JP6616426B2 - 酵素およびその適用 - Google Patents
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Description
本明細書において用いられる用語「SHC」は、表10〜12に挙げられているソースのいずれかからのスクアレン−ホペンシクラーゼ酵素を意味する。好ましい態様において、用語SHCは、BASFのWO2010/139719、US2012/01345477A1、Seitz et al (2012 同上)、およびSeitz (2012 PhD学位論文、同上)に開示されているジモモナス・モビリスSHC酵素およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスSHC酵素を包含する。参照の便宜のために、呼称「AacSHC」がアリシクロバチルス・アシドカルダリウスSHCに用いられ、呼称「ZmoSHC」がジモモナス・モビリスSHCに用いられ、呼称「BjpSHC」がブラディリゾビウム・ジャポニクムSHCに用いられる。WT AacSHCおよび互いに関するそれらの配列の配列同一性パーセント(これは、用いられるアルゴリズムに応じて変わり得る)が表18および19に記されている。
本明細書において用いられる用語「アンブロックス」は、式(I)の(−)−アンブロックス、ならびに立体異性体的に純粋な形態のあるいは式(II)、(IV)、および/または(III)の下記分子の少なくとも1種以上との混合物としての(−)−アンブロックスを包含する。
(−)−アンブロックスはアンブロックス(Firmenich)、アンブロキサン(Ambroxan)(Henkel)、Ambrofix(Givaudan)、Amberlyn(Quest)、Cetalox Laevo(Firmenich)、Ambermor(Aromor)、および/またはNorambrenolide Ether(Pacific)として商業的に知られている。
(−)−アンブロックスは下記の通りの産生プロセスに従ってスクラレオリドから産生され得る。スクラレオールは天然の植物クラリセージから抽出される生成物である。しかしながら、天然の出発材料がこのプロセスにおいて用いられるので、これは多段階反応を包含し、その工程は遠回りであり、出発材料の供給の量および安定性が常に充分ではないこともあるかもしれず、クロム酸または過マンガン酸などの酸化剤が(+)−スクラレオールの酸化的分解のステップにおいて用いられるので反応は環境親和性ではないかもしれないという潜在的問題がある。
本明細書において用いられる用語「SHC/HAC誘導体」は、SHC/HAC誘導体のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号1または配列番号2または配列番号3または配列番号4に従う参照(または野生型)SHC配列のアミノ酸配列と比較して変更されている、改変されたまたはバリアントのアミノ酸配列であるということを意味する。一般的に、SHC/HAC誘導体は、その基質(例えばEEH)に対する酵素の活性を改変する(例えば増大させる)少なくとも1つの変更を有するSHCの変更された形態を含む。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)中性、親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖の向きに影響する残基:Gly、Pro、および
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明は、SHC/HAC誘導体を提供し、少なくとも配列番号1または配列番号2または配列番号3または配列番号4に従う参照(または野生型)SHC配列のアミノ酸配列に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される約1から約50個の変異を有するアミノ酸配列を含む、ホモファルネソール−アンブロックスシクラーゼ(HAC)活性を有する酵素を記載する。
T77Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
I92Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F129Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
M132Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
A224Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
I432Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
Q579Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F601Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F605Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有する。
S129Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
V145Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F182Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
Y185Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
G282Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
I498Xは、A、B、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
H646Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F668Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F698Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有する。
G85Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
V100Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F137Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
I140Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
V233Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
I450Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
N598Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F620Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F624Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有する。
A88Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
V104Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F141Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
Y144Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
V241Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
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M607Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F628Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有し、
F658Xは、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、またはYから選択されるXを有する。
1つの態様において、SHC誘導体は、表5に記されているように、配列番号1に対してT77A、F129L、M132R、I92V、A224V、I432T、Q579H、およびF601Yからなる変異体の群から選択される1種以上の置換を含む。
いくつかの態様において、AacSHC/HAC誘導体は、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、および/または171の1つ以上に記されているポリペプチドの1種以上を含む。
例えばAacSHC、ZmoSHC1、ZmoSHC2、およびBjpSHCポリペプチド配列などのSHC参照配列の異なる長さを原因として、参照AacSHC配列(配列番号1)の位置Xのアミノ酸残基は、ZmoSHC1参照配列(配列番号2)上の異なるアミノ酸位置B、ZmoSHC2参照配列(配列番号3)上の異なるアミノ酸位置J、およびBjpSHC参照配列(配列番号4)上の異なるアミノ酸位置Zに対応する。加えて、SHC参照配列の変更もまた参照SHC配列に対してSHC誘導体配列を改変し得る。
WT SHC/HACおよび/またはSHC/HAC誘導体酵素活性を決定および定量するためのアッセイは本明細書に記載されており、当分野において公知である。例として、WT SHC/HACおよび/またはSHC/HAC誘導体活性は、ホスト細胞からの精製されたSHC/HAC酵素もしくは抽出物、またはSHC/HAC酵素を産生した完全な組み換えホスト生物を適切な条件下において適切な基質とインキュベーションすることと、(例えばガスクロマトグラフィー(GC)またはHPLC分析による)反応生成物の分析を行うこととによって決定され得る。SHC/HACおよび/またはSHC/HAC酵素活性アッセイならびに反応生成物の分析のさらなる詳細は例において提供されている。これらのアッセイは、組み換えホスト細胞(例えば大腸菌)によってSHC誘導体を産生することを包含する。
本開示は、さらに、本明細書に記載されるSHC誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
http:/www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/もしくは
http:/www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlもしくは
http:/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlにおいて利用可能なCLUSTALアルゴリズム(Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)、または本明細書の表18に提供されているWT SHCに対する配列アラインメントに利用されたGAPプログラム(アイオワ大学の計算アルゴリズム)、または本明細書において提供されている表19のWT SHC配列アラインメントにおいて開示および利用されているMyers and Miller (1989 - Cabios 4: 11-17)の計算アルゴリズムによる。
http:/www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/または
http:/www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html
においてそれらが設定されているデフォルトパラメータである。
本開示に従うホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換は主要化合物として(−)−アンブロックスを産生するが、(−)−アンブロックス以外の化合物をもまた産生することがあり、これは生物変換混合物に心地よい嗅覚的ノートを付与するかもしれずまたは付与しないかもしれず、そのため、(−)−アンブロックス最終生成物の知覚特性にポジティブなまたはネガティブな様式で寄与し得る。従って、試験が、化学的に関連するターゲット生成物が、参照生成物に対して嗅覚的に関連する最終生成物でもあるかどうかを決定する助けとなり得るように、知覚分析は、熟練の専門家(例えば香水業者)によって利用される良く確立された知覚試験を用いて行われる。例22の知覚分析が示しているように、(−)−アンブロックスからの1種以上の副生成物化合物の除去は、除去された化合物それ自体が実際には無臭の化合物である場合でさえも、残りの化合物((−)−アンブロックス)の匂いを改善し得る。すなわち、(−)−アンブロックスの匂いの増強が化合物II、III、およびIVの非存在下において観察された。
1. (−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセスであって、(3E,7E)−ホモファルネソール(EEH)またはEEHを含む立体異性体の混合物が、(−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物に酵素的に変換され、酵素的な変換が、(−)−アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下においてSHC/HAC酵素を用いて行われ、EEHを含む立体異性体の混合物が、それぞれ[EE:EZ]、[EE:ZE]、ならびに[EE:EZ:ZE]ともまた呼称される[(3E,7E)および[(3Z,7E)]ならびに/または[(3E,7E)および(3E,7Z)]ならびに/または[(3Z,7E)、(3E,7E)、および(3E,7Z)]からなる群から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になる。
2. (−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセスであって、(3E,7E)−ホモファルネソール(EEH)またはEEHを含む立体異性体の混合物が酵素的に変換されて、(−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物を与え、SHC/HAC酵素を用いる酵素的な変換が、(−)−アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において行われ、反応が可溶化剤の存在下において行われる場合には、Triton X-100またはタウロデオキシコール酸が野生型SHC/HAC酵素との組み合わせで用いられない。
3. (−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセスであって、(3E,7E)−ホモファルネソール(EEH)またはEEHを含む立体異性体の混合物が、(−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物に酵素的に変換され、酵素的変換が、(−)−アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下においてSHC/HAC酵素を用いて行われ、EEHを含む立体異性体の混合物が、それぞれ[EE:EZ]、[EE:ZE]、ならびに[EE:EZ:ZE]ともまた呼称される[(3E,7E)および[(3Z,7E)]ならびに/または[(3E,7E)および(3E,7Z)]ならびに/または[(3Z,7E)、(3E,7E)、および(3E,7Z)]からなる群から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になり、反応が、水相、固相、および油相を含む3相システムにおいて起こる。
4. パラグラフ1またはパラグラフ2またはパラグラフ3に従うプロセスであって、プロセスが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4からなる群から選択されるSHC/HAC酵素ポリペプチド配列、あるいは表1、表5、表2、表6、表3、表7、表4、表8、もしくは表13、表14から選択されるかまたは配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、171、173、175、177、および/もしくは178から選択されるSHC/HAC誘導体、あるいは配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4と少なくとも30%の同一性、少なくとも40%の同一性、少なくとも50%の同一性、または少なくとも60%の同一性、または少なくとも70%の同一性、または少なくとも80%の同一性、または少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性、または少なくとも96%の同一性、または少なくとも97%の同一性、または少なくとも98%の同一性、または少なくとも99%の同一性を有する配列を用いて行われる。
5. パラグラフ1〜4のいずれか1つのプロセスであって、プロセスが、SHC/HAC酵素を産生する組み換えホスト細胞を用いる。
6. パラグラフ4またはパラグラフ5に従うプロセスであって、SHC/HAC酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号165、166、167、168、169、または配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40および/もしくは170、172、174および/もしくは176からなる群から選択される。
7. パラグラフ1〜6のいずれか1つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が30℃から60℃の範囲内の温度で約4〜8の範囲内のpHにおいて起こる。
8. パラグラフ1〜7のいずれか1つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、表24または表24aに記されている野生型SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件の1種以上を用いて、好ましくは5.0から6.2のpH範囲において、好ましくは35℃の温度で起こる。
9. パラグラフ3〜8のいずれか1つに従うプロセスであって、生体触媒対EEHの比が約2:1であるときにSDS/細胞比が10:1から20:1の範囲内に、好ましくは16:1にある。
10. パラグラフ3〜9のいずれか1つに従うプロセスであって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約0.5〜2:1の範囲内、好ましくは約1:1または0.5:1である。
11. パラグラフ3〜10のいずれか1つに従うプロセスであって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
12. パラグラフ2に従うプロセスであって、ホモファルネソール基質が1種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
13. パラグラフ12に従うプロセスであって、ホモファルネソール基質が2種のホモファルネソール立体異性体を含むかまたは本質的にそれらからなる。
14. パラグラフ13に従うプロセスであって、ホモファルネソール基質がEE:EZ立体異性体を含むかまたは本質的にそれらからなる。
15. パラグラフ14のいずれか1つに従うプロセスであって、ホモファルネソールが、100:00、99:01、98:02、97:03、96:04、95:05、94:06、93:07、92:08、91:09、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、および60:40からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
16. パラグラフ15に従うプロセスであって、ホモファルネソールが、EE:EZ92:8、EE:EZ90:10、EE:EZ80:20、EE:EZ86:14、EE:EZ70:30、EE:EZ69:31、およびEE:EZ66:34からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
17. パラグラフ15またはパラグラフ16に従うプロセスであって、ホモファルネソールが80:20の重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
18. パラグラフ1〜17のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の少なくとも1種以上との混合物として産生される。
19. パラグラフ1〜18のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
20. パラグラフ1〜19のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが、有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物の固相から単離される。
21. パラグラフ19またはパラグラフ20に従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
22. パラグラフ21に従うプロセスであって、(−)−アンブロックスがエタノールまたはトルエンを用いて反応混合物から単離される。
23. パラグラフ19〜22のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
24. パラグラフ23に従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない。
25. パラグラフ1〜24のいずれか1つに従うプロセスであって、約125〜200g/lの濃度範囲内の(−)−アンブロックスが産生される。
26. パラグラフ1〜25のいずれか1つの方法によって得られ得る(−)−アンブロックスであって、(−)−アンブロックスが約0.1から約0.5ng/lの匂い閾値を有する。
27. 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ26の(−)−アンブロックス。
28. (−)−アンブロックスを含有する製品を作るためのプロセスであって、パラグラフ26またはパラグラフ27のいずれか1つの(−)−アンブロックスを製品に組み込むことを含む。
29. パラグラフ28のプロセスであって、製品がフレグランス製品、化粧品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品である。
30. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ26またはパラグラフ27のいずれか1つの(−)−アンブロックスを含む。
31. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ26またはパラグラフ27の(−)−アンブロックスと1種以上の追加の構成成分とを含む。
32. フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および/または清掃製品の一部としての、パラグラフ26またはパラグラフ27の(−)−アンブロックスの使用。
33. フレグランス組成物の芳香を拡張、増強、または付与するためのプロセスであって、
(a)副生成物化合物(II)、(III)、または(IV)の1種以上との混合物としての(−)−アンブロックスを含む反応混合物を調製するステップと、
(c)抽出混合物から(−)−アンブロックスを選択的に結晶化するステップと、
を含むプロセスに従って産生される芳香拡張または増強生成物を前記のフレグランス組成物と混合するステップを含み、
(−)−アンブロックスが、SHC/HAC酵素を用いて(−)−アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において、(3E,7E)−ホモファルネソール(EEH)またはEEHを含む立体異性体の混合物の酵素的な変換によって調製され、
EEHを含む立体異性体の混合物が、それぞれ[EE:EZ]、[EE:ZE]、ならびに[EE:EZ:ZE]ともまた呼称される[(3E,7E)および[(3Z,7E)]ならびに/または[(3E,7E)および(3E,7Z)]ならびに/または[(3Z,7E)、(3E,7E)、および(3E,7Z)]からなる群から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になる。
34. パラグラフ33のプロセスであって、反応が、水相、固相、および油相を含む3相システムにおいて起こる。
35. パラグラフ33またはパラグラフ34に従うプロセスであって、プロセスが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4からなる群から選択されるSHC/HAC酵素ポリペプチド配列、あるいは表1、表5、表2、表6、表3、表7、表4、表8、もしくは表14から選択されるかまたは配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、171、173、175、および/もしくは177から選択されるSHC/HAC誘導体、あるいは配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4と少なくとも30%の同一性、少なくとも40%の同一性、少なくとも50%の同一性、または少なくとも60%の同一性、または少なくとも70%の同一性、または少なくとも80%の同一性、または少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性、または少なくとも96%の同一性、または少なくとも97%の同一性、または少なくとも98%の同一性、または少なくとも99%の同一性を有する配列を用いて行われる。
36. パラグラフ33〜35のいずれか1つのプロセスであって、プロセスが、SHC/HAC酵素を産生する組み換えホスト細胞を用いる。
37. パラグラフ35またはパラグラフ36に従うプロセスであって、SHC/HAC酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号165、166、167、168、169、または配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、および/もしくは170、172、174、および/もしくは176からなる群から選択される。
38. パラグラフ33〜37のいずれか1つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、30℃から60℃の範囲内の温度で約4〜8の範囲内のpHにおいて起こる。
39. パラグラフ33〜38のいずれか1つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、表24または表24aに記されている野生型SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件の1つ以上を用いて、好ましくは5.0から6.2のpH範囲において、好ましくは35℃の温度で起こる。
40. パラグラフ34〜39のいずれか1つに従うプロセスであって、生体触媒対EEHの比が約2:1であるときにSDS/細胞比が10:1から20:1の範囲内、好ましくは16:1にある。
41. パラグラフ34〜40のいずれか1つに従うプロセスであって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約0.5〜2:1の範囲内、好ましくは約1:1または0.5:1である。
42. パラグラフ34〜41のいずれか1つに従うプロセスであって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
43. パラグラフ33〜42のいずれか1つに従うプロセスであって、ホモファルネソールが、100:00、99:01、98:02、97:03、96:04、95:05、94:06、93:07、92:08、91:09、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、および60:40からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
44. パラグラフ43に従うプロセスであって、ホモファルネソールが、EE:EZ92:08、EE:EZ90:10、EE:EZ80:20、EE:EZ86:14、EE:EZ70:30、EE:EZ69:31、およびEE:EZ66:34からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
45. パラグラフ43またはパラグラフ44に従うプロセスであって、ホモファルネソールが80:20の重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
46. パラグラフ33〜45のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の少なくとも1種以上との混合物として産生される。
47. パラグラフ33〜46のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
48. パラグラフ33〜47のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物の固相から単離される。
49. パラグラフ47またはパラグラフ48に従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
50. パラグラフ49に従うプロセスであって、(−)−アンブロックスがエタノールまたはトルエンを用いて反応混合物から単離される。
51. パラグラフ47〜49のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
52. パラグラフ51に従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない。
53. パラグラフ33〜52のいずれか1つに従うプロセスであって、約125〜200g/lの濃度範囲内の(−)−アンブロックスが産生される。
54. パラグラフ33〜53のいずれか1つに従うプロセスであって、(−)−アンブロックスが約0.1から約0.5ng/lの匂い閾値を有する。
1. スクアレン−ホペンシクラーゼ(SHC)/ホモファルネソール−アンブロックスシクラーゼ(HAC)誘導体であって、配列番号1に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜50個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
2. パラグラフ1に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号1に対して1から40個の変異、1〜30個の変異、1〜20個の変異、1〜10個の変異、または1〜6つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
3. パラグラフ1またはパラグラフ2に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC/HAC誘導体が、配列番号1に対して、少なくとも40%の同一性、少なくとも50%の同一性、または少なくとも60%の同一性、または少なくとも70%の同一性、または少なくとも80%の同一性、または少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性、または少なくとも96%の同一性、または少なくとも97%の同一性、または少なくとも98%の同一性、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
4. パラグラフ3に従うSHC/HAC誘導体であって、SHCバリアントが、配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
5. SHC/HAC誘導体であって、配列番号1に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜10個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の1つ以上の変異がSHC酵素のドメイン2(図19および/または20)内に位置する。
6. パラグラフ1〜5のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号1に対して1つ以上の変異が表1から選択され、1つの変異のみが選択される場合には、それはF601Yではない。
7. パラグラフ6に従うSHC/HAC誘導体であって、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の変異が表1または表5から選択される。
8. パラグラフ2のSHC/HAC誘導体であって、配列番号1に対して最大で6つの変異を有し、かつF129Lおよび/またはI432Tの少なくともいずれか1つ以上との組み合わせで、少なくとも置換F601YまたはM132Rを含むアミノ酸配列を含む。
9. パラグラフ7のSHC/HAC誘導体であって、配列番号1に対して最大で8つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号1に対して位置77、129、132、192、224、432、579、601、および605からなる群から選択される位置に1つまたは1つよりも多くのアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC/HAC誘導体が配列番号1に対して増大したHAC酵素活性を有する。
10. パラグラフ9に従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号1に対して、T77A、F129L、M132R、I92V、A224V、I432T、Q579H、F601Y、および/またはF605Wからなる群から選択される1種以上の置換を含む。
11. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F601Yを含む。
12. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F129Lを含む。
13. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F601YおよびF129Lを含む。
14. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、M132RおよびI432Tを含む。
15. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにアミノ酸置換A224Vを含む。
16. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF601Yを含む。
17. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF129Lを含む。
18. パラグラフ17に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF601Yを含む。
19. パラグラフ11に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにQ579Hを含む。
20. パラグラフ10に従うSHC誘導体であって、T77AおよびI92VおよびF129Lを含む。
21. 先行するパラグラフのいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、および/または171からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
22. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC誘導体をコードする単離されたヌクレオチド配列。
23. パラグラフ22に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、および/または170からなる群から選択される。
24. パラグラフ22またはパラグラフ23のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
25. パラグラフ24に従うコンストラクトであって、パラグラフ22または23のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
26. パラグラフ25のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
27. パラグラフ24〜26のいずれか1つに従うコンストラクトを含むベクター。
28. パラグラフ27のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
29. パラグラフ28に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞による発現に向かわせること(directing)が可能である。
30. パラグラフ24〜26のいずれか1つのコンストラクトまたはパラグラフ27〜29のいずれか1つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
31. 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、またはパラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクターを含む。
32. パラグラフ31に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア(Escherichia)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、およびラクトコッカス(Lactococcus)の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
33. パラグラフ32の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌(E.coli)ホスト細胞である。
34. パラグラフ33の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC/HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
35. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体を調製する方法であって、SHC/HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う1種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
36. パラグラフ35の方法であって、細胞培養が、生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
37. (−)−アンブロックスを調製する方法であって、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC/HACをコードする配列番号169または配列番号165を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを(−)−アンブロックスに変換することを含み、WT SHC/HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換がTriton X-100またはタウロデオキシコール酸以外の可溶化剤によって行われる。
38. パラグラフ37に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
39. パラグラフ37または38に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適なpH、温度、可溶化剤濃度において起こる。
40. パラグラフ39に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、30℃から60℃の範囲内の温度で約4〜8の範囲内のpHにおいて、WT SHC/HAC酵素についてはTriton X-100またはタウロデオキシコール酸以外の可溶化剤の存在下において起こる。
41. パラグラフ37〜40のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、表24または表24aに記されているWT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件の1つ以上を用いて起こる。
42. パラグラフ37〜41のいずれか1つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約0.5:1から2:1の範囲内、好ましくは約1:1または0.5:1である。
43. パラグラフ37〜42のいずれか1つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
44. パラグラフ37〜43のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が1種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
45. パラグラフ44の方法であって、ホモファルネソール基質が2種のホモファルネソール立体異性体を含む。
46. パラグラフ45の方法であって、ホモファルネソール基質がEE:EZ立体異性体を含む。
47. パラグラフ44〜46のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールが、100:00、99:01、98:02、97:03、96:04、95:05、94:06、93:07、92:08、91:09、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、および70:30からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
48. パラグラフ47の方法であって、ホモファルネソールが、EE:EZ90:10、EE:EZ80:20、EE:EZ86:14、EE:EZ70:30、EE:EZ69:31、およびEE:EZ66:34からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
49. パラグラフ35または36の方法であって、ホモファルネソールが80:20の重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
50. パラグラフ37〜49のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の1種以上との混合物として産生される。
51. パラグラフ37〜50のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは蒸気抽出/蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物から単離されるか、または(−)−アンブロックス結晶が濾過の手段によって生物変換反応混合物から直接的に単離される。
52. パラグラフ51に従う方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
53. パラグラフ52の方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
54. パラグラフ52または53の方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない。
55. パラグラフ51〜54のいずれか1つの方法によって得られ得る(−)−アンブロックス。
56. 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ55の(−)−アンブロックス。
57. (−)−アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
58. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを含む。
59. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスと1種以上の追加の構成成分とを含む。
60. フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および/または清掃製品の一部としての、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスの使用。
61. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体酵素、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、パラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、パラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクター、またはパラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC/HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC/HAC 酵素が、Triton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
62. (−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスの立体異性体混合物を調製するための方法であって、(3E,7E)−ホモファルネソールまたは(3E,7E)−ホモファルネソールの立体異性体混合物が酵素的に変換されて(−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスの立体異性体混合物を与え、SHC/HAC酵素を用いる酵素的な変換が、(−)−アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において行われ、反応が可溶化剤の存在下において行われる場合には、Triton X-100がWT SHC/HAC酵素との組み合わせで用いられない。
63. パラグラフ62に従うプロセスであって、プロセスが、AacSHC(配列番号1)、ZmoSHC1(配列番号2)、ZmoSHC2(配列番号3)、BjpSHC(配列番号4)からなる群から選択されるSHC/HAC酵素、表1、表5、表2、表6、表3、表7、表4、および/もしくは表8から選択されるSHC/HAC誘導体、または配列番号1、配列番号2、配列番号3、および/もしくは配列番号4に対して少なくとも30%の同一性、少なくとも40%の同一性、少なくとも50%の同一性、もしくは少なくとも60%の同一性、もしくは少なくとも70%の同一性、もしくは少なくとも80%の同一性、もしくは少なくとも90%の同一性、もしくは少なくとも95%の同一性、もしくは少なくとも96%の同一性、もしくは少なくとも97%の同一性、もしくは少なくとも98%の同一性、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を用いて行われる。
64. パラグラフ63に従うプロセスであって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、30℃から60℃の範囲内の温度で、4〜8の範囲内のpHにおいて、WT SHCについてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
65. パラグラフ64に従うプロセスであって、表24または表24aに記されているWT SHC/HACまたはそれぞれのSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件が用いられる。
66. パラグラフ62〜65のいずれか1つに従うプロセスであって、プロセスが、E,E−ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換に先立って、(a)WT SHCまたはSHC/HAC誘導体ポリペプチドの発現を許容する条件下において、WT SHCまたはSHC誘導体酵素を発現する1種以上の組み換えホスト細胞を培養することを含む。
67. パラグラフ66に従うプロセスであって、培養ステップおよび引き続く変換ステップが同じ反応容器内で異なる反応条件下において起こる。
68. パラグラフ67に従うプロセスであって、培養ステップが約6から約7のpH範囲においてであり、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへのステップが約4.8〜5.5のpH範囲においてである。
69. パラグラフ62〜68のいずれか1つに従うプロセスであって、ホモファルネソール基質がEE:EZ立体異性体を含む。
70. パラグラフ69に従うプロセスであって、ホモファルネソールが、EE:EZ90:10、EE:EZ80:20、EE:EZ86:14、EE:EZ70:30、EE:EZ69:31、およびEE:EZ66:34からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
71. パラグラフ70のプロセスであって、ホモファルネソールが80:20の重量比でEE:EZを含む。
72. パラグラフ62〜71のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の1種以上との混合物として産生される。
73. パラグラフ62〜72のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが、有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップまたは濾過を用いて反応混合物から単離される。
74. パラグラフ73に従う方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
75. パラグラフ74の方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
76. パラグラフ74または75の方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない。
77. パラグラフ72〜76のいずれか1つの方法によって得られ得る(−)−アンブロックス。
78. 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ26の(−)−アンブロックス。
79. 製品を作るための方法であって、パラグラフ77または78の(−)−アンブロックスを製品に組み込むことを含む。
80. パラグラフ79の方法であって、製品がフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品である。
81. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ77または78の(−)−アンブロックスを含む。
82. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ77または78の(−)−アンブロックスと追加の構成成分とを含む。
83. フレグランスまたは化粧品消費者ケア製品の一部としての、パラグラフ77または78の(−)−アンブロックスの使用。
1. スクアレン−ホペンシクラーゼ(SHC)/ホモファルネソール−アンブロックスシクラーゼ(HAC)誘導体であって、配列番号2に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜50個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
2. パラグラフ1に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号2に対して1から40個の変異、1〜30個の変異、1〜20個の変異、1〜10個の変異、または1〜6つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
3. パラグラフ1またはパラグラフ2に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC/HAC誘導体が、配列番号2に対して、少なくとも40%の同一性、少なくとも50%の同一性、または少なくとも60%の同一性、または少なくとも70%の同一性、または少なくとも80%の同一性、または少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性、または少なくとも96%の同一性、または少なくとも97%の同一性、または少なくとも98%の同一性、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
4. パラグラフ3に従うSHC/HAC誘導体であって、SHCバリアントが、配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
5. SHC/HAC誘導体であって、配列番号2に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜10個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の1つ以上の変異がSHC酵素のドメイン2(図19および/または20)内に位置する。
6. パラグラフ1〜5のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号2に対して1つ以上の変異が表2から選択され、1つの変異のみが選択される場合には、それはF668Yではない。
7. パラグラフ6のSHC/HAC誘導体であって、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の変異が表2および/または表6から選択される。
8. パラグラフ2のSHC/HAC誘導体であって、配列番号2に対して最大で6つの変異を有し、かつF182Lおよび/またはI498Tの少なくともいずれか1種以上との組み合わせで、少なくとも置換F668YまたはY185Rを含むアミノ酸配列を含む。
9. パラグラフ7のSHC/HAC誘導体であって、配列番号2に対して最大で8つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号2に対して位置129、145、182、185、282、498、647、および668からなる群から選択される位置に1つ以上のアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC/HAC誘導体が配列番号2に対して増大したHAC酵素活性を有する。
10. パラグラフ9に従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号2に対して、S129A、V145V、F182L、Y185R、G282V、I498T、H646H、およびF668Yからなる群から選択される1種以上の置換を含む。
11. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F668Yを含む。
12. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F182Lを含む。
13. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F668YおよびF182Lを含む。
14. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、Y185RおよびI498Tを含む。
15. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにG282Vを含む。
16. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF668Yを含む。
17. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF182Lを含む。
18. パラグラフ17に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF668Yを含む。
19. パラグラフ11に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにH646Hを含む。
20. パラグラフ10に従うSHC誘導体であって、S129AおよびV145VおよびF182Lを含む。
21. 先行するパラグラフのいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、および/または75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
22. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC誘導体をコードする単離されたヌクレオチド配列。
23. パラグラフ22に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、および/または76からなる群から選択される。
24. パラグラフ22またはパラグラフ23のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
25. パラグラフ24に従うコンストラクトであって、パラグラフ22または23のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
26. パラグラフ25のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
27. パラグラフ24〜26のいずれか1つに従うコンストラクトを含むベクター。
28. パラグラフ27のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
29. パラグラフ28に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞による発現に向かわせることが可能である。
30. パラグラフ24〜26のいずれか1つのコンストラクトまたはパラグラフ27〜29のいずれか1つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
31. 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、またはパラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクターを含む。
32. パラグラフ31に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア(Escherichia)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、およびラクトコッカス(Lactococcus)の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
33. パラグラフ32の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌ホスト細胞である。
34. パラグラフ33の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC/HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
35. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体を調製する方法であって、SHC/HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う1種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
36. パラグラフ35の方法であって、細胞培養が、生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
37. (−)−アンブロックスを調製する方法であって、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC/HACをコードする配列番号166を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを(−)−アンブロックスに変換することを含み、WT SHC/HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換がTriton X-100以外の可溶化剤によって行われる。
38. パラグラフ37に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
39. パラグラフ37または38に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適なpH、温度、可溶化剤濃度において起こる。
40. パラグラフ39に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、30℃から60℃の範囲内の温度で約4〜8の範囲内のpHにおいて、WT SHC/HAC酵素についてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
41. パラグラフ37〜40のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、表24または表24aに記されているWT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件の1つ以上を用いて起こる。
42. パラグラフ37〜41のいずれか1つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約0.5:1から2:1の範囲内、好ましくは約1:1または0.5:1である。
43. パラグラフ37〜42のいずれか1つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
44. パラグラフ37〜43のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が1種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
45. パラグラフ44の方法であって、ホモファルネソール基質が2種のホモファルネソール立体異性体を含む。
46. パラグラフ45の方法であって、ホモファルネソール基質がEE:EZ立体異性体を含む。
47. パラグラフ44〜46のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールが、100:00、99:01、98:02、97:03、96:04、95:05、94:06、93:07、92:08、91:09、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、および70:30からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
48. パラグラフ47の方法であって、ホモファルネソールが、EE:EZ90:10、EE:EZ80:20、EE:EZ86:14、EE:EZ70:30、EE:EZ69:31、およびEE:EZ66:34からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
49. パラグラフ35または36の方法であって、ホモファルネソールが80:20の重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
50. パラグラフ37〜49のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の1種以上との混合物として産生される。
51. パラグラフ37〜50のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
52. パラグラフ51に従う方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
53. パラグラフ52の方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて(−)−アンブロックスから選択的に結晶化される。
54. パラグラフ52または53の方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない。
55. パラグラフ51〜54のいずれか1つの方法によって得られ得る(−)−アンブロックス。
56. 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ55の(−)−アンブロックス。
57. (−)−アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
58. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを含む。
59. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスと1種以上の追加の構成成分とを含む。
60. フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および/または清掃製品の一部としての、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスの使用。
61. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体酵素、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、パラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、パラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクター、またはパラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC/HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC/HAC酵素が、Triton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
1. スクアレン−ホペンシクラーゼ(SHC)/ホモファルネソール−アンブロックスシクラーゼ(HAC)誘導体であって、配列番号3に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜50個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
2. パラグラフ1に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号3に対して1から40個の変異、1〜30個の変異、1〜20個の変異、1〜10個の変異、または1〜6つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
3. パラグラフ1またはパラグラフ2に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC/HAC誘導体が、配列番号3に対して、少なくとも40%の同一性、少なくとも50%の同一性、または少なくとも60%の同一性、または少なくとも70%の同一性、または少なくとも80%の同一性、または少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性、または少なくとも96%の同一性、または少なくとも97%の同一性、または少なくとも98%の同一性、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
4. パラグラフ3に従うSHC/HAC誘導体であって、SHCバリアントが配列番号3との少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
5. SHC/HAC誘導体であって、配列番号3に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜10個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の1つ以上の変異がSHC酵素のドメイン2(図19および/または20)内に位置する。
6. パラグラフ1〜5のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号3に対して1つ以上の変異が表3から選択され、1つの変異のみが選択される場合には、それはF620Yではない。
7. パラグラフ6のSHC/HAC誘導体であって、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の変異が表3および/または表7から選択される。
8. パラグラフ2のSHC/HAC誘導体であって、配列番号3に対して最大で6つの変異を有し、かつF137Lおよび/またはI450Tの少なくともいずれか1種以上との組み合わせで、少なくとも置換F620YまたはI140Rを含むアミノ酸配列を含む。
9. パラグラフ7のSHC/HAC誘導体であって、配列番号3に対して最大で8つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号3に対して位置85、100、137、140、233、450、598、および620からなる群から選択される位置に1つ以上のアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC/HAC誘導体が配列番号3に対して増大したHAC酵素活性を有する。
10. パラグラフ9に従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号3に対して、G85A、V100V、F137L、I140R、V233V、I450T、N598H、およびF620Yからなる群から選択される1種以上の置換を含む。
11. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F620Yを含む。
12. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F137Lを含む。
13. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F620YおよびF137Lを含む。
14. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、I140RおよびI450Tを含む。
15. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにV233Vを含む。
16. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF620Yを含む。
17. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF137Lを含む。
18. パラグラフ17に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF620Yを含む。
19. パラグラフ11に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにN598Hを含む。
20. パラグラフ10に従うSHC誘導体であって、G85AおよびV100VおよびF137Lを含む。
21. 先行するパラグラフのいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、および/または111からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
22. 単離されたヌクレオチド配列であって、パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC誘導体をコードする。
23. パラグラフ22に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、および/または112からなる群から選択される。
24. パラグラフ22またはパラグラフ23のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
25. パラグラフ24に従うコンストラクトであって、パラグラフ22または23のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
26. パラグラフ25のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
27. パラグラフ24〜26のいずれか1つに従うコンストラクトを含むベクター。
28. パラグラフ27のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
29. パラグラフ28に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞における発現に向かわせることが可能である。
30. パラグラフ24〜26のいずれか1つのコンストラクトまたはパラグラフ27〜29のいずれか1つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
31. 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、またはパラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクターを含む。
32. パラグラフ31に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア(Escherichia)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、およびラクトコッカス(Lactococcus)の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
33. パラグラフ32の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌ホスト細胞である。
34. パラグラフ33の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC/HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
35. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体を調製する方法であって、(a)SHC/HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う1種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
36. パラグラフ35の方法であって、細胞培養が生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
37. (−)−アンブロックスを調製するための方法であって、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC/HACをコードする配列番号167を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを(−)−アンブロックスに変換することを含み、WT SHC/HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換がTriton X-100以外の可溶化剤によって行われる。
38. パラグラフ37に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
39. パラグラフ37または38に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適なpH、温度、可溶化剤濃度において起こる。
40. パラグラフ39に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、30℃から60℃の範囲内の温度で、約4〜8の範囲内のpHにおいて、WT SHC/HAC酵素についてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
41. パラグラフ37〜40のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、表24または表24aに記されているWT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件の1つ以上を用いて起こる。
42. パラグラフ37〜41のいずれか1つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約0.5:1から2:1の範囲内、好ましくは約1:1または0.5:1である。
43. パラグラフ37〜42のいずれか1つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
44. パラグラフ37〜43のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が1種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
45. パラグラフ44の方法であって、ホモファルネソール基質が2種のホモファルネソール立体異性体を含む。
46. パラグラフ45の方法であって、ホモファルネソール基質がEE:EZ立体異性体を含む。
47. パラグラフ44〜46のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールが、100:00、99:01、98:02、97:03、96:04、95:05、94:06、93:07、92:08、91:09、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、および70:30からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
48. パラグラフ47の方法であって、ホモファルネソールが、EE:EZ90:10、EE:EZ80:20、EE:EZ86:14、EE:EZ70:30、EE:EZ69:31、およびEE:EZ66:34からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
49. パラグラフ35または36の方法であって、ホモファルネソールが80:20の重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
50. パラグラフ37〜49のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の1種以上との混合物として産生される。
51. パラグラフ37〜50のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
52. パラグラフ51に従う方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
53. パラグラフ52の方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて(−)−アンブロックスから選択的に結晶化される。
54. パラグラフ52または53の方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない。
55. パラグラフ51〜54のいずれか1つの方法によって得られ得る(−)−アンブロックス。
56. 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ55の(−)−アンブロックス。
57. (−)−アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
58. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを含む。
59. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスと1種以上の追加の構成成分とを含む。
60. フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および/または清掃製品の一部としての、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスの使用。
61. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体酵素、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、パラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、パラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクター、またはパラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC/HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC/HAC酵素が、Triton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
1. スクアレン−ホペンシクラーゼ(SHC)/ホモファルネソール−アンブロックスシクラーゼ(HAC)誘導体であって、配列番号4に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜50個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
2. パラグラフ1に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号4に対して1から40個の変異、1〜30個の変異、1〜20個の変異、1〜10個の変異、または1〜6つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
3. パラグラフ1またはパラグラフ2に従うSHC/HAC誘導体であって、SHC/HAC誘導体が、配列番号4に対して、少なくとも40%の同一性、少なくとも50%の同一性、または少なくとも60%の同一性、または少なくとも70%の同一性、または少なくとも80%の同一性、または少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性、または少なくとも96%の同一性、または少なくとも97%の同一性、または少なくとも98%の同一性、または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
4. パラグラフ3に従うSHC/HAC誘導体であって、SHCバリアントが配列番号4との少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
5. SHC/HAC誘導体であって、配列番号4に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜10個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の1つ以上の変異がSHC酵素のドメイン2(図19および/または20)内に位置する。
6. パラグラフ1〜5のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号4に対して1つ以上の変異が表4から選択され、1つの変異のみが選択される場合には、それはF628Yではない。
7. パラグラフ6のSHC/HAC誘導体であって、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の変異が表4および/または表8から選択される。
8. パラグラフ2のSHC/HAC誘導体であって、配列番号4に対して最大で6つの変異を有し、かつF137Lおよび/またはI450Tの少なくともいずれか1種以上との組み合わせで、少なくとも置換F628YまたはI140Rを含むアミノ酸配列を含む。
9. パラグラフ7のSHC/HAC誘導体であって、配列番号4に対して最大で8つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号4に対して位置88、104、141、144、241、459、607、および628からなる群から選択される位置に1つまたは1つよりも多くのアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC/HAC誘導体が配列番号4に対して増大したHAC酵素活性を有する。
10. パラグラフ9に従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号4に対して、A88A、V104V、F141L、Y144R、V241V、I459T、M607H、およびF628Yからなる群から選択される1種以上の置換を含む。
11. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F628Yを含む。
12. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F141Lを含む。
13. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、F628YおよびF141Lを含む。
14. パラグラフ10に従うSHC/HAC誘導体であって、Y144RおよびI459Tを含む。
15. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにV241Vを含む。
16. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF628Yを含む。
17. パラグラフ14に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF141Lを含む。
18. パラグラフ17に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにF628Yを含む。
19. パラグラフ11に従うSHC/HAC誘導体であって、さらにM607Hを含む。
20. パラグラフ10に従うSHC誘導体であって、S129AおよびV145VおよびF182Lを含む。
21. 先行するパラグラフのいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体であって、配列番号113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、および/または147からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
22. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC誘導体をコードする単離されたヌクレオチド配列。
23. パラグラフ22に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号114、116、118、120、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、および/または148からなる群から選択される。
24. パラグラフ22またはパラグラフ23のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
25. パラグラフ24に従うコンストラクトであって、パラグラフ22または23のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
26. パラグラフ25のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
27. パラグラフ24〜26のいずれか1つに従うコンストラクトを含むベクター。
28. パラグラフ27のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
29. パラグラフ28に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞による発現に向かわせることが可能である。
30. パラグラフ24〜26のいずれか1つのコンストラクトまたはパラグラフ27〜29のいずれか1つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
31. 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、またはパラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクターを含む。
32. パラグラフ31に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア(Escherichia)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、およびラクトコッカス(Lactococcus)の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
33. パラグラフ32の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌ホスト細胞である。
34. パラグラフ33の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC/HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
35. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体を調製する方法であって、(a)SHC/HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う1種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
36. パラグラフ35の方法であって、細胞培養が生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
37. (−)−アンブロックスを調製する方法であって、パラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC/HACをコードする配列番号168を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを(−)−アンブロックスに変換することを含み、WT SHC/HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換がTriton X-100以外の可溶化剤によって行われる。
38. パラグラフ37に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
39. パラグラフ37または38に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、WT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素にとって好適なpH、温度、可溶化剤濃度において起こる。
40. パラグラフ39に従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、30℃から60℃の範囲内の温度で、約4〜8の範囲内のpHにおいて、WT SHC/HAC酵素についてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
41. パラグラフ37〜40のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、表24または表24aに記されているWT SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件の1つ以上を用いて起こる。
42. パラグラフ37〜41のいずれか1つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約0.5:1から2:1の範囲内、好ましくは約1:1または0.5:1である。
43. パラグラフ37〜42のいずれか1つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
44. パラグラフ27〜31のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が1種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
45. パラグラフ44の方法であって、ホモファルネソール基質が2種のホモファルネソール立体異性体を含む。
46. パラグラフ45の方法であって、ホモファルネソール基質がEE:EZ立体異性体を含む。
47. パラグラフ44〜46のいずれか1つに従う方法であって、ホモファルネソールが、100:00、99:01、98:02、97:03、96:04、95:05、94:06、93:07、92:08、91:09、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、および70:30からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
48. パラグラフ47の方法であって、ホモファルネソールが、EE:EZ90:10、EE:EZ80:20、EE:EZ86:14、EE:EZ70:30、EE:EZ69:31、およびEE:EZ66:34からなる群から選択される重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
49. パラグラフ35または36の方法であって、ホモファルネソールが80:20の重量比でEE:EZ立体異性体混合物を含む。
50. パラグラフ37〜49のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の1種以上との混合物として産生される。
51. パラグラフ37〜50のいずれか1つの方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
52. パラグラフ51に従う方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
53. パラグラフ52の方法であって、(−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて(−)−アンブロックスから選択的に結晶化される。
54. パラグラフ52または53の方法であって、(−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない。
55. パラグラフ51〜54のいずれか1つの方法によって得られ得る(−)−アンブロックス。
56. 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ55の(−)−アンブロックス。
57. (−)−アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
58. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスを含む。
59. フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスと1種以上の追加の構成成分とを含む。
60. フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および/または清掃製品の一部としての、パラグラフ55または56の(−)−アンブロックスの使用。
61. パラグラフ1〜21のいずれか1つに従うSHC/HAC誘導体酵素、パラグラフ22もしくは23に従うヌクレオチド配列、パラグラフ24〜26もしくは30のいずれか1つに従うコンストラクト、パラグラフ27〜30のいずれか1つに従うベクター、またはパラグラフ31〜34のいずれか1つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC/HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC/HAC酵素がTriton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
配列番号2(ジモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis))、ZmoSHC1
MGIDRMNSLSRLLMKKIFGAEKTSYKPASDTIIGTDTLKRPNRRPEPTAKVDKTIFKTMGNSLNNTLVSACDWLIGQQKPDGHWVGAVESNASMEAEWCLALWFLGLEDHPLRPRLGNALLEMQREDGSWGVYFGAGNGDINATVEAYAALRSLGYSADNPVLKKAAAWIAEKGGLKNIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNLPPEIIWFPDNFVFSIYNFAQWARATMVPIAILSARRPSRPLRPQDRLDELFPEGRARFDYELPKKEGIDLWSQFFRTTDRGLHWVQSNLLKRNSLREAAIRHVLEWIIRHQDADGGWGGIQPPWVYGLMALHGEGYQLYHPVMAKALSALDDPGWRHDRGESSWIQATNSPVWDTMLALMALKDAKAEDRFTPEMDKAADWLLARQVKVKGDWSIKLPDVEPGGWAFEYANDRYPDTDDTAVALIALSSYRDKEEWQKKGVEDAITRGVNWLIAMQSECGGWGAFDKDNNRSILSKIPFCDFGESIDPPSVDVTAHVLEAFGTLGLSRDMPVIQKAIDYVRSEQEAEGAWFGRWGVNYIYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYITKACDWLVAHQQEDGGWGESCSSYMEIDSIGKGPTTPSQTAWALMGLIAANRPEDYEAIAKGCHYLIDRQEQDGSWKEEEFTGTGFPGYGVGQTIKLDDPALSKRLLQGAELSRAFMLRYDFYRQFFPIMALSRAERLIDLNN
配列番号3(ジモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis))、ZmoSHC2
MTVSTSSAFHHSPLSDDVEPIIQKATRALLEKQQQDGHWVFELEADATIPAEYILLKHYLGEPEDLEIEAKIGRYLRRIQGEHGGWSLFYGGDLDLSATVKAYFALKMIGDSPDAPHMLRARNEILARGGAMRANVFTRIQLALFGAMSWEHVPQMPVELMLMPEWFPVHINKMAYWARTVLVPLLVLQALKPVARNRRGILVDELFVPDVLPTLQESGDPIWRRFFSALDKVLHKVEPYWPKNMRAKAIHSCVHFVTERLNGEDGLGAIYPAIANSVMMYDALGYPENHPERAIARRAVEKLMVLDGTEDQGDKEVYCQPCLSPIWDTALVAHAMLEVGGDEAEKSAISALSWLKPQQILDVKGDWAWRRPDLRPGGWAFQYRNDYYPDVDDTAVVTMAMDRAAKLSDLHDDFEESKARAMEWTIGMQSDNGGWGAFDANNSYTYLNNIPFADHGALLDPPTVDVSARCVSMMAQAGISITDPKMKAAVDYLLKEQEEDGSWFGRWGVNYIYGTWSALCALNVAALPHDHLAVQKAVAWLKTIQNEDGGWGENCDSYALDYSGYEPMDSTASQTAWALLGLMAVGEANSEAVTKGINWLAQNQDEEGLWKEDYYSGGGFPRVFYLRYHGYSKYFPLWALARYRNLKKANQPIVHYGM
配列番号4(ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum))、BjpSHC
MTVTSSASARATRDPGNYQTALQSTVRAAADWLIANQKPDGHWVGRAESNACMEAQWCLALWFMGLEDHPLRKRLGQSLLDSQRPDGAWQVYFGAPNGDINATVEAYAALRSLGFRDDEPAVRRAREWIEAKGGLRNIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNIPPEVIWFPLWFPFSIYNFAQWARATLMPIAVLSARRPSRPLPPENRLDALFPHGRKAFDYELPVKAGAGGWDRFFRGADKVLHKLQNLGNRLNLGLFRPAATSRVLEWMIRHQDFDGAWGGIQPPWIYGLMALYAEGYPLNHPVLAKGLDALNDPGWRVDVGDATYIQATNSPVWDTILTLLAFDDAGVLGDYPEAVDKAVDWVLQRQVRVPGDWSMKLPHVKPGGWAFEYANNYYPDTDDTAVALIALAPLRHDPKWKAKGIDEAIQLGVDWLIGMQSQGGGWGAFDKDNNQKILTKIPFCDYGEALDPPSVDVTAHIIEAFGKLGISRNHPSMVQALDYIRREQEPSGPWFGRWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYIGRACDWLVAHQQADGGWGESCASYMDVSAVGRGTTTASQTAWALMALLAANRPQDKDAIERGCMWLVERQSAGTWDEPEFTGTGFPGYGVGQTIKLNDPALSQRLMQGPELSRAFMLRYGMYRHYFPLMALGRALRPQSHS
配列番号149(バークホルデリア・アンビファリア(Burkholderia ambifaria))
MNDLTEMATLSAGTVPAGLDAAVASATDALLAAQNADGHWVYELEADSTIPAEYVLLVHYLGETPNLELEQKIGRYLRRVQQADGGWPLFTDGAPNISASVKAYFALKVIGDDENAEHMQRARRAIQAMGGAEMSNVFTRIQLALYGAIPWRAVPMMPVEIMLLPQWFPFHLSKVSYWARTVIVPLLVLNAKRPIAKNPRGVRIDELFVDPPVNAGLLPRQGHQSPGWFAFFRVVDHALRAADGLFPNYTRERAIRQAVSFVDERLNGEDGLGAIYPAMANAVMMYDVLGYAEDHPNRAIARKSIEKLLVVQEDEAYCQPCLSPVWDTSLAAHALLETGDARAEEAVIRGLEWLRPLQILDVRGDWISRRPHVRPGGWAFQYANPHYPDVDDTAVVAVAMDRVQKLKHNDAFRDSIARAREWVVGMQSSDGGWGAFEPENTQYYLNNIPFSDHGALLDPPTADVSGRCLSMLAQLGETPLNSEPARRALDYMLKEQEPDGSWYGRWGMNYVYGTWTALCALNAAGLTPDDPRVKRGAQWLLSIQNKDGGWGEDGDSYKLNYRGFEQAPSTASQTAWALLGLMAAGEVNNPAVARGVEYLIAEQKEHGLWDETRFTATGFPRVFYLRYHGYRKFFPLWALARYRNLKRNNATRVTFGL
配列番号151(バークホルデリア・アンビファリア(Burkholderia ambifaria))
MIRRMNKSGPSPWSALDAAIARGRDALMRLQQPDGSWCFELESDATITAEYILMMHFMDKIDDARQEKMARYLRAIQRLDTHGGWDLYVDGDPDVSCSVKAYFALKAAGDSEHAPHMVRARDAILELGGAARSNVFTRILLATFGQVPWRATPFMPIEFVLFPKWVPISMYKVAYWARTTMVPLLVLCSLKARARNPRNIAIPELFVTPPDQERQYFPPARGMRRAFLALDRVVRHVEPLLPKRLRQRAIRHAQAWCAERMNGEDGLGGIFPPIVYSYQMMDVLGYPDDHPLRRDCENALEKLLVTRPDGSMYCQPCLSPVWDTAWSTMALEQARGVAVPEAGAPASALDELDARIARAYDWLAERQVNDLRGDWIENAPADTQPGGWAFQYANPYYPDIDDSAVVTAMLDRRGRTHRNADGSHPYAARVARALDWMRGLQSRNGGFAAFDADCDRLYLNAIPFADHGALLDPPTEDVSGRVLLCFGVTKRADDRASLARAIDYVKRTQQPDGSWWGRWGTNYLYGTWSVLAGLALAGEDPSQPYIARALAWLRARQHADGGWGETNDSYIDPALAGTNAGESTSNCTAWALLAQMAFGDGESESVRRGIAYLQSVQQDDGFWWHRSHNAPGFPRIFYLKYHGYTAYFPLWALARYRRLAGGVSAAGAHAVPASTGADAALA
配列番号153(炭疽菌(Bacillus anthracis))
MLLYEKAHEEIVRRATALQTMQWQDGTWRFCFEGAPLTDCHMIFLLKLLGRDKEIEPFVERVASLQTNEGTWKLHEDEVGGNLSATIQSYAALLASKKYTKEDANMKRAENFIQERGGVARAHFMTKFLLAIHGEYEYPSLFHLPTPIMFLQNDSPFSIFELSSSARIHLIPMMLCLNKRFRVGKKLLPNLNHIAGGGGEWFREDRSPVFQTLLSDVKQIISYPLSLHHKGYEEIERFMKERIDENGTLYSYATASFYMIYALLALGHSLQSSMIQKAIAGITSYIWKMERGNHLQNSPSTVWDTALLSYALQEAQVSKDNKMIQNATAYLLKKQHTKKADWSVHAPALTPGGWGFSDVNTTIPDIDDTTAVLRALARSRGNKNIDNAWKKGGNWIKGLQNNDGGWGAFEKGVTSKLLAKLPIENASDMITDPSTPDITGRVLEFFGTYAQNELPEKQIQRAINWLMNVQEENGSWYGKWGICYLYGTWAVMTGLRSLGIPSSNPSLTRAASWLEHIQHEDGGWGESCHSSVEKRFVTLPFSTPSQTAWALDALISYYDTETPAIRKGVSYLLSNPYVNERYPTGTGLPGAFYIRYHSYAHIYPLLTLAHYIKKYRK
配列番号155(フランキア・アルニ(Frankia alni))
MPAGVGVLVWLDQRLRAMGRPDLVTTTGGAEIPFVLVAATASTVGVALALRRPRHPVGWLFLALGGVLLLSGGTQGYAAYGAVARPGRLPAADLVAIYADAGFIPWLVLVALILHLTPTGRPLSARWGRIALATAVAGGLWLLVGLVTTETMQPPFQSVTNPLLIGGPLGPLLVARRVLGLATGAGVVLAAVSLIVRFRRSVDVERRQLLWVAVAAVPLPVLMAASFAASYAGNNTAAGLAAATLIGLLAIGAGLAIGQYHLYDVEEILSRAVTYLLVSGLLAASYATVVIVVGQSLAGRTGRSQISAVLATLAAVAVTAPAYRKIQEGVDRRFSRRRFETLQVIRRYLRDPDPDVAVEEVLRRALGDPTLAVAYLVDDRRQWVSADGQPANPGNSFMAAVEVYRRGRPIARVTFDRGRAQPGLVRAAATAATAELDNAGLRAAVALQLVEVRQSRTRIAAAQFAERRTIERNLHDGAQQRLLALALQLRAVQLGGDEASLRQAISTGIDQLQAAVVELRELANGLHPAVLADGGLAAALDDVAARTPVPIKISAPDRRYPPDLEAAAWFIACEAMANAVKHAHPTTIAVDVSAPDGQLIVEVRDDGIGGAQPSGPGLRGIADRAEAFGGSLTVHTDPGTGTTIRALLHRRSPLSSGRRSVMIEGCVDVVAVRRFRCRSSRGSGSRRRRSSWRCGGICGSRCRTGMSRSCSRNAASKLIT
配列番号157(ロドシュードモナス・パレント(Rhodopseudomonas patent))
MDSILAPRADAPRNIDGALRESVQQAADWLVANQKPDGHWVGRAETNATMEAQWCLALWFLGLEDHPLRVRLGRALLDTQRPDGAWHVFYGAPNGDINATVEAYAALRSLGHRDDEEPLRKARDWILSKGGLANIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNILPEVIWLPTWFPFSIYNFAQWARATLMPIAVLSAHRPSRPLAPQDRLDALFPQGRDSFNYDLPARLGAGVWDVIFRKIDTILHRLQDWGARRGPHGIMRRGAIDHVLQWIIRHQDYDGSWGGIQPPWIYGLMALHTEGYAMTHPVMAKALDALNEPGWRIDIGDATFIQATNSPVWDTMLSLLAFDDAGLGERYPEQVERAVRWVLKRQVLVPGDWSVKLPDVKPGGWAFEYANNFYPDTDDTSVALMALAPFRHDPKWQAEGIEDAIQRGIDWLVAMQCKEGGWGAFDKDNDKKILAKIPFCDFGEALDPPSADVTAHIIEAFAKVGLDRNHPSIVRALDYLKREQEPEGPWFGRWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMRQPYIARACDWLIARQQANGGWGESCVSYMDAKQAGEGTATASQTAWALMALIAADRPQDRDAIERGCLYLTETQRDGTWQEVHYTGTGFPGYGVGQTIKLNDPLLSKRLMQGPELSRSFMLRYDLYRHYFPMMAIGRVLRQRGDRSGH
配列番号159(ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor))
MTATTDGSTGASLRPLAASASDTDITIPAAAAGVPEAAARATRRATDFLLAKQDAEGWWKGDLETNVTMDAEDLLLRQFLGIQDEETTRAAALFIRGEQREDGTWATFYGGPGELSTTIEAYVALRLAGDSPEAPHMARAAEWIRSRGGIASARVFTRIWLALFGWWKWDDLPELPPELIYFPTWVPLNIYDFGCWARQTIVPLTIVSAKRPVRPAPFPLDELHTDPARPNPPRPLAPVASWDGAFQRIDKALHAYRKVAPRRLRRAAMNSAARWIIERQENDGCWGGIQPPAVYSVIALYLLGYDLEHPVMRAGLESLDRFAVWREDGARMIEACQSPVWDTCLATIALADAGVPEDHPQLVKASDWMLGEQIVRPGDWSVKRPGPPGGWAFEFHNDNYPDIDDTAEVVLALRRVRHHDPERVEKAIGRGVRWNLGMQSKNGAWGAFDVDNTSAFPNRLPFCDFGEVIDPPSADVTAHVVEMLAVEGLAHDPRTRRGIQWLLDAQETDGSWFGRWGVNYVYGTGSVIPALTAAGLPTSHPAIRRAVRWLESVQNEDGGWGEDLRSYRYVREWSGRGASTASQTGWALMALLAAGERDSKAVERGVAWLAATQREDGSWDEPYFTGTGFPWDFSINYNLYRQVFPLTALGRYVHGEPFAKKPRAADAPAEAAPAEVKGS
配列番号169
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアント101A10(配列番号30)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCACCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCATTACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアント101A10(配列番号29)
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バリアント111C8((配列番号28)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCGCGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCGTCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアント111C8(配列番号27)
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バリアントSHC215G2(配列番号22)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC215G2(配列番号21)
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バリアントSHC3(配列番号26)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC3(配列番号25)
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バリアントSHC10(配列番号32)
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バリアントSHC10(配列番号31)
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バリアントSHC26(配列番号24)
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バリアントSHC26(配列番号23)
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バリアントSHC30(配列番号34)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC30(配列番号33)
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バリアントSHC31(配列番号36)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC31(配列番号35)
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バリアントSHC32(配列番号38)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC32(配列番号37)
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バリアントSHC33(配列番号40)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC33(配列番号39)
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バリアントF605W(配列番号170)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTGGTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントF605W(配列番号171)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDWYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
配列番号166(ZmoSHC1)
ATGGGTATTGACAGAATGAATAGCTTAAGTCGCTTGTTAATGAAGAAGATTTTCGGGGCTGAAAAAACCTCGTATAAACCGGCTTCCGATACCATAATCGGAACGGATACCCTGAAAAGACCGAACCGGCGGCCTGAACCGACGGCAAAAGTCGACAAAACGATATTCAAGACTATGGGGAATAGTCTGAATAATACCCTTGTTTCAGCCTGTGACTGGTTGATCGGACAACAAAAGCCCGATGGTCATTGGGTCGGTGCCGTGGAATCCAATGCTTCGATGGAAGCAGAATGGTGTCTGGCCTTGTGGTTTTTGGGTCTGGAAGATCATCCGCTTCGTCCAAGATTGGGCAATGCTCTTTTGGAAATGCAGCGGGAAGATGGCTCTTGGGGAGTCTATTTCGGCGCTGGAAATGGCGATATCAATGCCACGGTTGAAGCCTATGCGGCCTTGCGGTCTTTGGGGTATTCTGCCGATAATCCTGTTTTGAAAAAAGCGGCAGCATGGATTGCTGAAAAAGGCGGATTAAAAAATATCCGTGTCTTTACCCGTTATTGGCTGGCGTTGATCGGGGAATGGCCTTGGGAAAAGACCCCTAACCTTCCCCCTGAAATTATCTGGTTCCCTGATAATTTTGTCTTTTCGATTTATAATTTTGCCCAATGGGCGCGGGCAACCATGGTGCCGATTGCTATTCTGTCCGCGAGACGACCAAGCCGCCCGCTGCGCCCTCAAGACCGATTGGATGAACTGTTTCCAGAAGGCCGCGCTCGCTTTGATTATGAATTGCCGAAAAAAGAAGGCATCGATCTTTGGTCGCAATTTTTCCGAACCACTGACCGTGGATTACATTGGGTTCAGTCCAATCTGTTAAAGCGCAATAGCTTGCGTGAAGCCGCTATCCGTCATGTTTTGGAATGGATTATCCGGCATCAGGATGCCGATGGCGGTTGGGGTGGAATTCAGCCACCTTGGGTCTATGGTTTGATGGCGTTACATGGTGAAGGCTATCAGCTTTATCATCCGGTGATGGCCAAGGCTTTGTCGGCTTTGGATGATCCCGGTTGGCGACATGACAGAGGCGAGTCTTCTTGGATACAGGCCACCAATAGTCCGGTATGGGATACAATGTTGGCCTTGATGGCGTTAAAAGACGCCAAGGCCGAGGATCGTTTTACGCCGGAAATGGATAAGGCCGCCGATTGGCTTTTGGCTCGACAGGTCAAAGTCAAAGGCGATTGGTCAATCAAACTGCCCGATGTTGAACCCGGTGGATGGGCATTTGAATATGCCAATGATCGCTATCCCGATACCGATGATACCGCCGTCGCTTTGATCGCCCTTTCCTCTTATCGTGATAAGGAGGAGTGGCAAAAGAAAGGCGTTGAGGACGCCATTACCCGTGGGGTTAATTGGTTGATCGCCATGCAAAGCGAATGTGGCGGTTGGGGAGCCTTTGATAAGGATAATAACAGAAGTATCCTTTCCAAAATTCCTTTTTGTGATTTCGGAGAATCTATTGATCCGCCTTCAGTCGATGTAACGGCGCATGTTTTAGAGGCCTTTGGCACCTTGGGACTGTCCCGCGATATGCCGGTCATCCAAAAAGCGATCGACTATGTCCGTTCCGAACAGGAAGCCGAAGGCGCGTGGTTTGGTCGTTGGGGCGTTAATTATATCTATGGCACCGGTGCGGTTCTGCCTGCTTTGGCGGCGATCGGTGAAGATATGACCCAGCCTTACATCACCAAGGCTTGCGATTGGCTGGTCGCACATCAGCAGGAAGACGGCGGTTGGGGCGAAAGCTGCTCTTCCTATATGGAGATTGATTCCATTGGGAAGGGCCCAACCACGCCGTCCCAGACTGCTTGGGCTTTGATGGGGTTGATCGCGGCCAATCGTCCCGAAGATTATGAAGCCATTGCCAAGGGATGCCATTATCTGATTGATCGCCAAGAGCAGGATGGTAGCTGGAAAGAAGAAGAATTCACCGGCACCGGATTCCCCGGTTATGGCGTGGGTCAGACGATCAAGTTGGATGATCCGGCTTTATCGAAACGATTGCTTCAAGGCGCTGAACTGTCACGGGCGTTTATGCTGCGTTATGATTTTTATCGGCAATTCTTCCCGATTATGGCGTTAAGTCGGGCAGAGAGACTGATTGATTTGAATAATTGA
生体触媒産生
方法1
SHCプラスミド調製
アリシクロバチルス・アシドカルダリウス スクアレン−ホペンシクラーゼ(AacSHC)をコードする遺伝子をプラスミドpET-28a(+)に挿入した。そこでそれは大腸菌による蛋白質産生のためのIPTG誘導性T7プロモーターのコントロール下にある(図5および21参照)。プラスミドを標準的なヒートショック形質転換プロトコールを用いて大腸菌株BL21(DE3)に形質転換した。
蛋白質産生のためには、複雑な(LB)または最少培地どちらかを用いた。M9は最少培地の1つの例であり、これを用いて成功した。
デフォルトとして選んだ最少培地は、350ml培養のために下記のように調製した。35mlクエン酸/リン酸ストック(133g/lのKH2PO4、40g/lの(NH4)2HPO4、17g/lクエン酸.H2O、pHは6.3に調整)に307mlのH2Oを加え、pHは必要に応じて32%NaOHで6.8に調整した。0.850mlの50%MgSO4をオートクレーブした後に、0.035ml微量元素溶液(次項の組成物)溶液、0.035mlチアミン溶液、および7mlの20%グルコースを加えた。
小スケールの生体触媒産生(野生型SHCまたはSHCバリアント)、350ml培養(培地に50μg/mlカナマイシンを補った)に、SHC産生プラスミドを含有する大腸菌株BL21(DE3)の前培養から植菌した。細胞は、一定の撹拌(250rpm)をしながら37℃でおよそ0.5の光学密度(OD650nm)まで増殖させた。
次いで、300μMの濃度のIPTGの添加によって蛋白質産生を誘導し、次に一定の振盪をしながらさらなる5〜6時間のインキュベーションをした。得られたバイオマスは最終的に遠心によって集め、50mMのTris−HCl緩衝液pH7.5によって洗浄した。細胞はさらなる使用まで4℃または−20℃でペレットとして保存した。一般的に、用いた培地からは独立して、培養1リットルから、2.5から4グラムの細胞(湿重量)が得られた。
発酵を調製し、750mlのInforsHT反応容器内で実施した。発酵容器に脱イオン水168mlを加えた。反応容器には全ての必要なプローブ(pO2、pH、サンプリング、消泡剤)、C+Nフィード(feed)および水酸化ナトリウムのボトルを用意し、オートクレーブした。オートクレーブの後に、反応容器に、
20ml 10×リン酸/クエン酸緩衝液
14ml 50%グルコース
0.53ml MgSO4溶液
2ml (NH4)2SO4溶液
0.020ml 微量元素溶液
0.400ml チアミン溶液
0.200ml カナマイシンストック
を加えた。
実施パラメータは下記の通りであった。pH=6.95、pO2=40%、T=30℃、300rpmでの撹拌。カスケード:300でのrpmセットポイント、min300、max1000、フロー(flow)l/minセットポイント0.1、min0、max0.6。消泡剤コントロール:1:9。
種培養から、発酵槽に0.4〜0.5のOD650nmになるよう植菌した。この種培養をLB培地(+カナマイシン)中で37℃、220rpmで8h増殖させた。発酵は最初にバッチモードで11.5h実施し、その後にフィード溶液(滅菌グルコース溶液(143ml H2O+35gグルコース)によるC+Nフィードを開始した。これには、滅菌の後に、17.5mlの(NH4)2SO4溶液、1.8mlのMgSO4溶液、0.018ml微量元素溶液、0.360mlチアミン溶液、0.180mlカナマイシンストックが添加されていた。およそ4.2ml/hの一定の流速でフィードを実施した。グルコースおよびNH4 +測定が外部からなされて、培養物中のCおよびN源の利用可能性を評価した。通常は、グルコースレベルは非常に低いままである。
培養は合計およそ25時間増殖させ、そこでそれらは典型的には40〜45のOD650nmに達した。それから、(IPTGパルスとして、または注入シリンジを用いて3〜4時間の期間かけて)発酵槽にIPTGをおよそ1mMの濃度に追加し、温度を40℃に、pO2を20%に設定することによってSHC産生を開始した。SHC産生の誘導は40℃で16h続いた。誘導の終了時に、細胞を遠心によって集め、0.1Mクエン酸/クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.4によって洗浄し、さらなる使用まで4℃または−20℃でペレットとして保存した。
一般的に、全ての他の条件は不変で、産生された生体触媒の特異的活性は、複雑な培地と比較して最少培地を用いたときにより高かった。誘導は30または37℃で成功した。誘導が40〜43℃でなされたときには、より高い特異的活性の生体触媒が得られたということが着目された。
下記表22は、2つの例について、誘導開始および誘導終了両方における培養体積、光学密度、および細胞の量と、集められたバイオマスの量(湿重量)とを示している。
SHCバリアントの調製および活性スクリーニング
方法2
疑義の回避のために、EEは(3E,7E)に対応し、EZ混合物は(3Z,7E)に対応し、ZEは(7Z,3E)に対応し、ZZは(7Z,3Z)に対応し、EEHは(3E,7E)に対応する。
酵素進化プログラムを、野生型(WT)アリシクロバチルス・アシドカルダリウスSHC(AacSHC)遺伝子をテンプレートとして用いて行った(GenBank M73834、Swissprot P33247)。約10500個のSHCバリアントのライブラリーを産生し、増大したEEH環化能力を示すバリアントについてスクリーニングした。スクリーニングは4g/lのEEHおよび0.050%SDSを含有するクエン酸緩衝液pH6.0(0.150ml)中での反応において55℃で一定の撹拌下において実施した。
検証のために選択されたヒットしたものによって、標準的な試験を4g/lのEEH、0.050%SDS、10.0のOD600nmのSHCバリアントを発現した細胞を含有するクエン酸緩衝液pH6.0中において実施した。最終的な体積は1mlであり、反応は55℃でインキュベーションし、マグネティックスターラー上で激しく撹拌した。経時的な反応のサンプリングは、ガスクロマトグラフィー分析(下の分析方法参照)によって決定される活性プロファイル((−)−アンブロックスへのEEH変換)を検討することを可能にした。
この検証ラウンドから、改善されたEEH環化活性を有する3つのバリアント(101A10、111C8、および215G2)を得て、次いでそれらの3つのバリアント中に合計8つの変異を同定した。それから変異研究を実施して、それらの変異のどれがアンブロックスへのEEH環化に関して有益であるのかを同定した。このAacSHC誘導体に加えて、別のAacSHCバリアントを構築し、これは同定された有益な変異の全てを含有した(下の表23に概説されているSHC33)。スクリーニング条件は4g/lのEEH、OD650nmが10.0の細胞、0.05%および0.1%のSDS(2つの濃度)であり、反応は55℃で一定の撹拌下において実施した。
3つの選択された変異(101A10、111C8、および215G2)のうち、215G2が最良の活性を示した。
SHCバリアントの最適化した反応条件
検討した反応パラメータ:温度、SDS濃度、およびpH
方法3
表23において同定されているSHCバリアント誘導体の反応条件を、温度、pH、およびSDS濃度に関して個々に最適化した。この目的のために、大腸菌細胞を個々のバリアントの産生のためのプラスミドによって形質転換し、それらをエルレンマイヤーフラスコ中で培養し、上に記載されているようにSHC産生を誘導した。このやり方で、全ての培養物が同じかまたは非常に類似のSHC量を含有するということを確実にした。細胞を遠心によって集め、0.1Mクエン酸緩衝液(pH6.0)によって洗浄し、さらに用いられるまで−20℃で保存した。
この最適化研究の結果は下の表にまとめられている。最適化ラウンドはまた野生型SHCについても行った。
下記表24は、野生型と、それぞれのSHC/HAC誘導体酵素の特徴が考慮されたバリアントのそれぞれとについて至適反応条件を示す。
例3は、WT SHCと比較して、SHC誘導体の反応条件の着目された違いを示している。至適温度、pH、およびSDS濃度について、野生型SHCからのかなりの偏差がSHCバリアントで観察された。少数の変異のみが、至適な生物変換反応条件に対する顕著な効果を有する。選択されたSHCバリアントの個々の反応条件の決定のために、反応を、EEHの4g/lの基質の投入および10.0の光学密度OD650nmの野生型またはSHC誘導体を産生した細胞で実施した。
温度
表24のデータは、WT SHC酵素が55℃において(45〜60℃の範囲内において)至適活性を有する一方で、いくつものSHC誘導体が35℃(34〜50℃)において至適活性を有するという驚くべき発見を示している。より低い反応温度においてE,E−ホモファルネソールから(−)−アンブロックスを調製するための方法への本開示のSHC誘導体の適用は、産業スケールでの(−)−アンブロックスの産生にとってかなりのコスト利点を有する。
可溶化剤
生物変換反応において有用でなかった潜在的可溶化剤の長いリストから、SDSを選択および同定した(より多くの情報は例14参照)。SDSは、反応速度および収率の観点から、(EEH 4g/lでの試験において、および例7において提供されているようにEEH 125g/lが用いられるときに両方とも)例えばTriton X-100よりも良い。
標準的条件下におけるWT SHC酵素と比較したSHCバリアント活性試験
方法4
生体触媒の相対的活性を比較するために、バリアント(表24に記されている)の産生を下記のように記載する。SHCバリアントの1種の産生のためのプラスミドによって大腸菌細胞を形質転換し、それから大腸菌細胞をLB培地によって37℃および280rpmで培養し、0.50のOD650nmまで増殖させ、酵素産生をIPTGの添加によって誘導した。誘導は37℃、280rpmで5.5時間続けた。細胞を遠心によって集め、0.1Mクエン酸pH6.0によって洗浄し、さらなる使用まで−20℃で保存した。SHCバリアントの活性を比較するときには(図6参照)、反応混合物のサンプルを、反応のSHC含量を分析するためのSDS−PAGEゲルにロードする。この分析によって、全ての反応は同一量のSHC酵素を含有することが確認された。
図6は、標準的な条件下における野生型およびSHCバリアントの相対的活性を示す(pH6.0、55℃、0.050%SDS、OD650nm10の細胞)。野生型SHCおよび少なくとも本開示の例に従って試験されたSHCバリアントが溶媒に耐容性であることもまた着目された。これは、選択された水非混和性溶媒(最大でほぼ100%)を生物変換反応に加え得るということを意味する。
215G2 SHCバリアントを用いると、NaClが反応に添加されるときに(試験された濃度は5から100mM(のみ))、このバリアントの活性に及ぼす着目すべき効果は観察されなかった。加えて、最大で100mMまたは最大で154mM(0.9%NaCl)のNaCl添加は、バリアント215G2のSHC活性に対してネガティブな効果を示さなかった。これらの発見は、生物変換反応が生理的NaCl溶液(0.9%)等の中で行われ、かつpHが適切な値(例えば約5.4(5.2〜5.6))に維持される場合には、生物変換反応が緩衝液の非存在下において、生理的NaCl溶液等の存在下において行われ得ることを示唆している。
図6は、(−)−アンブロックスへのEEH変換の観点から、選択されたバリアントおよび野生型SHC酵素の活性のランキングを図示する。
WT SHCおよびSHC誘導体の活性プロファイル
方法5
活性試験を、0.1Mクエン酸緩衝液中において5ml体積で一定の振盪下において900rpmでHeidolph Synthesis 1装置にて実施した。用いた緩衝液のpH、反応が実施された温度、および反応中のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)濃度は、用いられたSHCバリアント(野生型またはバリアント)に応じた。試験されたバリアントのそれぞれの至適条件は上の表24にまとめられている。
純度96%のホモファルネソール出発材料および87:13のEEH:EZH比を有するホモファルネソール基質を用いた。
疑義の回避のために、EE:EZ混合物は((3E,7E)および(3Z,7E)異性体の混合物である。
用いたホモファルネソール:EEH:EZH87:13、純度(NMR):96%。
最適化した条件下において実施した標準的な試験の結果を、図7B(WT SHCに対するSHC誘導体の活性プロファイル)、およびWT SHCに対するSHC誘導体の相対的な活性の改善を示す図7Aに示す(4h(初期速度)および22hでの収率)。
用いたホモファルネソール:EEH:EZH92:08、純度(NMR):100%
最適化した条件下において実施した標準的な試験の結果を、図8B(WT AacSHCに対するAacSHC誘導体の活性プロファイル)、およびWT SHCに対するAacSHC誘導体の相対的な改善を示す図8Aに示す(4h(初期速度)および22hでの収率)。
用いたホモファルネソール:EEH:EZH66:33、純度(NMR):76%
最適化した条件下において実施した標準的な試験の結果を、図9B(WT AacSHCに対しする、表24に記されているAacSHC誘導体の活性プロファイル)およびWT SHCに対するAacSHC誘導体の相対的な改善を示す図9Aに示す(4h(初期速度)および22hでの収率)。
主な結論は、用いられたホモファルネソール基質の質からは独立して、4つの最良のSHC誘導体酵素が下記の順、215G SHC、SHC26、SHC32、およびSHC3でランク付けされたということであった。
溶媒によって完全に抽出された反応から物質収支を決定する
方法6
全ての条件は不変で、それぞれのバリアントについて2つの反応を実施した。ホモファルネソールを基質として用いた。4時間および22時間のインキュベーション後に、反応生成物および未反応の基質を、tert−ブチル−メチルエーテル(MTBE/tBME)の等しい体積による合計6回の洗浄によって、バリアントのそれぞれについて完全に抽出した。洗浄のそれぞれのホモファルネソールおよびアンブロックスの含量をGC分析によって決定した。形成されたアンブロックスおよび残りのホモファルネソールの合計量は、基準のアンブロックスおよびホモファルネソールから作られた溶液を用いて作成された較正曲線(calibration curve)から計算した。
図10の結果は、用いた基質では、3つの最良のバリアントが野生型SHC酵素よりおよそ10倍(215G2)、7倍(SHC26)、および6倍(SHC32)の改善を示すことが確認され、観察されたということを示した。
125g/lのE,E−ホモファルネソール(EEH)におけるバイオトランスフォーメーションの性能
方法7
215G2 SHCバリアントを用いて、体積当たりの生産性を増大させるという目標に取り組んだ。一連の実験(DOE)検討の設計を行い、パラメータのpH、細胞濃度、およびSDS濃度を包含する試験反応条件を最適化した。反応条件は、EEHの125g/l(EE:EZ86:14のホモファルネソールから)、細胞の250g/l、1.55%SDSであり、反応は35℃で0.1Mクエン酸緩衝液pH5.4中において実施された。
典型的な反応(150gの合計体積)を次のように0.75リットルInfors発酵槽内にセットアップする。反応容器に、18.75gのEEHに対応するホモファルネソールの適切な量を投入する。2.33gのSDSを、0.1Mクエン酸緩衝液pH5.4中に調製された15.5%(w/w)溶液から添加した。細胞を0.1Mクエン酸緩衝液pH5.4中に懸濁することによって、215G2 SHCバリアントを産生した大腸菌細胞から細胞懸濁液を調製する。10℃および17210gでの10分間の遠心によるこの懸濁液の細胞湿重量の決定の後に、37.5gの細胞を反応に導入するために、細胞の適切な体積を反応容器に加える。反応の体積は、反応緩衝液の必要量によって150gに合わせる。反応を37℃で一定の撹拌下において900rpmで実施する。pH制御は水中の40%クエン酸を用いて行う。反応を経時的にサンプリングし(1ml)、5倍体積のMTBE/tBME(5ml)によって抽出する。遠心による溶媒相の清澄化(卓上遠心機、13000rpm、2分)、MTBE/tBMEによる10倍希釈の後に、反応のホモファルネソールおよびアンブロックス含量をGC分析によって決定した。
同じ反応を、野生型SHC酵素を産生した大腸菌細胞により行った。このケースにおいては、反応は55℃で0.1Mクエン酸緩衝液pH6.0中において実施された。この例の反応条件の概要は下の表24aの2行目に提供されている。下の表24aの1行目に示されている反応条件は以前の例(例えば例3〜5)から取っている。
図11は、2つの酵素によるアンブロックスへの観察されたEEH変換を示している。7時間の反応において(初期反応速度の概算)、バリアント215G2 SHCによる変換は野生型SHCによって達成されたものよりも13倍高かった。反応の48時間において、バリアントによる変換は野生型酵素のものの約8倍であった。
細胞濃度
この例に記載されている反応中の細胞の全ての濃度(g/l)は細胞の湿重量で示されている。細胞懸濁液の細胞の湿重量(g/l)としての濃度は、この細胞懸濁液のサンプルを17210gかつ4℃で10分間遠心した後に決定する。
細胞g/lおよびOD650nmの間の相関
215G2 SHCまたはWT SHCによるEEH125g/lの生物変換を用いると、この反応における250g/lの細胞は、その反応における約172のOD650nmに対応する。異なる生体触媒調製物を試験したときには、OD650nm対生体触媒量の比の変動が観察された。生体触媒は、EEH 4g/lで標準的な試験に用いるが10.0のOD650nmの細胞を適用したときには、OD650nm10.0が細胞1.45g/lと同等であると概算された。
データは、当分野の開示と比較して比較的高いEEH基質濃度(125g/l)を用いた、最適化した効率的なHAC生物変換プロセスが開発されたということを示しており、ここで、大体0.2g/l(JP2009060799参照)から約2.36g/l(10mM)のホモファルネソール基質濃度が当分野においては開示されているのみである(WO2010/139719A2、US2012/0135477A1参照)およびSeitz et al (2012)同上)。
GC解析
方法8
それらのEEHおよびアンブロックスの含量の定量のために、サンプルを適切な体積のtert−ブチルメチルエーテル(MBTE/tBME)によって抽出した。溶媒画分を、ガスクロマトグラフィーによる分析に先立って遠心によって水相から分離した。1μlの溶媒相を30m×0.32mm×0.25μmのZebron ZB-5カラムに注入した(スプリット比3)。カラムは、一定のフロー(4ml/分 H2)で、温度勾配100℃、200℃までは15℃/分、240℃までは120℃/分、240℃で4分によって展開し、これはアンブロックス、EEH、およびEZHの分離をもたらした。流入(inlet)温度は200℃であり、検出器温度:300℃。
EEH変換は、アンブロックスおよびEEHに対応するピーク面積から下記式:
変換(%)=100×(面積アンブロックス_ピーク/(面積アンブロックス_ピーク+面積E,E−ホモファルネソールピーク))
によって計算した。
反応生成物アンブロックスの同一性はGC−MSによって確認した(記録値および強度:m/z 221 (100%), m/z 97 (40%), m/z 137 (3.3%), m/z 43 (2.6%), m/z 41 (2.5%), m/z 55 (2.4%), m/z 95 (1.9%), m/z 67 (1.8%), m/z 81 (138%), m/z 222 (1.7%))。
生成物回収は溶媒抽出または蒸気抽出/どちらかによって行った。用いた溶媒は例えばMTBEまたはヘキサン:イソプロパノール(3:2)であった。基質または生成物がもはや検出されなくなるまで、反応を溶媒の等しい体積によって繰り返し抽出し、溶媒画分をGC分析した。一般的に、5から6回の洗浄が十分であった。代替的には、反応生成物の抽出は蒸気抽出/によってなされた。
ワンポット反応
方法9
200mlの発酵を、上に記載されている標準的な増殖および誘導プロトコールを用いて、N−末HisTagを有する215G2 SHCの産生のためのpET28a(+) 215G2 SHCプラスミドによって形質転換された大腸菌BL21(DE3)によって実施した。誘導相の終了時に、通気をオフにし、温度を35℃に、pHをクエン酸によって5.5に、撹拌機の速度を500rpmに設定した。培養物の体積は、培養増殖の間になされた全ての添加(フィードおよび基礎消費)から概算した。この体積および培養物のODに従って、SDSの適切な量を発酵槽に加えた。EEHは4g/lまで追加した。反応を経時的にサンプリングし、サンプル(150〜300μl)をGC分析のために700μlのMTBEによって抽出した。EEHは直接的に培養ブロス中でアンブロックスに変換された。反応は合計22.5日間実施し、その間にはEEHを繰り返し添加した。
完了に達したときには、10.6gのEEHがアンブロックスに環化されていた。反応生成物(下で提供されている構造)を蒸気抽出/によって抽出し、反応混合物から定量的に回収した。
ホモファルネソールEE:EZ87:13がSHCによって変換されるときには、図12に記されているように反応生成物アンブロックス、(II)、(IV)、および(III)が産生され、出発材料のEE:EZ比を反映する。
EEHが出発材料として用いられるときには、(−)−アンブロックス(I)および生成物(IV)のみが生じる。
EZH(3Z,7E)が出発材料として用いられるときには、生成物(II)および(III)のみが生じる。
しかしながら、EEHおよびEZHの混合物が用いられるときには、アンブロックス(I)ならびに生成物(II)、(IV)、および(III)が生じる。
EE:EZ66:34の100%の変換が起こる場合には、これは66%:34%の((アンブロックス+(IV)):((II)+(III))を提供するであろう。
水蒸気抽出が行われるときには、これは全ての4生成物、アンブロックスならびに生成物(II)、(IV)、および(III)を抽出し、結晶化ステップにより純度99%(GC)のアンブロックスを少なくとも70%の収率で生じる。
データは、(−)−アンブロックスの産生が生物変換反応または「ワンポット」反応システムによって可能であるということと、アンブロックスの選択的な濃縮が蒸気抽出/および結晶化の後に達成されるということとを示している。
ホモファルネソール出発材料がEEおよびEZ(例えば86:14)異性体の混合物である場合には、2種の生成物がそれらの異性体(合計で4種)のそれぞれから生まれ、(−)−アンブロックスは粗生成物中の圧倒的に主要である構成成分、結晶化した材料(純度99.1%)中の主要構成成分である。(+)−アンブロックスは検出されなかった。
EE:EZホモファルネソール混合物の変換
疑義の回避のために、EEは(3E,7E)に対応し、EZ混合物は(3Z,7E)に対応し、ZEは(7Z,3E)に対応し、ZZは(7Z,3Z)に対応し、EEHは(3E,7E)に対応し、EZHは(3Z,7E)に対応する。
EE:EZ混合物を、下記反応条件下:下記ホモファルネソール基質(EE:EZホモファルネソール混合物)を用い、合計ホモファルネソール146g/l、細胞250g/lおよびSDS1.55%において生物変換した。
EE:EZ 86:14(この例では最も高いEEH含量)、
EE:EZ 69:31(この例では最も低いEEH含量)、
EE:EZ 80:20
EEH:EZH 70:30
7E,3E/7E,3Zホモファルネソール混合物の生物変換
下記反応条件を用いて生物変換を始めた:
反応(150.1gの合計体積)はInforsHTの750ml発酵槽内において0.1Mクエン酸/クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.4中で実施し、合計ホモファルネソール146g/lを含有し、86:14の7E,3E:7E,3Zの混合物であるホモファルネソール基質、細胞250g/l(例1の方法に従って産生された)、およびSDS1.55%を用いた。反応は35℃で一定の撹拌(800rpm)をしながら実施し、pHコントロールは水中の10から40%クエン酸を用いて行った。反応混合物を経時的にサンプリングし、サンプルをGC分析のために溶媒抽出した。ホモファルネソール変換がホモファルネソールの2種(EE:EZ86:14およびEE:EZ69:31)で等しく速やかに起こったということが着目された。
WT SHCおよび1つの特定のSHC誘導体(215G2 SHC)を用いるEEH:EZH86:14材料からの125g/lのE,E−ホモファルネソールの生物変換を行ったときに、E,E−およびE,Z−ホモファルネソール両方の変換が観察された。すなわち、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス由来の野生型SHC酵素は、表23からのSHCバリアントがEEH:EZH混合物から産生するものと同じ反応生成物(すなわち、アンブロックス、生成物(II)、(IV)、および(III))をEEH:EZH86:14材料から産生した。図13および14は反応生成物のGC分析をアンブロックスならびに生成物(II)、(IV)、および(III)について提供している。
本開示に従うホモファルネソールからアンブロックスの生物変換は主要化合物として(−)−アンブロックスを産生するが、上で同定されているように(−)−アンブロックス以外の化合物(例えば化合物(II)、(IV)、および(III))をもまた産生することがあり、これは(−)−アンブロックス生成物に快い嗅覚的なノートを付与することもありまたはしないこともある。上で示されているように、選択的結晶化条件下において、アンブロックスは他の副生成物((II)、(III)、および(IV))から分離可能である。従って、生成物がネガティブな事でアンブロックス最終生成物の知覚特性に寄与する場合には、(−)−アンブロックス最終生成物からの生成物(II)、(IV)、および(III)の選択的分離は、フレグランスまたはフレーバーまたは化粧品または消費者ケア製品としてのその価値を増大させる。知覚分析が、熟練の香水業者によって利用される良く確立された知覚試験を用いて行われる。(−)−アンブロックス最終生成物の純度は、生成物が単体で所望の知覚プロファイルの主な要因である場合には、生成物の嗅覚的質の指標であり得る。
EE:EZ:ZE:ZZ−ホモファルネソール混合物からのEEH変換
方法11
EE:EZ:ZE:ZZ−ホモファルネソール40:26:20:14を、215G2 SHCを用いたEEH変換に基質として用いた。比較目的のために、EE:EZ2:1または93:07の他のホモファルネソールをもまた用いた。
EE:EZ:ZE:ZZ−ホモファルネソール混合物の変換を215G2 SHCバリアントで検討したが、最適化した条件下においてではない。反応条件は、100mMクエン酸緩衝液中のpH5.8、0.10%SDS、40℃であった。下記EEH変換が観察され、全ての反応は一定の2g/lのEEH(従って、様々な合計ホモファルネソール濃度)で実施した。
次のホモファルネソール異性体混合物変換率が観察された。
EE:EZ 2:1 50〜55%
EE:EZ 93:7 78%
EE:EZ:ZE:ZZ 40:26:20:14 6%
観察された収率に加えて、データは、215G2 SHCバリアントが複雑なEE:EZ:ZE:ZZホモファルネソール混合物からEEHをアンブロックスに変換することが可能であるということを示している。予期されたように、より低い変換率がより低いアンブロックス収率からもたらされることが観察された。この結果は、EEH以外のホモファルネソール異性体がSHC/HAC誘導体酵素へのアクセスについてEEHと競合することがあり、それゆえに、EEHから(−)−アンブロックスへの変換については競合阻害剤および/または代替的な基質として作用し得るという見解と一致している。
Triton X-100およびSDSを用いる全細胞生物変換の比較データ
方法12
大腸菌ホスト細胞を、例4の方法4のプロトコールに従って増殖させた。215G2 SHCバリアントを用いる生物変換反応を例4の標準的な試験に従って行った。クエン酸/リン酸ナトリウム緩衝液0.1M、pH5.4中のOD650nm10.0の細胞と4g/lのホモファルネソール基質、35℃、および0.07%のSDSが、215G2 SHCバリアントにとって最も好適な反応条件として選ばれた。
図15は、0.005%から0.48%の濃度範囲のTriton X-100および0.07%の濃度のSDSを用いたときの全細胞生物変換アッセイにおける215G2 SHCバリアントの活性の比較を提供する。
データは、Triton X-100での最高の活性がSDSによって得られた活性の大体20%にしか過ぎないことを示している。
SDS/細胞比
方法13
EEH基質4g/l、215G2 SHC誘導体酵素を産生したOD650nm5.0の細胞を用いて、例4の方法4に従って生物変換反応をセットアップした。
結果は図16に記されており、これは、異なるSDS/細胞比について変換されたEEHパーセントを示している。
図16は、異なるSDS/細胞比の値を用いて、(−)−アンブロックスへのEEH変換パーセントがSDS/細胞比に依存するということを示している。この比は、最大の変換を達成するために慎重に設定されなければならない。
例えばSDS濃度が低すぎる場合には、準至適なホモファルネソール変換が観察され得る。他方で、例えばSDS濃度が高すぎる場合には、生体触媒が、無傷の微生物細胞の破破壊および/またはSHC/HAC酵素の変性/不活性化どちらかによって影響されるというリスクがあり得る。125g/lのEEHおよび250g/lの生体触媒を用いて例7の方法7に従って生物変換反応を行ったときには、最良の生物変換プロトコールは16:1の[SDS]/[細胞]比を示す。
結果は、可溶化剤(SDS)濃度、バイオマス量、および基質(EEH)濃度の間にある程度の相互依存性があるということを示している。例として、ホモファルネソール基質の濃度が増大すると、効率的な生物変換反応が起こるために十分な量の生体触媒および可溶化剤(SDS)が要求される。
生物変換反応への使用のための可能な可溶化剤の試験
方法14
種々の可溶化剤(下の表26に概説されている)を、標準的な試験と同じ条件を用いる215G2 SHCのEEH環化反応によって(4g/lのEEH、10.0のOD650nmの細胞)、SDSの可能な代用物として試験した。SDSをその至適濃度において(0.060〜0.070%)、用いた他の可溶化剤(それらの化合物によってなされたスクリーニングから個々に至適であると決定された濃度において(下の表26参照))と組み合わせることによって、活性(累積効果)を増強する可能性をもまた、標準的な試験を用いて試験した。加えて、水不溶性化合物を可溶化することを助けることが公知であるいくつかの「深共晶溶媒(deep eutectic solvent)」およびイオン性液体をもまた試験した。
下記表26は、どの可溶化剤(例えば、界面活性剤、洗剤、可溶性増強剤等)がこれまでのところ215G2 SHCのEEH環化反応によって試験されたかをまとめている。いかなるケースにおいても、0.060〜0.070%の範囲内の濃度のSDSを用いて行われたコントロール反応と比較して改善された活性はなかった。至適として定義された濃度において単独で用いられたそれらの化合物によって観察された活性は、SDSによるコントロール反応において得られたものの約20%にしか過ぎなかった。可溶化剤が全く添加されなかったときには、20%のEEH変換が達成されたということが着目された。SDSを用いかつさらなる可溶化剤を(試験において至適と定義された濃度で)加えたときには、相乗効果は観察されなかった。むしろ、EEH変換パーセントの減少が観察された。試験した条件下においては、化合物がEEH変換を全く改善せず、むしろ環化に対して悪影響がみられるということと、SDSが研究された可溶化剤のなかで最も有用であるということとが研究から結論付けられ得る。加えて、水不溶性化合物を可溶化することを助けることが公知である「深共晶溶媒」およびイオン性液体を用いる試験からはポジティブな結果は得られなかった。
出願人は、本開示のホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの生物変換反応に有用ではないと示されていた他の可溶化剤の長いリストから、有用な可溶化剤としてSDSを選択および同定した。
生物変換反応におけるSDS濃度に対する感受性
方法15
適用される条件は、125g/lでの250g/lの生体触媒および1.55%SDSによる標準的な生物変換の条件(例7に記載されている)である。2つの他のSDS濃度(1.40%および1.70%SDSもまた試験した)。全てのSDS濃度は重量/重量%である。
125g/lでの250g/lの生体触媒および1.55%SDSによる標準的な生物変換反応条件(例7に記載されている)は、異なるpH値を試験するためにもまた用いた。コントロールは0.1Mクエン酸緩衝液中でpH5.4において実施した。より低いpHで実施した反応は0.1M酢酸緩衝液によって実施した。
図17のデータは、生物変換反応が、EEH 4g/lおよびOD650nm10.0で適用された細胞での標準的な試験によってHAC活性が試験されたときよりもSDS濃度の変化に対して感受性でないようであるということを示している。
図18のデータは、生物変換反応が適用されるときに、システムが、HAC活性がEEH4g/lのおよびOD650nm10.0で適用された細胞での標準的な試験によって試験されるときよりもpH変動に対して感受性でないように見えるということを示している。
データは、試験したSDS濃度範囲およびpH範囲に関して、EEH 125g/lおよび細胞250g/lでの生物変換反応の確実性を示している。
結晶構造上の同定されたSHC/HAC変異の位置
AacSHC/HACバリアント中の同定された変異の位置を図19において下記のようにマークしている。バリアント215G2は赤色、バリアント101A10は紫色(ワインレッド)、バリアント111C8は緑色である。増大した活性の要因であると同定されたアミノ酸については、側鎖を共結晶化した基質アナログにおいて黄色で強調している。改善された活性を有さない同定されたバリアントの他の変異は青色でマークされている。青色の変異は酵素の2つのドメイン上に約半々(すなわち50:50)で散在しており、その一方で、同定された有益なAacSHC変異は大部分が(1つを別にして)ドメイン2内に位置するということが着目される。唯一の例外は変異F601Yであり、これは活性部位の近傍にある。SHC/HAC誘導体酵素215G2および111C8の両方のみを考える場合には、変異体の全てはドメイン2内に位置する。図20は同じ情報を白黒で提供している。
215G2、111C8、および101A10に対応する有益な変異体(赤色/緑色/紫色)の全ては大部分は(1つの変異体F601Yを別にして)、SHC結晶構造(図19に提供されている)のドメイン2内に位置する(Wendt et al (1997) Science 277: 1811)。SHCの有益な変異の組み合わせは野生型AacSHC(配列番号1)に従って付番される。
結晶構造は、特にホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換に関係して、望ましい構造/活性関係性を有するSHC/HAC誘導体を同定するために有用である。有用な予備選択ステップにより、SHC/HAC結晶構造(図19および20参照)のドメイン2内に位置するアミノ酸残基に対する選択を限定することであるかもしれない。
ホモファルネソールの調製
方法17
一般的な分析条件
非極性GC/MS:50℃/2分、20℃/分200℃、35℃/分270℃。HP 7890AシリーズGCシステムを有するGC/MSアジレント5975C MSD。非極性カラム:SGEからのBPX5、5%フェニル95%ジメチルポリシロキサン0.22mm×0.25mm×12m。キャリアガス:ヘリウム。インジェクター温度:230℃。スプリット1:50。フロー:1.0ml/分。トランスファーライン:250℃。MS−四重極型:106℃。MSソース:230℃。
水中の尿素(175g、2.9mol)およびメチルアミン塩酸塩(198g、2.9mol)の溶液(400ml)を撹拌下において3.5時間、加熱還流(105℃)した。40℃で、水(200ml)中に溶解したNaNO2(101g、1.45mol)を加える。15分後に、THF(1000ml)を加え、これは透明な2相混合物をもたらす。濃H2SO4(110g、1.1mol)を0〜5℃で加え、1.5h以内で撹拌する。0〜5℃でのさらなる0.5時間後に、2つの透明な相が25℃において分離する。有機相(A)(1065ml、理論上は1.35M)は0〜5℃で数日間保存するか、または直ちにシクロプロパン化反応装置に進む。
相分離の後に、水相をTHFによって2回抽出する(2×1:1)。これにより相B1100mlおよび相C1075が得られる。相Aは、引き続くシクロプロパン化反応において末端アルケンからシクロプロパンへの51%の変換を生じる一方で、相Bは<0.5%のシクロプロパンを生じ、相Cは検出可能な変換を生じない。我々は、>99%のMNUが最初の相分離の後に抽出されると結論づける。それゆえに、通常は、水相は、(有機相Aから)最初の相分離の後に、濃KOH水溶液および酢酸による処置後に捨てる。
残りのMNU溶液を0〜5℃で4hかけて加える。この段階におけるGCは28%の未変換E−β−ファルネセン、65%の所望のモノシクロプロパン(上に示されている)、および3%のビスシクロプロパン化された化合物5を示した。25℃での16時間後に、酢酸(100ml)を0〜5℃で、次いでtert−ブチルメチルエーテル(250ml)を加える。相分離の後に、有機相を2MのHCl(250ml)によって洗浄し、水相をtert−ブチルメチルエーテル(250ml)によって抽出する。組み合わせた有機層を水(2×100ml)、10%NaOH水溶液(2×100ml)、および水(2×100ml)によって洗浄し、MgSO4によって乾燥し、濾過し、濃縮してやや黄色の液体26.9gを得る。これは9%のE−β−ファルネセン、82%の所望のモノシクロプロパン化合物、および6%のビスシクロプロパン化された副生成物を含有する。
所望の化合物は蒸留精製によってさらに単離され得る。1gのK2CO3(1g)の添加および40〜60mbarでの30cmスチールコイルカラムによる蒸留により、147gのモノシクロプロパン化合物(68%corr)を135〜145℃で得る。画分をプールして、純度100%の92gモノシクロプロパン化合物を得る。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 5.1 (2 m, 2 H), 4.6 (2 H), 2.2 (2 H), 2.1 (4 H), 2.0 (2 H), 1.7 (s, 3 H), 1.6 (2 s, 6 H), 1.3 (1 H), 0.6 (2 H), 0.45 (2 H) ppm. 13C-NMR (CDCl3, 400 MHz): 150.9 (s), 135.1 (s), 131.2 (s), 124.4 (d), 124.1 (d), 106.0 (t), 39.7 (t), 35.9 (t), 26.7 (t), 25.7 (q), 17.7 (q), 16.0 (d), 6.0 (t) ppm. GC/MS: 218 (2%, M+), 203 (5%, [M - 15]+), 175 (11%), 147 (31%), 134 (15%), 133 (20%), 121 (12%), 107 (55%), 95 (16%), 93 (30%), 91 (20%), 82 (11%), 81 (33%), 79 (42%), 69 (100%), 67 (22%), 55 (20%), 53 (21%), 41 (75%). IR (film): 3081 (w), 2967 (m), 2915 (m), 2854 (m), 1642 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1107 (w), 1047 (w), 1018 (m), 875 (s), 819 (m), 629 (w). Anal, calcd. for C16H26: C, 88.00; H, 12.00. Found: C, 87.80; H, 12.01.
圧力管内の(E)−(6,10−ジメチルウンデカ−1,5,9−トリエン−2−イル)シクロプロパン(E−Δファルネセン)(1g、4.6mmol)、ドデカン(0.2g、1.15mmol、内部標準)、およびL−(+)−酒石酸(1g、6.9mmol)の混合物を撹拌下において150℃で加熱する。18時間および完全な変換(GCに従う)の後に、混合物を水(50ml)およびトルエン(50ml)に注ぐ。
相同士を分離し、水相をトルエン(50ml)によって抽出する。組み合わせた有機層を濃Na2CO3水溶液(50ml)および濃NaCl(2×50ml)によって洗浄し、MgSO4によって乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させることにより、茶色がかった樹脂(1.35g)を得る。これを30%KOH水溶液(4.3ml)と混合し、25℃で2時間撹拌する。GC分析から、内部標準に従って96%の(7E)−4,8,12−トリメチルトリデカ−3,7,11−トリエン−1−オールの形成が判明する。E/Z比68:22。E異性体の分析データは文献からのものと一致している。例えばP. Kocienski, S. Wadman J. Org. Chem. 54, 1215 (1989)参照。
データは、(−)−アンブロックスへの生物変換にとって好適であるホモファルネソールの調製を示している。
ホモファルネソールを調製するためのこのプロセスは2つの同時係属特許出願PCT/EP2014/072882(WO2015/059290)およびPCT/EP2014/072891(WO2015/059293)にもまた記載されており、その全体的な内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
ワンポット反応
この実験においては、(i)215G2 SHCバリアントを産生する大腸菌株による発酵(例えば例1に記載されている)、次に(ii)直接的に発酵ブロス中でのEEH変換を行った。3つのパラメータ[細胞]、[EEH]、および[SDS](g/l)は関連しているので、発酵の終了時に得られる細胞の濃度(g/l)に応じて、発酵ブロスの利用可能な体積中のパラメータ[EEH]および[SDS]を調整することが必要であった。目標は、1.55%のSDS濃度において125g/lのEEHを、細胞250g/lによって変換することであった。妥当な生物変換を可能にするためには、細胞は休止状態、グルコース枯渇の状態になければならない。通気をオフにした。
発酵:
発酵の終了時の反応容器内の発酵ブロスの体積の極めて正確な決定を可能にするために、取り出されたサンプルの体積および発酵槽になされた全ての添加体積(フィード、塩基、酸...)を記録した。
細胞の湿重量(g/l)決定のために発酵ブロスのサンプル(5〜10ml)を一定の撹拌下において抜き取り、遠心管に入れた。サンプルの質量を記録した。サンプルを17210gおよび4℃で10分間遠心する(例えば12000rpm、SS-34ローター、Sorvall RC3B遠心機)。上清を慎重なピペッティングによって取り出し、ペレットの質量を記録した。細胞の湿重量濃度をg細胞/lブロスまたはg細胞/gブロスとして決定する。
発酵槽内の発酵ブロスの体積は全ての添加および取り出しに従って決定した。発酵槽が秤上にある場合には、発酵ブロスの質量は秤量によって決定し、そうでない場合には1ml=1gと仮定した。
発酵ブロスの決定された細胞濃度および体積に従って、例9に記載されている生物変換に記されているように、3つの間の同じ比、EEH125g/l、細胞250g/l、1.55%SDSを保つために反応容器に添加されるべきE,E−ホモファルネソールおよびSDSの量を決定した。
1. 温度は35℃に設定した。通気をオフにする。
2. 発酵ブロスに、計算された量のホモファルネソールを加えた。
3. SDSの必要とされる量を15.5%SDS水溶液のストック溶液から慎重に加えた。
4. 反応を800rpmでおよそ15分間、よく混合した。
5. 反応のpHを記録した(内部pH電極)。
6. サンプル(およそ1ml)を15mlファルコンチューブに抜き取った。およそ5mlの脱イオン水を加え、徹底した混合の後に、外部校正した電極でpHを記録した。
7. 反応容器内のpHは85%H3PO4を用いて段階的に5.4に設定した(外部校正した電極で測定される値)。一方で、外部電極でpHを定期的にコントロールすることは上に記載した(6.)。
8. pHは、生物変換の間に例えば10〜25%H3PO4および32%NaOHを用いて制御した。
9. 反応のサンプリング:およそ1mlの反応混合物を15mlファルコンチューブに入れた。およそ5mlのMTBEを加える。サンプルを激しい振盪によって抽出した。
10. 分注したものを卓上遠心機によって最大スピードで1分間遠心した(エッペンドルフチューブ)。溶媒相の100μlを900μlのMTBEを含有するGCバイアルに追加した。生物変換の第1日の間は、サンプルを1〜1.5時間毎に取った。次の日からは、1日に3つのサンプルのみが取られた。
11. 溶媒相の1μlを、例8に記載されているようにそのアンブロックスおよびEEH含量について分析した。
12. EEH変換(%)を100×(アンブロックス面積/(アンブロックス面積+EEH面積))として計算する。
結果は、ワンポットの発酵+EEH変換がKLF2000反応容器(Bioengineering)内において1.9リットルのスケールで行われたということを示している。細胞251g/lは、47時間で≧93%までの238gのEEH(251g/l細胞)の変換を可能にした。開始の93h後に測定したときに、変換は99%であった。
類似のワンポット実験をInfors HT 0.751反応容器内で実施した。標準的なプロトコールを踏襲した発酵(例1)の後に、平行して同じプロトコールで実施した他の発酵から集められたリアクターの細胞を加えた。得られたブロス体積は479gであった。細胞濃度は313.7g/lと決定され、これは1.25×標準の生物変換の細胞濃度(250g/l細胞)であった。従って、EEHおよびSDSを反応容器に追加した。75.1gのEEH(この例においては157g/lのEEHと同等)が90時間未満で98%まで変換された。この結果は、実施される発酵が、215G2 SHCバリアントを十分に高い細胞密度で産生した細胞を提供する限り、ワンポット発酵+EEH変換を≧125g/lのEEHにおいて実施することが可能であるということを示している。
有利には、基質の99%変換が得られた。これは、高価な出発材料(例えばEEH)が用いられるときに商業的に非常に有用である。
体積当たりの生産性を増大させる.
方法19
体積当たりの生産性をさらに増大させるために、細胞375g/l、EEH 188g/l、SDS2.33%を含有する1.5×濃縮した生物変換を実施した。標準の生物変換を平行してEEH 125g/l、細胞250g/l、SDS1.55%(例7)で実施した。
2つの反応を、全ての他のパラメータは不変でInfors HT 0.7501反応容器内で実施した。
図22の結果は、開始75時間後の変換パーセントが、1.5×生物変換において88%vs.標準の生物変換において95%であったということを示している。開始96時間後のパーセントの変換は1.5×生物変換において93%のEEH変換(convert)vs.標準の生物変換において97%であった。1.5×生物変換によるパーセントの変換は、標準の生物変換によって得られたものの96%であった。1.5×生物変換における撹拌は、油状のホモファルネソールが消え、固体反応生成物によって取りかわられるに連れて経時的により困難になるということが着目された。これは1.5×生物変換のやや低い変換レベルを説明し得る。より良い混合装置を備え付けた反応容器を用いることは、1.5×生物変換によるEEH変換を改善し得る。結果は、効率的な混合が達成される場合には、EEH 188g/l以上において生物変換を実施することが可能であるということを示している。撹拌効率はシステムの唯一の限定であるように見える。
(−)−アンブロックス生産性
「(−)−アンブロックス生産性」は、生物変換時間(すなわち、基質を加えた後の時間)の時間当たり、生体内変換のリットル当たりのグラムによる、回収可能な(−)−アンブロックスの量を言う。この点で、図22を参照して、(−)−アンブロックス生産性は次のように計算される。
125g/lのEEHの生物変換(細胞 250g/l)
1.25hの生産性:時間当たりリットル当たり10.3グラム
8.25hの生産性:時間当たりリットル当たり6.3グラム
21.25hの生産性:時間当たりリットル当たり4.1グラム
187.5g/lのEEHの生物変換(375g/l細胞)
1.25hの生産性:時間当たりリットル当たり12.2グラム
8.25hの生産性:時間当たりリットル当たり8.2グラム
21.25hの生産性:時間当たりリットル当たり5.5グラム
開始後大体6〜8時間に計算された生産性が反応の初期速度に相当すると考えることができ、これはシステムの最高の変換率を最もよく表現する。
細胞250g/lに125g/lのEEHを用いる典型的な生物変換は、大体6〜8時間後に、時間当たり、リットル当たり6.3および8.5グラムの間のアンブロックス生産性を示す(反応の初期速度に相当する)。
NaCl溶液による反応緩衝液の置き換え
方法20
標準の生物変換(EEH 125g/l、細胞250g/l、SDS1.55%)を例7に記載されているように実施したが、クエン酸緩衝液pH5.4は0.5%または0.9%NaClどちらかに置き換え、全ての他の反応パラメータは不変であった。クエン酸緩衝液中での生物変換を平行してコントロールとして実施した。
図23の結果は、EEH変換率が緩衝液および0.9%NaClで実施された反応と同じであったということを示している。変換率は0.5%NaClのみで実施された反応のときにより低かった。結果は、正確なpH制御および十分なイオン強度が保証される場合に、緩衝液の非存在下において生物変換を実施する可能性を示している。
反応ブロスの固相の抽出
(−)−アンブロックスが水に可溶性ではなくかつおよそ75℃よりも低い温度で液体ではないということに鑑みて、それらの特性は、水混和性(例えばエタノール)および水非混和性(例えばトルエン)溶媒どちらかを用いて生体内変換の固相から生成物を抽出するための潜在的利点とされた。
200mlの反応ブロスを遠心して液体(水)相から固体を分離した(Sorvall GS3、5000rpm、10分、10℃)。これはおよそ80mlの固体ペレットをおよそ120mlの液相から分離した。MTBE抽出の後の水相の分析(ガスクロマトグラフィー、例8)は、それが初期に200ml反応ブロス中に存在する(−)−アンブロックスのおよそ0.3%以下を含有するということを示した。トルエンおよびエタノール99%を固相からAmbrofixを抽出するために用いた。
トルエン抽出:
固相80mlを、45mlトルエン(固相体積のおよそ1/2、30秒の激しい振盪、遠心(Sorvall GS3、5000rpm、10分、10℃)によって6×抽出した。溶媒相をその(−)−アンブロックス含量についてGCによって分析した。反応ブロス中に初期に存在する(−)−アンブロックスの99.5%超が、1.35×初期全反応ブロス体積(200ml)または3.4×固相体積という合計トルエン体積に相当する6回の抽出によって抽出された。図24のグラフは、トルエン洗浄による抽出の経過を、200mlの全反応ブロス中に初期に存在した(−)−アンブロックス量の%として示している(体積比ブロス/トルエンのため、最初の抽出物における%は100%を超える)。
エタノール抽出:
固相80mlをおよそ160ml(2倍体積)の99%エタノールによって抽出し(Infors Multifors HT、35℃、1000rpm、30分)、次に遠心をした。アンブロックスは抽出手順の間に結晶化しなかった。図25のグラフは、4回の洗浄(合計640mlのEtOH、すなわち3.2×全初期反応ブロス体積または8×固相の体積)の後に、反応ブロス中に初期に存在したアンブロックスの約99%が回収されたということを示している。最初の抽出ステップにおいてアンブロックス結晶化を防ぐために十分なエタノールが必要とされる(エタノールに可溶性)。固相の1または1/2倍体積のみを最初の抽出ステップに用いたときには、べたついたペーストが得られ、これは取り扱うことが困難であり、(−)−アンブロックスは遠心の間にペレット上の針状体として結晶化した。温度は、この結晶化の要因の因子ではないようであった(抽出および遠心は室温およびおよそ35℃〜40℃で試験した)。
EtOH相中の(−)−アンブロックス濃度および液相のEtOH/水比(固相の残留水分)は、結晶形成の要因であるように見えた。しかしながら、エタノールの体積を固相の1倍体積まで減ずることが可能であるということが着目された。
(−)−アンブロックスは室温では液相に存在しないので、これはバイオマスと共に分離し、有機溶媒(例えば、水混和性溶媒(例えばエタノール)または非水混和性溶媒(例えばトルエン)によって抽出され得る。(−)−アンブロックスを反応混合物の固相に分離する遠心ステップは、それが(−)−アンブロックスを抽出するために必要とされる溶媒の量を減ずるので有利である。
知覚分析
目的:「粗」抽出物中および「結晶化された」抽出物中の形成された(−)−アンブロックスおよび副生成物(化合物II、III、およびIV)の知覚分析を行うこと。
EEHの変換は(−)−アンブロックス(化合物I)および(−)−アンブロックス異性体(化合物IV)をもたらす。
結果22(b)
EZHの生体内変換はマクロ環エーテル(化合物II)および9b−エピ−アンブロックス(化合物III)をもたらす。
結果22(c)
(−)−アンブロックスの粗組成物は化合物I、II、III、およびIVを含み、それぞれの%の化合物はそれぞれ87.1、2.8、2.5、および7.6%の量で存在する。
結果22(d)
選択的に結晶化された材料の組成物(実験室規模)は、それぞれ99.1、0.1、0.1、および0.7%の量で存在する同じ構成成分を有する。
知覚分析結果は下記の通りであった。
(−)−アンブロックス:OTH 0.2ng/l(OTHは匂い閾値である)。
EEHからの化合物IV:弱い、IsoE、ウッディー、GC−TH 5〜10ng。
EZHからの化合物II:「無臭」(GC−TH >500ng)(GC−THは検出閾値である)。
EZHからの化合物III:アンブロックスよりも約10×高いGC−TH(およそ2ng)。
「粗」抽出物中の3つの副生成物(化合物II、III、およびIV)のそれぞれの合計のパーセントは約3%である。
「結晶化した」抽出物中の3つの副生成物(化合物II、III、およびIV)のそれぞれの合計のパーセントは約1%である(実験室規模)。
3つの副生成物(化合物II、III、およびIV)の知覚分析は、(−)−アンブロックスからのものよりも弱い匂いを示す。
事実、9b−エピ−アンブロックス(化合物III)の匂いは(−)−アンブロックスよりも約10倍弱く、それが本質的に無臭であるということを示唆している。
知覚分析は、(−)−アンブロックスからの1種以上の副生成物化合物の取り除きが、取り除かれた化合物それ自体が実際には無臭の化合物である場合でさえも、残りの化合物(すなわち(−)−アンブロックス)の匂いを改善し得るということを示した。すなわち、アンブロックスの匂い増強が化合物II、III、およびIVの非存在下において観察された。
蒸気抽出/によるアンブロックス回収
方法23
(蒸気抽出した)粗(−)−アンブロックスおよび結晶化した(−)−アンブロックスについて得られた純度
EE:EZ86:14の生体内変換反応混合物を水蒸気抽出し、反応生成物を下記のように結晶化した:水蒸気蒸留物を二相混合物として集めた。有機相を保持し、水相を捨てた。有機相の組成をGCによって分析し、結果を下の表25に示した(「粗」参照)。次いで、有機相を乾燥状態まで濃縮した。
次に、乾燥した粗生成物にエタノールを加え、混合物を、生成物が溶解するまで温めた。室温において、水をゆっくり加え、(−)−アンブロックスが時々の撹拌および氷浴による冷却下において結晶化する。
下の表25は、蒸気抽出/蒸留ステップの後に得られた(「粗」)生成物および結晶化した生成物((−)−アンブロックス)のGC解析結果をもまた示している。表25における「EZH」および「EEH」への言及は、それぞれ(3Z,7E)ホモファルネソールおよび7E,3Eホモファルネソールを言う。
表25は、特定の出発材料(EEH:EZH86:14)が、WT SHCまたはSHC誘導体を用いて所望の最終生成物(−)−アンブロックスおよび副生成物の極めて特異的な混合物(II、IV、およびIII)を産生するということを示している。選択的結晶化のデータは(−)アンブロックス(I)の強い濃縮を示しており、事実上、副生成物(II)、(IV)、または(III)が結晶化したサンプル中には見いだされない。従って、このEE:EZ混合物は、比較的単純明解で費用対効果の高いやり方で選択的に結晶化される嗅覚的に純粋な(−)−アンブロックス生成物を提供する。
蒸気抽出/濾過はアンブロックスを単離するための環境親和性の方法である。なぜなら、これは、アンブロックスの便利な溶媒を含まない単離を提供し、生体触媒の副次的な不活性化を伴うからである。
生物変換反応を用いて産生された(−)−アンブロックスは、溶媒を用いて全反応混合物から(例えば、非水混和性溶媒を用いて、または蒸気抽出/蒸留によって、または濾過によって)または固相から(例えば水混和性溶媒を用いて)、当業者に公知である方法を用いて抽出され得る。
Claims (25)
- EEHを含む異性体の混合物が、(−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物に酵素的に変換され、
酵素的な変換が、(−)−アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4と少なくとも85%の同一性を有するポリペプチド配列を有するスクアレン−ホペンシクラーゼ/ホモファルネソール−アンブロックスシクラーゼ(SHC/HAC)酵素を用いて行われ、
EEHを含む異性体の混合物が、それぞれ[EE:EZ]、[EE:ZE]、ならびに[EE:EZ:ZE]ともまた呼称される、[(3E,7E)および[(3Z,7E)]ならびに/または[(3E,7E)および(3E,7Z)]ならびに/または[(3Z,7E)、(3E,7E)、および(3E,7Z)]からなる群の1種以上から選択される、
(−)−アンブロックスまたは(−)−アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセス。 - プロセスが、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4からなる群から選択されるSHC/HAC酵素ポリペプチド配列を用いて行われる、請求項1に記載のプロセス。
- プロセスが、SHC/HAC酵素を産生する組み換えホスト細胞を用いる、請求項1または2に記載のプロセス。
- SHC/HAC酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号165、166、167、168または169からなる群から選択される、請求項2または3に記載のプロセス。
- ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が30℃から60℃の範囲内の温度で4〜8の範囲内のpHにおいて起こる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロセス。
- ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、表24または表24aに記されている野生型SHC/HACまたはSHC/HAC誘導体酵素のための反応条件の1種以上を用いて起こる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のプロセス。
- ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、5.0から6.2のpH範囲において起こる、請求項1〜6のいずれか一項に記載のプロセス。
- ホモファルネソールから(−)−アンブロックスへの変換が、35℃の温度で起こる、請求項1〜7のいずれか一項に記載のプロセス。
- (−)−アンブロックスが、副生成物(II)、(IV)、および/または(III)の少なくとも1種以上との混合物として産生される、請求項1〜8のいずれか一項に記載のプロセス。
- (−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される、請求項1〜9のいずれか一項に記載のプロセス。
- (−)−アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出/蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物の固相から単離される、請求項1〜10のいずれか一項に記載のプロセス。
- (−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される、請求項10または11に記載のプロセス。
- (−)−アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される、請求項10〜12のいずれか一項に記載のプロセス。
- 有機溶媒が、エタノールまたはトルエンである、請求項10〜13のいずれか一項に記載のプロセス。
- (−)−アンブロックスが副生成物(II)、(IV)、および/または(III)を実質的に含まない、請求項13に記載のプロセス。
- 125〜200g/lの濃度範囲内の(−)−アンブロックスが産生される、請求項1〜15のいずれか一項に記載のプロセス。
- (−)−アンブロックスが0.1から0.5ng/lの匂い閾値を有し、
EEHを含む異性体の混合物が、それぞれ[EE:EZ]ならびに[EE:EZ:ZE]ともまた呼称される、[(3E,7E)および[(3Z,7E)]ならびに/または[(3Z,7E)、(3E,7E)、および(3E,7Z)]からなる群の1種以上から選択される、
請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る(−)−アンブロックスを含む反応生成物。 - (−)−アンブロックスが固体形態である、請求項17に記載の反応生成物。
- (−)−アンブロックスが非晶質または結晶形態である、請求項18に記載の反応生成物。
- 請求項17〜19のいずれか一項に記載の反応生成物を製品に組み込むことを含む、(−)−アンブロックスを含有する製品を作るためのプロセス。
- 製品がフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品である、請求項20に記載のプロセス。
- 請求項17〜19のいずれか一項に記載の反応生成物を含む、フレグランスまたは化粧品または消費者ケア製品。
- 請求項17〜19のいずれか一項に記載の反応生成物と1種以上の追加の構成成分とを含む、フレグランスまたは化粧品または消費者ケア組成物。
- フレグランスまたは化粧品または消費者製品の一部としての、請求項17〜19のいずれか一項に記載の反応生成物の使用。
- ファブリックケア、トイレタリー、美容、および/または清掃製品の一部としての、請求項17〜19のいずれか一項に記載の反応生成物の使用。
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