088、P9WJ60、Q6Z5J6、M4HYP3(UniProtKB entry)等，但不限于这些。
关于本发明中使用的双萜合成酶，除了天然发现和分离的双萜合成酶外，还可以使用其修饰体。例如，可以是现有双萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有双萜合成酶活性的蛋白质。
在优选的实施方案中，除了双萜合成酶基因外，还具有编码IDI的基因作为外源基因。通过导入IDI基因，可以增强GPP合成能力。其结果，FPP合成能力和GPP合成能力增强，并且可以增强双萜合成能力。
在优选的实施方案中，除了双萜合成酶基因等外，还具有至少一种选自下述的基因作为外源基因：编码GPP合成酶(GPPS)的基因、编码FPP合成酶(FPPS)的基因、以及编码GGPP合成酶(GGPPS)的基因。通过导入这些基因，GPP、FPP、或GGPP的合成能力增强，其结果，可以增强双萜合成能力。GPPS和FPPS的实例包含上述的那些。GGPPS的实例，可以列举出：Q12051、Q84J75、P34802、P80042、Q94ID7、Q9SLG2、Q9C446、Q54BK1、Q9LUE1、Q92236、Q39108、O95749、Q12051、Q9P885、P24322(UniProtKB entry)等。需要说明的是，可以使用源于古生菌的GGPPS，特别优选使用例如源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属菌的MSBRM_0487、MA_0606、MM_1767、MSBRW_3310、Mbar_A1417(KEGG entry)等。
对于GPPS基因、FPPS基因、GGPPS基因，可以导入任一种，也可以导入两种以上。
在优选的实施方案中，除了双萜合成酶基因等之外，还具有编码柯巴基二磷酸合成酶(CPPS)作为外源基因的基因。柯巴基二磷酸(Copalyl diphosphate(CPP))是碳原子数为20的GGPP衍生物。通过导入CPP合成酶基因，可以应对双萜合成酶底物为CPP的情况。作为CPPS的实例，包含G8HZG6、O22667、A0A0N7I618、Q0Q2G7(UniProtKB entry)等。
<角鲨烯合成酶>
三萜是碳原子数为30的萜，其包含六个异戊二烯单元。通常，通过FPP(C15)的二聚体化，生成作为非环状三萜的角鲨烯(Squalene)(C30)(由角鲨烯合成酶进行催化)，由角鲨烯生成鲨烯-2,3-环氧化物(2,3-Oxidosqualene(2,3-epoxy-2,3-dihydroaqualene))，经过鲨烯-2,3-环氧化物(2,3-Oxidosqualene)的环化而生物合成200种以上的三萜骨架。然而，由于由角鲨烯生成鲨烯-2,3-环氧化物(2,3-Oxidosqualene)是需氧的，因此通过作为厌氧古生菌的本发明的重组细胞而可以生产的三萜主要为：通过角鲨烯的环化生产的藿烯(Hopene)、藿烷醇(Hopanol)、以及其衍生物即藿烷类(Hopanoid)化合物。
如上所述，角鲨烯合成酶(squalene synthase(SS))(EC 2.5.1.21)具有使FPP二聚体化的作用。在合成藿烷类化合物(Hopanoids)的情况下，除角鲨烯合成酶基因外，至少还导入角鲨烯/藿烯环化酶(Squalene/Hopene cyclase)(EC5.4.99.17)基因、或角鲨烯/藿烷醇环化酶(Squalene/Hopanol cyclase)(EC4.2.1.129)基因即可。通常，角鲨烯/藿烯环化酶具有角鲨烯/藿烷醇环化酶活性。角鲨烯合成酶(SS)的实例，可以列举出：P53799、P36596、P29704、P37268、P52020、Q9HGZ6、Q9Y753、Q9SDW9、P78589(UniProtKB entry)等。角鲨烯/藿烯环化酶(角鲨烯/藿烷醇环化酶)的实例包含P33247、P33990、P54924、P55348(UniProtKB entry)等。
通过进一步导入除SS基因之外的IDI基因，可以增强角鲨烯合成能力。此外，通过导入牻牛儿基二磷酸合成酶(GPPS)基因和/或法呢基二磷酸合成酶(FPPS)基因，可以增强合成角鲨烯的能力。GPPS和FPPS的实例可以列举出上述示例的那些。
关于本发明中使用的角鲨烯合成酶，除了在自然界中发现和分离的角鲨烯合成酶之外，还可以使用其修饰体。例如，可以是现有角鲨烯合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有角鲨烯合成酶活性的蛋白质。
<八氢番茄红素合成酶>
四萜是包含八个异戊二烯单元并且碳原子数为40的萜，主要包含类胡萝卜素的化合物组。四萜中存在许多非环状或环状四萜。非环状四萜包含八氢番茄红素、番茄红素、链孢红素等。单环状四萜包含γ-胡萝卜素等。双环状四萜包含α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、虾青素、抗青黄素、角黄素、辣椒红素、β-隐黄质、叶黄素、蓝溪藻黄素(myxoxanthophyll)、玉米黄质、岩藻黄质、紫罗兰红素、新黄质、毛莨黄素等。
八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase(PYS))(EC 2.5.1.32)具有使牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)二聚体化的作用。作为PYS的实例，可以列举出：Q7Z859、Q9P854、P37272、Q67GH9、D5KXJ0、P21683、Q9UUQ6、P08196、B2ATB0、Q2U4X9、A2QM49、P37271、P37273、P49085、P54975、P9WHP3、P54977、P22872、P17056(UniProtKB entry)等。
通过导入除PSY基因之外的IDI基因，可以增强八氢番茄红素的合成能力。此外，通过导入选自GPP合成酶基因、FPP合成酶基因、以及GGPP合成酶基因中的至少一种基因，可以增强八氢番茄红素的合成能力。GPPS、FPPS、GGPPS的实例可以例举出上述示例的那些。
关于本发明中使用的八氢番茄红素合成酶，除了在自然界中发现和分离的八氢番茄红素合成酶之外，还可以使用其修饰体。例如，可以是现有八氢番茄红素合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体，并且具有八氢番茄红素合成酶活性的蛋白质。
如上所述，本发明的重组细胞具有异戊二烯合成酶基因、单萜合成酶基因、倍半萜合成酶基因、双萜合成酶基因、角鲨烯合成酶基因、或八氢番茄红素合成酶基因作为外源基因。并且还任选具有IDI基因、GPPS基因、NPPS基因、GGPPS基因、CPPS基因、SS基因等。
就本发明中采用的上述外源基因而言，从作为宿主的古生菌出发，可以是异源基因或同源基因。
如上所述，古生菌的膜脂质组分具有异戊二烯骨架。因此，古生菌通过图1中所示的古生菌型甲羟戊酸途径(MVA途径)，与其他生物相比大量地合成IPP，上述IPP具有异戊二烯或类异戊二烯化合物的单元结构。以进一步生产大量的异戊二烯或萜为目的，可以采用使IPP合成能力进一步提高的措施。例如，为了进一步生产大量的异戊二烯或萜而不影响重组细胞的生长，可以进一步导入MVA途径基因作为外源基因。作为导入的MVA途径基因，只要其在重组细胞中正常发挥作用即可，没有特别限制。例如，可以使用与宿主相同的来源(内源性)、源于其他古生菌、源于古生菌以外的生物等的MVA途径基因。
此外，可以改善内源性MVA途径的功能，而不是从外部导入MVA途径基因。例如，可以通过启动子修饰增加内源性MVA途径基因的表达水平。
图1中表示构成代表性的源于古生菌的MVA途径的酶，但是如图2所示，在真核生物和原核生物中，由甲羟戊酸到IPP的生物合成途径是多样的。导入的上述MVA途径基因是编码图1或图2中所示的酶的部分或全部的基因。同样地，功能得到提高的上述内源性MVA途径的酶是这些酶的部分或全部。
具体而言，图1或图2中所示的酶为：
乙酰乙酰CoA硫解酶(acetoacetyl-CoA thiolase)(EC:2.3.1.9)、
HMG-CoA合成酶(HMG-CoA synthase)(EC:2.3.3.10)、
HMG-CoA还原酶(HMG-CoA reductase)(EC:1.1.1.34；1.1.1.88)、
甲羟戊酸-5-激酶(mevalonate-5-kinase)(EC:2.7.1.36)、
5-磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mevalonate-5-phosphate decarboxylase)(EC:4.1.1.99)、
异戊烯基磷酸激酶(isopentenyl phosphate kinase)(EC:2.7.4.26)、
异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase)(EC:5.3.3.2)、
磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase)(EC:2.7.4.2)、
甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase)(EC:4.1.1.33)、
甲羟戊酸-3-激酶(mevalonate-3-kinase)(EC:2.7.1.185)、
3-磷酸甲羟戊酸-5-激酶(mevalonate-3-phosphate-5-kinase)(EC:2.7.1.186)、
3,5-二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mevalonate-3,5-bisphosphate decarboxylase)。
其中，特别优选选自乙酰乙酰CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸-5-激酶、5-磷酸甲羟戊酸脱羧酶以及异戊烯基磷酸激酶中的一种或两种以上的酶。
此外，导入的上述MVA途径基因的来源没有特别限制。优选源于古生菌，更优选源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)属、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)属、甲烷丝菌属(Methanothrix)属、嗜热球菌(Thermococcus)、Thermofilum属、热原体属(Thermoplasma)、或古生球菌(Archaeoglobus)属。
本发明的重组细胞属于厌氧性古生菌，具体而言，外源基因被导入作为宿主的厌氧性古生菌中。
通常，古生菌可以以选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种作为唯一碳源而生长。它们具有如图3所示的还原型乙酰CoA途径，由甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及CoA合成乙酰CoA的同时，进行乙酸生成和甲烷生成，并将其作为基础代谢。CODH/ACS(carbon monoxide dehydrogenase/acetyl-CoA synthase)复合物在还原型乙酰CoA途径中的一氧化碳和二氧化碳的同化及异化中发挥重要作用。
作为本发明中使用的古生菌，可举出属于甲烷杆菌(Methanobacterium)属、甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)属、甲烷砾菌(Methanocalculus)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球形菌(Methanosphaera)属、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)属、甲烷丝菌属(Methanothrix)属,、甲烷囊菌(Methanoculleus)属、甲烷泡菌属(Methanofollis)属、产甲烷菌(Methanogenium)属、甲烷螺菌(Methanospirillium)属、甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)属、嗜热球菌(Thermococcus)属、Thermofilum属、古生球菌(Archaeoglobus)属等。其中，优选甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)属、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)属、甲烷丝菌属(Methanothrix)属、嗜热球菌(Thermococcus)属、热丝菌(Thermofilum)属、或古生球菌(Archaeoglobus)属，此外，从一氧化碳和二氧化碳利用性的观点出发，特别优选甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、或产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)属。作为具体实例，可举出巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)、梅氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)、万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)、或Methanothermococcus(Methanococcus)thermolithotrophicus)等。
另一方面，一氧化碳脱氢酶(一氧化碳脱氢酶，CO dehydrogenase，CODH)是一氧化碳代谢的重要的酶之一，并且具有由一氧化碳生成二氧化碳和质子的活性。该活性属于EC1.2(Oxidoreductase)，具体而言，属于EC 1.2.7.4(以前的EC 1.2.99.2)等。由一氧化碳和水生成二氧化碳和质子(water-gas shift)的反应，是该酶反应的代表例。
在优选的实施方案中，重组细胞具有一氧化碳脱氢酶。即，从应用于合成气发酵的观点出发，本发明的重组细胞优选具有上述酶活性。一氧化碳脱氢酶可以是宿主原本拥有的，也可以是外源基因表达而得的。当宿主没有CODH活性或具有低活性时，可用于导入CODH基因作为外源基因。作为此时的CODH的来源，例如，在细菌的情况下，存在一氧化碳利用性的红假单胞菌(Rhodopseudomonas)属、红螺菌(Rhodospirillum)属、红长命菌属(Rubrivivax)属、红环菌(Rhodocyclus)属、梭菌属(Clostridium)属、消化链球菌属(Peptostreptococcus)属、醋酸杆菌属(Acetobacterium)属、Moorella属、Carboxydothermus属等。另一方面，在古生菌中，存在源于Carboxydothermus属、热丝菌(Thermofilum)属、古生球菌(Archaeoglobus)属、甲烷八叠球菌(Methsanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)属、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)属等的CODH。
由于本发明的重组细胞通常具有图3所示的还原型乙酰CoA途径，因此可以以二氧化碳作为唯一碳源，并且以氢作为能源而生长。利用二氧化碳和氢气而生长的能力，可用于将废弃物燃烧气体或钢铁废气等工业废气转化为有价值物质。
在优选的实施方案中，重组细胞能够将甲醇作为唯一碳源而生长。即，本发明的重组细胞包含具有甲醇:辅酶M甲基转移酶(EC:2.1.1.246；methanol:coenzyme Mmethyltransferase)的细胞。由于由甲醇和CoM生成甲基CoM，所以它们能够在将甲醇作为唯一碳源的培养基中生长(图4)。由于甲醇由天然气、煤、废弃物燃烧气体等廉价地大量生产，因此具有甲醇利用能力的本发明的重组细胞可用于将甲醇转化为有价值物质。
在优选的实施方案中，重组细胞能够将甲烷作为唯一碳源而生长。即，本发明的重组细胞包含具有甲基辅酶M还原酶(EC 2.8.4.1；Methyl-CoM reductase)的细胞。由于由甲烷生产甲基CoM，所以它们能够在将甲烷作为唯一碳源的培养基中生长(图4)。具有甲烷利用能力的本发明的重组细胞可用于将天然气和生物质处理生成的甲烷转化为有价值物质。
将基因(核酸)导入古生菌的方法没有特别限定，可以根据作为宿主细胞的古生菌的种类进行适当选择。例如，可以使用可导入宿主细胞并且可表达整合基因的载体。作为该载体，可以使用能够在宿主细胞中自主复制的载体，或能够整合到染色体中并且在能够转录插入的上述基因的位置上含有启动子的载体。例如，优选使用该载体，在宿主细胞内构建包含启动子、核糖体结合序列、上述外源基因、以及转录终止序列的一系列构成。
如果对宿主细胞为甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属的情况进行说明，例如可以使用以噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)(DSM2834)中固有的质粒pC2A为基础的大肠杆菌的穿梭载体(Sowers K.R.et al.,J.Bacteriol.1988,170,4979-4982；Metcalf W.W.et al.,PNAS 1997,94,2626-2631)。存在通过同源重组而导入、缺乏基因的实例(Rother M.,et al.,J.Bacteriol 2005,187,5552-5559；Conway D.M.,J.Mol.Biol.1996,262,12-20)，这些方法也可用于本发明。
在宿主细胞是甲烷球菌(Methanococcus)属或产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)属的情况下，可以由海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)、甲烷球菌属(Methanococcus)st.AG83等固有的质粒pURB500、pURB900等，构建穿梭载体(Lange M.et al.,FEMS Microbiol.2001,25,553-571)。
组成型表达启动子可用作使外源基因表达的启动子。组成型表达启动子没有特别限制，从许多古菌具有甲烷生成能力的观点出发，可以使用例如甲基辅酶M还原酶启动子(Methyl Co-Enzyme M reductase promoter(Pmcr))(Buan N.et al.,Methods inEnzymology 2011,494,23-42)。另一方面，作为诱导型表达系统，可以利用使用了源于Tn10转座子的四环素抗性基因表达的控制系统的方法(Guess A.M.et al.,Archaea 2008,2,193-203)等。
此外，当使用载体将多种外源基因导入宿主时，各基因可以整合到一个载体中，也可以整合到各自的载体中。此外，当将多个基因整合到一个载体中时，各基因可以在共同的启动子下表达，或者可以在单独的启动子下表达。为了以融合蛋白的形式表达多种酶，可以导入其中连接有多种基因的融合基因。
转化方法没有特别限制，但脂质体法(Metcalf WW.et al.,PNAS 1997,94,2626-2631)可用于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属。此外，在甲烷球菌(Methanococcus)属或产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)属的情况下，PEG法(Gernhardt P.et al.,Mol.Gen.Genet.1990,221,273-279)是有效的。
除了如上所述的外源基因导入之外，还可以通过进一步实施突变或细胞融合，来培育异戊二烯和萜的生产性显著提高了的菌株。
在本发明的异戊二烯或萜的生产方法中，使选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种碳源与上述重组细胞接触，由该重组细胞中的上述碳源生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。通常，将选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种作为碳源来培养上述重组细胞，并且由该培养物获得异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜
由于本发明的重组细胞通常具有还原型乙酰CoA途径、以及甲醇利用途径、可逆的乙酸合成途径、可逆的甲烷生成途径，因此能够使用选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种碳源来生产异戊二烯或萜。对于这些C1化合物或乙酸，可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
当主要碳源、能源是气体组分时，优选通过在0.2～0.3MPa(绝对压力)左右的加压状态下进行培养，来提高气体组分的利用性。此外，为了使初始生长和到达细胞密度达到良好，可以添加少量有机物质，例如维生素、酵母提取物、玉米浆、Bacto Trypton等。
可以在不进行培养的情况下生产异戊二烯或萜。即，无论是否涉及细胞分裂(细胞生长)，都可以使重组细胞与上述C1化合物或乙酸接触，生产异戊二烯或萜。例如，可以将上述C1化合物或乙酸持续供应给固定化的重组细胞，以持续生产异戊二烯或萜。同样在该实施方案中，对于这些作为碳源的C1化合物或乙酸，可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。此外，优选同时使氢气(H2)作为能源接触。
在优选的实施方案中，将上述重组细胞在培养槽中培养，并且将包含一氧化碳、二氧化碳和氢气的混合气体供应到上述培养槽中。优选混合气体中的一氧化碳浓度为20％以上。优选上述混合气体中的二氧化碳浓度为5％以上。优选上述混合气体中的硫化氢浓度为10ppm以下。
需要说明的是，当使用上述混合气体来培养本发明的重组细胞时，如果向培养基中添加甲醇和/或乙酸，则在某些情况下可以将培养稳定化。例如，本发明的重组细胞包含能够进行化学自养生长(CO/CO2/H2利用)和异养生长(甲醇利用)这两者。在这种情况下，使用如下所述的碳源和能源的组合，而使有效且稳定的培养变得可能。
CO/CO2/H2/甲醇
CO/H2/甲醇
CO/甲醇
CO2/H2/甲醇
CO2/甲醇
CO/CO2/H2/乙酸
CO/H2/乙酸
CO/乙酸
CO2/H2/乙酸
CO2/乙酸
上述气体组分(CO、CO2、H2)和液体组分(甲醇、乙酸)可以总是共存，也可以在培养阶段单独使用。例如，可以单独使用甲醇来使细胞生长至稳定状态，然后仅转换气体组分，或转换为气体组分和甲醇的组合。通过使甲醇在合成气(CO、CO2、H2的混合气体)发酵中共存，可以在长期持续培养中实现合成气利用性的稳定化。能够期待通过甲醇来减少杂菌污染。
本发明可以应用于废弃物燃烧废气和炼钢废气等的再循环中。即，向上述重组细胞提供混合气体，该混合气体含有上述废气中的主要碳及作为能量组分的一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)和氢气(H2)作为主要成分。即，使用混合气体作为碳源来培养重组细胞，或者使混合气体与重组细胞接触，由混合气体中的一氧化碳或二氧化碳出发生产异戊二烯或萜。在该情况下，氢气被用作能源。在上述工业废气的主要成分组成是废弃物燃烧废气的情况下，例如，为CO/CO2/H2＝30-50/10-40/25-45％，在上述工业废气的主要成分组成是炼钢废气的情况下，例如，为CO/CO2/H2＝50-70/10-40/2-10％。
还可以根据使用的古生菌的气体利用性来改变上述气体组成。例如，通过水煤气变换反应等，可以容易地在水蒸汽存在下将上述混合气体中的一氧化碳转化为二氧化碳和氢气，并且可以增加二氧化碳和氢气的浓度。
此外，上述工业废气中存在硫化氢，一般暴露于1000ppm以上时，古生菌的生长会急剧恶化。因此，在将上述废气供应到培养槽之前，通过湿石灰石膏法、加氢脱硫法等，优选将硫化氢的浓度降低至100ppm以下，更优选10ppm以下。
在优选的实施方案中，培养液在生长稳定期的细胞浓度为1g干燥细胞/L以上，并且持续地进行培养基的供给和培养液的排出。即，培养方法是持续的，并且细胞密度保持的很高。
持续培养是指，在细胞密度达到一定水平后，通过持续进行新鲜培养基和气体的供给、以及培养液(含有菌体)的排出，使细胞密度及目标物质的生产速度保持恒定，并且经过长时间(例如一个月以上)来进行培养。与批量生产相比，由此可以显著提高异戊二烯或萜的生产性，并且还可以廉价地进行生产。上述持续培养中的细胞密度通常为1g干燥细胞/L以上，优选为5g干燥细胞/L，更优选为10g干燥细胞/L。
生产的异戊二烯或萜可以从细胞外，即培养液或气相级分中回收。
在下文中，将参考实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例
[实施例1]
用于在古生菌中生产异戊二烯的异戊二烯合成基因导入载体的制备
在本实施例中，制备如图5中所示的古生菌中异戊二烯合成用载体pAC:Pmcr-IDI-IspS。该载体为具有噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)的内源性质粒所含有的复制区、以及大肠杆菌中的复制区p15A的穿梭载体，并且可以通过源于沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)的启动子PmcrB(methyl coenzyme M reductase)，来使源于Saccharomyces cerevisiae的IDI(isopentenyl diphosphate isomerase)基因、以及源于Poplus canescens的IspS(isoprene synthase)基因进行组成型表达。
用HindIII和BclI来对质粒pACYC184(Nippon Gene株式会社)进行酶切，得到含有氯霉素抗性基因(Cat)和复制区p15A的片段，导入包含序列编号5和序列编号6的接头序列，获得质粒pAMCS。将序列编号7的嘌呤霉素(puromycin)抗性基因(PuR，Genewiz公司)导入pAMCS的SphI-AscI酶切位点，构建pAY:PuR。通过将含有序列编号8的IDI-IspS基因的基因片段(Genewiz公司)导入本质粒载体的PacI-NotI酶切位点，构建质粒pAY:Pmcr-IDI-IspS。
另一方面，根据Sowers KR等人的方法(Sowers KR et al.,1988J.Bacterial.,170(10),4979-4982)，通过M.acetivorans(DSM2834)的培养菌体，制备内源性质粒pC2A(GenBank No.U78295)。使通过SpeI进行的酶切而发生了直链化的pC2A、和通过SpeI进行了酶切而发生了直链化的上述pAY:Pmcr-IDI-IspS融合，构建在古生菌中对异戊二烯合成基因进行组成型表达的穿梭载体pAC:Pmcr-IDI-IspS(序列编号9，图5)。
通过同样地步骤，将pAY:PuR和pC2A融合，制备对照用的穿梭载体pAC:PuR(序列编号10)。
[实施例2]
巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)的转化、及由各种碳源生成异戊二烯
根据Metcalf WW等人的方法(Metcalf WW et al.,PNAS 1997,94,1997)，进行巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)(DSM800)的单细胞化培养和感受态细胞的制备。即，通过ATCC 2825改性培养基(其中，1L中含有10克氯化镁六水合物、0.76克氯化钾、24克氯化钠)(pH 6.8)，在严谨的厌氧条件下，培养至对数生长期(OD600＝0.3-0.6)。在厌氧室(Coy公司)中通过离心分离来回收菌体。将回收的菌体悬浮在0.85M蔗糖水溶液中，得到感受态细胞悬浮液(约109cells/mL)。
将15μL的DOTAP脂质体(Boehringer Mannheim公司)、100μL的20mM HEPES-KOH(pH7.4)、以及2μg的pAC:Pmcr-IDI-IspS(在50μL的HEPES-KOH(pH 7.4)中)混合，进行15分钟培养。添加1mL上述感受态细胞悬浮液，再培养4小时。将该混合溶液(1.165mL)通过10mL的ATCC2825改性培养基在35℃下进行恢复培养12～16小时，然后回收菌体。将回收的菌体悬浮于2mL的含有0.5％琼脂糖的ATCC2825改性培养基(45℃)中，然后涂布在含有1.4％琼脂糖和嘌呤霉素(2μg/mL)的ATCC2825改性琼脂培养基上。琼脂培养基上的培养，气相为N2/CO2/H2S＝80/20/0.1％的混合气体置换后的厌氧罐内，在35℃下，进行10～14天。
使用200μL的ATCC2825改性培养基(其中，1L含有500mg酵母提取物、500mgCasitone、5g氯化钠，并且不含甲醇)和指定的碳源，将生长了的菌落在35℃下培养3天。在表1所示的五种条件下，将整个培养液的菌体在35℃下振荡培养7～10天。在实验1～4中，将各种气体填充至绝对压力为2.5atm。在实验5和6中，使用N2作为气相进行填充，直至绝对压力为1.5atm。培养在由丁基橡胶塞密封的HS-20用20mL小瓶中(15mL气相、5mL培养液)进行。各实验中，一次进行3克隆(N＝3)培养。培养结束后，对气相进行顶空GCMS分析(GCMS-QP2010Ultra/HS-20，株式会社岛津制作所)，测定异戊二烯浓度。
作为对照，使用pAC:PuR代替pAC:Pmcr-IDI-IspS进行相同的操作。
结果如表1所示。即，当导入了pAC:Pmcr-IDI-IspS(图5)时，即使在使用CO2/H2(实验1)、CO/CO2/H2(实验2)、CO/H2/N2(实验3)中的任意碳源的情况下，可以确认显著的异戊二烯生成。此外，即使在使用甲醇(实验4)和乙酸(实验5)作为碳源的情况下，也可以确认显著的异戊二烯生成。它们的异戊二烯生产量均超过1mg/g干燥菌体。另一方面，在不存在主要碳源的情况下(实验6)，异戊二烯生成微乎其微。需要说明的是，当导入了pAC:PuR时，几乎均没有检测到异戊二烯。
由此可以确认，通过重组古生菌生成源于CO、CO2、甲醇以及乙酸的全部碳的异戊二烯。
该异戊二烯生产量(1g干燥菌体中超过1mg)明显高于现有报道的通过合成气利用性的梭菌属(Clostridium)细菌的异戊二烯生产(专利文献1、3等)的生产量，从而表明古生菌中的异戊二烯生产是高效的。此外，由于使用CO/CO2/H2、CO2/H2作为碳源来生产异戊二烯，因此在工业上可以使用作为废弃物燃烧气体等的合成气体作为碳源。
此外，在使用包含上述梭菌(Clostridium)属中的研究实例的细菌等作为宿主的现有技术中，需要导入由6种以上的外源酶基因构成的MVA途径基因。即，表明了：从基因操作的便利性出发，也可以利用古生菌内源性的MVA途径基因，即，不需要外源MVA途径基因的本发明是有效的。
如上所述，表明了本发明可以应用于由廉价且丰富地制造出的废弃物燃烧气体、甲醇、乙酸等生产异戊二烯。
[表1]
[实施例3]
用于在古生菌中生产法呢烯的载体的制备
在本实施例中，制备古细胞中的法呢烯合成用载体pAC:Pmcr-IDI-FnS(图6)与pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS(图7)。pAC:Pmcr-IDI-FnS含有源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的IDI和源于青蒿(Artemisia annua)的法呢烯合成酶(Farnesene synthase)(FnS)基因。pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS含有上述IDI、源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的法呢基二磷酸合成酶(Farnesene synthase)(FPS)、以及上述FnS基因。
用MluI-NotI对实施例1中制备的pAC:Pmcr-IDI-IspS(图5)进行酶切，除去IDI-IspS区域，获得直链片段。将该直链片段与含有IDI-FnS(序列编号11)的基因片段融合，构建pAC:Pmcr-IDI-FnS(序列编号13，图6)。此外，将该直链片段与含有IDI-FnS-FPS基因(序列编号12)(Genewiz公司)的基因片段融合，构建pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS基因(序列编号14，图7)。在图6和7中，scIDI表示源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的IDI，aaFnS表示源于青蒿(Artemisia annua)的FnS，scFPS表示源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的法呢基二磷酸合成酶。
[实施例4]
基于重组巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)进行的由各种碳源生成法呢烯
通过与实施例2中相同的脂质体法的转化方法，将PAC:Pmcr-IDI-FnS或pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS导入巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)(DSM800)，分别获得转化体。接下来，在与实施例2相同的条件下培养这些转化体。然而，为了提取、吸收所生成的法呢烯，将10％(v/v)的十二烷叠层在培养液上。培养完成后，通过离心分离从各培养液中回收十二烷层。将回收的十二烷层用正己烷稀释10倍，并通过GCMS(GCMS-QP2010Ultra，株式会社岛津制作所)分析来测定法呢烯浓度。
作为对照，使用pAC:PuR(实施例1)代替pAC:Pmcr-IDI-FnS或pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS并进行相同的操作。
结果如表2所示。即，当导入了pAC:Pmcr-IDI-FnS(图6)或pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS(图7)时，即使在使用CO2/H2(实验7)、CO/CO2/H2(实验8)、CO/H2/N2(实验9)中的任一碳源、能源的情况下，也可以确认显著地生成法呢烯。此外，即使在使用甲醇(实验10)和乙酸(实验11)作为碳源的情况下，也可以确认显著地生成法呢烯。它们的法呢烯生产量均超过1mg/g干燥菌体。
另一方面，即使在导入pAC:Pmcr-IDI-FnS(图6)或pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS(图7)的情况下，在不存在主要碳源的情况下(实验12)，生成的法呢烯微乎其微。由于可以使用CO/CO2/H2、CO2/H2、CO/H2作为碳源生产法呢烯，因此表示了，本发明可以应用于由废弃物燃烧气体等合成气生产法呢烯。
需要说明的是，当导入pAC:PuR时，几乎没有检测到法呢烯。
由上可知，本发明可以应用于由廉价且丰富制造出的废弃物燃烧气体、甲醇、乙酸等来生产法呢烯。
[表2]
[实施例5]
外源异戊二烯二磷酸异构酶(IDI)基因对重组甲烷八叠球菌(巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri))生产异戊二烯的影响
制备载体pAC:Pmcr-IspS(序列编号15)。该载体对应于从pAC:Pmcr-IDI-IspS(图5)中切除IDI基因而得的载体。
以与实施例2中相同的方式将PAC:Pmcr-IspS或pAC:Pmcr-IDI-IspS导入巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)(DSM800)，获得各自的转化体。在与实施例2相同的条件下培养各转化体，测定气相中的异戊二烯浓度。使用CO2/H2(实验13)或甲醇(实验14)作为培养的碳源。
结果如表3所示。即，在使用任何碳源的情况下，当导入IDI基因时，异戊二烯的生产量均更高。由此发现，通过IDI同时进行作用而增加异戊二烯的生产量。
[表3]
[实施例6]
通过导入MVA途径酶基因的异戊二烯生产的增强
制备载体pAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspS(序列编号16，图8)。除了源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的IDI基因(实施例1)、源于银灰杨(Poplus canescens)的IspS基因(实施例1)之外，本载体还具有源于噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivotans)的HMG-CoA合成酶(KEGG entry：MA_4041)基因和HMG-CoA还原酶(MA_3073)基因。
以与实施例2中相同的方式将pAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspS或pAC:Pmcr-IDI-IspS(实施例1)导入巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)(DSM800)中，获得各自的转化体。在与实施例2相同的条件下培养各转化体，测定气相中的异戊二烯浓度。使用CO2/H2(实验16)或甲醇(实验17)作为培养的碳源。
结果如表4所示。即，在使用任何碳源的情况下，导入了pAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspS的转化体具有较大的异戊二烯生产量。由此，发现了仅通过增强构成MVA途径的酶的一部分，可以增加异戊二烯生产量。
[表4]
序列列表
<110> 积水化学株式会社
<120> 重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法
<130> 17P01130
<150> JP 2016-211836
<151> 2016-10-28
<160> 16
<170> 专利版本 3.1
<210> 1
<211> 595
<212> PRT
<213> 银灰杨
<400> 1
Met Ala Thr Glu Leu Leu Cys Leu His Arg Pro Ile Ser Leu Thr His
1 5 10 15
Lys Leu Phe Arg Asn Pro Leu Pro Lys Val Ile Gln Ala Thr Pro Leu
20 25 30
Thr Leu Lys Leu Arg Cys Ser Val Ser Thr Glu Asn Val Ser Phe Thr
35 40 45
Glu Thr Glu Thr Glu Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser
50 55 60
Trp Asp Tyr Asp Phe Leu Leu Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser Ile Glu
65 70 75 80
Val Tyr Lys Asp Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu
85 90 95
Ile Asn Asn Glu Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ile Asp
100 105 110
Asn Val Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Arg
115 120 125
Arg Ala Leu Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Gly Val Thr
130 135 140
Lys Thr Ser Leu His Ala Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln
145 150 155 160
His Gly Phe Glu Val Ser Gln Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gln
165 170 175
Asn Gly Asn Phe Leu Glu Asn Leu Lys Glu Asp Thr Lys Ala Ile Leu
180 185 190
Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn Ile Leu
195 200 205
Asp Glu Ala Arg Val Phe Ala Ile Ser His Leu Lys Glu Leu Ser Glu
210 215 220
Glu Lys Ile Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Val Asn His Ala Leu Glu
225 230 235 240
Leu Pro Leu His Arg Arg Thr Gln Arg Leu Glu Ala Val Trp Ser Ile
245 250 255
Glu Ala Tyr Arg Lys Lys Glu Asp Ala Asn Gln Val Leu Leu Glu Leu
260 265 270
Ala Ile Leu Asp Tyr Asn Met Ile Gln Ser Val Tyr Gln Arg Asp Leu
275 280 285
Arg Glu Thr Ser Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu
290 295 300
His Phe Ala Lys Asp Arg Leu Ile Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly
305 310 315 320
Val Ala Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys
325 330 335
Met Phe Ser Phe Val Thr Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly
340 345 350
Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp
355 360 365
Val Asn Ala Ile Asn Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu
370 375 380
Ala Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Glu Ile Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Asp
385 390 395 400
Lys Gly Glu Asn Ile Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu
405 410 415
Cys Asn Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr
420 425 430
Pro Thr Phe Asp Asp Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Ser Ser Gly
435 440 445
Pro Leu Gln Leu Ile Phe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gln Asn Ile Lys
450 455 460
Lys Glu Glu Ile Glu Asn Leu Gln Lys Tyr His Asp Ile Ile Ser Arg
465 470 475 480
Pro Ser His Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ser Ala
485 490 495
Glu Ile Ala Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg
500 505 510
Thr Lys Gly Ile Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu
515 520 525
Ile Asp Glu Thr Cys Lys Lys Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser
530 535 540
Leu Phe Ala Lys Pro Phe Val Glu Thr Ala Ile Asn Leu Ala Arg Gln
545 550 555 560
Ser His Cys Thr Tyr His Asn Gly Asp Ala His Thr Ser Pro Asp Glu
565 570 575
Leu Thr Arg Lys Arg Val Leu Ser Val Ile Thr Glu Pro Ile Leu Pro
580 585 590
Phe Glu Arg
595
<210> 2
<211> 778
<212> PRT
<213> 潘那利番茄
<400> 2
Met Ile Val Gly Tyr Arg Ser Thr Ile Ile Thr Leu Ser His Pro Lys
1 5 10 15
Leu Gly Asn Gly Lys Thr Ile Ser Ser Asn Ala Ile Phe Gln Arg Ser
20 25 30
Cys Arg Val Arg Cys Ser His Ser Thr Thr Ser Ser Met Asn Gly Phe
35 40 45
Glu Asp Ala Arg Asp Arg Ile Arg Glu Ser Phe Gly Lys Leu Glu Leu
50 55 60
Ser Pro Ser Ser Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val Pro Ser Lys
65 70 75 80
His Ser Leu Asn Glu Pro Cys Phe Pro Gln Cys Leu Asp Trp Ile Ile
85 90 95
Glu Asn Gln Arg Glu Asp Gly Ser Trp Gly Leu Asn Pro Thr His Pro
100 105 110
Leu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ala Cys Leu Leu Ala
115 120 125
Leu Thr Lys Trp Arg Val Gly Asp Glu Gln Ile Lys Arg Gly Leu Gly
130 135 140
Phe Ile Glu Thr Tyr Gly Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Gln Ile Ser
145 150 155 160
Pro Leu Gly Phe Glu Val Ile Phe Ser Ser Met Ile Lys Ser Ala Glu
165 170 175
Lys Leu Asp Leu Asn Leu Pro Leu Asn Leu His Leu Val Asn Leu Val
180 185 190
Asn Cys Lys Arg Asp Ser Thr Ile Lys Arg Asn Val Glu Tyr Met Gly
195 200 205
Glu Gly Val Gly Glu Leu Cys Asp Trp Lys Glu Ile Ile Lys Leu His
210 215 220
Gln Arg Gln Asn Gly Ser Leu Phe Asp Ser Pro Ala Thr Thr Ala Ala
225 230 235 240
Ala Leu Ile Tyr His Gln His Asp Gln Lys Cys Asn Gln Tyr Leu Asn
245 250 255
Ser Ile Leu Lys Gln His Lys Asn Trp Val Pro Thr Met Tyr Pro Thr
260 265 270
Lys Ile His Ser Leu Leu Cys Leu Val Asp Thr Leu Gln Asn Leu Gly
275 280 285
Val His Arg His Phe Lys Ser Glu Ile Lys Lys Ala Leu Asp Glu Ile
290 295 300
Tyr Arg Leu Trp Gln Gln Lys Asn Glu Gln Ile Phe Ser Asn Val Thr
305 310 315 320
His Cys Ala Met Ala Phe Arg Leu Leu Arg Met Ser Tyr Tyr Asp Val
325 330 335
Ser Ser Asp Glu Leu Ala Glu Phe Val Asp Glu Glu His Phe Phe Thr
340 345 350
Thr Ser Gly Lys Tyr Thr Ser His Val Glu Ile Leu Glu Leu His Lys
355 360 365
Ala Ser Gln Leu Ala Ile Asp His Glu Lys Asp Asp Ile Leu Asp Lys
370 375 380
Ile Asn Asn Trp Thr Arg Thr Phe Met Glu Gln Lys Leu Leu Asn Asn
385 390 395 400
Gly Phe Ile Asp Arg Met Ser Lys Lys Glu Val Glu Leu Ala Leu Lys
405 410 415
Lys Phe Tyr Thr Thr Ser Asp Leu Ala Glu Asn Arg Arg Tyr Ile Lys
420 425 430
Ser Tyr Glu Glu Asn Asn Phe Lys Ile Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ser
435 440 445
Pro Asn Ile Asn Asn Lys Asp Leu Leu Ala Phe Ser Ile His Glu Phe
450 455 460
Glu Leu Cys Gln Ala Gln His Arg Glu Glu Leu Gln Gln Leu Arg Arg
465 470 475 480
Trp Phe Glu Asp Tyr Arg Leu Asp Gln Leu Gly Leu Ala Glu Arg Tyr
485 490 495
Ile His Ala Thr Tyr Leu Phe Gly Val Thr Ile Ile Pro Glu Pro Glu
500 505 510
Leu Ser Asp Ala Arg Leu Met Asn Ala Lys Tyr Ile Met Leu Leu Thr
515 520 525
Ile Val Asp Glu Tyr Phe Glu Ser Phe Ala Ser Lys Asp Glu Cys Leu
530 535 540
Asn Ile Ile Glu Leu Val Glu Arg Trp Asp Asp Tyr Ala Ser Val Gly
545 550 555 560
Tyr Lys Ser Glu Lys Val Lys Val Phe Phe Ser Thr Phe Tyr Lys Ser
565 570 575
Ile Glu Glu Leu Ala Thr Ile Ala Glu Ile Lys Gln Gly Arg Ser Val
580 585 590
Lys Asn His Leu Ile Asn Leu Trp Leu Glu Val Met Lys Leu Met Leu
595 600 605
Met Glu Gln Val Glu Trp Trp Thr Ser Lys Thr Ile Pro Ser Ile Glu
610 615 620
Glu Tyr Leu Cys Val Thr Ser Ile Thr Phe Gly Ser Arg Leu Leu Leu
625 630 635 640
Leu Thr Ile Gln Tyr Phe Leu Gly Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Leu
645 650 655
Glu Ser Asp Glu Ile Cys Gly Leu Cys Asn Cys Thr Gly Arg Val Met
660 665 670
Arg Ile Leu Asn Asp Leu Gln Asp Ser Lys Arg Glu Gln Lys Gly Val
675 680 685
Ser Ile Asn Leu Val Thr Leu Leu Met Lys Ser Ile Ser Glu Glu Glu
690 695 700
Ala Ile Met Lys Met Lys Glu Ile Leu Glu Met Asn Arg Arg Glu Leu
705 710 715 720
Leu Lys Met Val Leu Val Gln Lys Lys Gly Ser Gln Leu Pro Gln Leu
725 730 735
Cys Lys Asp Ile Phe Trp Arg Thr Ser Lys Trp Thr His Phe Thr Tyr
740 745 750
Ser Gln Thr Asp Gly Phe Arg Ile Glu Glu Glu Met Lys Asn His Ile
755 760 765
Asp Glu Val Phe Tyr Lys Pro Leu Asn His
770 775
<210> 3
<211> 630
<212> PRT
<213> 北美冷杉
<400> 3
Met Ala Leu Val Ser Ser Ala Pro Lys Ser Cys Leu His Lys Ser Leu
1 5 10 15
Ile Arg Ser Thr His His Glu Leu Lys Pro Leu Arg Arg Thr Ile Pro
20 25 30
Thr Leu Gly Met Cys Arg Arg Gly Lys Ser Phe Thr Pro Ser Val Ser
35 40 45
Met Ser Leu Thr Thr Ala Val Ser Asp Asp Gly Leu Gln Arg Arg Ile
50 55 60
Gly Asp Tyr His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Phe Ile Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Thr Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Arg Glu Arg Ala Glu Lys Leu
85 90 95
Ile Gly Glu Val Lys Glu Met Phe Asn Ser Met Pro Ser Glu Asp Gly
100 105 110
Glu Ser Met Ser Pro Leu Asn Asp Leu Ile Glu Arg Leu Trp Met Val
115 120 125
Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly Ile Asp Arg His Phe Lys Lys Glu Ile
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ser Tyr Trp Asn Glu Lys Gly Ile
145 150 155 160
Gly Cys Gly Arg Asp Ser Val Phe Pro Asp Val Asn Ser Thr Ala Ser
165 170 175
Gly Phe Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Ser Val Ser Ser Glu Val
180 185 190
Leu Lys Val Phe Gln Asp Gln Asn Gly Gln Phe Ala Phe Ser Pro Ser
195 200 205
Thr Lys Glu Arg Asp Ile Arg Thr Val Leu Asn Leu Tyr Arg Ala Ser
210 215 220
Phe Ile Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Glu Glu Ala Glu Ile Phe
225 230 235 240
Ser Ser Arg Tyr Leu Lys Glu Ala Val Gln Lys Ile Pro Val Ser Ser
245 250 255
Leu Ser Gln Glu Ile Asp Tyr Thr Leu Glu Tyr Gly Trp His Thr Asn
260 265 270
Met Pro Arg Leu Glu Thr Arg Asn Tyr Leu Asp Val Phe Gly His Pro
275 280 285
Thr Ser Pro Trp Leu Lys Lys Lys Arg Thr Gln Tyr Leu Asp Ser Glu
290 295 300
Lys Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn Ile Phe His Ser Leu
305 310 315 320
Gln Gln Lys Glu Leu Gln Tyr Leu Ser Arg Trp Trp Ile His Ser Gly
325 330 335
Leu Pro Glu Leu Thr Phe Gly Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr
340 345 350
Leu Ser Ser Cys Ile Ala Thr Glu Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu
355 360 365
Gly Phe Ala Lys Thr Cys His Leu Ile Thr Val Leu Asp Asp Ile Tyr
370 375 380
Asp Thr Phe Gly Thr Met Asp Glu Ile Glu Leu Phe Asn Glu Ala Val
385 390 395 400
Arg Arg Trp Asn Pro Ser Glu Lys Glu Arg Leu Pro Glu Tyr Met Lys
405 410 415
Glu Ile Tyr Met Ala Leu Tyr Glu Ala Leu Thr Asp Met Ala Arg Glu
420 425 430
Ala Glu Lys Thr Gln Gly Arg Asp Thr Leu Asn Tyr Ala Arg Lys Ala
435 440 445
Trp Glu Val Tyr Leu Asp Ser Tyr Thr Gln Glu Ala Lys Trp Ile Ala
450 455 460
Ser Gly Tyr Leu Pro Thr Phe Glu Glu Tyr Leu Glu Asn Ala Lys Val
465 470 475 480
Ser Ser Gly His Arg Ala Ala Ala Leu Thr Pro Leu Leu Thr Leu Asp
485 490 495
Val Pro Leu Pro Asp Asp Val Leu Lys Gly Ile Asp Phe Pro Ser Arg
500 505 510
Phe Asn Asp Leu Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg
515 520 525
Cys Tyr Lys Ala Asp Arg Asp Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ser Ile Ser
530 535 540
Cys Tyr Met Lys Asp Asn Pro Gly Leu Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn
545 550 555 560
His Ile Asn Ala Met Ile Asn Asp Ile Ile Lys Glu Leu Asn Trp Glu
565 570 575
Leu Leu Lys Pro Asp Ser Asn Ile Pro Met Thr Ala Arg Lys His Ala
580 585 590
Tyr Glu Ile Thr Arg Ala Phe His Gln Leu Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly
595 600 605
Phe Ser Val Ala Thr Gln Glu Thr Lys Ser Leu Val Arg Arg Thr Val
610 615 620
Leu Glu Pro Val Pro Leu
625 630
<210> 4
<211> 574
<212> PRT
<213> 青蒿
<400> 4
Met Ser Thr Leu Pro Ile Ser Ser Val Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser
1 5 10 15
Pro Leu Val Val Asp Asp Lys Val Ser Thr Lys Pro Asp Val Ile Arg
20 25 30
His Thr Met Asn Phe Asn Ala Ser Ile Trp Gly Asp Gln Phe Leu Thr
35 40 45
Tyr Asp Glu Pro Glu Asp Leu Val Met Lys Lys Gln Leu Val Glu Glu
50 55 60
Leu Lys Glu Glu Val Lys Lys Glu Leu Ile Thr Ile Lys Gly Ser Asn
65 70 75 80
Glu Pro Met Gln His Val Lys Leu Ile Glu Leu Ile Asp Ala Val Gln
85 90 95
Arg Leu Gly Ile Ala Tyr His Phe Glu Glu Glu Ile Glu Glu Ala Leu
100 105 110
Gln His Ile His Val Thr Tyr Gly Glu Gln Trp Val Asp Lys Glu Asn
115 120 125
Leu Gln Ser Ile Ser Leu Trp Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly Phe
130 135 140
Asn Val Ser Ser Gly Val Phe Lys Asp Phe Met Asp Glu Lys Gly Lys
145 150 155 160
Phe Lys Glu Ser Leu Cys Asn Asp Ala Gln Gly Ile Leu Ala Leu Tyr
165 170 175
Glu Ala Ala Phe Met Arg Val Glu Asp Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ala
180 185 190
Leu Glu Phe Thr Lys Val His Leu Asp Ile Ile Ala Lys Asp Pro Ser
195 200 205
Cys Asp Ser Ser Leu Arg Thr Gln Ile His Gln Ala Leu Lys Gln Pro
210 215 220
Leu Arg Arg Arg Leu Ala Arg Ile Glu Ala Leu His Tyr Met Pro Ile
225 230 235 240
Tyr Gln Gln Glu Thr Ser His Asp Glu Val Leu Leu Lys Leu Ala Lys
245 250 255
Leu Asp Phe Ser Val Leu Gln Ser Met His Lys Lys Glu Leu Ser His
260 265 270
Ile Cys Lys Trp Trp Lys Asp Leu Asp Leu Gln Asn Lys Leu Pro Tyr
275 280 285
Val Arg Asp Arg Val Val Glu Gly Tyr Phe Trp Ile Leu Ser Ile Tyr
290 295 300
Tyr Glu Pro Gln His Ala Arg Thr Arg Met Phe Leu Met Lys Thr Cys
305 310 315 320
Met Trp Leu Val Val Leu Asp Asp Thr Phe Asp Asn Tyr Gly Thr Tyr
325 330 335
Glu Glu Leu Glu Ile Phe Thr Gln Ala Val Glu Arg Trp Ser Ile Ser
340 345 350
Cys Leu Asp Met Leu Pro Glu Tyr Met Lys Leu Ile Tyr Gln Glu Leu
355 360 365
Val Asn Leu His Val Glu Met Glu Glu Ser Leu Glu Lys Glu Gly Lys
370 375 380
Thr Tyr Gln Ile His Tyr Val Lys Glu Met Ala Lys Glu Leu Val Arg
385 390 395 400
Asn Tyr Leu Val Glu Ala Arg Trp Leu Lys Glu Gly Tyr Met Pro Thr
405 410 415
Leu Glu Glu Tyr Met Ser Val Ser Met Val Thr Gly Thr Tyr Gly Leu
420 425 430
Met Ile Ala Arg Ser Tyr Val Gly Arg Gly Asp Ile Val Thr Glu Asp
435 440 445
Thr Phe Lys Trp Val Ser Ser Tyr Pro Pro Ile Ile Lys Ala Ser Cys
450 455 460
Val Ile Val Arg Leu Met Asp Asp Ile Val Ser His Lys Glu Glu Gln
465 470 475 480
Glu Arg Gly His Val Ala Ser Ser Ile Glu Cys Tyr Ser Lys Glu Ser
485 490 495
Gly Ala Ser Glu Glu Glu Ala Cys Glu Tyr Ile Ser Arg Lys Val Glu
500 505 510
Asp Ala Trp Lys Val Ile Asn Arg Glu Ser Leu Arg Pro Thr Ala Val
515 520 525
Pro Phe Pro Leu Leu Met Pro Ala Ile Asn Leu Ala Arg Met Cys Glu
530 535 540
Val Leu Tyr Ser Val Asn Asp Gly Phe Thr His Ala Glu Gly Asp Met
545 550 555 560
Lys Ser Tyr Met Lys Ser Phe Phe Val His Pro Met Val Val
565 570
<210> 5
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 连接子
<400> 5
agctggcatg cagagtttaa acccagggcg cgccacgcgt ccttcaattg ccgcgatcgt 60
taattaaccg ccacctaggc ctctgcggcc gcactagtc 99
<210> 6
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 连接子
<400> 6
gatcgactag tgcggccgca gaggcctagg tggcggttaa ttaacgatcg cggcaattga 60
aggacgcgtg gcgcgccctg ggtttaaact ctgcatgcc 99
<210> 7
<211> 964
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 嘌呤霉素抗性的DNA片段
<400> 7
gcatgcatct tctattttca tcttaatttt atatattaaa ggctaatttt tcaatatttt 60
atcgcaaact attgtgttaa ttacatcaaa tatataaact tttctattta aagctaatga 120
aaaagtgaat atatacacat agagtaatgt tatgatgtat atatcaaaaa aataggagtg 180
attcctatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtcccccgg 240
gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgac 300
ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg 360
ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg 420
ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg 480
agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc 540
aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt 600
ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc 660
ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc 720
accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt 780
gcctgagtta attactaatt tattattaat ttattattag attgggcaaa atagtaaaag 840
aaaactaaag gaaacctaat atggtttcct ttttttatat atttttaaaa attgattata 900
ttatatgtaa acaattataa ttaatgttaa tcgaattcaa tttttattta ataaacggcg 960
cgcc 964
<210> 8
<211> 2918
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 编码IDI-IspS的DNA片段
<400> 8
ttaattaaat gatttttaaa aaaatacatg aattcatcta gcggagaaca caaaagattt 60
aagtaccttc taaacgaatg agatttcatt gggaaagtgg acacttaaga acgacgcggt 120
acttgattta ttgagtgcaa aagcactcga ttaggtgacc agtcccaaag tgattttaat 180
aaattaagga ggaaattaaa atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat 240
ctagttacgc caaattagtg caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg 300
aaattattcc attacaacaa agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa 360
gcggagaaac atgtttttct ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt 420
gtattgtttt ggattgggac gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt 480
taatggaaaa tattgaaaag ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg 540
aacaaggtga attactttta caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt 600
ggactaacac atgctgctct catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta 660
agctagacga taagattaag ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat 720
taggtattcc agaagatgaa actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc 780
attacatggc accaagcaat gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt 840
ataagatcaa cgctaaagaa aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact 900
tcaaatgggt ttcaccaaat gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta 960
cgccttggtt taagattatt tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg 1020
acctttctga agtggaaaat gacaggcaaa ttcatagaat gctataaaca aattagttaa 1080
aaggtctaaa gatggaagcc agacggtctg ccaattatga accaaatagc tgggattatg 1140
attttttgct gtcttcagac actgacgaat cgattgaagt atacaaagac aaggccaaaa 1200
agctggaggc tgaggtgaga agagagatta acaatgaaaa ggcagagttt ttgactctgc 1260
ttgaactgat agataatgtc caaaggttag gattgggtta ccggttcgag agtgacataa 1320
ggagagccct cgacagattt gtttcttcag gaggatttga tggtgttaca aaaactagcc 1380
ttcatgctac tgctcttagc ttcaggcttc tcagacagca tggctttgag gtctctcaag 1440
aagcgttcag tggattcaag gatcaaaatg gcaatttctt ggaaaacctt aaggaggaca 1500
ccaaggcaat actaagccta tatgaagctt catttcttgc attagaagga gaaaatatct 1560
tggatgaggc cagggtgttt gcaatatcac atctaaaaga gctcagcgaa gaaaagattg 1620
gaaaagagct ggccgaacag gtgaatcatg cattggagct tccattgcat cgcaggacgc 1680
aaagactaga agctgtttgg agtattgaag cataccgtaa aaaggaagat gcaaatcaag 1740
tactgctaga acttgctata ttggactaca acatgattca atcagtatac caaagagatc 1800
ttcgcgagac atcaaggtgg tggaggcgag tgggtcttgc aacaaagttg cattttgcta 1860
aagacaggtt aattgaaagc ttttactggg cagttggagt tgcgttcgaa cctcaataca 1920
gtgattgccg taattcagta gcaaaaatgt tttcatttgt aacaatcatt gatgatatct 1980
atgatgttta tggtactctg gatgagctgg agctatttac agatgctgtt gagagatggg 2040
atgttaacgc catcaatgat cttccggatt atatgaagct ctgcttccta gctctctaca 2100
acactatcaa tgagatagct tatgacaatc tgaaggacaa gggggaaaac attcttccat 2160
acctaacaaa agcgtgggca gatttatgca atgcattcct acaagaagca aaatggctgt 2220
acaataagtc cacaccaaca tttgatgact atttcggaaa tgcatggaaa tcatcctcag 2280
ggcctcttca actaattttt gcctactttg ccgtggttca aaacatcaag aaagaggaaa 2340
ttgaaaactt acaaaagtat catgatatca tcagtaggcc ttcccacatc tttcgtcttt 2400
gcaacgacct ggcttcagca tcggctgaga tagcgagagg tgaaactgcg aattccgtat 2460
cctgctacat gcgtacaaaa ggcatttctg aggaacttgc tactgaatcc gtaatgaatt 2520
tgatcgacga aacctgtaaa aagatgaaca aagaaaagct tggtggctct ttgtttgcaa 2580
aaccttttgt cgaaacagct attaaccttg cacggcaatc ccattgcact tatcataacg 2640
gagatgcgca tacttcacca gacgagctaa ctaggaaacg tgtcctgtca gtaatcacag 2700
agcctattct accctttgag agataaactc aataaattaa acaacttaaa acagagcagg 2760
ccttcgggcc tgctttttct ttctttcccg agtcccgcct cgggagggcg gtgtcctttc 2820
cgccccgaat tgcgcatcgg gagcacgcgg tccttttcgc tcgctttgct ctctcaagag 2880
gactaattta caaaattaca tattgagagc gcggccgc 2918
<210> 9
<211> 11613
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 载体 pAC:Pmcr-IDI-IspS
<400> 9
gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60
gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120
ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180
tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240
aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300
ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360
ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420
ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480
gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540
acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600
ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660
aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720
actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780
ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840
agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900
agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960
tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020
gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080
tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140
gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200
agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260
tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320
cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380
aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440
atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500
atgtttgaca gcttatcatc gataagcttg catgcatctt ctattttcat cttaatttta 1560
tatattaaag gctaattttt caatatttta tcgcaaacta ttgtgttaat tacatcaaat 1620
atataaactt ttctatttaa agctaatgaa aaagtgaata tatacacata gagtaatgtt 1680
atgatgtata tatcaaaaaa ataggagtga ttcctatgac cgagtacaag cccacggtgc 1740
gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg 1800
actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc 1860
tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg 1920
acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg 1980
ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga 2040
tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg 2100
gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg 2160
aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc 2220
ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc 2280
gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagttaa ttactaattt attattaatt 2340
tattattaga ttgggcaaaa tagtaaaaga aaactaaagg aaacctaata tggtttcctt 2400
tttttatata tttttaaaaa ttgattatat tatatgtaaa caattataat taatgttaat 2460
cgaattcaat ttttatttaa taaacggcgc gccacgcgtc cttcaattgc cgcgatcgtt 2520
aattaaatga tttttaaaaa aatacatgaa ttcatctagc ggagaacaca aaagatttaa 2580
gtaccttcta aacgaatgag atttcattgg gaaagtggac acttaagaac gacgcggtac 2640
ttgatttatt gagtgcaaaa gcactcgatt aggtgaccag tcccaaagtg attttaataa 2700
attaaggagg aaattaaaat gactgccgac aacaatagta tgccccatgg tgcagtatct 2760
agttacgcca aattagtgca aaaccaaaca cctgaagaca ttttggaaga gtttcctgaa 2820
attattccat tacaacaaag acctaatacc cgatctagtg agacgtcaaa tgacgaaagc 2880
ggagaaacat gtttttctgg tcatgatgag gagcaaatta agttaatgaa tgaaaattgt 2940
attgttttgg attgggacga taatgctatt ggtgccggta ccaagaaagt ttgtcattta 3000
atggaaaata ttgaaaaggg tttactacat cgtgcattct ccgtctttat tttcaatgaa 3060
caaggtgaat tacttttaca acaaagagcc actgaaaaaa taactttccc tgatctttgg 3120
actaacacat gctgctctca tccactatgt attgatgacg aattaggttt gaagggtaag 3180
ctagacgata agattaaggg cgctattact gcggcggtga gaaaactaga tcatgaatta 3240
ggtattccag aagatgaaac taagacaagg ggtaagtttc actttttaaa cagaatccat 3300
tacatggcac caagcaatga accatggggt gaacatgaaa ttgattacat cctattttat 3360
aagatcaacg ctaaagaaaa cttgactgtc aacccaaacg tcaatgaagt tagagacttc 3420
aaatgggttt caccaaatga tttgaaaact atgtttgctg acccaagtta caagtttacg 3480
ccttggttta agattatttg cgagaattac ttattcaact ggtgggagca attagatgac 3540
ctttctgaag tggaaaatga caggcaaatt catagaatgc tataaacaaa ttagttaaaa 3600
ggtctaaaga tggaagccag acggtctgcc aattatgaac caaatagctg ggattatgat 3660
tttttgctgt cttcagacac tgacgaatcg attgaagtat acaaagacaa ggccaaaaag 3720
ctggaggctg aggtgagaag agagattaac aatgaaaagg cagagttttt gactctgctt 3780
gaactgatag ataatgtcca aaggttagga ttgggttacc ggttcgagag tgacataagg 3840
agagccctcg acagatttgt ttcttcagga ggatttgatg gtgttacaaa aactagcctt 3900
catgctactg ctcttagctt caggcttctc agacagcatg gctttgaggt ctctcaagaa 3960
gcgttcagtg gattcaagga tcaaaatggc aatttcttgg aaaaccttaa ggaggacacc 4020
aaggcaatac taagcctata tgaagcttca tttcttgcat tagaaggaga aaatatcttg 4080
gatgaggcca gggtgtttgc aatatcacat ctaaaagagc tcagcgaaga aaagattgga 4140
aaagagctgg ccgaacaggt gaatcatgca ttggagcttc cattgcatcg caggacgcaa 4200
agactagaag ctgtttggag tattgaagca taccgtaaaa aggaagatgc aaatcaagta 4260
ctgctagaac ttgctatatt ggactacaac atgattcaat cagtatacca aagagatctt 4320
cgcgagacat caaggtggtg gaggcgagtg ggtcttgcaa caaagttgca ttttgctaaa 4380
gacaggttaa ttgaaagctt ttactgggca gttggagttg cgttcgaacc tcaatacagt 4440
gattgccgta attcagtagc aaaaatgttt tcatttgtaa caatcattga tgatatctat 4500
gatgtttatg gtactctgga tgagctggag ctatttacag atgctgttga gagatgggat 4560
gttaacgcca tcaatgatct tccggattat atgaagctct gcttcctagc tctctacaac 4620
actatcaatg agatagctta tgacaatctg aaggacaagg gggaaaacat tcttccatac 4680
ctaacaaaag cgtgggcaga tttatgcaat gcattcctac aagaagcaaa atggctgtac 4740
aataagtcca caccaacatt tgatgactat ttcggaaatg catggaaatc atcctcaggg 4800
cctcttcaac taatttttgc ctactttgcc gtggttcaaa acatcaagaa agaggaaatt 4860
gaaaacttac aaaagtatca tgatatcatc agtaggcctt cccacatctt tcgtctttgc 4920
aacgacctgg cttcagcatc ggctgagata gcgagaggtg aaactgcgaa ttccgtatcc 4980
tgctacatgc gtacaaaagg catttctgag gaacttgcta ctgaatccgt aatgaatttg 5040
atcgacgaaa cctgtaaaaa gatgaacaaa gaaaagcttg gtggctcttt gtttgcaaaa 5100
ccttttgtcg aaacagctat taaccttgca cggcaatccc attgcactta tcataacgga 5160
gatgcgcata cttcaccaga cgagctaact aggaaacgtg tcctgtcagt aatcacagag 5220
cctattctac cctttgagag ataaactcaa taaattaaac aacttaaaac agagcaggcc 5280
ttcgggcctg ctttttcttt ctttcccgag tcccgcctcg ggagggcggt gtcctttccg 5340
ccccgaattg cgcatcggga gcacgcggtc cttttcgctc gctttgctct ctcaagagga 5400
ctaatttaca aaattacata ttgagagcgc ggccgcacta gtaagttata gaaatgtcat 5460
ccgataccga aaaagaaaac ggaataaatc agtaacaaat caaaaaaaca aaactataac 5520
atttaatctt cgtaaaatca atatcaatcg accatacaca aaacatgttc aaataaaata 5580
catgggtgta catatgtcaa ccgacattga aaaagaaaac ggaataaatc agtaacaaat 5640
caaaaaaaca aaaccataac atttctataa cattccatag agtaaaaatc aacatcgaat 5700
aaccttacac aaaccataca taaaccatac ataaaaatac acatatgtca accgttaccg 5760
taaaaagatt acttaaataa ttttatactc acctcttatt ttttgtgttt tttattatcc 5820
agggcaacct ttcccaggga gaaattcttc cttgcagttg caggcaagaa ccaggacttt 5880
cttccagggc atactttccc agggagaaat tcttccttgc agctgcaggc aagaaccagg 5940
actttccccc aggaccagga cctcaaggtc tgcatccaga ggaagacctt cccagggcgc 6000
caagatcccg cagattatgg aacattattt cccgggaaat aattcagggc ttaatgccca 6060
actgaggaat acattttaaa taagcttctc ttagttcatc cttttctatg tggtcgtaca 6120
cgtctattgc ttcgcctctc gaatctcccc ttaattcctg aatgaatgtc ctttccatac 6180
ctgaacgtcg aagccatgta gtgaaccaat gccggcagca atgcggagta aaatgttctt 6240
caagtctccc ctcggggtta tggagtccga tagaggaagc ggcagatgtg acaatatcgt 6300
acactaaatt tctttgtaca cggtgaccgt tttgtctgcc tatgaataat gctttttctt 6360
tatcatgcct cgtgttaagg tacgcttcca ggaaggcctt agtctcaagg tcaaagaata 6420
cgatacgatt tgacctttta gctgtcttct tgagtctcac cgtacacttt tccagatcta 6480
tgtcagctcg atcaagagta attaattcat ttctcctgat gccagtttta gctaaaaaga 6540
ttatcaatgc ttgatacatg gggtaacgtg gtactttgac aagctttgcc atgtcttcaa 6600
tggtaatcaa ttgccttgtt tccggagtat ggtatttttt gtagcttctt agatagcgtt 6660
ttctgaacgt gggaatgttg tttctctcga ttatatgctt gaattcaagg aagtcaaaaa 6720
aggtactcag tgaagcaaag taattgttac aggttgcgag tgtgtactgc ctttcatctc 6780
ttatgtgaac aaggaaccct tcaagctccg gaaaccctgc attcactcca cacatttgaa 6840
ggaaaaactt agcatgactt acgtatcctt ctattgttct tttagagtaa ccccttccga 6900
tacaatcaga agtgaataaa cttataagtc tttcattatc aagcggttca tagataccag 6960
ttagctgaat agctgccatt tcacccataa atcaataaaa gaagtatgta aataaatact 7020
ttgtgcatag atgtcattta aacacaaagt ataagtacat ctaccttctt ttagtatatg 7080
ctggtaacag caaaaaagcg ccaaacaacg catctttacc caatagaatg acgtcgatta 7140
aaagagtaag ttggtggtga gccttaaaaa aggtaaaaga gagcttactc ttaagttaaa 7200
aacggaattg gcaaacagta aggattgttc cagcagtcct tactaaaaac attactttat 7260
taattctata tagtcacaac attcacaaaa ataggctttt ttctcgattt ttccttttga 7320
atgtttataa agaaaaatca tatagcattt attacactgt ggacatattt tcttttcaat 7380
tttgcccctt ccaatttgtg gaagcctttt ttcagtaaca cgcttaggca taatgaaaga 7440
tcggtgtatt aagtattaac attttctaac ttgtgcaata ataattattc ggggttgtcg 7500
aagaacttcc aaacagtaga ccgatccatt ttccacatta ttctaatgaa gccaagactc 7560
aaggatgggg ggaaatatcc ccccacaccc cccaatgaga ctacccaaga cagcccgtat 7620
gccgacagcg acacagttaa atatcaatgt gtattaatac atatcaacaa gtatcaacac 7680
acacaattaa acaataatac acatcaatgg agaacaatac acatgccaac acaagaatac 7740
acacggacaa acattacatt accagaacat gttagagcaa tgattaaaga gtacaataaa 7800
agaagtacat ggggagacct caacgtatca gcagtatgct ctaatgcaat agcagacaga 7860
attagagcta cattcccaaa attagaaaaa gaactatttc cagaacaatt tccagaactt 7920
aacccaaaaa tgacaaaaac cagctcacca ggacaaccag aaataacaca aaaaggaaaa 7980
tccaaacaag gagactctaa agatagaata tgcgcttatt gtggccaacc ttttgaaccg 8040
aaatcgcata atcaaaaatt ctgtaaagat gcatgtaagt cagcaaatta tagaaaaaac 8100
aaaaaaacac agagttaaac ccattaacca cactcttttt ttgaatttat ctgcatttca 8160
cggtactttt tatccaagaa agcccacaaa tcacgctctt taaacggttt catggaaaaa 8220
ttttcccgga atgcattaat taacatcttt tcaattttag ggttgaaata agccccataa 8280
cggtaatctg gcgaccaatc tgaagcttta acctcttcat aagtccgata cggcacatta 8340
cccggaagaa gcccaggaac cacaagcaga taatagatat agcaccttat acacatatgt 8400
gattttttag tagtctttaa ccattcaata tatgaaagat ccgcacctgt tcgataatcc 8460
tcaaaaagaa ttaagttcct ttgcctccga gatccacaca cacagcaata cttcaattcc 8520
ataatacata acaccccgaa ataataagac atctgaaaaa ccgtatcact ttaggcttta 8580
agcatcttat ccggaccttc gagcccaaaa gccttgttga acgtggcatc tcaatcaccc 8640
ccaaacatca tggagcgtga ttttaagctt gtaaatagct cttcataatt aatttcggaa 8700
gccttttgca agctgttaga aggcatttca ggcgattctt caattataca gccatcatgc 8760
tcccattgat gagagtcaac caccaggaag ccggcagggg gatcaggaag cccttctaag 8820
aaccataccc gaagaagact cccggcaggt tcaagcttca aaaactccgg taattcatcc 8880
actttgaagg gagaagccca taatttacgc cattttttag gaactttgtt tttgccatct 8940
cgccctttta ggttatgata aaaattattt cttgcaatta attgttgcaa gtaatcggca 9000
tattcaggtt taaccgcttt agcttccttc aaataagcat gtagagcctg tcttccaccc 9060
gaaaaatgat cccgaagctt tgttaacggt atccatccag tatcatcgtt ttcctgtcct 9120
tcccacttca actctccatt ataaacgagt tttacttctc gaccttcatt gattaaatta 9180
aggacttcgg ttctggtatc tatcaattgc tcaaatgtca gctttccgga ggaacttaca 9240
actttatcag gatgccaccg gaacaaagca ccaaagcgag attctatatg gatattaccg 9300
tatctgttat ccgtgagctg cccaacgtga gaataaagat aagtcacctg cttgtaaata 9360
tccataaggc tccgcaattc ccattgcctt ttaccattga ctttatgaga aagcctctga 9420
ataaatatat catattcatc actcttgcat ctctttttac tcttcggatt ctttccagtt 9480
atacgaatgt ttccagggaa aatgaaaaaa tgaaaatgag gagcaaggat aaggcagtca 9540
taaatagagt ttatttcgat atttagcaag tccgcgatct tgtttaaatt gccttcgttg 9600
tggtcgtctc ttatgtaatt ccaaaaagct tcggagtcgt cattaccttt taaacctgtt 9660
aacttacgga tagcccgagt tatttccggc ttaatcctgt aagggtgaaa gattgtagta 9720
ccagcagtta cgccccagcg ttccagcctg tcctttaaat tcctccggaa aagtcggatt 9780
gcttccacag atactccccg gctaaagtcc atcgaagcaa acccccatga aggaaactgc 9840
ccagaaaaca gggcataagt ccacaaaatt acaactaatg caaatctatg ttgcaattcc 9900
gataggatgc cgcaaccagg acaagaaagt gtattgcagt gagaattaag atcctttcgt 9960
gcattataat tttcagatac agcataagtg aaaggacgcc cacagtaagc gggtcttttt 10020
ccctttgctg gaagaacaaa gtcgccaact tttagaggac gatacttaga gcatttagaa 10080
aaatcgaagt caggacaaga gtagtattta cagatagaaa ccccgttctt tttgttgcga 10140
accgggcaca aaacaccatc ggtacatata cacgtcgcaa aatctctaca ctctggagca 10200
taggaaacgg cgccaggtct agaactaaaa tcagaactca gagaacattt cctgtcgaaa 10260
atttaaaccg taaaccaaag ataacaattt tcataatatt acagaaccta tattttttgt 10320
aactcgacat tacaaaaatg taccacaaaa cataaaaaca ttttcataga agaaatattc 10380
acaaacaata gaaaaaaatt ataagaataa gattaacgcc taccttatta aaagaaggtg 10440
tcgagtcttc aggttccatc aaggcaggcg ttgatattct atatatgtta cacataacat 10500
atataacata cgtacctcag aacattcaga cctgaatgct ctaaaatgaa ataagcttta 10560
aactttataa attcatctgc tataaatagt tttagagata tagaaagccc aaggaagaaa 10620
aagaatagca aaaataaaaa agaaaaacgg cccgcgacgg caaacccgga gacttataat 10680
caaagtaaga cgaaaaggaa gccgacaacg atttgataat aacaaatcat cttttatttt 10740
ggcaatattc atatgatata tgaagaaatc aacatcaagc ggattagtat ttttgctatt 10800
tgtaaatcaa tatcgggtga gacagtatat caaaaacaaa cttcattttt ttcgaacaaa 10860
aaaatcacta tcaaatgaca ttgtagtaag aaactacatc aaaactagtt gatcatatcg 10920
tcaattatta cctccacggg gagagcctga gcaaactggc ctcaggcatt tgagaagcac 10980
acggtcacac tgcttccggt agtcaataaa ccggtaaacc agcaatagac ataagcggct 11040
atttaacgac cctgccctga accgacgacc gggtcgaatt tgctttcgaa tttctgccat 11100
tcatccgctt attatcactt attcaggcgt agcaccaggc gtttaagggc accaataact 11160
gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca ctcatcgcag tactgttgta attcattaag 11220
cattctgccg acatggaagc catcacagac ggcatgatga acctgaatcg ccagcggcat 11280
cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg cgaagaagtt 11340
gtccatattg gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc acccagggat tggctgagac 11400
gaaaaacata ttctcaataa accctttagg gaaataggcc aggttttcac cgtaacacgc 11460
cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg ccggaaatcg tcgtggtatt cactccagag 11520
cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa cactatccca 11580
tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acg 11613
<210> 10
<211> 8728
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 载体pAC:Pur
<400> 10
gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60
gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120
ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180
tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240
aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300
ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360
ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420
ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480
gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540
acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600
ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660
aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720
actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780
ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840
agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900
agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960
tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020
gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080
tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140
gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200
agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260
tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320
cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380
aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440
atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500
atgtttgaca gcttatcatc gataagcttg catgcatctt ctattttcat cttaatttta 1560
tatattaaag gctaattttt caatatttta tcgcaaacta ttgtgttaat tacatcaaat 1620
atataaactt ttctatttaa agctaatgaa aaagtgaata tatacacata gagtaatgtt 1680
atgatgtata tatcaaaaaa ataggagtga ttcctatgac cgagtacaag cccacggtgc 1740
gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg 1800
actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc 1860
tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg 1920
acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg 1980
ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga 2040
tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg 2100
gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg 2160
aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc 2220
ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc 2280
gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagttaa ttactaattt attattaatt 2340
tattattaga ttgggcaaaa tagtaaaaga aaactaaagg aaacctaata tggtttcctt 2400
tttttatata tttttaaaaa ttgattatat tatatgtaaa caattataat taatgttaat 2460
cgaattcaat ttttatttaa taaacggcgc gccacgcgtc cttcaattgc cgcgatcgtt 2520
aattaaccgc cacctaggcc tctgcggccg cactagtaag ttatagaaat gtcatccgat 2580
accgaaaaag aaaacggaat aaatcagtaa caaatcaaaa aaacaaaact ataacattta 2640
atcttcgtaa aatcaatatc aatcgaccat acacaaaaca tgttcaaata aaatacatgg 2700
gtgtacatat gtcaaccgac attgaaaaag aaaacggaat aaatcagtaa caaatcaaaa 2760
aaacaaaacc ataacatttc tataacattc catagagtaa aaatcaacat cgaataacct 2820
tacacaaacc atacataaac catacataaa aatacacata tgtcaaccgt taccgtaaaa 2880
agattactta aataatttta tactcacctc ttattttttg tgttttttat tatccagggc 2940
aacctttccc agggagaaat tcttccttgc agttgcaggc aagaaccagg actttcttcc 3000
agggcatact ttcccaggga gaaattcttc cttgcagctg caggcaagaa ccaggacttt 3060
cccccaggac caggacctca aggtctgcat ccagaggaag accttcccag ggcgccaaga 3120
tcccgcagat tatggaacat tatttcccgg gaaataattc agggcttaat gcccaactga 3180
ggaatacatt ttaaataagc ttctcttagt tcatcctttt ctatgtggtc gtacacgtct 3240
attgcttcgc ctctcgaatc tccccttaat tcctgaatga atgtcctttc catacctgaa 3300
cgtcgaagcc atgtagtgaa ccaatgccgg cagcaatgcg gagtaaaatg ttcttcaagt 3360
ctcccctcgg ggttatggag tccgatagag gaagcggcag atgtgacaat atcgtacact 3420
aaatttcttt gtacacggtg accgttttgt ctgcctatga ataatgcttt ttctttatca 3480
tgcctcgtgt taaggtacgc ttccaggaag gccttagtct caaggtcaaa gaatacgata 3540
cgatttgacc ttttagctgt cttcttgagt ctcaccgtac acttttccag atctatgtca 3600
gctcgatcaa gagtaattaa ttcatttctc ctgatgccag ttttagctaa aaagattatc 3660
aatgcttgat acatggggta acgtggtact ttgacaagct ttgccatgtc ttcaatggta 3720
atcaattgcc ttgtttccgg agtatggtat tttttgtagc ttcttagata gcgttttctg 3780
aacgtgggaa tgttgtttct ctcgattata tgcttgaatt caaggaagtc aaaaaaggta 3840
ctcagtgaag caaagtaatt gttacaggtt gcgagtgtgt actgcctttc atctcttatg 3900
tgaacaagga acccttcaag ctccggaaac cctgcattca ctccacacat ttgaaggaaa 3960
aacttagcat gacttacgta tccttctatt gttcttttag agtaacccct tccgatacaa 4020
tcagaagtga ataaacttat aagtctttca ttatcaagcg gttcatagat accagttagc 4080
tgaatagctg ccatttcacc cataaatcaa taaaagaagt atgtaaataa atactttgtg 4140
catagatgtc atttaaacac aaagtataag tacatctacc ttcttttagt atatgctggt 4200
aacagcaaaa aagcgccaaa caacgcatct ttacccaata gaatgacgtc gattaaaaga 4260
gtaagttggt ggtgagcctt aaaaaaggta aaagagagct tactcttaag ttaaaaacgg 4320
aattggcaaa cagtaaggat tgttccagca gtccttacta aaaacattac tttattaatt 4380
ctatatagtc acaacattca caaaaatagg cttttttctc gatttttcct tttgaatgtt 4440
tataaagaaa aatcatatag catttattac actgtggaca tattttcttt tcaattttgc 4500
cccttccaat ttgtggaagc cttttttcag taacacgctt aggcataatg aaagatcggt 4560
gtattaagta ttaacatttt ctaacttgtg caataataat tattcggggt tgtcgaagaa 4620
cttccaaaca gtagaccgat ccattttcca cattattcta atgaagccaa gactcaagga 4680
tggggggaaa tatcccccca caccccccaa tgagactacc caagacagcc cgtatgccga 4740
cagcgacaca gttaaatatc aatgtgtatt aatacatatc aacaagtatc aacacacaca 4800
attaaacaat aatacacatc aatggagaac aatacacatg ccaacacaag aatacacacg 4860
gacaaacatt acattaccag aacatgttag agcaatgatt aaagagtaca ataaaagaag 4920
tacatgggga gacctcaacg tatcagcagt atgctctaat gcaatagcag acagaattag 4980
agctacattc ccaaaattag aaaaagaact atttccagaa caatttccag aacttaaccc 5040
aaaaatgaca aaaaccagct caccaggaca accagaaata acacaaaaag gaaaatccaa 5100
acaaggagac tctaaagata gaatatgcgc ttattgtggc caaccttttg aaccgaaatc 5160
gcataatcaa aaattctgta aagatgcatg taagtcagca aattatagaa aaaacaaaaa 5220
aacacagagt taaacccatt aaccacactc tttttttgaa tttatctgca tttcacggta 5280
ctttttatcc aagaaagccc acaaatcacg ctctttaaac ggtttcatgg aaaaattttc 5340
ccggaatgca ttaattaaca tcttttcaat tttagggttg aaataagccc cataacggta 5400
atctggcgac caatctgaag ctttaacctc ttcataagtc cgatacggca cattacccgg 5460
aagaagccca ggaaccacaa gcagataata gatatagcac cttatacaca tatgtgattt 5520
tttagtagtc tttaaccatt caatatatga aagatccgca cctgttcgat aatcctcaaa 5580
aagaattaag ttcctttgcc tccgagatcc acacacacag caatacttca attccataat 5640
acataacacc ccgaaataat aagacatctg aaaaaccgta tcactttagg ctttaagcat 5700
cttatccgga ccttcgagcc caaaagcctt gttgaacgtg gcatctcaat cacccccaaa 5760
catcatggag cgtgatttta agcttgtaaa tagctcttca taattaattt cggaagcctt 5820
ttgcaagctg ttagaaggca tttcaggcga ttcttcaatt atacagccat catgctccca 5880
ttgatgagag tcaaccacca ggaagccggc agggggatca ggaagccctt ctaagaacca 5940
tacccgaaga agactcccgg caggttcaag cttcaaaaac tccggtaatt catccacttt 6000
gaagggagaa gcccataatt tacgccattt tttaggaact ttgtttttgc catctcgccc 6060
ttttaggtta tgataaaaat tatttcttgc aattaattgt tgcaagtaat cggcatattc 6120
aggtttaacc gctttagctt ccttcaaata agcatgtaga gcctgtcttc cacccgaaaa 6180
atgatcccga agctttgtta acggtatcca tccagtatca tcgttttcct gtccttccca 6240
cttcaactct ccattataaa cgagttttac ttctcgacct tcattgatta aattaaggac 6300
ttcggttctg gtatctatca attgctcaaa tgtcagcttt ccggaggaac ttacaacttt 6360
atcaggatgc caccggaaca aagcaccaaa gcgagattct atatggatat taccgtatct 6420
gttatccgtg agctgcccaa cgtgagaata aagataagtc acctgcttgt aaatatccat 6480
aaggctccgc aattcccatt gccttttacc attgacttta tgagaaagcc tctgaataaa 6540
tatatcatat tcatcactct tgcatctctt tttactcttc ggattctttc cagttatacg 6600
aatgtttcca gggaaaatga aaaaatgaaa atgaggagca aggataaggc agtcataaat 6660
agagtttatt tcgatattta gcaagtccgc gatcttgttt aaattgcctt cgttgtggtc 6720
gtctcttatg taattccaaa aagcttcgga gtcgtcatta ccttttaaac ctgttaactt 6780
acggatagcc cgagttattt ccggcttaat cctgtaaggg tgaaagattg tagtaccagc 6840
agttacgccc cagcgttcca gcctgtcctt taaattcctc cggaaaagtc ggattgcttc 6900
cacagatact ccccggctaa agtccatcga agcaaacccc catgaaggaa actgcccaga 6960
aaacagggca taagtccaca aaattacaac taatgcaaat ctatgttgca attccgatag 7020
gatgccgcaa ccaggacaag aaagtgtatt gcagtgagaa ttaagatcct ttcgtgcatt 7080
ataattttca gatacagcat aagtgaaagg acgcccacag taagcgggtc tttttccctt 7140
tgctggaaga acaaagtcgc caacttttag aggacgatac ttagagcatt tagaaaaatc 7200
gaagtcagga caagagtagt atttacagat agaaaccccg ttctttttgt tgcgaaccgg 7260
gcacaaaaca ccatcggtac atatacacgt cgcaaaatct ctacactctg gagcatagga 7320
aacggcgcca ggtctagaac taaaatcaga actcagagaa catttcctgt cgaaaattta 7380
aaccgtaaac caaagataac aattttcata atattacaga acctatattt tttgtaactc 7440
gacattacaa aaatgtacca caaaacataa aaacattttc atagaagaaa tattcacaaa 7500
caatagaaaa aaattataag aataagatta acgcctacct tattaaaaga aggtgtcgag 7560
tcttcaggtt ccatcaaggc aggcgttgat attctatata tgttacacat aacatatata 7620
acatacgtac ctcagaacat tcagacctga atgctctaaa atgaaataag ctttaaactt 7680
tataaattca tctgctataa atagttttag agatatagaa agcccaagga agaaaaagaa 7740
tagcaaaaat aaaaaagaaa aacggcccgc gacggcaaac ccggagactt ataatcaaag 7800
taagacgaaa aggaagccga caacgatttg ataataacaa atcatctttt attttggcaa 7860
tattcatatg atatatgaag aaatcaacat caagcggatt agtatttttg ctatttgtaa 7920
atcaatatcg ggtgagacag tatatcaaaa acaaacttca tttttttcga acaaaaaaat 7980
cactatcaaa tgacattgta gtaagaaact acatcaaaac tagttgatca tatcgtcaat 8040
tattacctcc acggggagag cctgagcaaa ctggcctcag gcatttgaga agcacacggt 8100
cacactgctt ccggtagtca ataaaccggt aaaccagcaa tagacataag cggctattta 8160
acgaccctgc cctgaaccga cgaccgggtc gaatttgctt tcgaatttct gccattcatc 8220
cgcttattat cacttattca ggcgtagcac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt 8280
aaaaaaatta cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc 8340
tgccgacatg gaagccatca cagacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca 8400
ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca 8460
tattggccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa 8520
acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat 8580
cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg 8640
aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca 8700
ccagctcacc gtctttcatt gccatacg 8728
<210> 11
<211> 3008
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 编码IDI-FnS的DNA片段
<400> 11
ttaattaaat gatttttaaa aaaatacatg aattcatcta gcggagaaca caaaagattt 60
aagtaccttc taaacgaatg agatttcatt gggaaagtgg acacttaaga acgacgcggt 120
acttgattta ttgagtgcaa aagcactcga ttaggtgacc agtcccaaag tgattttaat 180
aaattaagga ggaaattaaa atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat 240
ctagttacgc caaattagtg caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg 300
aaattattcc attacaacaa agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa 360
gcggagaaac atgtttttct ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt 420
gtattgtttt ggattgggac gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt 480
taatggaaaa tattgaaaag ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg 540
aacaaggtga attactttta caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt 600
ggactaacac atgctgctct catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta 660
agctagacga taagattaag ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat 720
taggtattcc agaagatgaa actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc 780
attacatggc accaagcaat gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt 840
ataagatcaa cgctaaagaa aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact 900
tcaaatgggt ttcaccaaat gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta 960
cgccttggtt taagattatt tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg 1020
acctttctga agtggaaaat gacaggcaaa ttcatagaat gctataaaca aattagttaa 1080
aaggactaaa gatgtcgact cttcctattt ctagtgtttc attctcttca tctacgtcac 1140
ctttggttgt tgacgataaa gttagcacga aaccagatgt tatccgccat accatgaatt 1200
tcaatgctag catatgggga gatcaatttc ttacatatga tgagccagaa gatttggtta 1260
tgaagaaaca acttgttgaa gagctcaaag aggaagtcaa gaaagagcta ataacgatca 1320
aaggttcaaa tgaaccgatg cagcatgtca agttgataga acttattgat gcagtccaac 1380
ggcttggcat agcctatcat tttgaagagg agattgaaga agccttgcaa catatccatg 1440
ttacatatgg cgagcagtgg gtcgataaag aaaacctaca aagcatttct ctttggttcc 1500
gactcctacg acaacaaggc ttcaacgtct catcaggagt attcaaggac tttatggacg 1560
agaagggaaa atttaaggaa tccttatgta atgatgctca gggaattctt gctctgtatg 1620
aagcggcatt tatgagggtg gaagatgaaa caatactaga taatgcgctc gagttcacta 1680
aagttcacct tgacatcata gccaaggatc cttcttgtga ctcttcccta agaacccaaa 1740
tacaccaagc gttaaagcag ccacttagga gaaggctggc aaggattgag gcgttgcatt 1800
acatgcctat ctaccaacaa gaaacatccc acgatgaggt cttactgaag cttgcaaaat 1860
tagattttag cgtgcttcag tcgatgcaca aaaaggaact tagccacatt tgcaaatggt 1920
ggaaggattt ggacctccaa aataagcttc cttatgttcg agacagggtg gtggaaggct 1980
atttttggat actatccatc tattacgagc ctcaacatgc tcgaacaaga atgttcctaa 2040
tgaaaacatg catgtggtta gtcgttttag atgatacatt tgataattat ggtacttatg 2100
aagaactcga aatctttaca caagctgttg aaagatggtc aataagctgc ctggatatgc 2160
ttccagaata catgaaacta atatatcaag agcttgtgaa tcttcacgtg gaaatggagg 2220
aatcacttga aaaggaggga aaaacatatc aaattcacta tgtcaaggag atggcaaaag 2280
agttggttcg caattacttg gtagaagcca gatggctaaa agaggggtac atgccaactc 2340
ttgaggagta catgtctgtg tcaatggtga ctggtaccta tggcttgatg atagcgagat 2400
cttatgtcgg caggggtgat atcgtcaccg aggatacctt taaatgggtg tcctcgtatc 2460
ctcctattat aaaagcttca tgtgtgattg taagacttat ggatgatatt gtcagccaca 2520
aggaggaaca agagagaggc catgttgctt caagcatcga atgctattct aaggaaagtg 2580
gtgcatcaga ggaggaagcg tgtgaatata tctcaagaaa agttgaagat gcatggaaag 2640
ttataaaccg agagtcgctc aggcctacag ctgtcccatt tcctctactt atgcctgcaa 2700
tcaaccttgc acgtatgtgt gaagtcctat atagcgtcaa cgatggcttc actcatgctg 2760
agggagacat gaaaagttac atgaaatcgt tcttcgttca ccctatggtt gtctaaactc 2820
aataaattaa acaacttaaa acagagcagg ccttcgggcc tgctttttct ttctttcccg 2880
agtcccgcct cgggagggcg gtgtcctttc cgccccgaat tgcgcatcgg gagcacgcgg 2940
tccttttcgc tcgctttgct ctctcaagag gactaattta caaaattaca tattgagagc 3000
gcggccgc 3008
<210> 12
<211> 4083
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 编码IDI-FnS-FPS的DNA片段
<400> 12
ttaattaaat gatttttaaa aaaatacatg aattcatcta gcggagaaca caaaagattt 60
aagtaccttc taaacgaatg agatttcatt gggaaagtgg acacttaaga acgacgcggt 120
acttgattta ttgagtgcaa aagcactcga ttaggtgacc agtcccaaag tgattttaat 180
aaattaagga ggaaattaaa atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat 240
ctagttacgc caaattagtg caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg 300
aaattattcc attacaacaa agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa 360
gcggagaaac atgtttttct ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt 420
gtattgtttt ggattgggac gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt 480
taatggaaaa tattgaaaag ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg 540
aacaaggtga attactttta caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt 600
ggactaacac atgctgctct catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta 660
agctagacga taagattaag ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat 720
taggtattcc agaagatgaa actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc 780
attacatggc accaagcaat gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt 840
ataagatcaa cgctaaagaa aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact 900
tcaaatgggt ttcaccaaat gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta 960
cgccttggtt taagattatt tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg 1020
acctttctga agtggaaaat gacaggcaaa ttcatagaat gctataaaca aattagttaa 1080
aaggactaaa gatgtcgact cttcctattt ctagtgtttc attctcttca tctacgtcac 1140
ctttggttgt tgacgataaa gttagcacga aaccagatgt tatccgccat accatgaatt 1200
tcaatgctag catatgggga gatcaatttc ttacatatga tgagccagaa gatttggtta 1260
tgaagaaaca acttgttgaa gagctcaaag aggaagtcaa gaaagagcta ataacgatca 1320
aaggttcaaa tgaaccgatg cagcatgtca agttgataga acttattgat gcagtccaac 1380
ggcttggcat agcctatcat tttgaagagg agattgaaga agccttgcaa catatccatg 1440
ttacatatgg cgagcagtgg gtcgataaag aaaacctaca aagcatttct ctttggttcc 1500
gactcctacg acaacaaggc ttcaacgtct catcaggagt attcaaggac tttatggacg 1560
agaagggaaa atttaaggaa tccttatgta atgatgctca gggaattctt gctctgtatg 1620
aagcggcatt tatgagggtg gaagatgaaa caatactaga taatgcgctc gagttcacta 1680
aagttcacct tgacatcata gccaaggatc cttcttgtga ctcttcccta agaacccaaa 1740
tacaccaagc gttaaagcag ccacttagga gaaggctggc aaggattgag gcgttgcatt 1800
acatgcctat ctaccaacaa gaaacatccc acgatgaggt cttactgaag cttgcaaaat 1860
tagattttag cgtgcttcag tcgatgcaca aaaaggaact tagccacatt tgcaaatggt 1920
ggaaggattt ggacctccaa aataagcttc cttatgttcg agacagggtg gtggaaggct 1980
atttttggat actatccatc tattacgagc ctcaacatgc tcgaacaaga atgttcctaa 2040
tgaaaacatg catgtggtta gtcgttttag atgatacatt tgataattat ggtacttatg 2100
aagaactcga aatctttaca caagctgttg aaagatggtc aataagctgc ctggatatgc 2160
ttccagaata catgaaacta atatatcaag agcttgtgaa tcttcacgtg gaaatggagg 2220
aatcacttga aaaggaggga aaaacatatc aaattcacta tgtcaaggag atggcaaaag 2280
agttggttcg caattacttg gtagaagcca gatggctaaa agaggggtac atgccaactc 2340
ttgaggagta catgtctgtg tcaatggtga ctggtaccta tggcttgatg atagcgagat 2400
cttatgtcgg caggggtgat atcgtcaccg aggatacctt taaatgggtg tcctcgtatc 2460
ctcctattat aaaagcttca tgtgtgattg taagacttat ggatgatatt gtcagccaca 2520
aggaggaaca agagagaggc catgttgctt caagcatcga atgctattct aaggaaagtg 2580
gtgcatcaga ggaggaagcg tgtgaatata tctcaagaaa agttgaagat gcatggaaag 2640
ttataaaccg agagtcgctc aggcctacag ctgtcccatt tcctctactt atgcctgcaa 2700
tcaaccttgc acgtatgtgt gaagtcctat atagcgtcaa cgatggcttc actcatgctg 2760
agggagacat gaaaagttac atgaaatcgt tcttcgttca ccctatggtt gtctaaaaag 2820
gaggagatca taatggcttc agaaaaagaa attaggagag agagattctt gaacgttttc 2880
cctaaattag tagaggaatt gaacgcatcg cttttggctt acggtatgcc taaggaagca 2940
tgtgactggt atgcccactc attgaactac aacactccag gcggtaagct aaatagaggt 3000
ttgtccgttg tggacacgta tgctattctc tccaacaaga ccgttgaaca attggggcaa 3060
gaagaatacg aaaaggttgc cattctaggt tggtgcattg agttgttgca ggcttacttc 3120
ttggtcgccg atgatatgat ggacaagtcc attaccagaa gaggccaacc atgttggtac 3180
aaggttcctg aagttgggga aattgccatc aatgacgcat tcatgttaga ggctgctatc 3240
tacaagcttt tgaaatctca cttcagaaac gaaaaatact acatagatat caccgaattg 3300
ttccatgagg tcaccttcca aaccgaattg ggccaattga tggacttaat cactgcacct 3360
gaagacaaag tcgacttgag taagttctcc ctaaagaagc actccttcat agttactttc 3420
aagactgctt actattcttt ctacttgcct gtcgcattgg ccatgtacgt tgccggtatc 3480
acggatgaaa aggatttgaa acaagccaga gatgtcttga ttccattggg tgaatacttc 3540
caaattcaag atgactactt agactgcttc ggtaccccag aacagatcgg taagatcggt 3600
acagatatcc aagataacaa atgttcttgg gtaatcaaca aggcattgga acttgcttcc 3660
gcagaacaaa gaaagacttt agacgaaaat tacggtaaga aggactcagt cgcagaagcc 3720
aaatgcaaaa agattttcaa tgacttgaaa attgaacagc tataccacga atatgaagag 3780
tctattgcca aggatttgaa ggccaaaatt tctcaggtcg atgagtctcg tggcttcaaa 3840
gctgatgtct taactgcgtt cttgaacaaa gtttacaaga gaagcaaata gactcaataa 3900
attaaacaac ttaaaacaga gcaggccttc gggcctgctt tttctttctt tcccgagtcc 3960
cgcctcggga gggcggtgtc ctttccgccc cgaattgcgc atcgggagca cgcggtcctt 4020
ttcgctcgct ttgctctctc aagaggacta atttacaaaa ttacatattg agagcgcggc 4080
cgc 4083
<210> 13
<211> 11703
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 载体pAC:Pmcr-IDI-FnS
<400> 13
gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60
gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120
ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180
tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240
aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300
ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360
ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420
ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480
gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540
acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600
ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660
aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720
actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780
ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840
agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900
agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960
tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020
gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080
tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140
gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200
agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260
tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320
cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380
aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440
atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500
atgtttgaca gcttatcatc gataagcttg catgcatctt ctattttcat cttaatttta 1560
tatattaaag gctaattttt caatatttta tcgcaaacta ttgtgttaat tacatcaaat 1620
atataaactt ttctatttaa agctaatgaa aaagtgaata tatacacata gagtaatgtt 1680
atgatgtata tatcaaaaaa ataggagtga ttcctatgac cgagtacaag cccacggtgc 1740
gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg 1800
actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc 1860
tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg 1920
acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg 1980
ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga 2040
tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg 2100
gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg 2160
aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc 2220
ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc 2280
gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagttaa ttactaattt attattaatt 2340
tattattaga ttgggcaaaa tagtaaaaga aaactaaagg aaacctaata tggtttcctt 2400
tttttatata tttttaaaaa ttgattatat tatatgtaaa caattataat taatgttaat 2460
cgaattcaat ttttatttaa taaacggcgc gccacgcgtc cttcaattgc cgcgatcgtt 2520
aattaaatga tttttaaaaa aatacatgaa ttcatctagc ggagaacaca aaagatttaa 2580
gtaccttcta aacgaatgag atttcattgg gaaagtggac acttaagaac gacgcggtac 2640
ttgatttatt gagtgcaaaa gcactcgatt aggtgaccag tcccaaagtg attttaataa 2700
attaaggagg aaattaaaat gactgccgac aacaatagta tgccccatgg tgcagtatct 2760
agttacgcca aattagtgca aaaccaaaca cctgaagaca ttttggaaga gtttcctgaa 2820
attattccat tacaacaaag acctaatacc cgatctagtg agacgtcaaa tgacgaaagc 2880
ggagaaacat gtttttctgg tcatgatgag gagcaaatta agttaatgaa tgaaaattgt 2940
attgttttgg attgggacga taatgctatt ggtgccggta ccaagaaagt ttgtcattta 3000
atggaaaata ttgaaaaggg tttactacat cgtgcattct ccgtctttat tttcaatgaa 3060
caaggtgaat tacttttaca acaaagagcc actgaaaaaa taactttccc tgatctttgg 3120
actaacacat gctgctctca tccactatgt attgatgacg aattaggttt gaagggtaag 3180
ctagacgata agattaaggg cgctattact gcggcggtga gaaaactaga tcatgaatta 3240
ggtattccag aagatgaaac taagacaagg ggtaagtttc actttttaaa cagaatccat 3300
tacatggcac caagcaatga accatggggt gaacatgaaa ttgattacat cctattttat 3360
aagatcaacg ctaaagaaaa cttgactgtc aacccaaacg tcaatgaagt tagagacttc 3420
aaatgggttt caccaaatga tttgaaaact atgtttgctg acccaagtta caagtttacg 3480
ccttggttta agattatttg cgagaattac ttattcaact ggtgggagca attagatgac 3540
ctttctgaag tggaaaatga caggcaaatt catagaatgc tataaacaaa ttagttaaaa 3600
ggactaaaga tgtcgactct tcctatttct agtgtttcat tctcttcatc tacgtcacct 3660
ttggttgttg acgataaagt tagcacgaaa ccagatgtta tccgccatac catgaatttc 3720
aatgctagca tatggggaga tcaatttctt acatatgatg agccagaaga tttggttatg 3780
aagaaacaac ttgttgaaga gctcaaagag gaagtcaaga aagagctaat aacgatcaaa 3840
ggttcaaatg aaccgatgca gcatgtcaag ttgatagaac ttattgatgc agtccaacgg 3900
cttggcatag cctatcattt tgaagaggag attgaagaag ccttgcaaca tatccatgtt 3960
acatatggcg agcagtgggt cgataaagaa aacctacaaa gcatttctct ttggttccga 4020
ctcctacgac aacaaggctt caacgtctca tcaggagtat tcaaggactt tatggacgag 4080
aagggaaaat ttaaggaatc cttatgtaat gatgctcagg gaattcttgc tctgtatgaa 4140
gcggcattta tgagggtgga agatgaaaca atactagata atgcgctcga gttcactaaa 4200
gttcaccttg acatcatagc caaggatcct tcttgtgact cttccctaag aacccaaata 4260
caccaagcgt taaagcagcc acttaggaga aggctggcaa ggattgaggc gttgcattac 4320
atgcctatct accaacaaga aacatcccac gatgaggtct tactgaagct tgcaaaatta 4380
gattttagcg tgcttcagtc gatgcacaaa aaggaactta gccacatttg caaatggtgg 4440
aaggatttgg acctccaaaa taagcttcct tatgttcgag acagggtggt ggaaggctat 4500
ttttggatac tatccatcta ttacgagcct caacatgctc gaacaagaat gttcctaatg 4560
aaaacatgca tgtggttagt cgttttagat gatacatttg ataattatgg tacttatgaa 4620
gaactcgaaa tctttacaca agctgttgaa agatggtcaa taagctgcct ggatatgctt 4680
ccagaataca tgaaactaat atatcaagag cttgtgaatc ttcacgtgga aatggaggaa 4740
tcacttgaaa aggagggaaa aacatatcaa attcactatg tcaaggagat ggcaaaagag 4800
ttggttcgca attacttggt agaagccaga tggctaaaag aggggtacat gccaactctt 4860
gaggagtaca tgtctgtgtc aatggtgact ggtacctatg gcttgatgat agcgagatct 4920
tatgtcggca ggggtgatat cgtcaccgag gataccttta aatgggtgtc ctcgtatcct 4980
cctattataa aagcttcatg tgtgattgta agacttatgg atgatattgt cagccacaag 5040
gaggaacaag agagaggcca tgttgcttca agcatcgaat gctattctaa ggaaagtggt 5100
gcatcagagg aggaagcgtg tgaatatatc tcaagaaaag ttgaagatgc atggaaagtt 5160
ataaaccgag agtcgctcag gcctacagct gtcccatttc ctctacttat gcctgcaatc 5220
aaccttgcac gtatgtgtga agtcctatat agcgtcaacg atggcttcac tcatgctgag 5280
ggagacatga aaagttacat gaaatcgttc ttcgttcacc ctatggttgt ctaaactcaa 5340
taaattaaac aacttaaaac agagcaggcc ttcgggcctg ctttttcttt ctttcccgag 5400
tcccgcctcg ggagggcggt gtcctttccg ccccgaattg cgcatcggga gcacgcggtc 5460
cttttcgctc gctttgctct ctcaagagga ctaatttaca aaattacata ttgagagcgc 5520
ggccgcacta gtaagttata gaaatgtcat ccgataccga aaaagaaaac ggaataaatc 5580
agtaacaaat caaaaaaaca aaactataac atttaatctt cgtaaaatca atatcaatcg 5640
accatacaca aaacatgttc aaataaaata catgggtgta catatgtcaa ccgacattga 5700
aaaagaaaac ggaataaatc agtaacaaat caaaaaaaca aaaccataac atttctataa 5760
cattccatag agtaaaaatc aacatcgaat aaccttacac aaaccataca taaaccatac 5820
ataaaaatac acatatgtca accgttaccg taaaaagatt acttaaataa ttttatactc 5880
acctcttatt ttttgtgttt tttattatcc agggcaacct ttcccaggga gaaattcttc 5940
cttgcagttg caggcaagaa ccaggacttt cttccagggc atactttccc agggagaaat 6000
tcttccttgc agctgcaggc aagaaccagg actttccccc aggaccagga cctcaaggtc 6060
tgcatccaga ggaagacctt cccagggcgc caagatcccg cagattatgg aacattattt 6120
cccgggaaat aattcagggc ttaatgccca actgaggaat acattttaaa taagcttctc 6180
ttagttcatc cttttctatg tggtcgtaca cgtctattgc ttcgcctctc gaatctcccc 6240
ttaattcctg aatgaatgtc ctttccatac ctgaacgtcg aagccatgta gtgaaccaat 6300
gccggcagca atgcggagta aaatgttctt caagtctccc ctcggggtta tggagtccga 6360
tagaggaagc ggcagatgtg acaatatcgt acactaaatt tctttgtaca cggtgaccgt 6420
tttgtctgcc tatgaataat gctttttctt tatcatgcct cgtgttaagg tacgcttcca 6480
ggaaggcctt agtctcaagg tcaaagaata cgatacgatt tgacctttta gctgtcttct 6540
tgagtctcac cgtacacttt tccagatcta tgtcagctcg atcaagagta attaattcat 6600
ttctcctgat gccagtttta gctaaaaaga ttatcaatgc ttgatacatg gggtaacgtg 6660
gtactttgac aagctttgcc atgtcttcaa tggtaatcaa ttgccttgtt tccggagtat 6720
ggtatttttt gtagcttctt agatagcgtt ttctgaacgt gggaatgttg tttctctcga 6780
ttatatgctt gaattcaagg aagtcaaaaa aggtactcag tgaagcaaag taattgttac 6840
aggttgcgag tgtgtactgc ctttcatctc ttatgtgaac aaggaaccct tcaagctccg 6900
gaaaccctgc attcactcca cacatttgaa ggaaaaactt agcatgactt acgtatcctt 6960
ctattgttct tttagagtaa ccccttccga tacaatcaga agtgaataaa cttataagtc 7020
tttcattatc aagcggttca tagataccag ttagctgaat agctgccatt tcacccataa 7080
atcaataaaa gaagtatgta aataaatact ttgtgcatag atgtcattta aacacaaagt 7140
ataagtacat ctaccttctt ttagtatatg ctggtaacag caaaaaagcg ccaaacaacg 7200
catctttacc caatagaatg acgtcgatta aaagagtaag ttggtggtga gccttaaaaa 7260
aggtaaaaga gagcttactc ttaagttaaa aacggaattg gcaaacagta aggattgttc 7320
cagcagtcct tactaaaaac attactttat taattctata tagtcacaac attcacaaaa 7380
ataggctttt ttctcgattt ttccttttga atgtttataa agaaaaatca tatagcattt 7440
attacactgt ggacatattt tcttttcaat tttgcccctt ccaatttgtg gaagcctttt 7500
ttcagtaaca cgcttaggca taatgaaaga tcggtgtatt aagtattaac attttctaac 7560
ttgtgcaata ataattattc ggggttgtcg aagaacttcc aaacagtaga ccgatccatt 7620
ttccacatta ttctaatgaa gccaagactc aaggatgggg ggaaatatcc ccccacaccc 7680
cccaatgaga ctacccaaga cagcccgtat gccgacagcg acacagttaa atatcaatgt 7740
gtattaatac atatcaacaa gtatcaacac acacaattaa acaataatac acatcaatgg 7800
agaacaatac acatgccaac acaagaatac acacggacaa acattacatt accagaacat 7860
gttagagcaa tgattaaaga gtacaataaa agaagtacat ggggagacct caacgtatca 7920
gcagtatgct ctaatgcaat agcagacaga attagagcta cattcccaaa attagaaaaa 7980
gaactatttc cagaacaatt tccagaactt aacccaaaaa tgacaaaaac cagctcacca 8040
ggacaaccag aaataacaca aaaaggaaaa tccaaacaag gagactctaa agatagaata 8100
tgcgcttatt gtggccaacc ttttgaaccg aaatcgcata atcaaaaatt ctgtaaagat 8160
gcatgtaagt cagcaaatta tagaaaaaac aaaaaaacac agagttaaac ccattaacca 8220
cactcttttt ttgaatttat ctgcatttca cggtactttt tatccaagaa agcccacaaa 8280
tcacgctctt taaacggttt catggaaaaa ttttcccgga atgcattaat taacatcttt 8340
tcaattttag ggttgaaata agccccataa cggtaatctg gcgaccaatc tgaagcttta 8400
acctcttcat aagtccgata cggcacatta cccggaagaa gcccaggaac cacaagcaga 8460
taatagatat agcaccttat acacatatgt gattttttag tagtctttaa ccattcaata 8520
tatgaaagat ccgcacctgt tcgataatcc tcaaaaagaa ttaagttcct ttgcctccga 8580
gatccacaca cacagcaata cttcaattcc ataatacata acaccccgaa ataataagac 8640
atctgaaaaa ccgtatcact ttaggcttta agcatcttat ccggaccttc gagcccaaaa 8700
gccttgttga acgtggcatc tcaatcaccc ccaaacatca tggagcgtga ttttaagctt 8760
gtaaatagct cttcataatt aatttcggaa gccttttgca agctgttaga aggcatttca 8820
ggcgattctt caattataca gccatcatgc tcccattgat gagagtcaac caccaggaag 8880
ccggcagggg gatcaggaag cccttctaag aaccataccc gaagaagact cccggcaggt 8940
tcaagcttca aaaactccgg taattcatcc actttgaagg gagaagccca taatttacgc 9000
cattttttag gaactttgtt tttgccatct cgccctttta ggttatgata aaaattattt 9060
cttgcaatta attgttgcaa gtaatcggca tattcaggtt taaccgcttt agcttccttc 9120
aaataagcat gtagagcctg tcttccaccc gaaaaatgat cccgaagctt tgttaacggt 9180
atccatccag tatcatcgtt ttcctgtcct tcccacttca actctccatt ataaacgagt 9240
tttacttctc gaccttcatt gattaaatta aggacttcgg ttctggtatc tatcaattgc 9300
tcaaatgtca gctttccgga ggaacttaca actttatcag gatgccaccg gaacaaagca 9360
ccaaagcgag attctatatg gatattaccg tatctgttat ccgtgagctg cccaacgtga 9420
gaataaagat aagtcacctg cttgtaaata tccataaggc tccgcaattc ccattgcctt 9480
ttaccattga ctttatgaga aagcctctga ataaatatat catattcatc actcttgcat 9540
ctctttttac tcttcggatt ctttccagtt atacgaatgt ttccagggaa aatgaaaaaa 9600
tgaaaatgag gagcaaggat aaggcagtca taaatagagt ttatttcgat atttagcaag 9660
tccgcgatct tgtttaaatt gccttcgttg tggtcgtctc ttatgtaatt ccaaaaagct 9720
tcggagtcgt cattaccttt taaacctgtt aacttacgga tagcccgagt tatttccggc 9780
ttaatcctgt aagggtgaaa gattgtagta ccagcagtta cgccccagcg ttccagcctg 9840
tcctttaaat tcctccggaa aagtcggatt gcttccacag atactccccg gctaaagtcc 9900
atcgaagcaa acccccatga aggaaactgc ccagaaaaca gggcataagt ccacaaaatt 9960
acaactaatg caaatctatg ttgcaattcc gataggatgc cgcaaccagg acaagaaagt 10020
gtattgcagt gagaattaag atcctttcgt gcattataat tttcagatac agcataagtg 10080
aaaggacgcc cacagtaagc gggtcttttt ccctttgctg gaagaacaaa gtcgccaact 10140
tttagaggac gatacttaga gcatttagaa aaatcgaagt caggacaaga gtagtattta 10200
cagatagaaa ccccgttctt tttgttgcga accgggcaca aaacaccatc ggtacatata 10260
cacgtcgcaa aatctctaca ctctggagca taggaaacgg cgccaggtct agaactaaaa 10320
tcagaactca gagaacattt cctgtcgaaa atttaaaccg taaaccaaag ataacaattt 10380
tcataatatt acagaaccta tattttttgt aactcgacat tacaaaaatg taccacaaaa 10440
cataaaaaca ttttcataga agaaatattc acaaacaata gaaaaaaatt ataagaataa 10500
gattaacgcc taccttatta aaagaaggtg tcgagtcttc aggttccatc aaggcaggcg 10560
ttgatattct atatatgtta cacataacat atataacata cgtacctcag aacattcaga 10620
cctgaatgct ctaaaatgaa ataagcttta aactttataa attcatctgc tataaatagt 10680
tttagagata tagaaagccc aaggaagaaa aagaatagca aaaataaaaa agaaaaacgg 10740
cccgcgacgg caaacccgga gacttataat caaagtaaga cgaaaaggaa gccgacaacg 10800
atttgataat aacaaatcat cttttatttt ggcaatattc atatgatata tgaagaaatc 10860
aacatcaagc ggattagtat ttttgctatt tgtaaatcaa tatcgggtga gacagtatat 10920
caaaaacaaa cttcattttt ttcgaacaaa aaaatcacta tcaaatgaca ttgtagtaag 10980
aaactacatc aaaactagtt gatcatatcg tcaattatta cctccacggg gagagcctga 11040
gcaaactggc ctcaggcatt tgagaagcac acggtcacac tgcttccggt agtcaataaa 11100
ccggtaaacc agcaatagac ataagcggct atttaacgac cctgccctga accgacgacc 11160
gggtcgaatt tgctttcgaa tttctgccat tcatccgctt attatcactt attcaggcgt 11220
agcaccaggc gtttaagggc accaataact gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca 11280
ctcatcgcag tactgttgta attcattaag cattctgccg acatggaagc catcacagac 11340
ggcatgatga acctgaatcg ccagcggcat cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt 11400
gcccatggtg aaaacggggg cgaagaagtt gtccatattg gccacgttta aatcaaaact 11460
ggtgaaactc acccagggat tggctgagac gaaaaacata ttctcaataa accctttagg 11520
gaaataggcc aggttttcac cgtaacacgc cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg 11580
ccggaaatcg tcgtggtatt cactccagag cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa 11640
aacggtgtaa caagggtgaa cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat 11700
acg 11703
<210> 14
<211> 12778
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> pAC:Pmcr-IDI-FnS-FPS
<400> 14
gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60
gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120
ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180
tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240
aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300
ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360
ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420
ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480
gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540
acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600
ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660
aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720
actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780
ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840
agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900
agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960
tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020
gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080
tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140
gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200
agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260
tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320
cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380
aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440
atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500
atgtttgaca gcttatcatc gataagcttg catgcatctt ctattttcat cttaatttta 1560
tatattaaag gctaattttt caatatttta tcgcaaacta ttgtgttaat tacatcaaat 1620
atataaactt ttctatttaa agctaatgaa aaagtgaata tatacacata gagtaatgtt 1680
atgatgtata tatcaaaaaa ataggagtga ttcctatgac cgagtacaag cccacggtgc 1740
gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg 1800
actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc 1860
tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg 1920
acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg 1980
ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga 2040
tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg 2100
gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg 2160
aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc 2220
ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc 2280
gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagttaa ttactaattt attattaatt 2340
tattattaga ttgggcaaaa tagtaaaaga aaactaaagg aaacctaata tggtttcctt 2400
tttttatata tttttaaaaa ttgattatat tatatgtaaa caattataat taatgttaat 2460
cgaattcaat ttttatttaa taaacggcgc gccacgcgtc cttcaattgc cgcgatcgtt 2520
aattaaatga tttttaaaaa aatacatgaa ttcatctagc ggagaacaca aaagatttaa 2580
gtaccttcta aacgaatgag atttcattgg gaaagtggac acttaagaac gacgcggtac 2640
ttgatttatt gagtgcaaaa gcactcgatt aggtgaccag tcccaaagtg attttaataa 2700
attaaggagg aaattaaaat gactgccgac aacaatagta tgccccatgg tgcagtatct 2760
agttacgcca aattagtgca aaaccaaaca cctgaagaca ttttggaaga gtttcctgaa 2820
attattccat tacaacaaag acctaatacc cgatctagtg agacgtcaaa tgacgaaagc 2880
ggagaaacat gtttttctgg tcatgatgag gagcaaatta agttaatgaa tgaaaattgt 2940
attgttttgg attgggacga taatgctatt ggtgccggta ccaagaaagt ttgtcattta 3000
atggaaaata ttgaaaaggg tttactacat cgtgcattct ccgtctttat tttcaatgaa 3060
caaggtgaat tacttttaca acaaagagcc actgaaaaaa taactttccc tgatctttgg 3120
actaacacat gctgctctca tccactatgt attgatgacg aattaggttt gaagggtaag 3180
ctagacgata agattaaggg cgctattact gcggcggtga gaaaactaga tcatgaatta 3240
ggtattccag aagatgaaac taagacaagg ggtaagtttc actttttaaa cagaatccat 3300
tacatggcac caagcaatga accatggggt gaacatgaaa ttgattacat cctattttat 3360
aagatcaacg ctaaagaaaa cttgactgtc aacccaaacg tcaatgaagt tagagacttc 3420
aaatgggttt caccaaatga tttgaaaact atgtttgctg acccaagtta caagtttacg 3480
ccttggttta agattatttg cgagaattac ttattcaact ggtgggagca attagatgac 3540
ctttctgaag tggaaaatga caggcaaatt catagaatgc tataaacaaa ttagttaaaa 3600
ggactaaaga tgtcgactct tcctatttct agtgtttcat tctcttcatc tacgtcacct 3660
ttggttgttg acgataaagt tagcacgaaa ccagatgtta tccgccatac catgaatttc 3720
aatgctagca tatggggaga tcaatttctt acatatgatg agccagaaga tttggttatg 3780
aagaaacaac ttgttgaaga gctcaaagag gaagtcaaga aagagctaat aacgatcaaa 3840
ggttcaaatg aaccgatgca gcatgtcaag ttgatagaac ttattgatgc agtccaacgg 3900
cttggcatag cctatcattt tgaagaggag attgaagaag ccttgcaaca tatccatgtt 3960
acatatggcg agcagtgggt cgataaagaa aacctacaaa gcatttctct ttggttccga 4020
ctcctacgac aacaaggctt caacgtctca tcaggagtat tcaaggactt tatggacgag 4080
aagggaaaat ttaaggaatc cttatgtaat gatgctcagg gaattcttgc tctgtatgaa 4140
gcggcattta tgagggtgga agatgaaaca atactagata atgcgctcga gttcactaaa 4200
gttcaccttg acatcatagc caaggatcct tcttgtgact cttccctaag aacccaaata 4260
caccaagcgt taaagcagcc acttaggaga aggctggcaa ggattgaggc gttgcattac 4320
atgcctatct accaacaaga aacatcccac gatgaggtct tactgaagct tgcaaaatta 4380
gattttagcg tgcttcagtc gatgcacaaa aaggaactta gccacatttg caaatggtgg 4440
aaggatttgg acctccaaaa taagcttcct tatgttcgag acagggtggt ggaaggctat 4500
ttttggatac tatccatcta ttacgagcct caacatgctc gaacaagaat gttcctaatg 4560
aaaacatgca tgtggttagt cgttttagat gatacatttg ataattatgg tacttatgaa 4620
gaactcgaaa tctttacaca agctgttgaa agatggtcaa taagctgcct ggatatgctt 4680
ccagaataca tgaaactaat atatcaagag cttgtgaatc ttcacgtgga aatggaggaa 4740
tcacttgaaa aggagggaaa aacatatcaa attcactatg tcaaggagat ggcaaaagag 4800
ttggttcgca attacttggt agaagccaga tggctaaaag aggggtacat gccaactctt 4860
gaggagtaca tgtctgtgtc aatggtgact ggtacctatg gcttgatgat agcgagatct 4920
tatgtcggca ggggtgatat cgtcaccgag gataccttta aatgggtgtc ctcgtatcct 4980
cctattataa aagcttcatg tgtgattgta agacttatgg atgatattgt cagccacaag 5040
gaggaacaag agagaggcca tgttgcttca agcatcgaat gctattctaa ggaaagtggt 5100
gcatcagagg aggaagcgtg tgaatatatc tcaagaaaag ttgaagatgc atggaaagtt 5160
ataaaccgag agtcgctcag gcctacagct gtcccatttc ctctacttat gcctgcaatc 5220
aaccttgcac gtatgtgtga agtcctatat agcgtcaacg atggcttcac tcatgctgag 5280
ggagacatga aaagttacat gaaatcgttc ttcgttcacc ctatggttgt ctaaaaagga 5340
ggagatcata atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc 5400
taaattagta gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg 5460
tgactggtat gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt 5520
gtccgttgtg gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga 5580
agaatacgaa aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt 5640
ggtcgccgat gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa 5700
ggttcctgaa gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta 5760
caagcttttg aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt 5820
ccatgaggtc accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga 5880
agacaaagtc gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa 5940
gactgcttac tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac 6000
ggatgaaaag gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca 6060
aattcaagat gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac 6120
agatatccaa gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc 6180
agaacaaaga aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa 6240
atgcaaaaag attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc 6300
tattgccaag gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc 6360
tgatgtctta actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaataga ctcaataaat 6420
taaacaactt aaaacagagc aggccttcgg gcctgctttt tctttctttc ccgagtcccg 6480
cctcgggagg gcggtgtcct ttccgccccg aattgcgcat cgggagcacg cggtcctttt 6540
cgctcgcttt gctctctcaa gaggactaat ttacaaaatt acatattgag agcgcggccg 6600
cactagtaag ttatagaaat gtcatccgat accgaaaaag aaaacggaat aaatcagtaa 6660
caaatcaaaa aaacaaaact ataacattta atcttcgtaa aatcaatatc aatcgaccat 6720
acacaaaaca tgttcaaata aaatacatgg gtgtacatat gtcaaccgac attgaaaaag 6780
aaaacggaat aaatcagtaa caaatcaaaa aaacaaaacc ataacatttc tataacattc 6840
catagagtaa aaatcaacat cgaataacct tacacaaacc atacataaac catacataaa 6900
aatacacata tgtcaaccgt taccgtaaaa agattactta aataatttta tactcacctc 6960
ttattttttg tgttttttat tatccagggc aacctttccc agggagaaat tcttccttgc 7020
agttgcaggc aagaaccagg actttcttcc agggcatact ttcccaggga gaaattcttc 7080
cttgcagctg caggcaagaa ccaggacttt cccccaggac caggacctca aggtctgcat 7140
ccagaggaag accttcccag ggcgccaaga tcccgcagat tatggaacat tatttcccgg 7200
gaaataattc agggcttaat gcccaactga ggaatacatt ttaaataagc ttctcttagt 7260
tcatcctttt ctatgtggtc gtacacgtct attgcttcgc ctctcgaatc tccccttaat 7320
tcctgaatga atgtcctttc catacctgaa cgtcgaagcc atgtagtgaa ccaatgccgg 7380
cagcaatgcg gagtaaaatg ttcttcaagt ctcccctcgg ggttatggag tccgatagag 7440
gaagcggcag atgtgacaat atcgtacact aaatttcttt gtacacggtg accgttttgt 7500
ctgcctatga ataatgcttt ttctttatca tgcctcgtgt taaggtacgc ttccaggaag 7560
gccttagtct caaggtcaaa gaatacgata cgatttgacc ttttagctgt cttcttgagt 7620
ctcaccgtac acttttccag atctatgtca gctcgatcaa gagtaattaa ttcatttctc 7680
ctgatgccag ttttagctaa aaagattatc aatgcttgat acatggggta acgtggtact 7740
ttgacaagct ttgccatgtc ttcaatggta atcaattgcc ttgtttccgg agtatggtat 7800
tttttgtagc ttcttagata gcgttttctg aacgtgggaa tgttgtttct ctcgattata 7860
tgcttgaatt caaggaagtc aaaaaaggta ctcagtgaag caaagtaatt gttacaggtt 7920
gcgagtgtgt actgcctttc atctcttatg tgaacaagga acccttcaag ctccggaaac 7980
cctgcattca ctccacacat ttgaaggaaa aacttagcat gacttacgta tccttctatt 8040
gttcttttag agtaacccct tccgatacaa tcagaagtga ataaacttat aagtctttca 8100
ttatcaagcg gttcatagat accagttagc tgaatagctg ccatttcacc cataaatcaa 8160
taaaagaagt atgtaaataa atactttgtg catagatgtc atttaaacac aaagtataag 8220
tacatctacc ttcttttagt atatgctggt aacagcaaaa aagcgccaaa caacgcatct 8280
ttacccaata gaatgacgtc gattaaaaga gtaagttggt ggtgagcctt aaaaaaggta 8340
aaagagagct tactcttaag ttaaaaacgg aattggcaaa cagtaaggat tgttccagca 8400
gtccttacta aaaacattac tttattaatt ctatatagtc acaacattca caaaaatagg 8460
cttttttctc gatttttcct tttgaatgtt tataaagaaa aatcatatag catttattac 8520
actgtggaca tattttcttt tcaattttgc cccttccaat ttgtggaagc cttttttcag 8580
taacacgctt aggcataatg aaagatcggt gtattaagta ttaacatttt ctaacttgtg 8640
caataataat tattcggggt tgtcgaagaa cttccaaaca gtagaccgat ccattttcca 8700
cattattcta atgaagccaa gactcaagga tggggggaaa tatcccccca caccccccaa 8760
tgagactacc caagacagcc cgtatgccga cagcgacaca gttaaatatc aatgtgtatt 8820
aatacatatc aacaagtatc aacacacaca attaaacaat aatacacatc aatggagaac 8880
aatacacatg ccaacacaag aatacacacg gacaaacatt acattaccag aacatgttag 8940
agcaatgatt aaagagtaca ataaaagaag tacatgggga gacctcaacg tatcagcagt 9000
atgctctaat gcaatagcag acagaattag agctacattc ccaaaattag aaaaagaact 9060
atttccagaa caatttccag aacttaaccc aaaaatgaca aaaaccagct caccaggaca 9120
accagaaata acacaaaaag gaaaatccaa acaaggagac tctaaagata gaatatgcgc 9180
ttattgtggc caaccttttg aaccgaaatc gcataatcaa aaattctgta aagatgcatg 9240
taagtcagca aattatagaa aaaacaaaaa aacacagagt taaacccatt aaccacactc 9300
tttttttgaa tttatctgca tttcacggta ctttttatcc aagaaagccc acaaatcacg 9360
ctctttaaac ggtttcatgg aaaaattttc ccggaatgca ttaattaaca tcttttcaat 9420
tttagggttg aaataagccc cataacggta atctggcgac caatctgaag ctttaacctc 9480
ttcataagtc cgatacggca cattacccgg aagaagccca ggaaccacaa gcagataata 9540
gatatagcac cttatacaca tatgtgattt tttagtagtc tttaaccatt caatatatga 9600
aagatccgca cctgttcgat aatcctcaaa aagaattaag ttcctttgcc tccgagatcc 9660
acacacacag caatacttca attccataat acataacacc ccgaaataat aagacatctg 9720
aaaaaccgta tcactttagg ctttaagcat cttatccgga ccttcgagcc caaaagcctt 9780
gttgaacgtg gcatctcaat cacccccaaa catcatggag cgtgatttta agcttgtaaa 9840
tagctcttca taattaattt cggaagcctt ttgcaagctg ttagaaggca tttcaggcga 9900
ttcttcaatt atacagccat catgctccca ttgatgagag tcaaccacca ggaagccggc 9960
agggggatca ggaagccctt ctaagaacca tacccgaaga agactcccgg caggttcaag 10020
cttcaaaaac tccggtaatt catccacttt gaagggagaa gcccataatt tacgccattt 10080
tttaggaact ttgtttttgc catctcgccc ttttaggtta tgataaaaat tatttcttgc 10140
aattaattgt tgcaagtaat cggcatattc aggtttaacc gctttagctt ccttcaaata 10200
agcatgtaga gcctgtcttc cacccgaaaa atgatcccga agctttgtta acggtatcca 10260
tccagtatca tcgttttcct gtccttccca cttcaactct ccattataaa cgagttttac 10320
ttctcgacct tcattgatta aattaaggac ttcggttctg gtatctatca attgctcaaa 10380
tgtcagcttt ccggaggaac ttacaacttt atcaggatgc caccggaaca aagcaccaaa 10440
gcgagattct atatggatat taccgtatct gttatccgtg agctgcccaa cgtgagaata 10500
aagataagtc acctgcttgt aaatatccat aaggctccgc aattcccatt gccttttacc 10560
attgacttta tgagaaagcc tctgaataaa tatatcatat tcatcactct tgcatctctt 10620
tttactcttc ggattctttc cagttatacg aatgtttcca gggaaaatga aaaaatgaaa 10680
atgaggagca aggataaggc agtcataaat agagtttatt tcgatattta gcaagtccgc 10740
gatcttgttt aaattgcctt cgttgtggtc gtctcttatg taattccaaa aagcttcgga 10800
gtcgtcatta ccttttaaac ctgttaactt acggatagcc cgagttattt ccggcttaat 10860
cctgtaaggg tgaaagattg tagtaccagc agttacgccc cagcgttcca gcctgtcctt 10920
taaattcctc cggaaaagtc ggattgcttc cacagatact ccccggctaa agtccatcga 10980
agcaaacccc catgaaggaa actgcccaga aaacagggca taagtccaca aaattacaac 11040
taatgcaaat ctatgttgca attccgatag gatgccgcaa ccaggacaag aaagtgtatt 11100
gcagtgagaa ttaagatcct ttcgtgcatt ataattttca gatacagcat aagtgaaagg 11160
acgcccacag taagcgggtc tttttccctt tgctggaaga acaaagtcgc caacttttag 11220
aggacgatac ttagagcatt tagaaaaatc gaagtcagga caagagtagt atttacagat 11280
agaaaccccg ttctttttgt tgcgaaccgg gcacaaaaca ccatcggtac atatacacgt 11340
cgcaaaatct ctacactctg gagcatagga aacggcgcca ggtctagaac taaaatcaga 11400
actcagagaa catttcctgt cgaaaattta aaccgtaaac caaagataac aattttcata 11460
atattacaga acctatattt tttgtaactc gacattacaa aaatgtacca caaaacataa 11520
aaacattttc atagaagaaa tattcacaaa caatagaaaa aaattataag aataagatta 11580
acgcctacct tattaaaaga aggtgtcgag tcttcaggtt ccatcaaggc aggcgttgat 11640
attctatata tgttacacat aacatatata acatacgtac ctcagaacat tcagacctga 11700
atgctctaaa atgaaataag ctttaaactt tataaattca tctgctataa atagttttag 11760
agatatagaa agcccaagga agaaaaagaa tagcaaaaat aaaaaagaaa aacggcccgc 11820
gacggcaaac ccggagactt ataatcaaag taagacgaaa aggaagccga caacgatttg 11880
ataataacaa atcatctttt attttggcaa tattcatatg atatatgaag aaatcaacat 11940
caagcggatt agtatttttg ctatttgtaa atcaatatcg ggtgagacag tatatcaaaa 12000
acaaacttca tttttttcga acaaaaaaat cactatcaaa tgacattgta gtaagaaact 12060
acatcaaaac tagttgatca tatcgtcaat tattacctcc acggggagag cctgagcaaa 12120
ctggcctcag gcatttgaga agcacacggt cacactgctt ccggtagtca ataaaccggt 12180
aaaccagcaa tagacataag cggctattta acgaccctgc cctgaaccga cgaccgggtc 12240
gaatttgctt tcgaatttct gccattcatc cgcttattat cacttattca ggcgtagcac 12300
caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc tgccactcat 12360
cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca cagacggcat 12420
gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 12480
tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 12540
aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 12600
aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 12660
aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 12720
tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacg 12778
<210> 15
<211> 10722
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> pAC:Pmcr-IspS
<400> 15
gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60
gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120
ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180
tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240
aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300
ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360
ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420
ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480
gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540
acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600
ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660
aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720
actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780
ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840
agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900
agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960
tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020
gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080
tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140
gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200
agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260
tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320
cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380
aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440
atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500
atgtttgaca gcttatcatc gataagcttg catgcatctt ctattttcat cttaatttta 1560
tatattaaag gctaattttt caatatttta tcgcaaacta ttgtgttaat tacatcaaat 1620
atataaactt ttctatttaa agctaatgaa aaagtgaata tatacacata gagtaatgtt 1680
atgatgtata tatcaaaaaa ataggagtga ttcctatgac cgagtacaag cccacggtgc 1740
gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg 1800
actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc 1860
tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg 1920
acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg 1980
ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga 2040
tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg 2100
gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg 2160
aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc 2220
ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc 2280
gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagttaa ttactaattt attattaatt 2340
tattattaga ttgggcaaaa tagtaaaaga aaactaaagg aaacctaata tggtttcctt 2400
tttttatata tttttaaaaa ttgattatat tatatgtaaa caattataat taatgttaat 2460
cgaattcaat ttttatttaa taaacggcgc gccacgcgtc cttcaattgc cgcgatcgtt 2520
aattaaatga tttttaaaaa aatacatgaa ttcatctagc ggagaacaca aaagatttaa 2580
gtaccttcta aacgaatgag atttcattgg gaaagtggac acttaagaac gacgcggtac 2640
ttgatttatt gagtgcaaaa gcactcgatt aggtgaccag tcccaaagtg attttaataa 2700
attaaggagg aaattaaaat ggaagccaga cggtctgcca attatgaacc aaatagctgg 2760
gattatgatt ttttgctgtc ttcagacact gacgaatcga ttgaagtata caaagacaag 2820
gccaaaaagc tggaggctga ggtgagaaga gagattaaca atgaaaaggc agagtttttg 2880
actctgcttg aactgataga taatgtccaa aggttaggat tgggttaccg gttcgagagt 2940
gacataagga gagccctcga cagatttgtt tcttcaggag gatttgatgg tgttacaaaa 3000
actagccttc atgctactgc tcttagcttc aggcttctca gacagcatgg ctttgaggtc 3060
tctcaagaag cgttcagtgg attcaaggat caaaatggca atttcttgga aaaccttaag 3120
gaggacacca aggcaatact aagcctatat gaagcttcat ttcttgcatt agaaggagaa 3180
aatatcttgg atgaggccag ggtgtttgca atatcacatc taaaagagct cagcgaagaa 3240
aagattggaa aagagctggc cgaacaggtg aatcatgcat tggagcttcc attgcatcgc 3300
aggacgcaaa gactagaagc tgtttggagt attgaagcat accgtaaaaa ggaagatgca 3360
aatcaagtac tgctagaact tgctatattg gactacaaca tgattcaatc agtataccaa 3420
agagatcttc gcgagacatc aaggtggtgg aggcgagtgg gtcttgcaac aaagttgcat 3480
tttgctaaag acaggttaat tgaaagcttt tactgggcag ttggagttgc gttcgaacct 3540
caatacagtg attgccgtaa ttcagtagca aaaatgtttt catttgtaac aatcattgat 3600
gatatctatg atgtttatgg tactctggat gagctggagc tatttacaga tgctgttgag 3660
agatgggatg ttaacgccat caatgatctt ccggattata tgaagctctg cttcctagct 3720
ctctacaaca ctatcaatga gatagcttat gacaatctga aggacaaggg ggaaaacatt 3780
cttccatacc taacaaaagc gtgggcagat ttatgcaatg cattcctaca agaagcaaaa 3840
tggctgtaca ataagtccac accaacattt gatgactatt tcggaaatgc atggaaatca 3900
tcctcagggc ctcttcaact aatttttgcc tactttgccg tggttcaaaa catcaagaaa 3960
gaggaaattg aaaacttaca aaagtatcat gatatcatca gtaggccttc ccacatcttt 4020
cgtctttgca acgacctggc ttcagcatcg gctgagatag cgagaggtga aactgcgaat 4080
tccgtatcct gctacatgcg tacaaaaggc atttctgagg aacttgctac tgaatccgta 4140
atgaatttga tcgacgaaac ctgtaaaaag atgaacaaag aaaagcttgg tggctctttg 4200
tttgcaaaac cttttgtcga aacagctatt aaccttgcac ggcaatccca ttgcacttat 4260
cataacggag atgcgcatac ttcaccagac gagctaacta ggaaacgtgt cctgtcagta 4320
atcacagagc ctattctacc ctttgagaga taaactcaat aaattaaaca acttaaaaca 4380
gagcaggcct tcgggcctgc tttttctttc tttcccgagt cccgcctcgg gagggcggtg 4440
tcctttccgc cccgaattgc gcatcgggag cacgcggtcc ttttcgctcg ctttgctctc 4500
tcaagaggac taatttacaa aattacatat tgagagcgcg gccgcactag taagttatag 4560
aaatgtcatc cgataccgaa aaagaaaacg gaataaatca gtaacaaatc aaaaaaacaa 4620
aactataaca tttaatcttc gtaaaatcaa tatcaatcga ccatacacaa aacatgttca 4680
aataaaatac atgggtgtac atatgtcaac cgacattgaa aaagaaaacg gaataaatca 4740
gtaacaaatc aaaaaaacaa aaccataaca tttctataac attccataga gtaaaaatca 4800
acatcgaata accttacaca aaccatacat aaaccataca taaaaataca catatgtcaa 4860
ccgttaccgt aaaaagatta cttaaataat tttatactca cctcttattt tttgtgtttt 4920
ttattatcca gggcaacctt tcccagggag aaattcttcc ttgcagttgc aggcaagaac 4980
caggactttc ttccagggca tactttccca gggagaaatt cttccttgca gctgcaggca 5040
agaaccagga ctttccccca ggaccaggac ctcaaggtct gcatccagag gaagaccttc 5100
ccagggcgcc aagatcccgc agattatgga acattatttc ccgggaaata attcagggct 5160
taatgcccaa ctgaggaata cattttaaat aagcttctct tagttcatcc ttttctatgt 5220
ggtcgtacac gtctattgct tcgcctctcg aatctcccct taattcctga atgaatgtcc 5280
tttccatacc tgaacgtcga agccatgtag tgaaccaatg ccggcagcaa tgcggagtaa 5340
aatgttcttc aagtctcccc tcggggttat ggagtccgat agaggaagcg gcagatgtga 5400
caatatcgta cactaaattt ctttgtacac ggtgaccgtt ttgtctgcct atgaataatg 5460
ctttttcttt atcatgcctc gtgttaaggt acgcttccag gaaggcctta gtctcaaggt 5520
caaagaatac gatacgattt gaccttttag ctgtcttctt gagtctcacc gtacactttt 5580
ccagatctat gtcagctcga tcaagagtaa ttaattcatt tctcctgatg ccagttttag 5640
ctaaaaagat tatcaatgct tgatacatgg ggtaacgtgg tactttgaca agctttgcca 5700
tgtcttcaat ggtaatcaat tgccttgttt ccggagtatg gtattttttg tagcttctta 5760
gatagcgttt tctgaacgtg ggaatgttgt ttctctcgat tatatgcttg aattcaagga 5820
agtcaaaaaa ggtactcagt gaagcaaagt aattgttaca ggttgcgagt gtgtactgcc 5880
tttcatctct tatgtgaaca aggaaccctt caagctccgg aaaccctgca ttcactccac 5940
acatttgaag gaaaaactta gcatgactta cgtatccttc tattgttctt ttagagtaac 6000
cccttccgat acaatcagaa gtgaataaac ttataagtct ttcattatca agcggttcat 6060
agataccagt tagctgaata gctgccattt cacccataaa tcaataaaag aagtatgtaa 6120
ataaatactt tgtgcataga tgtcatttaa acacaaagta taagtacatc taccttcttt 6180
tagtatatgc tggtaacagc aaaaaagcgc caaacaacgc atctttaccc aatagaatga 6240
cgtcgattaa aagagtaagt tggtggtgag ccttaaaaaa ggtaaaagag agcttactct 6300
taagttaaaa acggaattgg caaacagtaa ggattgttcc agcagtcctt actaaaaaca 6360
ttactttatt aattctatat agtcacaaca ttcacaaaaa taggcttttt tctcgatttt 6420
tccttttgaa tgtttataaa gaaaaatcat atagcattta ttacactgtg gacatatttt 6480
cttttcaatt ttgccccttc caatttgtgg aagccttttt tcagtaacac gcttaggcat 6540
aatgaaagat cggtgtatta agtattaaca ttttctaact tgtgcaataa taattattcg 6600
gggttgtcga agaacttcca aacagtagac cgatccattt tccacattat tctaatgaag 6660
ccaagactca aggatggggg gaaatatccc cccacacccc ccaatgagac tacccaagac 6720
agcccgtatg ccgacagcga cacagttaaa tatcaatgtg tattaataca tatcaacaag 6780
tatcaacaca cacaattaaa caataataca catcaatgga gaacaataca catgccaaca 6840
caagaataca cacggacaaa cattacatta ccagaacatg ttagagcaat gattaaagag 6900
tacaataaaa gaagtacatg gggagacctc aacgtatcag cagtatgctc taatgcaata 6960
gcagacagaa ttagagctac attcccaaaa ttagaaaaag aactatttcc agaacaattt 7020
ccagaactta acccaaaaat gacaaaaacc agctcaccag gacaaccaga aataacacaa 7080
aaaggaaaat ccaaacaagg agactctaaa gatagaatat gcgcttattg tggccaacct 7140
tttgaaccga aatcgcataa tcaaaaattc tgtaaagatg catgtaagtc agcaaattat 7200
agaaaaaaca aaaaaacaca gagttaaacc cattaaccac actctttttt tgaatttatc 7260
tgcatttcac ggtacttttt atccaagaaa gcccacaaat cacgctcttt aaacggtttc 7320
atggaaaaat tttcccggaa tgcattaatt aacatctttt caattttagg gttgaaataa 7380
gccccataac ggtaatctgg cgaccaatct gaagctttaa cctcttcata agtccgatac 7440
ggcacattac ccggaagaag cccaggaacc acaagcagat aatagatata gcaccttata 7500
cacatatgtg attttttagt agtctttaac cattcaatat atgaaagatc cgcacctgtt 7560
cgataatcct caaaaagaat taagttcctt tgcctccgag atccacacac acagcaatac 7620
ttcaattcca taatacataa caccccgaaa taataagaca tctgaaaaac cgtatcactt 7680
taggctttaa gcatcttatc cggaccttcg agcccaaaag ccttgttgaa cgtggcatct 7740
caatcacccc caaacatcat ggagcgtgat tttaagcttg taaatagctc ttcataatta 7800
atttcggaag ccttttgcaa gctgttagaa ggcatttcag gcgattcttc aattatacag 7860
ccatcatgct cccattgatg agagtcaacc accaggaagc cggcaggggg atcaggaagc 7920
ccttctaaga accatacccg aagaagactc ccggcaggtt caagcttcaa aaactccggt 7980
aattcatcca ctttgaaggg agaagcccat aatttacgcc attttttagg aactttgttt 8040
ttgccatctc gcccttttag gttatgataa aaattatttc ttgcaattaa ttgttgcaag 8100
taatcggcat attcaggttt aaccgcttta gcttccttca aataagcatg tagagcctgt 8160
cttccacccg aaaaatgatc ccgaagcttt gttaacggta tccatccagt atcatcgttt 8220
tcctgtcctt cccacttcaa ctctccatta taaacgagtt ttacttctcg accttcattg 8280
attaaattaa ggacttcggt tctggtatct atcaattgct caaatgtcag ctttccggag 8340
gaacttacaa ctttatcagg atgccaccgg aacaaagcac caaagcgaga ttctatatgg 8400
atattaccgt atctgttatc cgtgagctgc ccaacgtgag aataaagata agtcacctgc 8460
ttgtaaatat ccataaggct ccgcaattcc cattgccttt taccattgac tttatgagaa 8520
agcctctgaa taaatatatc atattcatca ctcttgcatc tctttttact cttcggattc 8580
tttccagtta tacgaatgtt tccagggaaa atgaaaaaat gaaaatgagg agcaaggata 8640
aggcagtcat aaatagagtt tatttcgata tttagcaagt ccgcgatctt gtttaaattg 8700
ccttcgttgt ggtcgtctct tatgtaattc caaaaagctt cggagtcgtc attacctttt 8760
aaacctgtta acttacggat agcccgagtt atttccggct taatcctgta agggtgaaag 8820
attgtagtac cagcagttac gccccagcgt tccagcctgt cctttaaatt cctccggaaa 8880
agtcggattg cttccacaga tactccccgg ctaaagtcca tcgaagcaaa cccccatgaa 8940
ggaaactgcc cagaaaacag ggcataagtc cacaaaatta caactaatgc aaatctatgt 9000
tgcaattccg ataggatgcc gcaaccagga caagaaagtg tattgcagtg agaattaaga 9060
tcctttcgtg cattataatt ttcagataca gcataagtga aaggacgccc acagtaagcg 9120
ggtctttttc cctttgctgg aagaacaaag tcgccaactt ttagaggacg atacttagag 9180
catttagaaa aatcgaagtc aggacaagag tagtatttac agatagaaac cccgttcttt 9240
ttgttgcgaa ccgggcacaa aacaccatcg gtacatatac acgtcgcaaa atctctacac 9300
tctggagcat aggaaacggc gccaggtcta gaactaaaat cagaactcag agaacatttc 9360
ctgtcgaaaa tttaaaccgt aaaccaaaga taacaatttt cataatatta cagaacctat 9420
attttttgta actcgacatt acaaaaatgt accacaaaac ataaaaacat tttcatagaa 9480
gaaatattca caaacaatag aaaaaaatta taagaataag attaacgcct accttattaa 9540
aagaaggtgt cgagtcttca ggttccatca aggcaggcgt tgatattcta tatatgttac 9600
acataacata tataacatac gtacctcaga acattcagac ctgaatgctc taaaatgaaa 9660
taagctttaa actttataaa ttcatctgct ataaatagtt ttagagatat agaaagccca 9720
aggaagaaaa agaatagcaa aaataaaaaa gaaaaacggc ccgcgacggc aaacccggag 9780
acttataatc aaagtaagac gaaaaggaag ccgacaacga tttgataata acaaatcatc 9840
ttttattttg gcaatattca tatgatatat gaagaaatca acatcaagcg gattagtatt 9900
tttgctattt gtaaatcaat atcgggtgag acagtatatc aaaaacaaac ttcatttttt 9960
tcgaacaaaa aaatcactat caaatgacat tgtagtaaga aactacatca aaactagttg 10020
atcatatcgt caattattac ctccacgggg agagcctgag caaactggcc tcaggcattt 10080
gagaagcaca cggtcacact gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca 10140
taagcggcta tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaat 10200
ttctgccatt catccgctta ttatcactta ttcaggcgta gcaccaggcg tttaagggca 10260
ccaataactg ccttaaaaaa attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa 10320
ttcattaagc attctgccga catggaagcc atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc 10380
cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga aaacgggggc 10440
gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt 10500
ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc 10560
gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc 10620
actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac 10680
actatcccat atcaccagct caccgtcttt cattgccata cg 10722
<210> 16
<211> 14004
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> pAC:Pmcr-MVA1-IDI-IspS
<400> 16
tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 60
tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 120
aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 180
gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 240
actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 300
gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 360
agcgctagcg gagtgtatac tggcttacta tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt 420
gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg 480
atatattccg cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg 540
gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg 600
gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt tccataggct ccgcccccct gacaagcatc 660
acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 720
cgtttccccc tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg 780
tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag 840
gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc 900
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca 960
gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta 1020
aactgaaagg acaagttttg gtgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga 1080
gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga 1140
gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc tcaagaagat catcttatta atcagataaa 1200
atatttctag atttcagtgc aatttatctc ttcaaatgta gcacctgaag tcagccccat 1260
acgatataag ttgtaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctt gcatgcatct 1320
tctattttca tcttaatttt atatattaaa ggctaatttt tcaatatttt atcgcaaact 1380
attgtgttaa ttacatcaaa tatataaact tttctattta aagctaatga aaaagtgaat 1440
atatacacat agagtaatgt tatgatgtat atatcaaaaa aataggagtg attcctatga 1500
ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtcccccgg gccgtacgca 1560
ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgac ccggaccgcc 1620
acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg 1680
gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg 1740
tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc 1800
ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg 1860
cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg 1920
ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga 1980
cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg 2040
tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgagtta 2100
attactaatt tattattaat ttattattag attgggcaaa atagtaaaag aaaactaaag 2160
gaaacctaat atggtttcct ttttttatat atttttaaaa attgattata ttatatgtaa 2220
acaattataa ttaatgttaa tcgaattcaa tttttattta ataaacggcg cgccacgcgt 2280
ccttcaattg ccgcgatcgt taattaaatg atttttaaaa aaatacatga attcatctag 2340
cggagaacac aaaagattta agtaccttct aaacgaatga gatttcattg ggaaagtgga 2400
cacttaagaa cgacgcggta cttgatttat tgagtgcaaa agcactcgat taggtgacca 2460
gtcccaaagt gattttaata aattaaggag gaaattaaaa tgaggaagag aataaaaaga 2520
tcaaccggtg atttcatgtt tttaaatgat tatgaacttg gtgaggaaga aaagcttctt 2580
ttacagaagg ttcttgatgg agatatagcc tttcgtaaga tcgaagagtt tgcagagccg 2640
ctaacagccg taaaaattcg gagacttgct attcaggagt acgcaaaact cgaatttgaa 2700
cacatccaga acttctcttt agatgtagaa attgtgacaa agagaaacat tgaaaacatg 2760
ataggagcag ttcagatccc tctggggact gccggccttc tgaaagtaaa cggggaatat 2820
gcagacgccg aatactatat ccctctggct acaacggaag gagcccttgt tgccagtgta 2880
aaccgcggat gttcggtcat cacaaagtca ggcggggcaa atgtcagagt gtttgaagat 2940
gaaatgacca gagctccggt cttcaagctt gaaagccttg acagagccaa gaaattttat 3000
gaatgggtaa agcgtcccga gattttcgag cagatgaaag aggttgctga aaagacgacc 3060
aggtttggca agctggtttc ggtaaagcct ttcgttaccg ggacgtatgt ctatctccgg 3120
ttttcctatg acacaaaaga tgcgatgggc atgaatatgg tgaccatagc cactgatgcg 3180
gtgatgcacc tcatagaaga cgaatttggc gcgcatccca ttaccctttc gagcaatatg 3240
tgcacagaca aaaaacctgc gtccataagt accattctcg ggagaggaaa gaccgtggtt 3300
gccgaagtaa ctatccctga agagatagtc aaggagactc tcaagtgtac ccctgagtca 3360
atgtttgaag tgaattacag taaaaacctg cttggttcgg caagagccgg agccatggga 3420
tttaatgccc atgctgcaaa cgtcatcgct gctctttacc ttgcctgcgg gcaggacgct 3480
gcccacgtcg ttgaaggcag caccgcaatt acgagtatgg aacttacaaa atacggggag 3540
atacactgct cggtcaccct gccagctctt cctgtcggca cggtgggcgg aggcaccggc 3600
cttggaaccc agagggattg cctcaatatc cttggggtgg caggagcagg agacgagccc 3660
ggcataaact cgctaaagtt tgcagaaatc gtggcctctg cagtacttgc aggggagatt 3720
tcccttatag gggcacaggc agccggacac ctggcacgcg cacatgcaca actcggacgc 3780
ggaaagttct gaacaaatta gttaaaaggt ctaaagatga ctatcggaat tgtatcttac 3840
ggtgcttatg tcccgagata ccggataaaa attgaagaaa tcgcccggct ctggggtgat 3900
gacgccgagg ctctcaaaaa tggcctcatg gtgtacgaaa agtccgtgcc tgatgtcgac 3960
gaagacgcag caacgattgc agtggaagcg gcaagatatg caatggcaag aagcggcgta 4020
gatccctcca gaatcggggc ggtgtacacg ggttcagaaa gtcatcccta cgctgtaaaa 4080
cctacaagca ccatcgtcgc ccaggctatc ggcgcaaccc ccgaaatgac tgcagcagac 4140
tttgagtttg cctgtaaagc aggaacagcc gcagttcagg cctgtatggg cctcgtgggc 4200
tcgggaatga tcgaccttgg cctggccatc ggagcagacg tttcccaggg agccccaagc 4260
gatgcccttg aatacactgc agctgcaggc ggagttgcct gcctgatcgg aagaaaagaa 4320
tccgaacttg ccgcaatcat tgaagataca tactctttta caacggatac ccctgacttc 4380
tggagaaggg aaggaatgcc ctatcccgaa catggaggca ggtttacggg agagcccgga 4440
tacttcaagc acgtgacaaa cggcgcaaaa gggctgcttg aaaaactcgg gacaaaacct 4500
gaagattatg attatgcagt cttccaccag ccaaacggga aattccctag caaagctgca 4560
aagatactcg ggtttacaaa agcccagatt actcccggac ttgttgtccc gaaaataggg 4620
aacacctatt ctggttcctg cctgatggga attgctgcaa cccttgacca ggcaaagccc 4680
ggagaccgta tttttgcaac cgccttcggg tcaggagcag ggtccgacgc gttcagcata 4740
acagttaccg acaggattga ggaaatccga aatagggctc cgaaggtttc cgaacttatc 4800
aaggatcccg tatacatcga ctacgcaagg tatgccaggc ataaaggcaa gatccgtctg 4860
gcctgaacaa attagttaaa aggtctaaag atgactgccg acaacaatag tatgccccat 4920
ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa 4980
gagtttcctg aaattattcc attacaacaa agacctaata cccgatctag tgagacgtca 5040
aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg 5100
aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa 5160
gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt 5220
attttcaatg aacaaggtga attactttta caacaaagag ccactgaaaa aataactttc 5280
cctgatcttt ggactaacac atgctgctct catccactat gtattgatga cgaattaggt 5340
ttgaagggta agctagacga taagattaag ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta 5400
gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta 5460
aacagaatcc attacatggc accaagcaat gaaccatggg gtgaacatga aattgattac 5520
atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa 5580
gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt 5640
tacaagttta cgccttggtt taagattatt tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag 5700
caattagatg acctttctga agtggaaaat gacaggcaaa ttcatagaat gctataaaca 5760
aattagttaa aaggtctaaa gatggaagcc agacggtctg ccaattatga accaaatagc 5820
tgggattatg attttttgct gtcttcagac actgacgaat cgattgaagt atacaaagac 5880
aaggccaaaa agctggaggc tgaggtgaga agagagatta acaatgaaaa ggcagagttt 5940
ttgactctgc ttgaactgat agataatgtc caaaggttag gattgggtta ccggttcgag 6000
agtgacataa ggagagccct cgacagattt gtttcttcag gaggatttga tggtgttaca 6060
aaaactagcc ttcatgctac tgctcttagc ttcaggcttc tcagacagca tggctttgag 6120
gtctctcaag aagcgttcag tggattcaag gatcaaaatg gcaatttctt ggaaaacctt 6180
aaggaggaca ccaaggcaat actaagccta tatgaagctt catttcttgc attagaagga 6240
gaaaatatct tggatgaggc cagggtgttt gcaatatcac atctaaaaga gctcagcgaa 6300
gaaaagattg gaaaagagct ggccgaacag gtgaatcatg cattggagct tccattgcat 6360
cgcaggacgc aaagactaga agctgtttgg agtattgaag cataccgtaa aaaggaagat 6420
gcaaatcaag tactgctaga acttgctata ttggactaca acatgattca atcagtatac 6480
caaagagatc ttcgcgagac atcaaggtgg tggaggcgag tgggtcttgc aacaaagttg 6540
cattttgcta aagacaggtt aattgaaagc ttttactggg cagttggagt tgcgttcgaa 6600
cctcaataca gtgattgccg taattcagta gcaaaaatgt tttcatttgt aacaatcatt 6660
gatgatatct atgatgttta tggtactctg gatgagctgg agctatttac agatgctgtt 6720
gagagatggg atgttaacgc catcaatgat cttccggatt atatgaagct ctgcttccta 6780
gctctctaca acactatcaa tgagatagct tatgacaatc tgaaggacaa gggggaaaac 6840
attcttccat acctaacaaa agcgtgggca gatttatgca atgcattcct acaagaagca 6900
aaatggctgt acaataagtc cacaccaaca tttgatgact atttcggaaa tgcatggaaa 6960
tcatcctcag ggcctcttca actaattttt gcctactttg ccgtggttca aaacatcaag 7020
aaagaggaaa ttgaaaactt acaaaagtat catgatatca tcagtaggcc ttcccacatc 7080
tttcgtcttt gcaacgacct ggcttcagca tcggctgaga tagcgagagg tgaaactgcg 7140
aattccgtat cctgctacat gcgtacaaaa ggcatttctg aggaacttgc tactgaatcc 7200
gtaatgaatt tgatcgacga aacctgtaaa aagatgaaca aagaaaagct tggtggctct 7260
ttgtttgcaa aaccttttgt cgaaacagct attaaccttg cacggcaatc ccattgcact 7320
tatcataacg gagatgcgca tacttcacca gacgagctaa ctaggaaacg tgtcctgtca 7380
gtaatcacag agcctattct accctttgag agataaactc aataaattaa acaacttaaa 7440
acagagcagg ccttcgggcc tgctttttct ttctttcccg agtcccgcct cgggagggcg 7500
gtgtcctttc cgccccgaat tgcgcatcgg gagcacgcgg tccttttcgc tcgctttgct 7560
ctctcaagag gactaattta caaaattaca tattgagagc gcggccgcac tagtaagtta 7620
tagaaatgtc atccgatacc gaaaaagaaa acggaataaa tcagtaacaa atcaaaaaaa 7680
caaaactata acatttaatc ttcgtaaaat caatatcaat cgaccataca caaaacatgt 7740
tcaaataaaa tacatgggtg tacatatgtc aaccgacatt gaaaaagaaa acggaataaa 7800
tcagtaacaa atcaaaaaaa caaaaccata acatttctat aacattccat agagtaaaaa 7860
tcaacatcga ataaccttac acaaaccata cataaaccat acataaaaat acacatatgt 7920
caaccgttac cgtaaaaaga ttacttaaat aattttatac tcacctctta ttttttgtgt 7980
tttttattat ccagggcaac ctttcccagg gagaaattct tccttgcagt tgcaggcaag 8040
aaccaggact ttcttccagg gcatactttc ccagggagaa attcttcctt gcagctgcag 8100
gcaagaacca ggactttccc ccaggaccag gacctcaagg tctgcatcca gaggaagacc 8160
ttcccagggc gccaagatcc cgcagattat ggaacattat ttcccgggaa ataattcagg 8220
gcttaatgcc caactgagga atacatttta aataagcttc tcttagttca tccttttcta 8280
tgtggtcgta cacgtctatt gcttcgcctc tcgaatctcc ccttaattcc tgaatgaatg 8340
tcctttccat acctgaacgt cgaagccatg tagtgaacca atgccggcag caatgcggag 8400
taaaatgttc ttcaagtctc ccctcggggt tatggagtcc gatagaggaa gcggcagatg 8460
tgacaatatc gtacactaaa tttctttgta cacggtgacc gttttgtctg cctatgaata 8520
atgctttttc tttatcatgc ctcgtgttaa ggtacgcttc caggaaggcc ttagtctcaa 8580
ggtcaaagaa tacgatacga tttgaccttt tagctgtctt cttgagtctc accgtacact 8640
tttccagatc tatgtcagct cgatcaagag taattaattc atttctcctg atgccagttt 8700
tagctaaaaa gattatcaat gcttgataca tggggtaacg tggtactttg acaagctttg 8760
ccatgtcttc aatggtaatc aattgccttg tttccggagt atggtatttt ttgtagcttc 8820
ttagatagcg ttttctgaac gtgggaatgt tgtttctctc gattatatgc ttgaattcaa 8880
ggaagtcaaa aaaggtactc agtgaagcaa agtaattgtt acaggttgcg agtgtgtact 8940
gcctttcatc tcttatgtga acaaggaacc cttcaagctc cggaaaccct gcattcactc 9000
cacacatttg aaggaaaaac ttagcatgac ttacgtatcc ttctattgtt cttttagagt 9060
aaccccttcc gatacaatca gaagtgaata aacttataag tctttcatta tcaagcggtt 9120
catagatacc agttagctga atagctgcca tttcacccat aaatcaataa aagaagtatg 9180
taaataaata ctttgtgcat agatgtcatt taaacacaaa gtataagtac atctaccttc 9240
ttttagtata tgctggtaac agcaaaaaag cgccaaacaa cgcatcttta cccaatagaa 9300
tgacgtcgat taaaagagta agttggtggt gagccttaaa aaaggtaaaa gagagcttac 9360
tcttaagtta aaaacggaat tggcaaacag taaggattgt tccagcagtc cttactaaaa 9420
acattacttt attaattcta tatagtcaca acattcacaa aaataggctt ttttctcgat 9480
ttttcctttt gaatgtttat aaagaaaaat catatagcat ttattacact gtggacatat 9540
tttcttttca attttgcccc ttccaatttg tggaagcctt ttttcagtaa cacgcttagg 9600
cataatgaaa gatcggtgta ttaagtatta acattttcta acttgtgcaa taataattat 9660
tcggggttgt cgaagaactt ccaaacagta gaccgatcca ttttccacat tattctaatg 9720
aagccaagac tcaaggatgg ggggaaatat ccccccacac cccccaatga gactacccaa 9780
gacagcccgt atgccgacag cgacacagtt aaatatcaat gtgtattaat acatatcaac 9840
aagtatcaac acacacaatt aaacaataat acacatcaat ggagaacaat acacatgcca 9900
acacaagaat acacacggac aaacattaca ttaccagaac atgttagagc aatgattaaa 9960
gagtacaata aaagaagtac atggggagac ctcaacgtat cagcagtatg ctctaatgca 10020
atagcagaca gaattagagc tacattccca aaattagaaa aagaactatt tccagaacaa 10080
tttccagaac ttaacccaaa aatgacaaaa accagctcac caggacaacc agaaataaca 10140
caaaaaggaa aatccaaaca aggagactct aaagatagaa tatgcgctta ttgtggccaa 10200
ccttttgaac cgaaatcgca taatcaaaaa ttctgtaaag atgcatgtaa gtcagcaaat 10260
tatagaaaaa acaaaaaaac acagagttaa acccattaac cacactcttt ttttgaattt 10320
atctgcattt cacggtactt tttatccaag aaagcccaca aatcacgctc tttaaacggt 10380
ttcatggaaa aattttcccg gaatgcatta attaacatct tttcaatttt agggttgaaa 10440
taagccccat aacggtaatc tggcgaccaa tctgaagctt taacctcttc ataagtccga 10500
tacggcacat tacccggaag aagcccagga accacaagca gataatagat atagcacctt 10560
atacacatat gtgatttttt agtagtcttt aaccattcaa tatatgaaag atccgcacct 10620
gttcgataat cctcaaaaag aattaagttc ctttgcctcc gagatccaca cacacagcaa 10680
tacttcaatt ccataataca taacaccccg aaataataag acatctgaaa aaccgtatca 10740
ctttaggctt taagcatctt atccggacct tcgagcccaa aagccttgtt gaacgtggca 10800
tctcaatcac ccccaaacat catggagcgt gattttaagc ttgtaaatag ctcttcataa 10860
ttaatttcgg aagccttttg caagctgtta gaaggcattt caggcgattc ttcaattata 10920
cagccatcat gctcccattg atgagagtca accaccagga agccggcagg gggatcagga 10980
agcccttcta agaaccatac ccgaagaaga ctcccggcag gttcaagctt caaaaactcc 11040
ggtaattcat ccactttgaa gggagaagcc cataatttac gccatttttt aggaactttg 11100
tttttgccat ctcgcccttt taggttatga taaaaattat ttcttgcaat taattgttgc 11160
aagtaatcgg catattcagg tttaaccgct ttagcttcct tcaaataagc atgtagagcc 11220
tgtcttccac ccgaaaaatg atcccgaagc tttgttaacg gtatccatcc agtatcatcg 11280
ttttcctgtc cttcccactt caactctcca ttataaacga gttttacttc tcgaccttca 11340
ttgattaaat taaggacttc ggttctggta tctatcaatt gctcaaatgt cagctttccg 11400
gaggaactta caactttatc aggatgccac cggaacaaag caccaaagcg agattctata 11460
tggatattac cgtatctgtt atccgtgagc tgcccaacgt gagaataaag ataagtcacc 11520
tgcttgtaaa tatccataag gctccgcaat tcccattgcc ttttaccatt gactttatga 11580
gaaagcctct gaataaatat atcatattca tcactcttgc atctcttttt actcttcgga 11640
ttctttccag ttatacgaat gtttccaggg aaaatgaaaa aatgaaaatg aggagcaagg 11700
ataaggcagt cataaataga gtttatttcg atatttagca agtccgcgat cttgtttaaa 11760
ttgccttcgt tgtggtcgtc tcttatgtaa ttccaaaaag cttcggagtc gtcattacct 11820
tttaaacctg ttaacttacg gatagcccga gttatttccg gcttaatcct gtaagggtga 11880
aagattgtag taccagcagt tacgccccag cgttccagcc tgtcctttaa attcctccgg 11940
aaaagtcgga ttgcttccac agatactccc cggctaaagt ccatcgaagc aaacccccat 12000
gaaggaaact gcccagaaaa cagggcataa gtccacaaaa ttacaactaa tgcaaatcta 12060
tgttgcaatt ccgataggat gccgcaacca ggacaagaaa gtgtattgca gtgagaatta 12120
agatcctttc gtgcattata attttcagat acagcataag tgaaaggacg cccacagtaa 12180
gcgggtcttt ttccctttgc tggaagaaca aagtcgccaa cttttagagg acgatactta 12240
gagcatttag aaaaatcgaa gtcaggacaa gagtagtatt tacagataga aaccccgttc 12300
tttttgttgc gaaccgggca caaaacacca tcggtacata tacacgtcgc aaaatctcta 12360
cactctggag cataggaaac ggcgccaggt ctagaactaa aatcagaact cagagaacat 12420
ttcctgtcga aaatttaaac cgtaaaccaa agataacaat tttcataata ttacagaacc 12480
tatatttttt gtaactcgac attacaaaaa tgtaccacaa aacataaaaa cattttcata 12540
gaagaaatat tcacaaacaa tagaaaaaaa ttataagaat aagattaacg cctaccttat 12600
taaaagaagg tgtcgagtct tcaggttcca tcaaggcagg cgttgatatt ctatatatgt 12660
tacacataac atatataaca tacgtacctc agaacattca gacctgaatg ctctaaaatg 12720
aaataagctt taaactttat aaattcatct gctataaata gttttagaga tatagaaagc 12780
ccaaggaaga aaaagaatag caaaaataaa aaagaaaaac ggcccgcgac ggcaaacccg 12840
gagacttata atcaaagtaa gacgaaaagg aagccgacaa cgatttgata ataacaaatc 12900
atcttttatt ttggcaatat tcatatgata tatgaagaaa tcaacatcaa gcggattagt 12960
atttttgcta tttgtaaatc aatatcgggt gagacagtat atcaaaaaca aacttcattt 13020
ttttcgaaca aaaaaatcac tatcaaatga cattgtagta agaaactaca tcaaaactag 13080
ttgatcatat cgtcaattat tacctccacg gggagagcct gagcaaactg gcctcaggca 13140
tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa ccagcaatag 13200
acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa tttgctttcg 13260
aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag gcgtttaagg 13320
gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg 13380
taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat gaacctgaat 13440
cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg 13500
ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg 13560
attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc 13620
accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta 13680
ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg 13740
aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaatt ccggatgagc 13800
attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt 13860
tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc 13920
aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt 13980
atatccagtg atttttttct ccat 14004

Claims (45)

1.一种重组细胞，其是厌氧性古生菌的重组细胞，所述重组细胞具有下述基因作为所述第一外源基因：
编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码双萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因、或编码八氢番茄红素合成酶的基因，
该第一外源基因表达，所述重组细胞能够生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其能够以选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种作为唯一碳源进行生长。
3.根据权利要求1或2所述的重组细胞，其具有一氧化碳脱氢酶。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的重组细胞，其具有由甲基四氢蝶呤、一氧化碳及CoA来合成乙酰CoA的功能。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的重组细胞，其具有甲烷生成能力。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的重组细胞，其能够将二氧化碳作为唯一碳源，并将氢作为能源进行生长。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的重组细胞，其能够将甲醇作为唯一碳源进行生长。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的重组细胞，其能够将甲烷作为唯一碳源进行生长。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的重组细胞，其属于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、产甲烷热球菌(Methanothermococcus)属、甲烷热杆菌(Methanothermobacter)属、甲烷丝菌(Methanothrix)属、热球菌(Thermococcus)属、热丝菌(Thermofilum)属、或古生球菌(Archaeoglobus)属。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的重组细胞，其属于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)属、甲烷球菌(Methanococcus)属、或产甲烷热球菌属(Methanothermococcus)属。
11.根据权利要求10所述的重组细胞，其为巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)、梅氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)、万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)或Methanothermococcus(Methanococcus)thermolithotrophicus。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的重组细胞，其还含有编码一氧化碳脱氢酶的基因作为第二外源基因。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因是编码异戊二烯合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产异戊二烯，
所述异戊二烯合成酶源于植物。
14.根据权利要求13所述的重组细胞，其中，
所述异戊二烯合成酶是下述(a-1)、(a-2)或(a-3)的蛋白质：
(a-1)是包含序列编号1所示的氨基酸序列的蛋白质；
(a-2)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(a-3)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号1所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
15.根据权利要求13或14所述的重组细胞，其还含有编码异戊烯二磷酸异构酶的基因作为第三外源基因。
16.根据权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因是编码倍半萜合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产碳原子数为15的萜，
所述倍半萜合成酶是法呢烯合成酶。
17.根据权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因是编码倍半萜合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产碳原子数为15的萜，
所述倍半萜合成酶是环状倍半萜合成酶。
18.根据权利要求16所述的重组细胞，其中，
所述法呢烯合成酶是下述(d-1)、(d-2)或(d-3)的蛋白质：
(d-1)是包含序列编号4所示的氨基酸序列的蛋白质；
(d-2)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(d-3)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号4所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
19.根据权利要求16～18中任一项所述的重组细胞，其还含有编码异戊烯二磷酸异构酶的基因作为第四外源基因。
20.根据权利要求16～19中任一项所述的重组细胞，其还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因及编码法呢基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第五外源基因。
21.根据权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因是编码单萜合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产碳原子数为10的萜，
所述单萜合成酶是环状单萜合成酶。
22.根据权利要求21所述的重组细胞，其还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第六外源基因。
23.根据权利要求21或22所述的重组细胞，其还含有编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因作为第七外源基因。
24.根据权利要求21或22所述的重组细胞，其还含有编码橙花基二磷酸合成酶的基因作为第八外源基因。
25.根据权利要求21～24中任一项所述的重组细胞，其中，
所述环状单萜合成酶是水芹烯合成酶。
26.根据权利要求25所述的重组细胞，其中，
所述水芹烯合成酶是下述(b-1)、(b-2)或(b-3)的蛋白质：
(b-1)是包含序列编号2所示的氨基酸序列的蛋白质；
(b-2)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(b-3)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
27.根据权利要求25所述的重组细胞，其中，
所述水芹烯合成酶是下述(c-1)、(c-2)或(c-3)的蛋白质：
(c-1)是包含序列编号3所示的氨基酸序列的蛋白质；
(c-2)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列通过在序列编号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1～20个氨基酸而形成；
(c-3)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质，其中，所述氨基酸序列与序列编号3所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性。
28.根据权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因是编码双萜合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产碳原子数为20的萜，
所述双萜合成酶是环状双萜合成酶。
29.根据权利要求28所述的重组细胞，其还含有编码柯巴基二磷酸合成酶的基因作为第九外源基因。
30.根据权利要求28或29所述的重组细胞，其还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十外源基因。
31.根据权利要求28～30中任一项所述的重组细胞，其还具有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因、编码法呢基二磷酸合成酶的基因及编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第十一外源基因。
32.根据权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因是编码角鲨烯合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产碳原子数为30的萜，
所述重组细胞还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十二外源基因。
33.根据权利要求32所述的重组细胞，其还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因及编码法呢基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第十三外源基因。
34.根据权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因是编码八氢番茄红素合成酶的基因，
所述重组细胞能够生产碳原子数为40的萜，
所述重组细胞还包含编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十四外源基因。
35.根据权利要求34所述的重组细胞，其还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因、编码法呢基二磷酸合成酶的基因、以及牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶中的至少一种基因作为第十五外源基因。
36.根据权利要求1～35中任一项所述的重组细胞，其还具有选自乙酰乙酰CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸-5-激酶、5-磷酸甲羟戊酸脱羧酶及异戊烯磷酸激酶中的至少一种基因作为第十六外源基因。
37.根据权利要求1～36中任一项所述的重组细胞，其中，
所述第一外源基因在组成型表达启动子下进行了表达。
38.一种异戊二烯或萜的生产方法，其包括：
使权利要求1～37中任一项所述的重组细胞与选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇及乙酸中的至少一种碳源接触，在所述重组细胞中由所述碳源生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
39.根据权利要求38所述的异戊二烯或萜的生产方法，其中，
用选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇及乙酸中的至少一种碳源来培养所述重组细胞，并且从该培养物中取得异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
40.根据权利要求38或39所述的异戊二烯或萜的生产方法，其中，
生长稳定期的培养液的细胞浓度为1g干细胞/L以上，
持续地进行培养基的供应和培养液的排出。
41.根据权利要求38～40中任一项所述的异戊二烯或萜的生产方法，其中，
在培养槽中培养所述重组细胞，并且将包含一氧化碳、二氧化碳及氢气的混合气体供给至所述培养槽。
42.根据权利要求41所述的异戊二烯或萜的生产方法，其中，
所述混合气体的一氧化碳浓度为20％以上。
43.根据权利要求41或42所述的异戊二烯或萜的生成方法，其中，
所述混合气体的二氧化碳浓度为5％以上。
44.根据权利要求41～43中任一项所述的异戊二烯或萜的生成方法，其中，
所述混合气体的硫化氢浓度为10ppm以下。
45.根据权利要求41～44中任一项所述的异戊二烯或萜的生产方法，其中，
进一步向培养液中添加甲醇和/或乙酸。
CN201780052483.1A 2016-10-28 2017-10-25 重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法 Pending CN109689857A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-211836 2016-10-28
JP2016211836 2016-10-28
PCT/JP2017/038551 WO2018079619A1 (ja) 2016-10-28 2017-10-25 組換え細胞、並びに、イソプレン又はテルペンの生産方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109689857A true CN109689857A (zh) 2019-04-26

Family

ID=62023524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780052483.1A Pending CN109689857A (zh) 2016-10-28 2017-10-25 重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190309328A1 (zh)
EP (1) EP3505618A4 (zh)
JP (1) JPWO2018079619A1 (zh)
CN (1) CN109689857A (zh)
WO (1) WO2018079619A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111607546A (zh) * 2020-04-30 2020-09-01 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114181964A (zh) * 2021-11-02 2022-03-15 云南大学 一种表达盒组合、重组载体和重组酿酒酵母及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852600B (zh) * 2018-12-25 2021-12-31 天津大学 一种小萼苔倍半萜合成酶MTb及其基因序列
CN115725638A (zh) * 2022-10-27 2023-03-03 中国科学院天津工业生物技术研究所 单萜生产基因工程菌株及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101484584A (zh) * 2006-05-26 2009-07-15 阿米瑞斯生物技术公司 类异戊二烯的生产
CN101978042A (zh) * 2008-01-22 2011-02-16 基因组股份公司 利用合成气或其它气态碳源和甲醇的方法和有机体
WO2014193473A1 (en) * 2013-05-31 2014-12-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Recombinant anaerobic acetogenic bacteria for production of isoprene and/or industrial bio-products using synthesis gas
CN104789512A (zh) * 2014-01-16 2015-07-22 清华大学 异戊二烯的生产菌以及生产异戊二烯的方法
CN104919038A (zh) * 2012-10-23 2015-09-16 积水化学工业株式会社 重组细胞以及异戊二烯的生产方法
CN105008514A (zh) * 2013-03-07 2015-10-28 凯利斯塔公司 用于生物生产异戊二烯的组合物和方法
CN105189772A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 阿迈瑞斯公司 磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶生产乙酰-辅酶a衍生化合物的用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX284139B (es) * 2006-05-26 2011-02-18 Amyris Biotechnologies Inc Produccion de isoprenoides.
CA2652801C (en) * 2006-05-26 2018-05-22 Amyris Biotechnologies, Inc. Apparatus for making bio-organic compounds
WO2011123567A1 (en) * 2010-03-31 2011-10-06 Codexis, Inc. Production of geranyl diphosphate
WO2014015210A2 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Glycos Biotechnologies, Inc. Microorganisms and processes for the conversion of glycerol to isoprene
US10533192B2 (en) * 2015-12-22 2020-01-14 Nutech Ventures Production of isoprene by methane-producing archaea

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101484584A (zh) * 2006-05-26 2009-07-15 阿米瑞斯生物技术公司 类异戊二烯的生产
CN101978042A (zh) * 2008-01-22 2011-02-16 基因组股份公司 利用合成气或其它气态碳源和甲醇的方法和有机体
CN104919038A (zh) * 2012-10-23 2015-09-16 积水化学工业株式会社 重组细胞以及异戊二烯的生产方法
CN105008514A (zh) * 2013-03-07 2015-10-28 凯利斯塔公司 用于生物生产异戊二烯的组合物和方法
CN105189772A (zh) * 2013-03-15 2015-12-23 阿迈瑞斯公司 磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶生产乙酰-辅酶a衍生化合物的用途
WO2014193473A1 (en) * 2013-05-31 2014-12-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Recombinant anaerobic acetogenic bacteria for production of isoprene and/or industrial bio-products using synthesis gas
CN104789512A (zh) * 2014-01-16 2015-07-22 清华大学 异戊二烯的生产菌以及生产异戊二烯的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111607546A (zh) * 2020-04-30 2020-09-01 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用
CN111607546B (zh) * 2020-04-30 2022-08-09 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114181964A (zh) * 2021-11-02 2022-03-15 云南大学 一种表达盒组合、重组载体和重组酿酒酵母及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3505618A1 (en) 2019-07-03
JPWO2018079619A1 (ja) 2019-09-19
WO2018079619A1 (ja) 2018-05-03
EP3505618A4 (en) 2020-04-22
US20190309328A1 (en) 2019-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lauersen et al. Phototrophic production of heterologous diterpenoids and a hydroxy-functionalized derivative from Chlamydomonas reinhardtii
JP4803739B2 (ja) カロテノイドケトラーゼ及びカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子を利用したアスタキサンチンまたはその代謝物の製造法
CN109689857A (zh) 重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法
Khan et al. Triterpene hydrocarbon production engineered into a metabolically versatile host—Rhodobacter capsulatus
CN107429223A (zh) 从头微生物合成萜类的方法
PT2970934T (pt) Polipèptidos de valenceno sintase, moléculas de ácido nucleico que os codificam e suas utilizações
JP5624974B2 (ja) 新しいカロテノイドケトラーゼ
BRPI0713105A2 (pt) método para produzir um isoprenóide, e, célula hospedeira
Pattanaik et al. Introduction of a green algal squalene synthase enhances squalene accumulation in a strain of Synechocystis sp. PCC 6803
US20110039323A1 (en) Isoprene Production
Styles et al. The heterologous production of terpenes by the thermophile Parageobacillus thermoglucosidasius in a consolidated bioprocess using waste bread
CN108779476A (zh) α-烯烃的生产
CN111088175A (zh) 一种产红没药烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与用途
Leite et al. Engineered cyanobacteria: research and application in bioenergy
US20230126375A1 (en) Engineered bacteria and methods of producing sustainable biomolecules
EP4323508A1 (en) Methods of isoprenoid synthesis using a genetically engineered hydrocarbonoclastic organism in a biofilm bioreactor
US7087403B2 (en) Biological production of tetradehydrolycopene
KR20190097093A (ko) 피토엔의 생산 방법
BR112019027919A2 (pt) micro-organismo com número de cópias estabilizado de sequência de dna funcional e métodos associados
JP5641232B2 (ja) オゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼの遺伝子及び該遺伝子を利用するプロスタグランジン類生産方法
Halfmann The Synthetic Biology of N2-Fixing Cyanobacteria for Photosynthetic Terpenoid Production
CA3203103A1 (en) Methods for producing biochemicals using enzyme genes derived from a strain of brevundimonas, and compositions made thereby
CN116555133A (zh) 一种用于生产虾青素的转基因蓝藻及其应用
Rautela et al. Photosynthetic Production of Α-Farnesene by Engineered Synechococcus Elongatus Utex 2973 from Co2
Jin et al. Activated Biosynthetic Genetic Module Chassis for Microbial Zeaxanthin Manufacturing Through Sphingomonasarvum Sp. Nov. Genome Mining

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190426

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication