CN115725638A - 单萜生产基因工程菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组酿酒酵母及其构建方法和应用。该重组酿酒酵母的构建方法，包括：将桉叶素合酶基因及其突变体导入酿酒酵母，得到产桉叶素、柠檬烯和/或月桂烯的重组酿酒酵母。本发明为单萜的生物合成方面提供有力菌株及研究基础，对高活性单萜合成酶的挖掘具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及单萜生产基因工程菌株的构建方法，以及利用该工程菌株发酵生产单萜物质的应用。
背景技术
单萜类化合物是分子中含有两分子异戊二烯单位的萜烯及其衍生物。按其结构分类包括：无环单萜(包括月桂烯、香叶醇、芳樟醇等)，单环单萜(包括柠檬烯、萜品烯、萜品油烯等)，多环单萜(包括蒎烯、桧烯、桉叶素等)。因其药用价值及其在食品、化妆品、能源工业中存在的巨大应用潜力，吸引了广泛关注。
目前，单萜类化合物主要通过从天然植物中提取或者化学合成得到，但是这些方法产率低，高度依赖原料的可利用性。同时，产生的废弃物成分复杂，污染环境，给后续处理带来困难。随着合成生物学技术和代谢工程的发展，改造微生物使其成为高附加值化学品合成的细胞工厂，为萜类化合物的合成开辟了绿色清洁生产的新途径。
酵母中天然存在合成萜类物质前体化合物的甲羟戊酸(MVA)途径，且酵母遗传背景清楚、操作简单、发酵性能好，因此是合成萜类化合物的优良细胞工厂。酵母MVA途径代谢物香叶基焦磷酸酯(GPP)、在不同单萜合酶的作用下生成单萜类物质。目前通过对酵母进行MVA途径、单萜合酶挖掘、发酵工艺优化等一系列工程调控，最终使单萜物质产量有所提高，但仍达不到工业应用要求。
发明内容
本发明提供单萜生产基因工程菌株的构建方法，以及利用该工程菌株发酵生产单萜物质的应用。
本发明的一个目的是提供产单萜物质的重组基因工程菌的构建方法。
本发明提供了一种产单萜物质的重组基因工程菌的构建方法，包括：将桉叶素合成酶基因导入基因工程菌，得到产桉叶素的重组基因工程菌。
根据本发明的实施方案，所述宿主菌为酿酒酵母、解脂耶氏酵母、克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母等酵母中的任一种。可选地，所述出发酿酒酵母为TIBH1(中国专利202110934151.4)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21000。
根据本发明的实施方案，所述酵母为能够积累牻牛儿基二磷酸盐(GPP)的酿酒酵母。
可选地，根据上述的构建方法，所述桉叶素合成酶基因来源于炭团菌属。
可选地，根据上述的构建方法，所述桉叶素合成酶基因编码的桉叶素合成酶氨基酸序列为SEQ ID No.9所示。
可选地，根据上述的构建方法，所述基因工程菌为提高出发菌中法尼基焦磷酸合成酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A tHMG1、乙酰辅酶A酰基转移酶mvaE、HMG-CoA合成酶mvaS-m、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、甲羟戊酸激酶ERG12、MVAP激酶ERG8和/或MVAPP脱羧酶ERG19的含量和/或活性，和/或降低出发菌中半乳糖调节基因Gal80基因表达得到的菌，和/或动态调控关键ERG20基因表达。例如，提高酶的含量和/或活性通过增加所述出发菌相应酶基因的拷贝数实现，降低Gal80基因表达通过敲除所述出发菌Gal80基因实现，动态调控关键ERG20基因表达通过将其启动子替换为ERG1基因表达启动子。
可选地，根据上述的构建方法，包括：对所述出发菌还进行如下至少一种改造，获得所述基因工程菌：A1、导入法尼基焦磷酸合成酶基因96位和127位双点突变基因ERG20F96W /N127W基因；A2、导入tHMG1基因；A3、导入mvaE基因；A4、导入mvaS-m基因；A5、导入IDI1基因；A6、导入ERG12基因；A7、导入ERG8基因；A8、导入ERG19基因；A9、敲除Gal80基因；A10、替换ERG20启动子。
可选地，所述ERG20F96W/N127W基因编码的ERG20F96W/N127W蛋白质的序列如SEQ IDNo.10所示；和/或，所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为Genbank登陆号：AJS96703.1序列第530-1054位所示；和/或，所述mvaE基因编码的mvaE蛋白质的序列为Genbank登陆号AAG02439.1所示；和/或，所述mvaS-m基因编码的mvaS-m蛋白质的序列为Genbank登陆号AAG02438.1第110位丙氨酸替换为甘氨酸所示；和/或，所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为Genbank登陆号：NP_015208.1序列所示；和/或，所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为Genbank登陆号：NP_013935.1序列所示；和/或，所述ERG8基因编码的ERG8蛋白质的序列为Genbank登陆号：NP_013947.1序列所示；和/或，所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为Genbank登陆号：NP_014441.1序列所示。
可选地，所述ERG20F96W/N127W基因序列如SEQ ID No.1第722-1780位所示；和/或，所述tHMG1基因序列如SEQ ID No.2第800-2383位所示；和/或，所述mvaE基因序列如SEQIDNo.3第270-2681位的反向互补所示；和/或，所述mvaS-m基因序列如SEQ ID No.3第3358-4509位所示；和/或，所述IDI1基因序列如SEQ ID No.4第270-1136位的反向互补所示；和/或，所述ERG12基因序列如SEQ ID No.4第1813-3144位所示；和/或，所述ERG8基因序列如SEQ ID No.5第333-1688位的反向互补所示；和/或，所述ERG19基因序列如SEQ IDNo.5第2365-3555位所示。
可选地，根据上述的构建方法，所述将桉叶素合成酶基因导入出发菌通过向所述出发菌导入桉叶素合成酶基因表达盒实现；和/或，所述A1通过向所述出发菌导入ERG20F96W /N127W基因表达盒实现；和/或，所述A2通过向所述出发菌导入tHMG1基因表达盒实现；和/或，所述A3通过向所述出发菌导入mvaE基因表达盒实现；和/或，所述A4通过向所述出发菌导入mvaS-m基因表达盒实现；和/或，所述A5通过向所述出发菌导入IDI1基因表达盒实现；和/或，所述A6通过向所述出发菌导入ERG12基因表达盒实现；和/或，所述A7通过向所述出发菌导入ERG8基因表达盒实现；和/或，所述A8通过向所述出发菌导入ERG19基因表达盒实现；和/或，所述A9通过CRISPR/CAS9系统敲除所述出发菌中的Gal80基因实现；和/或，所述A10通过CRISPR/CAS9系统替换出发菌中的ERG20基因实现。
可选地，根据上述的构建方法，所述桉叶素合成酶基因表达盒包括启动子、所述桉叶素合成酶基因和/或其突变体基因和终止子，所述启动子为Gal2；所述终止子为CYC1。例如，所述桉叶素合成酶基因表达盒序列为SEQ ID No.6的72-2114位所示。
可选地，根据上述的构建方法，所述ERG20F96W/N127W基因表达盒序列如SEQ ID No.1第54-2141位所示；和/或，所述tHMG1基因表达盒序列如SEQ ID No.2第75-2769位所示；和/或，所述mvaE基因表达盒序列如SEQ ID No.3第78-3357位的反向互补所示；和/或，所述mvaS-m基因表达盒序列如SEQ ID No.3第2682-4728位所示；和/或，所述IDI1基因表达盒序列如SEQ ID No.4第69-1812位的反向互补所示；和/或，所述ERG12基因表达盒序列如SEQID No.4第1137-3256位所示；和/或，所述ERG8基因表达盒序列如SEQ ID No.5第74-2364位的反向互补所示；和/或，所述ERG19基因表达盒序列如SEQ ID No.5第1689-3774位所示。
通过CRISPR/CAS9系统敲除所述出发菌中的Gal80基因具体可为将CAS9基因、gRNA基因和Gal80同源重组片段导入所述出发菌，并使CAS9基因和gRNA基因表达。所述gRNA基因编码的gRNA片段靶向Gal80基因。Gal80同源重组片段例如可为SEQ ID No.7所示。
通过CRISPR/CAS9系统替换所述出发菌中的ERG20基因启动子具体可为将CAS9基因、gRNA基因和ERG1启动子片段导入所述工程菌，并使CAS9基因和gRNA基因表达。所述gRNA基因编码的gRNA片段靶向ERG20启动子。ERG1启动子同源重组片段例如可为SEQ ID No.8所示。由此，将其构建为动态调控启动子，受胞内麦角甾醇的调控。
采用上述的构建方法构建的重组菌也属于本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供生产桉叶素的方法。
本发明提供了生产桉叶素的方法，包括培养上述重组基因工程菌，得到发酵产物，即得到桉叶素。
本发明还提供了下述任一一种应用，X1、上述的构建方法在制备生产桉叶素产品中的应用；X2、上述的构建方法在生产桉叶素中的应用；X3、上述的重组基因工程菌在制备生产桉叶素产品中的应用；X4、上述的重组基因工程菌在生产桉叶素中的应用；X5、桉叶素合酶在制备生产桉叶素产品中的应用；X6、桉叶素合酶在生产桉叶素中的应用。可选地，上述应用中，所述桉叶素合成酶基因来源于炭团菌。例如，所述桉叶素合酶基因编码的桉叶素合成酶氨基酸序列为(SEQ ID No.9)所示。又例如，所述桉叶素合成酶基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.6第777-1895位所示。
桉叶素是许多不同植物精油的重要组成部分，它是一种单萜物质。本发明实施例通过对酿酒酵母中MVA途径进行强化及导入桉叶素合成酶基因，构建出产桉叶素的重组基因工程菌；为单萜的生物合成方面提供有力菌株及研究基础；更进一步地，通过生产工艺的优化，大大提高了菌株的单萜生产能力，具有重要应用价值。
附图说明
图1桉叶素合酶酿酒酵母菌株摇瓶发酵桉叶素水平。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值表示。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TIB H1，已于2020年11月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21000。
YPD培养基，每L体积YPD培养基包含：20g蛋白胨，10g酵母提取物，20g葡萄糖，20g琼脂粉(YPD固体培养基添加)。
无尿嘧啶添加的SD平板：每L体积无尿嘧啶添加的SD培养基含：8g Ura minusmeida(北京泛基诺科技有限公司)，20g琼脂粉，20g葡萄糖。
含5-氟乳清酸的SD平板，每L体积含5-氟乳清酸的SD含：8g Ura minus meida(北京泛基诺科技有限公司)，20g琼脂粉，20g葡萄糖，尿嘧啶60mg，5-氟乳清酸1g。
Delft液体培养基，每L体积Delft液体培养基包含：20g葡萄糖，7.5g硫酸铵，0.5g七水硫酸镁，14.4g磷酸二氢钾，2ml微量金属盐母液(1L体积中含3.0g七水硫酸铁，4.5g七水硫酸锌，4.5g二水氯化钙，0.84g二水氯化锰，0.3g六水氯化钴，0.3g五水硫酸铜，0.4g二水钼酸钠，1.0g硼酸，0.1g碘化钾，19.0g乙二胺四乙酸二钠盐)，1ml维他命母液(1L体积中含0.05g D-生物素，1.0g D-泛酸，1.0g维生素B1，1.0g吡哆醇，1.0g烟酸，0.2g 4-氨基苯酸，25.0g肌醇)，60mg尿嘧啶。
下述实施例中的基因片段和蛋白质序列相关信息参见下表。
基因片段和蛋白质序列相关信息
蛋白质相关信息
实施例1、目标基因的制备
1、MVA途径改造相关基因的获得
ERG20F96W-N127W-TERG20、tHMG-Thmg1、IDI1-TIDI1、ERG8-TERG8、ERG12-TERG12、ERG19-TERG19基因及Gal1、Gal2-1、Gal2-2、Gal7、Gal10启动子，ADH、CYC1终止子-1、CYC1终止子-2、Gal80上游片段、Gal80下游片段、ERG1启动子的获得。
提取酵母基因组DNA为模板，使用表1中基因扩增所需引物进行扩增，得到符合预期大小的片段
使用PrimSTARHS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物各1μL，基因组DNA模板1μL，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸2.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
表1为引物序列
2、桉叶素合成酶及mvaS-m、mvaE基因的获得
苏州金唯智生物科技有限公司依照CinS_HE7(GenBank:AHY23922.1，萜烯合酶，来源于炭团菌Hypoxylon)，mvaE(GenBank:AAG02439.1，HMG-CoA还原酶，来源于肠球菌Enterococcus)，mvaS-m(Genbank:AAG02438.1第110位丙氨酸替换为甘氨酸，HMG-CoA合成酶，来源于肠球菌Enterococcus)密码子优化后基因序列人工合成得到双链DNA，然后将双链DNA转化克隆至克隆载体pET28a(苏州金唯智生物科技有限公司)中，分别构建含以上基因的质粒。
使用以上各质粒为模板，表2中基因扩增所需引物进行扩增，得到符合预期大小的片段，产物经割胶回收保存。由此获得CinS_HE7基因(SEQ ID No.6的777-1895位所示)、mvaE基因(SEQ ID No.3的270-2681位的反向互补序列)和mvaS-m基因(SEQ ID No.3的3358-4509位所示)。
表2为引物序列
3、PGal1-ERG20F96W-N127W-TEer20表达元件的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段PGal1，ERG20F96W-N127W-TEer20进行连接扩增，使用PrimSTARHS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PSBuffer10μL，Dntp Mix 4μL，引物PGal1-f及TErg20-r各1μL，基因组DNA模板1μL(PGal1，ERG20F96W-N127W-TEer20各片段添加摩尔比为1：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。获得PGal1-ERG20F96W-N127W-TEer20表达元件。PGal1-ERG20F96W-N127W-TEer20表达元件含有ERG20F96W-N127W表达盒，其表达ERG20F96W-N127W基因，表达产物为ERG20F96W-N127W蛋白质。
4、PGal7-tHMG1-Thmg1表达元件的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段PGal7，tHMG1-Thmg1进行连接扩增，使用PrimSTARHS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer10μL，Dntp Mix 4μL，引物PGal7-f及Thmg1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(PGal7，tHMG-Thmg1各片段添加摩尔比为1：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得PGal7-tHMG1-Thmg1表达元件。PGal7-tHMG1-Thmg1表达元件含有tHMG1表达盒，其表达tHMG1基因，表达产物为tHMG1蛋白质。
5、TADH-mvaE-PGAL1-PGAL10-mvaS-m-TCYC1表达元件的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段TADH，mvaE，PGAL1，PGAL10，mvaS-m，TCYC1进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物TADH1-r及TCYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(TADH，mvaE，PGAL1，PGAL10，mvaS-m，TCYC1各片段摩尔比1：3：5：5：3：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得TADH-mvaE-PGAL1-PGAL10-mvaS-m-TCYC1表达元件。TADH-mvaE-PGAL1-PGAL10-mvaS-m-TCYC1表达元件含有mvaE表达盒和mvaS-m表达盒。mvaE表达盒表达mvaE基因，表达产物为mvaE蛋白质。mvaS-m表达盒表达mvaS-m基因，表达产物为mvaS-m蛋白质。
6、TIDI1-IDI1-PGAL1-PGAL10-ERG12-TERG12表达元件的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段IDI1-TIDI1，PGAL1，PGAL10，ERG12-TERG12进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物TIDI1-r及TERG20-r各1μL，基因组DNA模板1μL(IDI1-TIDI1，PGAL1，PGAL10，ERG12-TERG12各片段摩尔比1：3：3：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得TIDI1-IDI1-PGAL1-PGAL10-ERG12–TERG12表达元件。TIDI1-IDI1-PGAL1-PGAL10-ERG12-TERG12表达元件含有IDI1表达盒和ERG12表达盒。IDI1表达盒表达IDI1基因，表达产物为IDI1蛋白质。ERG12表达盒表达ERG12基因，表达产物为ERG12蛋白质。
7、TERG8-ERG8-PGAL1-PGAL10-ERG19-T ERG19表达元件的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段ERG8-TERG8，PGal1，PGal10，ERG19-TERG19进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物TERG8-r及TCYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(ERG8-TERG8，PGAL1，PGAL10，ERG19-TERG19各片段摩尔比1：3：3：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得TERG8-ERG8-PGAL1-PGAL10-ERG19-Terg19表达元件。TERG8-ERG8-PGAL1-PGAL10-ERG19-Terg19表达元件含有ERG8表达盒和ERG19表达盒。ERG8表达盒表达ERG8基因，表达产物为ERG8蛋白质。ERG19表达盒表达ERG19基因，表达产物为ERG19蛋白质。
8、PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(1)表达元件的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段PGal2-1,CinS_HE7,Tcyc1-1进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PSBuffer10μL，Dntp Mix 4μL，引物PGal2-f及TCYC1-r各1μL，基因组DNA模板1μL(PGal2，CinS_HE7，Tcyc1各片段摩尔比1：3：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(1)表达元件。PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(1)表达元件含有CinS_HE7表达盒，表达CinS_HE7基因，表达产物为CinS_HE7蛋白质。
9、PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(2)表达元件的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段PGal2-2,CinS_HE7,Tcyc1-2进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PSBuffer10μL，Dntp Mix 4μL，引物PGal2-2-f及TCYC1-2-r各1μL，基因组DNA模板1μL(PGal2-2，CinS_HE7，Tcyc1-2各片段摩尔比1：3：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(2)表达元件。PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(2)表达元件含有CinS_HE7表达盒，表达CinS_HE7基因，表达产物为CinS_HE7蛋白质。
10、Gal80同源重组片段的构建
利用Overlap PCR技术将以上获得的片段Gal80上游片段与Gal80下游片段进行连接扩增，使用PrimSTAR HS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物Gal80-up-f及Gal80-down-r各1μL，基因组DNA模板1μL(Gal80上游片段:Gal80下游片段摩尔比1：1)，HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得Gal80同源重组片段，用于Gal80基因的敲除。
实施例2、重组菌的构建
1、酵母感受态的制备
将出发菌单菌落于YPD培养基中30℃，250rpm过夜培养，计数过夜培养物细胞密度，以最终OD600nm0.1的细胞浊度接种20mlYPD培养基。30℃，250rpm培养至OD600nm0.8。使用无菌离心管2500rpm离心5分钟，收集细胞。弃培养液，把细胞悬浮于无菌水中，再同上离心。弃水，把细胞悬浮于1mL100mM醋酸锂中，转悬浮物到无菌离心管中；高速短时沉淀细胞，去除醋酸锂；悬浮细胞到4倍体系的100mM醋酸锂中并分装获得感受态细胞。
下述重组菌的构建原理为菌株TIB H1中预先转入了可以表达Cas9蛋白的表达元件，而后表达gRNA的重组质粒(质粒1-7)与表达元件或同源重组片段一同转化进该菌株中，表达gRNA的重组质粒识别并结合相应位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使相应位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的表达元件或同源重组片段通过同源重组修复被整合进入菌株DNA中。
2、含gRNA的重组质粒的构建
质粒pBGR的构建：以pET32a载体为模板，使用引物1及引物3扩增含片段AmpR表达框及ori片段的片段1，以酿酒酵母TIB H1基因组为模板，以引物8及引物9扩增片段Ura3表达盒；以p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t(DiCarlo JE,Norville JE,Mali P,etal.Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cassystems.Nucleic Acids Res2013b；41:4336–43)为模板，以引物4及引物5扩增gRNA表达框1，以引物10及引物11扩增gRNA表达框2，以引物6及引物7扩增2μori，使用overlap PCR，以gRNA表达框1，gRNA表达框2，2μori片段为模板，以引物4及引物10获得片段2；使用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)，将片段1及片段2在体外重组，转化入DH5α感受态细胞进行扩增，提取质粒，获得质粒pBGR。
质粒1：以质粒pBGR为模板，以引物gRNA1-f，gRNA1-r扩增基因片段gRNA1，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA1，pBGR-2进行重组，获得质粒1。质粒1表达gRNA1，其靶序列为tgaaactctaatcctactat，tagaaacgcggacacaggag。
质粒2：以pBGR为模板，以引物gRNA2-f扩增基因片段gRNA2，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA2，pBGR-2进行重组，获得质粒2。质粒2表达gRNA2，其靶序列为gcaatgcgatgttagtttag。
质粒3：以pBGR为模板，以引物gRNA3-f扩增基因片段gRNA3，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA3，pBGR-2进行重组，获得质粒3。质粒3表达gRNA3，其靶序列为cgccattcaagagcagcaac。
质粒4：以pBGR为模板，以引物gRNA4-f扩增基因片段gRNA4，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA4，pBGR-2进行重组，获得质粒4。质粒4表达gRNA4，其靶序列为ttgtcacagtgtcacatcag。
质粒5：以pBGR为模板，以引物gRNA5-f扩增基因片段gRNA5，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA5，pBGR-2进行重组，获得质粒5。质粒5表达gRNA5，其靶序列为tggatgctctgatattacacagg。
质粒6：以pBGR为模板，以引物gRNA6-f扩增基因片段gRNA6，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA6，pBGR-2进行重组，获得质粒6。质粒6表达gRNA6，其靶序列为atatgtctctaattttggaa。
质粒7：以pBGR为模板，以引物Grna7-f扩增基因片段gRNA7，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA7，pBGR-2进行重组，获得质粒7。质粒7表达gRNA7，其靶序列为ccgataaatagaggaagcaa。
质粒8：以pBGR为模板，以引物Grna8-f扩增基因片段gRNA8，以引物pBGR-2-f扩增基因片段pBGR-2，利用CloneExpress II试剂盒(诺唯赞)将以上获得的基因片段gRNA8，pBGR-2进行重组，获得质粒8。质粒8表达gRNA8，其靶序列为tgagaatactgttgtaaaac。
上述所使用的引物如表3所示。
表3引物序列
3、GPP-1菌株的构建
出发菌酿酒酵母TIB H1于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)DNA(2mg/mL)，50μL水和基因(PGal1-ERG20F96W-N127W-TErg20表达元件，PGal7-tHMG1-Thmg1表达元件，质粒1)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-1并保存。
4、GPP-2菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-1于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL),50μL水和基因(TADH-mvaE-PGAL1-PGAL10-mvaS-m-TCYC1表达元件，质粒2)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s,除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-2并保存。
5、GPP-3菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-2于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL),50μL水和基因(TIDI1-IDI1-PGAL1-PGAL10-ERG12-TERG12表达元件，质粒3)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s,除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-3并保存。
6、GPP-4菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-3于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL),50μL水和基因(TERG8-ERG8-PGAL1-PGAL10-ERG19-T ERG19表达元件，质粒4)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s,除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-4并保存。
7、GPP-5菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-4于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(Gal80同源重组片段，质粒5)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-5并保存。
8、GPP-6菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-5于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(Perg1同源重组片段，质粒7)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为GPP-6并保存。
8、SLQ-1菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-1于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(PGal2-CinS_HE7-Tcyc1表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-1并保存。
9、SLQ-2菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-2于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL),50μL水和基因(PGal2-CinS_HE7-Tcyc1表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-2并保存。
10、SLQ-3菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-3于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(PGal2-CinS_HE7-Tcyc1表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-3并保存。
11、SLQ-4菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-4于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(PGal2-CinS_HE7-Tcyc1表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-4并保存。
12、SLQ-5菌株的构建
出发菌酿酒酵母GPP-6于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL)，50μL水和基因(PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(1)表达元件，质粒6)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-5并保存。
13、SLQ-6菌株的构建
出发菌酿酒酵母SLQ-5于YPD液体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：240μL PEG(50％w/v)，36μL 1.0mol/L醋酸锂，25μL鲑鱼精DNA(sigma)(2mg/mL),50μL水和基因(PGal2-CinS_HE7-Tcyc1(2)表达元件，质粒8)；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于30℃保温30分，置于4℃水浴20分；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸100μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布无尿嘧啶添加的SD平板，待菌落长起，挑选菌落到含5-氟乳清酸的SD平板，平板中长起的菌落命名为SLQ-6并保存。
实施例3、重组菌在生产单萜中的应用
1、工程菌培养及产物提取
在Delft液体培养基中分别活化实施例2制备的酵母工程菌株SLQ-1、SLQ-2、SLQ-3、SLQ-4、SLQ-5、SLQ-6，于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含20mLDelft液体培养基及2ml含仲丁基苯正十二烷的100mL三角瓶中，30℃，250rpm培养2-3天，最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集有机相备用。
2、菌体生产单萜物质的定性定量分析
将步骤1收集的有机相物质用正己烷稀释50倍，用GC-MS检测。GC-MS测定条件：进样口温度260℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mM)；色谱条件：60℃，3min，40℃/min到150℃，20℃/min到220℃，40℃/min到260℃保温2min；MS条件：Full Scan:50-750amu。用不同单萜物质的混合标准品进行定性定量。
结果如图1所示，各工程菌发酵3天时产量如下：
SLQ-1、SLQ-2、SLQ-3、SLQ-4、SLQ-5、SLQ-6的桉叶素产量分别为67.3±4.22mg/L，99.8±5.50mg/L，127.8±1.44mg/L，150.7±7.57mg/L，236.2±11.82mg/L，405.4±18.39mg/L。
该实施例证明，在酿酒酵母中表达桉叶素合成酶基因，可以生产桉叶素。
3、酿酒酵母生产单萜
以工程菌株SLQ-6进行5L规模发酵罐发酵，通过发酵条件优化，使用Delft培养基，添加10％IPM于培养基中，30℃，pH5.0，溶氧40％，维持葡萄糖浓度1g/L，测定发酵液中桉叶素含量为5.48g/L。该结果说明，本发明挖掘的构建的酵母菌株及其发酵工艺优良，对单萜生产水平有明显促进作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.一种产单萜物质的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括：将桉叶素合酶编码基因导入基因工程菌，得到产桉叶素的重组基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：是将所述桉叶素合酶编码基因构建表达框，再整合入宿主菌基因组中得到的重组菌株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述宿主菌为酿酒酵母、解脂耶氏酵母、克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母中的任一种。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于：所述基因工程菌为能够积累单萜合成前体牻牛儿基二磷酸盐GPP的菌株。
5.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于：所述桉叶素合酶编码基因编码的酶的氨基酸序列为GenBank: AHY23922.1。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述出发菌株还包括提高出发菌中法尼基焦磷酸合成酶ERG20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A tHMG1、乙酰辅酶A酰基转移酶mvaE、HMG-CoA合成酶mvaS-m、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、甲羟戊酸激酶ERG12、MVAP激酶ERG8和/或MVAPP脱羧酶ERG19的含量和/或活性，和/或降低出发菌中半乳糖调节基因Gal80基因表达，和/或动态调控ERG20基因表达，异源引入多拷贝桉叶素合酶CinS_HE7基因表达的改造；更优选地，所述基因工程菌进行如下至少一种改造，获得所述菌株：
A1、导入法尼基焦磷酸合成酶基因96位和127位双点突变基因ERG20F96W/N127W基因；
A2、导入tHMG1基因；
A3、导入mvaE基因；
A4、导入mvaS-m基因；
A5、导入IDI1基因；
A6、导入ERG12基因；
A7、导入ERG8基因；
A8、导入ERG19基因；
A9、敲除Gal80基因；
A10、替换ERG20启动子为ERG1启动子；
A11、导入多拷贝CinS_HE7基因。
7.采用权利要求1-6任一项所述的构建方法构建的重组基因工程菌。
8.一种生产单萜的方法，其特征在于：包括培养权利要求7所述重组基因工程菌，进行桉叶素的生产；
优选地，所述培养的温度为25-35℃；培养时间为24-96h更优选地，所述培养在搅拌或振荡条件下进行，例如震荡转速为100-800rpm；进一步优选地，所述培养的体系中添加萃取剂；萃取剂选自：正十二烷，油酸丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸异丙酯；特别优选地，所述添加萃取剂的含量为10-30%；
更优选地，所述发酵体系中控制pH在7.0以下、溶氧水平在20%-60%、葡萄糖浓度0.1-5%。
9.一种应用，其特征在于，是下述任一项中应用：
X1、权利要求1-6中任一所述的方法在制备生产桉叶素产品中的应用；
X2、权利要求1-6中任一所述的方法在生产桉叶素中的应用；
X3、权利要求7所述的重组基因工程菌在制备生产桉叶素产品中的应用；
X4、权利要求8所述的重组基因工程菌在生产桉叶素中的应用；
10.桉叶素合酶或其编码基因的应用，其特征在于，是下述应用之一：
X5、在制备生产桉叶素产品中的应用；
X6、在生产桉叶素中的应用；
X7、在制备生产桉叶素产品中的应用；
X8、在生产桉叶素中的应用。
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