CN110268065A - 生产单萜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产单萜和/或其衍生物的方法。该方法包括以下步骤：a)提供经基因工程修饰以表达细菌的单萜合成酶(mTS)的宿主微生物；和b)使香叶基焦磷酸(GPP)与该细菌的mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。本发明还涉及一种用于生产单萜和/或其衍生物的微生物，以及一种重组微生物，所述重组微生物适于通过表达细菌的mTS以进行将香叶基焦磷酸(GPP)转化为单萜和/或其衍生物的步骤。它显示使用1,8桉叶素合成酶产生1,8桉叶素，以及使用芳樟醇合成酶生产芳樟醇，所述1,8桉叶素合成酶和芳樟醇合成酶均来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。

Description

生产单萜的方法
技术领域
本发明涉及一种生产单萜的方法。特别地，本发明涉及一种例如在宿主微生物中通过细菌的单萜合成酶的作用生产单萜的方法。
背景技术
萜类化合物(也称为类异戊二烯)是最丰富和最大类别(>75000)的天然产品。在植物中最常见，它们的生物学作用多种多样，从物种间的信息传递到细胞内的信号传导，以及对捕食性物种的防御。它们具有广泛的应用范围，用于制药、除草剂、调味剂、香料和生物燃料中。由于萜类化合物的广泛商业利益，近年来通过合成的生物学途径合成萜类化合物的步伐日益加快。
萜类化合物的底物由C5异戊二烯结构单元，即二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯焦磷酸(IPP)合成。DMAPP和IPP的组合可以产生不同碳长度的底物，然后可以被萜类合成酶(Terpene synthase)/环化酶用于生产单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)等。例如，通过偶联DMAPP和IPP的各一个分子来合成用于制备所有单萜的底物的香叶基焦磷酸(GPP)。
单萜合成酶(Monoterpene synthase，mTS)是使用单个C10底物分子香叶基焦磷酸(GPP)产生数千种不同单萜的酶。植物mTS的结构具有两个结构域结构：一个I类萜类化合物折叠C-30末端结构域和一个功能未知的相对小的N-末端结构域。活性位点的氨基酸序列变化以及GPP识别的保守残基导致mTS在生物学中进行一些最复杂的反应，形成了线性萜类化合物、单环萜类化合物和双环萜类化合物。
近年来，通过使用酵母或大肠杆菌作为宿主并使用植物来源的mTS，已经在经工程改造的微生物中产生了许多单萜烃类化合物。然而，得到的单萜产量相对较低。在此类体系中产生的单萜类化合物的实例包括香叶醇、β-月桂烯、柠檬烯和松萜。
大肠杆菌是全世界学术界和工业界的重组蛋白生产的主力军。这种偏爱的选择是由于其易于将外部DNA材料引入细胞、快速的生长周期和使用廉价的生长培养基。如上所述，为了使用合成的生物学途径生产单萜，已经使用了植物mTS。然而，这种植物mTS的使用具有相关的缺点。
本发明人的实验表明，当在大肠杆菌中过表达时，许多植物mTS会产生大部分不溶性蛋白质，即不适合单萜的生物合成的非活性物质。已证明这种有限的溶解度是生产单萜的瓶颈，因为宿主细胞中的大多数GPP分子都没有用于合成单萜，导致了产品产量/滴度低。对于被广泛用作清洁剂中香料的芳樟醇的生物合成尤其如此。当在酵母或大肠杆菌中时，使用植物芳樟醇合成酶导致非常低的产物滴度(0.1-1mg/Lorg -1)。由内源性大肠杆菌活性引起的类香叶醇(geranoid)副产物(>10倍过量)的存在表明这些观察到的滴度低与底物有效性无关。缺乏稳健性也使得植物mTS成为蛋白质工程改造的靶标的吸引力降低。此外，植物来源的mTS酶通常显示出高度的产物多样性，导致产物为混合物而非纯净产物的特征。对于更复杂的双环单萜支架如用于调味剂、香料和化妆品的1,8-桉叶素(也称为桉树脑)而言尤其如此。使用几种不同植物来源的桉叶素合成酶均得到了相对的1,8-桉叶素的量为42-64％(Leferink,N.G.H.et al.A‘Plug and Play'Platform for the Production ofDiverse Monoterpene Hydrocarbon Scaffolds in Escherichia coli.(2016))。需要生成单一的、纯净的产物，从而需要较少的下游处理。
本发明的一个目的是消除或减轻一个或多个上述问题。
发明概述
本发明涉及一种生产单萜和/或其衍生物的方法。本发明还涉及用于生产单萜和/或其衍生物的微生物和适于生产单萜的重组微生物。
本发明某种程度上基于发明人的研究，其中它们显示在大肠杆菌中某些细菌单萜合成酶的表达(mTS)会导致高产量且高纯度的单萜。
生产单萜和/或其衍生物的方法包括以下步骤：提供经基因修饰以表达细菌单萜合成酶(mTS)的宿主微生物，和使香叶基焦磷酸与所述细菌mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。
在本发明的第一方面，提供了一种在宿主微生物中生产单萜和/或其衍生物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供经基因修饰以表达细菌单萜合成酶(mTS)的宿主微生物；和
(b)使香叶基焦磷酸(GPP)与所述细菌mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。
在本发明人进行的研究中，它们出人意料地显示：当使用细菌单萜合成酶时，可以在宿主微生物中产生高产量且高纯度的单萜烯。如下述更详细的讨论，使用细菌mTS时获得的产量和纯度出人意料地高于使用植物来源的mTS时的产量和纯度。
单萜和/或其衍生物
本发明的方法包括使香叶基焦磷酸(GPP)与所述细菌mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。
如本领域技术人员所理解的，术语单萜和/或其衍生物用于定义与“起始材料”香叶基焦磷酸不同的“产物”单萜。
如上所述，萜类例如单萜类具有多种应用，包括药物、除草剂、调味剂、香料和生物燃料。在本发明第一方面的方法中生产的单萜可以是任何合适的单萜或其衍生物。本发明的单萜的合适衍生物可以通过例如烷基化、氧化或还原来获得。例如，单萜衍生物可包括单萜类化合物。
如本领域技术人员所理解的，可以通过独立于mTS的单萜的化学衍生化来生产单萜衍生物。或者，可以通过宿主微生物中存在的mTS本身或另一种酶生物学生产单萜衍生物。
在本发明第一方面的方法中生产的单萜或其衍生物可以是例如香叶醇、罗勒烯、柠檬醛、香茅醛、香茅醇、芳樟醇、海乐萌(halomon)、柠檬烯、蒎烯、蒈烯、桧烯、莰烯、崖柏烯、樟脑、冰片、阿米替林(terpioline)、萜品烯、水芹烯、萜品醇、葑醇、1,8-桉叶素或β-月桂烯。
在本发明的实施方案中，单萜可以是芳樟醇或1,8-桉叶素和/或其衍生物。
宿主微生物
本发明的宿主微生物可以是非天然存在的微生物，例如基因修饰的细菌、古细菌、酵母、真菌、藻类或任何各种其他微生物。
在本发明实施例中，宿主微生物是细菌。适宜细菌的实例包括属于埃希氏菌属变形杆菌的肠杆菌(Escherichia)、产气肠杆菌(Enterobacter)、泛生菌(Pantoea)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、沙雷氏菌(Serratia)、欧文氏菌(Erwinia)、沙门氏菌(Salmonella)或摩根氏菌(Morganella)，属于短杆菌属的棒状杆菌(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或微杆菌属(Microbacterium)、和属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、甲烷球菌属(Methane-coccus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、轴根瘤菌属(Axorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、无浆体属(Anaplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、巴尔通体属(Bartonella)、鲍特氏菌(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布氏杆菌属(Brucella)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、考克斯氏体属(Coxiella)、埃立克菌属(Ehrlichia)、肠球菌属(Enterococcus)、弗朗西斯菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、克氏杆菌属(Kelbsiella)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌(Prevotella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、立克次氏体属(Rickettsia)、罗卡利玛氏体属(Rochalimaea)、罗思氏菌属(Rothia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)或耶尔森菌属(Yersinia)。
优选地，细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)，优选大肠杆菌(Escherichiacoli)。
在宿主微生物是大肠杆菌(E.coli)的实施方案中，大肠杆菌可以是K-12、B菌株或W菌株中的一种或多种。例如，宿主微生物可包含一种或多种以下菌株：DH5α、DH10β、MG1655、W3110、DH1、MDS42、BL21或Mach1。
适宜的酵母或真菌实例包括酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母菌属(Pichia)或隐球菌属(Crytpococcus)。在本发明实施方案中，酵母或真菌物种包括选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillusniger)或毕赤酵母(Pichia pastoris)的那些。
对本发明第一方面的宿主微生物进行基因修饰(例如基因工程改造)以表达细菌单萜合成酶(mTS)。
如本领域技术人员所理解的，生产单萜的宿主微生物可以是经基因工程改造以表达细菌mTS的相同宿主微生物。
技术人员将理解，在实施方案中，可以对宿主微生物进行基因修饰以表达不在宿主微生物中天然编码或表达的细菌单萜合成酶。技术人员将进一步理解，在实施方案中，可以对宿主微生物进行基因修饰以产生比编码或表达这种细菌mTS的野生型微生物更多的细菌单萜合成酶。
与野生型微生物相比，提高细菌mTS的产量可以包括通过使用本领域已知的各种基因修饰技术对现有核酸和/或蛋白质进行修饰(例如通过在正常沉默或表达不良的基因之前引入强启动子)，以下进行了进一步讨论。与野生型微生物相比，提高细菌mTS的产量还可以包括修饰微生物以在微生物中表达一种或多种异源基因，例如编码来自另一种微生物的细菌mTS的基因，或用于直接或间接促进细菌mTS的功能和表达的基因。例如，在实施方案中，宿主微生物可以是大肠杆菌，其已经过基因修饰以表达来自替代的细菌物种(例如链霉菌属)的细菌mTS。
可以修饰本发明的宿主微生物以增强单萜和/或其衍生物的产生。例如，微生物可以包含通过竞争相同的底物和/或中间体(例如GPP)来降低或消除酶催化合成除单萜之外的化合物活性的修饰。可选地或者另外地，本发明方法中使用的宿主微生物可包含降低或消除在单萜生产中代谢单萜或中间体的酶活性的修饰。
提高单萜的产量可包括选择与野生型微生物相比适于产生更多单萜的宿主微生物。在本发明的上下文中，当术语“适于”的使用与宿主微生物相关时，其是指基因修饰的或工程化的生物体、或生物体的突变株，其基于其表达一种或多种导致单萜的产生增加的酶而被选择。
为了修饰酶或蛋白质的活性，可以通过常规的随机或定点诱变或基因工程技术，将用于增加、减少或消除酶或蛋白质的细胞内活性的突变引入酶或蛋白质的基因中。诱变的实例可包括，例如，X射线或紫外线照射、用诱变剂处理、通过聚合酶链式反应的体外定点或随机诱变。基因上引入突变的位点可以为编码酶或蛋白质的编码区或表达控制区如启动子中。基因工程技术的实例包括基因重组、转导、细胞融合和基因敲除。
可以使用本领域技术人员熟知的技术将核酸序列稳定地或瞬时地引入宿主微生物中，包括例如接合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化。
用于构建和测试修饰的宿主微生物中蛋白质表达的方法可以使用本领域技术人员熟知的重组技术和检测方法进行，例如Sambrook and Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)中所描述的。
可以构建表达一种或多种载体以包括与微生物中功能性表达控制序列可操作地连接的一种或多种酶(例如细菌mTS)。适用于本发明微生物的表达载体包括，例如，质粒、粘粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，包括可操作地用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或标记。
另外，表达载体可包括一种或多种选择标记基因和合适的表达控制序列。还可以包括，例如提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷型、或提供培养基中不存在的关键营养素的选择标记基因。表达控制序列可包括例如组成型、诱导型或阻遏型启动子、转录增强子、转录终止子或翻译信号。
酶活性的增强可包括将靶基因的表达调控序列(例如基因组DNA或质粒上的启动子)替换为具有适当强度的启动子来增强靶基因(例如mTS)的表达。例如，本领域技术人员熟知的thr启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子和tac启动子。在微生物例如细菌中具有高表达活性的启动子的实例可包括例如延伸因子Tu(EF-Tu)基因的启动子、tuf、编码共伴侣蛋白GroES/EL和硫氧还蛋白还原酶的基因的启动子。强启动子和用于评估启动子强度的方法的实例是本领域熟知的。此外，还可以在基因的启动子区域中替换掉几个核苷酸，使得启动子具有适当的强度。
在实施方案中，宿主微生物可以(天然地或通过基因修饰)表达一种或多种酶，其可以将异戊二酸二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为香叶基焦磷酸(GPP)。在实施方案中，一种或多种酶可以是EC编号2.5.1.X下的异戊二烯基转移酶，例如EC编号2.5.1.1下的香叶基-二磷酸合成酶。在实施方案中，异戊烯转移酶可以来自例如冷杉属(Abies grandis)。
因此，在实施方案中，该方法可以进一步包括将IPP和DMAPP转化为GPP的步骤。可以通过如上所述的异戊二烯基转移酶的作用实现转化。
在实施方案中，宿主微生物可以表达(通过天然地或通过基因修饰地)一种或多种酶，其可以通过例如甲羟戊酸依赖性(MVA)途径将乙酰CoA转化为IPP。在实施方案中，一种或多种酶可包括，例如，乙酰乙酰-CoA硫解酶(AtoB，EC 2.3.1.9)(例如来自大肠杆菌)、羟甲基戊二酰-CoA合成酶(HMGS，EC 2.3.3.10)(例如来自酿酒酵母)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR，EC 1.1.1.34)(例如来自酿酒酵母)、甲羟戊酸激酶(MK，EC 2.7.1.36)(例如来自酿酒酵母)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK，EC 2.7.4.2)(例如来自酿酒酵母)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD，EC 4.1.1.33)(例如来自酿酒酵母)和/或异戊烯二磷酸异构酶(idi，EC5.3.3.2)(例如来自大肠杆菌)。
因此，在实施方案中，该方法可以进一步包括将乙酰CoA转化为IPP的步骤。例如，可以通过上述一种或多种酶的作用实现转化。
可选地，或另外地，宿主微生物可以表达(通过天然地或通过基因修饰地)一种或多种酶，其可以通过例如甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径将丙酮酸转化为DMAPP。在实施方案中，一种或多种酶可包括，例如，1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS，EC 2.2.1.7)、1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR，IspC，EC 1.1.1.267)、2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶(YgbP，IspD，EC 2.7.7.60)、4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(YchB，IspE，EC 2.7.1.148)、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸合成酶(GcpE，IspG，EC1.17.7.1)和/或4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-二磷酸二酯还原酶(LytB，IspH，EC 1.17.7.4)。在实施方案中，此类酶可以来自例如大肠杆菌。
因此，在实施方案中，该方法可以进一步包括将丙酮酸转化为DMAPP的步骤。例如，可以通过上述一种或多种酶的作用实现转化。
在本发明的另一方面，提供了一种微生物，其用于根据本发明第一方面的方法生产单萜和/或其衍生物。
本发明还提供了适于进行以下步骤的重组微生物：
a)通过表达的细菌mTS，将香叶基焦磷酸(GPP)转化为单萜和/或其衍生物。
重组微生物可以与关于本发明第一方面描述的宿主微生物一致。
在本发明的上下文中，术语“重组微生物”用于表示包含遗传物质的基因修饰的或工程改造的生物体，所述遗传物质已被人工构建并插入生物体中。遗传物质可包含内源性或异源性的核酸。
术语“内源性”是指源自同一种生物。术语“异源性”意指源自不同种类的生物。
本发明还进一步提供了经基因修饰以表达细菌mTS的微生物。
微生物可以与关于本发明第一方面描述的宿主微生物一致。
单萜合成酶
本发明的方法包括使香叶基焦磷酸(GPP)与细菌mTS接触以产生单萜和/或其衍生物。通过细菌mTS的作用将GPP转化为单萜和/或其衍生物。
如上所述，本发明人意外地证明了当利用细菌mTS将GPP转化为单萜时，可以获得特别高的单萜产量和纯度。
如本领域技术人员所理解的，本发明的细菌mTS可以从与宿主微生物相同的细菌物种获得(即mTS可以是内源性的)。例如，宿主微生物可以包含大肠杆菌，且细菌mTS可以从大肠杆菌中获得(即源自大肠杆菌)。
可选地，细菌mTS可以从与宿主微生物不同的细菌物种获得(即mTS可以是异源性的)。例如，宿主微生物可以是酵母，或宿主微生物可以是大肠杆菌，同时细菌mTS可以从不同的细菌物种例如链霉菌中获得。
细菌mTS可以是EC编号4.2.3.x下的细菌单萜合成酶。
编码细菌mTS基因的核酸来源可包括，例如，编码基因产物能够将GPP转化为单萜或其衍生物的任何物种。示例性细菌来源包括大肠杆菌(Escherichia coli)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium fredenreichii)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、弗氏志贺氏杆菌(Shigella flexneri)、肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)、费氏耶尔森菌(Yersinia frederiksenii)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、拜氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、克氏梭状杆菌(Clostridium kluyveri)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)、匙形梭菌(Clostridium cochlearium)、破伤风形梭状芽胞杆菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、糖原乳酸梭菌肠系膜明串珠菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum Leuconostoc mesenteroides)、巴克氏真杆菌(Eubacterium barkeri)，多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、厌氧大肠杆菌(Anaerotruncus colihominis)、嗜热钠杆菌(Natranaerobius thermophilus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、谷氨酰胺棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、链霉菌(Streptomyces)类，例如，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)或棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)，或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
在本发明的优选实施方案中，细菌mTS源自链霉菌属(Streptomyces)物种，例如棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。本发明人意外地发现，源自链霉菌的mTS在生产高纯度和高产量的单萜方面特别有效。在实施方案中，细菌mTS源自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。
在本发明的实施方案中，细菌mTS可包含EC编号4.2.3.108下的1,8-桉叶素合成酶和/或EC编号4.2.3.25或4.2.3.26下的芳樟醇合成酶。可以理解为，在这样的实施方案中，所产生的单萜分别包含1,8-桉叶素或芳樟醇。
在本发明的实施方案中，细菌mTS可包含源自棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)的1,8-桉叶素合成酶和/或芳樟醇合成酶。
当在本发明第一方面的方法中使用时，细菌mTS优选产生至少100mg/Lorg -1的单萜产量(或滴度)。更优选地，细菌mTS产生至少150、200、250或300mg/Lorg -1的单萜产量。最优选地，细菌mTS产生至少350mg/Lorg -1的单萜产量。可以是如Leferink等人于2016年所述，例如通过GC或GCMS测量并在真实标准期间量化单萜的产量。产量是每升有机相捕获产品的产物量。
因此，本发明还提供了细菌mTS在改善从GPP获得的单萜和/或其衍生物的产量(或滴度)的用途。在实施方案中，单萜是从宿主微生物中的GPP获得的。适当地，与使用植物mTS的GPP获得的单萜和/或其衍生物的产量相比，产量得到提高。
可以理解为，细菌mTS和宿主微生物可以与关于本发明第一方面所述的一致。
在本发明第一方面的方法中使用的细菌mTS优选产生纯度至少约70％的单萜。当提及纯度时，我们指的是由GPP产生的单萜的量，不包括副产物的形成，例如作为混合产物产生的其他萜类(如Leferink等，2016中所述)。
可以基于mTS从GPP产生的单萜类化合物来确定纯度(如Leferink等，2016中所述)。例如，当使用细菌1,8-桉叶素合成酶作为mTS时，除主要产物1,8-桉叶素外，还可产生少量的α-萜品醇和柠檬烯。在优选的实施方案中，所用的细菌mTS产生单萜的纯度至少约为75％、80％、85％或90％。更优选地，所产生的单萜的纯度至少约为95％、96％、97％、98％或99％。
因此，本发明还提供了使用细菌mTS来改善从GPP获得的单萜和/或其衍生物的纯度。在实施方案中，单萜是从宿主微生物中的GPP获得的。适当地，与使用植物mTS从GPP获得的单萜和/或其衍生物的纯度相比，其纯度得到提高。
可以理解为，细菌mTS和宿主微生物可以与关于本发明第一方面所述的一致。
在本发明的实施方案中，细菌mTS不包含N-末端α-桶状结构域。许多植物mTS包含N末端α-桶状结构域。然而，如上所述，当植物mTS在大肠杆菌中过表达时，其产生大部分不溶性蛋白质。不希望受到理论束缚，本发明人假设许多植物mTS中存在的额外结构域可能导致了mTS在宿主微生物中的不溶性。因此，利用不包含N-末端α-桶状结构域的细菌mTS可能是有利的。
进一步的方法步骤
在本发明的第一方面中，单萜和/或其衍生物可以由宿主微生物在发酵培养基中产生。可以在所述宿主微生物能够产生单萜或其衍生物的条件下，在发酵培养基中提供本发明的宿主微生物。
在实施方案中，本发明第一方面的方法包括在所述发酵培养基中培养宿主微生物。培养可能需要碳基原料，微生物可从该原料获得能量并生长。
发酵培养基可以是包围宿主微生物的周围培养基。优选地，碳基原料存在于介质中，例如溶解或悬浮在介质中或与介质混合。
发酵培养基可以是本领域技术人员公知的任何适合宿主微生物需要的市售培养基。发酵培养基可包含碳基原料和氮源，以及宿主微生物生长所需的其他化合物，例如抗生素、缓冲剂、磷酸盐、硫酸盐、镁盐等。
合适的碳基原料对于在该技术领域中工作的技术人员来说是熟知的。碳基原料可包括例如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉和/或可源自废物，例如食品废物或来自如林业或农业等工业废物。
例如，所需原料的量将根据宿主微生物的需要和宿主微生物的培养时长而变化。
如本领域技术人员所理解的，可以对宿主微生物进行基因修饰以产生GPP(如上所述)，或者可以在发酵培养基中提供GPP。
宿主微生物可以分批、补料分批或连续培养。优选地，以工业规模进行培养。
在实施方案中，本发明的方法可以进一步包括从宿主微生物中除去单萜和/或其衍生物的步骤，例如从宿主微生物或培养宿主微生物的发酵培养基中提取单萜。例如，当宿主微生物存在于发酵培养基中时，该方法可包括从与发酵培养基接触中除去或提取单萜或其衍生物。
在实施方案中，除去单萜和/或其衍生物可包括溶剂萃取。例如，可以提供与发酵培养基接触的有机相。有机相可以包括浓度高于发酵培养基的单萜。有机相可以例如是有机溶剂。如本领域技术人员所理解的，可以使用任何合适的有机溶剂，并且可以包括壬烷(例如正壬烷)、十二烷(例如正十二烷)、十六烷(例如正十六烷)或邻苯二甲酸二异壬酯。
可选地，可以通过例如超临界二氧化碳或加压来进行蒸汽蒸馏，以从发酵培养基中除去单萜。
所描述的和说明的实施方案被认为是说明性的，而不是限制性的，应理解为仅显示和描述了优选实施方案，并且在本发明权利要求中限定的范围内的所有的变化和修改都希望得到保护。
此外，上述任何一个或多个优选实施方案可以是与一个或多个其他优选实施方案结合以适合特定的应用。
应该理解的是，虽然说明书中使用了诸如“优选”、“优选地”、“优选的”或“更优选的”之类的词语表示如此描述的特征可能是理想的，但它可以不是必需的，并且缺乏这类特征的实施方案可以被认为是在如所附权利要求中定义的本发明的范围内。关于权利要求，旨在当使用诸如“一”或“至少一”此类的词语限定一个特征时，并非意图去限制这个权利要求至只有一个此类特征，除非在权利要求中特别说明了相反情况。
发明详述
现在将参考以下附图进一步描述本发明，附图显示：
图1：使用细菌1,8-桉叶素合成酶(bCinS)和细菌芳樟醇合成酶(bLinS)的GC-MS分析。A)bCinS平台产品简介。B)GPP的bCinS转化(20mM)。C)1,8-桉叶素标准品(0.1mg/ml)。D)bLinS平台产品简介。E)GPP的bLinS转化(20mM)。F)R-芳樟醇标准品(0.1mg/ml)。G)顺式和反式-橙花叔醇标准品(0.1mg/ml)。IS＝内标(仲丁基苯)。
图2：bCinS-FNPP复合物的结构。植物桉叶素合成酶(暗色)和bCinS(亮色)的叠加。植物CinS的N-末端和C-末端结构域被标记。箭头表示螺旋-断裂基序的构象差异。
材料和方法
细菌1,8-桉叶素合成酶(bCinS)和细菌芳樟醇合成酶(bLinS)的表达和纯化
编码来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)ATCC 27064的1,8-桉叶素合成酶(WP_003952918)和芳樟醇合成酶(WP_0003957954)的全长基因经密码子优化并由GeneArt(Life Technologies)合成。使用PCR扩增基因，并使用无缝克隆(In fusionCloning，Clontech)将其亚克隆到双消化的(NcoI和XhoI)pETM11载体中。最终构建体带编码6×-His标签的1,8-桉叶素合成酶(bCinS)或芳樟醇合成酶(bLinS)，在N-末端有TEV蛋白酶切割位点。以下解释的表达和纯化方法对于两种蛋白质是相同的。
将质粒转化到ArcticExpress(DE3)细胞(Agilent)中，并将少数菌落接种到含有40μg/ml卡那霉素和20μg/ml庆大霉素的100ml 2×-YT培养基中，并在37℃下生长3-4小时。将培养物稀释到3升含有40μg/ml卡那霉素的新鲜2×-YT培养基中，并使其在37℃下生长直至600nm处的OD达到0.6-0.8。在此阶段，将温度降至16℃并加入0.1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷并孵育14-18小时。通过在6000g离心10分钟收获细胞，并将沉淀重悬于缓冲液A(25mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，1mM DTT，4mM MgCl2和5％(v/v)甘油)中。通过超声处理裂解细胞，以30,000g离心30分钟除去碎片。将上清液通过0.2μm过滤器过滤，并加载到用缓冲液A预平衡过的5ml HisTrap柱(GE Healthcare)上。用含有10mM咪唑(pH 8.0)的缓冲液A洗涤柱，并以每个浓度3倍柱体积的逐步梯度增加至40mM咪唑。将咪唑浓度增加至200-500mM洗脱蛋白质。使用缓冲液A平衡过的Centripure P100柱(emp biotech)将纯化的蛋白质进行脱盐处理。为了去除His标签，向蛋白质中加入TEV蛋白酶(1:1000(w/w))并在4℃温和混合孵育24小时。通过使蛋白质混合物通过5ml HisTrap柱除去TEV蛋白酶，并收集流经的物质。将去除了His标签的蛋白质浓缩并上样到缓冲液A预平衡过的Hiload Superdex(26/60)S75柱(GE Healthcare)上。将来自凝胶过滤柱的纯的级分浓缩至13-15mg/ml并等分试样后储存在-80℃。
生物转化
使用缓冲液A制备0.25ml反应体系，并置于含有2mM GPP和20μM bCinS或bLinS的玻璃小瓶中。将小瓶在25℃温育并温和振荡16小时。将小瓶冷却至4℃并加入0.25ml作为内标的含有0.01％仲丁基苯的乙酸乙酯。将样品涡旋2分钟，然后以18,000g旋转5分钟。小心地去除含有乙酸乙酯层的上清液部分，用无水硫酸镁进行干燥。通过GC-MS分析样品。
大肠杆菌中芳樟醇和1,8-桉叶素的生成
使用引物pET_IF_Fw(5'-CATCCCCACTACTGAGAATC-3')(SEQ ID No:1)和pET_IF_Rv(5'-GGTGGTGGTGCTCGAGTTA-3')(SEQ ID No:2)，从bLinS和bCinS各自的pETM-11表达载体中扩增包括RBS的bLinS和bCinS基因。并使用In Fusion(Takara)克隆到质粒pGPPSmTS15中，使用引物对Vector_IF_Fw(5'-TAACTCGAGCACCACCACCACC-3')(SEQ ID No:3)和Vector_IF_Rv(5'-TCAGTAGTGGGGATGTCGTAATCG)(SEQ ID No:4)进行PCR线性化，分别产生质粒pGPPSmTS38和pGPPSmTSS39。通过自动测序(Eurofins)确认是否正确插入。
对于单萜产生，将pGPPSmTS质粒与pMVA共转化到大肠杆菌DH5α中并如前所述进行培养(Leferink,N.G.H.et al.A'Plug and Play'Platform for the Production ofDiverse Monoterpene Hydrocarbon Scaffolds in Escherichia coli.(2016))。简而言之，将表达菌株接种在补充有0.4％葡萄糖的极品肉汤(TB)的玻璃螺旋盖小瓶中，并在30℃下用50μM(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)IPTG和25nM脱水四环素(aTet)诱导72小时。加入20％正壬烷层以捕获挥发性萜类产物。诱导后，收集壬烷覆盖层，用无水MgSO4干燥，并以1:1的比例与作为内标的含有0.1％(v/v)仲丁基苯的乙酸乙酯混合。
GC-MS分析
将样品注入配备了Agilent Technologies 5977A MSD的Agilent Technologies7890B GC中。在DB-WAX柱(30m×0.32mm内径，0.25μM膜厚度，Agilent Technologies)上分离产物。将注射器温度设定为240℃，分流比为20:1(注射1μl)。载气为氦气，流速为1ml/min，压力为5.1psi。使用以下烘箱程序：50℃(保持1分钟)，按5℃min-1的速度升温至68℃(保持2分钟)，并按25℃min-1的速度升温至230℃(保持2分钟)。质谱仪(MS)的离子源温度设定为230℃，记录从m/z 50到m/z 250的光谱。使用真实标准进行化合物鉴定，并与如前所述的MS光谱的NIST库中的参考光谱和碎片模式进行比较(Leferink,N.G.H.et al.A'Plugand Play'Platform for the Production of Diverse Monoterpene HydrocarbonScaffolds in Escherichia coli.(2016))。
化学合成FGPP和FNPP
通过用氢化钠处理乙基(二乙氧基磷酰基)氟代乙酸酯进行霍纳尔-沃兹沃思-埃蒙斯(Horner-Wadsworth-Emmons)反应，然后用6-甲基-5-庚烯-2-酮处理得到2-氟橙花酚(2-fluoronerol)和2-氟香叶醇(2-fluorogeranoil)的混合物，比例几乎相等(1:1.08)，产率为86％。然后用H3PO4(Et3N)2盐处理分离后的产物，得到相应的单磷酸化产物和去磷酸化产物。
bCinS和bLinS的结晶
用“蚊式”机器人(Mosquito robot，TTP-Labtech)在3孔结晶微孔板上进行含200nl蛋白质和200nl沉淀液的结晶试验。最初的试验使用了五次筛选-Morpheus I和II、JCSG+、Pact Premier和SG1(Molecular Dimensions公司)。对于bcin和blin，筛选出三个变体-Apo，2mM FGPP和2mM FNPP。bCinS-FNPP在Morpheus II A4(90mM的Linak(0.3M硫酸锂，0.3M硫酸钠，0.3M硫酸钾)，0.1M的缓冲系统4(1M Mopso，1M双三甲基三丁基醚)，pH6.5，和50％的沉淀剂混合物8(10％PEG 20000，50％三甲基丙烷，2％NDSB195))的条件下结晶。bLinS-FNPP在Morpheus D7(0.12M醇(0.2M 1，6-己二醇；0.2M 1-丁醇；0.2M 1，2-丙二醇；0.2M 2-丙醇；0.2M 1，4-丁二醇；0.2M 1，3-丙二醇)0.1M缓冲体系27.5(1.0MNa-HEPES缓冲液；MOPS缓冲液(酸))50％v/v沉淀剂混合物3(40％v/v甘油；20％w/v聚乙二醇4000))的条件下结晶。LinS-apo在SG1E2(25％w/v聚乙二醇3350)的条件下结晶。虽然bCinS-apo能够结晶，但生长条件的优化不能产生足够大小的用于回收的单晶体。可采用母液浸泡法对bCinS-FNPP和bLinS-FGPP晶体进行低温保护。在添加20％甘油的母液中浸泡，对bLinS-apo晶体进行低温保护。对于FGPP和FNPP复合物，配体存在于低温溶液中。晶体在液氮中被回收并低温冷却。
结构溶液
在Diamond Light Source(DLS)中收集bLinS和bCinS的X射线数据集。使用XDS和XSCALE，通过xia2自动数据处理管道对图像进行集成和缩放。bCinS的晶体属于三斜晶系(空间群P1)并且在不对称单元(ASU)中包含两个分子，而bLinS晶体属于四方晶系(空间群I4)并且在ASU中还包含两个分子。通过使用并环萜烯(Pentalenene)合成酶结构(PDB1PS1)作为Phaser中的搜索模型进行分子置换来解析bLinS的结构(bLinS-apo和bLinS-FGPP)。使用bLinS-apo结构作为搜索模型，通过模型替换解析bCinS-FNPP结构。使用Phenix中的Autobuild构建bLinS-apo、bLinS-FGPP和bCinS-F-NPP模型。使用迭代循环手动模型建立结构并在phenix.refine中进行优化。使用molprobity工具和PDB_REDO验证结构。
质粒
下表1显示了本研究中使用的质粒。
表1：本研究中使用的质粒
结果
本发明人进行了重要的测试，以确定如何以更高的效率在细菌宿主中产生单萜。特别地，本发明人进行的实验意外地鉴定出许多细菌mTS，包括来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的bLinS和bCinS，其在大肠杆菌系统中的表达比使用植物mTS时所造成的单萜产量高出许多，并且纯度高出许多。
大肠杆菌中的芳樟醇和1,8-桉叶素生成
当在大肠杆菌中表达时，与主要产生不溶性或部分可溶性物质的植物mTS相比，产生了大量(>100mg/升)的bLinS和bCinS并且酶是稳定且可溶的。生物转化反应显示，当提供GPP时，bLinS和bCinS分别产生芳樟醇和1,8-桉叶素。通过GC-MS分析时未观察到副产物(图1)。
为了测试合成生物学方法的适用性，将bLinS和bCinS插入由发明人设计的大肠杆菌“即插即用(plug-and-play)”单萜生产平台中，该平台由两个基因模块组成(Leferink,N.G.H.et al.A'Plug and Play'Platform for the Production of DiverseMonoterpene Hydrocarbon Scaffolds in Escherichia coli.(2016))。第一个模块(pMVA)含有在IPTG诱导型启动子调控下的杂合MVA途径，第二个模块(质粒系列pGPPSmTS，表1)由来自Abies grandis(AgtrGPPS2)的重构的N末端截短的香叶基焦磷酸合成酶(GPPS)基因和紧随其后的在四环素诱导型启动子控制下的mTS基因(例如bLinS或bCinS)组成。
含有pMVA和pGPPSmTS质粒的菌株在两相摇瓶系统中生长，使用葡萄糖作为原料，使用正壬烷作为有机相。积累在有机相中的产物通过GC-MS分析进行鉴定和定量。
将先前获得的使用植物来源的mTS的产物概况与使用bLinS和bCinS获得的产物概况和滴度相比较(图1)，所述植物来源的mTS即来自青蒿的LinS(RLinS_Aa)和来自Salviafruticosa的CinS(CinS_Sf)、拟南芥的CinS(CinS_At)和温州密柑的CinS(CinS_Cu)(Leferink,N.G.H.et al.A'Plug and Play'Platform for the Production of DiverseMonoterpene Hydrocarbon Scaffolds in Escherichia coli.(2016))。
发明人意外地发现，两种细菌mTS均优于植物酶。BLinS产生的芳樟醇(363.3±57.9mg Lorg -1)比RLinS_Aa产生的芳樟醇(1.3mg Lorg -1)多300倍。不希望受理论束缚，与相应的植物mTS相比，这种高产量可归因于BLinS的高溶解度。
bCinS和bLinS都产生了比植物mTS更纯的单萜。与植物酶相比，bCinS产生了116.8±36.4mg Lorg -1(96％纯度)的1,8-桉叶素：CinS_Sf为118.2mg Lorg -1(67％纯度)；CinS_At为46.6mg Lorg -1(纯度42％)；CinS_Cu为18.2mg Lorg -1(纯度63％)。
除了通过异源性GPPS形成GPP之外，大肠杆菌天然产生倍半萜前体法呢基焦磷酸(FPP)。有趣的是，将bLinS加入到发明人的平台，除了将GPP形成芳樟醇外，其还能够将FPP转化为橙花叔醇(159.1±7.3mg Lorg -1)，这表明bLinS同时作为单萜合成酶和倍半萜合成酶。将bCinS加入到平台时，在特定条件下检测不到倍半萜产物。
bCinS底物类似物复合物的结构及与植物桉叶素合成酶的比较
本发明人用GPP异构体的2-氟衍生物(FNPP)解析了复合物中的bCinS结构。FNPP通过阻断电离步骤起到底物抑制剂的作用，从而阻止了焦磷酸盐的释放和香叶基阳离子的形成。该结构显示出活性位点以反平行方式定位的二聚体。
然后，本发明人将bCinS的结构与来自无配体状态的植物的1,8-桉叶素合成酶(PDB 2J5C)的结构进行比较。与植物酶相比，细菌酶缺乏N-末端α-桶状结构域(图2)。比较植物酶的C末端结构域(apo形式)与bCinS-FNPP复合物(序列相似度为25％)，显示了活性位点周围的构象变化。在植物酶中，观察到螺旋G的螺旋断裂基序的扭结区域(其包括针对诱导拟合机制描述的残基)具有最大的位移，它向内突出至活性位点并且几乎到达bCinS-FNPP复合物中的焦磷酸的位置(图2)。
应当理解，在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以对上述的方法、微生物及其应用进行多种修改。例如，尽管所描述的具体实例集中于来自链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的单萜合成酶bCinS和bLinS，但是应当理解的是，可以使用来自替代细菌物种的其他单萜合成酶。

Claims (10)

1.一种在宿主微生物中生产单萜和/或其衍生物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供经基因修饰以表达细菌的单萜合成酶(mTS)的宿主微生物；和
(b)使香叶基焦磷酸(GPP)与所述细菌的mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主微生物包含E.coli。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细菌的mTS包含链霉菌(Streptomyces)的mTS。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述细菌的mTS包含棒状链霉菌(Streptomyuces clavuligerus)的mTS。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述细菌的mTS包含桉叶素-1,8合成酶或芳樟醇合成酶。
6.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法产生一种产量至少为100mg/Lorg -1的单萜。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法产生一种产量至少为300mg/Lorg -1的单萜。
8.一种微生物，其用于如权利要求1-7任一项所述的方法生产单萜和/或其衍生物。
9.一种适于进行以下步骤的重组微生物：
通过表达细菌的单萜合成酶(mTS)，将香叶基焦磷酸(GPP)转化为单萜和/或其衍生物。
10.一种细菌的mTS在提高从GPP获得的单萜和/或其衍生物的产量和/或纯度上的应用。
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