JP2023015116A - 酵素およびその適用 - Google Patents

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Abstract

【課題】（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスの異性体混合物を調製するためのプロセスを提供する。【解決手段】プロセスは、（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソールまたは（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソールの異性体混合物が酵素的に変換されて（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスの異性体混合物を与え、特定の構造を有するＳＨＣ／ＨＡＣ酵素を用いる酵素的な変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において行われる。【選択図】なし

Description

本発明は、参照SHC／HAC蛋白質に関して改変されたスクアレン－ホペンシクラーゼ／ホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（SHC／HAC）誘導体酵素、SHC／HAC誘導体酵素を含むアミノ酸配列、SHC／HAC誘導体をコードするヌクレオチド配列、SHC／HAC誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、およびSHC／HAC誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えホスト細胞に関する。本発明はまた、SHC／HAC誘導体をコードするヌクレオチド配列を機能的に発現するための手段、ならびに、アンブロックス、好ましくは（－）－アンブロックスを作るためにSHC／HAC誘導体およびWT SHC／HACをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え微生物を用いる方法にも関する。
スクアレン－ホペンシクラーゼ（SHC、EC5.4.99.17）は、直鎖状トリテルペノイドのスクアレンからホペンおよびホパノールへの環化のための生体触媒として作用する膜結合原核生物酵素である。初期のSHC研究は、好熱性で好酸性の細菌アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）（かつてはバチルス・アシドカルダリウス（Bacillus acidocaldarius））のSHCの特性に焦点をあてていた（Neumann & Simon 1986, Biol Chem Hoppe-Seyler 367, 723-729、Seckler & Poralla 1986, Biochem Biophys Act 356-363、およびOchs et al 1990, J Bacteriol 174, 298-302参照）。しかしながら、より最近になって、ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）およびブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）からの他のSHCが精製され、それらの天然（例えばスクアレン）および非天然基質（例えばホモファルネソールおよびシトラール）の観点から特徴づけされてきた（例えば、WO2010/139710、WO2012/066059、およびSeitz et al 2012, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 84, 72-77参照）。
Neumann and Simon (1986 - 同上)による初期の研究は、ホモファルネソールがアリシクロバチルス・アシドカルダリウスSHC（AacSHC）の追加の基質であるということを開示している。しかしながら、Neumann and Simon (1986)によって教示される精製されたAacSHCによる非天然ホモファルネソールの環化率は、天然基質スクアレンの環化率の３％にしか過ぎないと報告された。アンブロックス（生成物２ｂ）の形成率は０．２５ｍＭから２．０ｍＭのホモファルネソール（生成物１ｂ）の濃度では増大し、生成物１ｂの４ｍＭの存在下においてはやや低下した。環化率の違いは、天然SHC基質スクアレンが１６炭素化合物である非天然のホモファルネソールのサイズの２倍である（Ｃ３０炭素化合物）という事実に部分的には帰せられ得る。
（JP2009060799 - Kao）もまた、Ａ・アシドカルダリウスからのSHCを用いてホモファルネソールからアンブロックスを産生するための方法を開示している。JP2009060799はアンブロックスの合成のためにSHCを含む微生物を用いるという可能性を教示している一方で、JP2009060799は、SHC遺伝子を発現する組み換え微生物全細胞の手段によってではなく、SHC遺伝子を発現する組み換え微生物から調製されたSHC抽出液を用いるホモファルネソールからのアンブロックス産生を開示しているのみである。SHC抽出液を用いるホモファルネソールからアンブロックスへの変換パーセントは、６０℃の温度でｐＨ５．２～６．０において１４時間行われたときには１７．５％だが、６．６のｐＨにおいて行われたときには６．８％にしか過ぎないと報告された。SHC抽出液を６０℃でｐＨ５．６において６４時間用いる３Ｅ，７Ｅ－ホモファルネソールからアンブロックスへの変換パーセントは、０．２％ホモファルネソール（２ｇ／ｌ）の基質濃度が用いられるときに６３％と報告された。
WO2010/139719A2およびそのＵＳ同等物（US2012/0135477A1）は、ホモファルネソールからアンブロックスへのシクラーゼ活性を有する少なくとも３つのSHC酵素抽出物を記載している。ジモモナス・モビリス（Zmo）SHCおよびブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bjp）SHC酵素は、１０ｍＭ（２．３６ｇ／ｌ）のホモファルネソール濃度が用いられたときに、それぞれ１６ｈの反応で４１％および２２％のホモファルネソール変換率を示すと報告されており、一方で、AacSHCの変換率は（おそらくは同じホモファルネソール濃度において）１．２％にしか過ぎないと報告されたが、実験の詳細は提供されていない。ZmoSHCおよびBjpSHC酵素抽出物は、SHC酵素を産生する大腸菌ホスト細胞を破砕すること、および可溶性SHC画分を分離することによって、SHC遺伝子を発現する組み換え微生物から調製された。
Seitz et al (2012 - 同上)は３つのSHC酵素の機能的発現および生化学的特性について報告しており、２つはＺ・モビリス（ZmoSHC1およびZmoSHC2）由来、１つはＡ・アシドカルダリウス由来のものである。１０ｍＭ（２．３６ｇ／ｌ）のホモファルネソール濃度が用いられたときには、ホモファルネソールからアンブロックスへの「効率的な」変換（２２．９５％）が野生型ZmoSHC1を用いて観察され、WT ZmoSHC2を用いてはホモファルネソールからアンブロックスへの変換はなく、AacSHCについてはホモファルネソールからアンブロックスへの比較的低い変換（３．４％）が見いだされたということが報告されている。AacSHCについてのホモファルネソールからアンブロックスへの比較的低い変換に関して観察された傾向、これは、Neumann and Simon (1986 - 同上)の結果と一致するものであり、そしてこれもまた上記で論じられている通りWO2010/139719A2に開示されている。３つのSHC酵素は、（凍結解凍サイクルを用いるホスト大腸菌細胞の部分的破砕による）細胞懸濁液フォーマットで、および部分的に精製された膜結合画分として用いられた。
WO2012/066059は、シクラーゼ活性を有する変異体、ならびに、特にシトロネラールの環化によってイソプレゴールを産生するためなどの、テルペンの生体触媒的な環化のための方法、メントールを産生するための方法およびテルペン型構造モチーフを有する他の化合物の生体触媒的な変換のための方法へのその使用を開示している。種々のSHCの配列アラインメントによりフェニルアラニン４８６（Ｆ４８６）が強く保存されたアミノ酸残基として同定され、ジモモナス・モビリスSHC酵素の一連の置換バリアントが作製された。それらの置換のいくつかは活性の喪失に至り、一方で、他のものはシトロネラールなどのテルペン基質からの新規テルペノイド生成物（イソプレゴール）の形成をもたらした。
２０１２年のSeitzによるＰｈＤ学位論文（http:／elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1400）中の報告は、ZmoSHC1のＦ４８６Ｙ変異が、３４．８％（WT ZmoSHC1）から２３．９％（変異体ZmoSHC1 F486Y）に、約１．５倍というホモファルネソールの減縮した生体内変換（biotransformation）率を提供したということを示している。AacSHCにおける変異同等物（Ｙ４２０Ｃ）が試験されたときには、より大きい基質に対する酵素活性が減少し、より小さい基質に対する活性が上昇するであろうということが推測された。変異体が野生型と同じ条件下において試験され、酵素活性が比較されたときには、変異体は、ホモファルネソール基質のいかなる変換も全く示さないということが観察された。それゆえに、Ｙ４２０アミノ酸残基が全ての基質についてAacSHCの活性にとって重大であるということが結論付けられた。
当分野における他のSHCの部位特異的変異導入研究（例えばHoshino and Sato 2002, Chem Commun 291-301）は、高度に保存された領域（例えばＦ６０１）における変異の効果と、ホモファルネソールなどの非天然基質よりもむしろ天然基質（すなわちスクアレンまたはスクアレンアナログ）に及ぼすそれらの効果とに焦点を当てた。
概要としては、ホモファルネソールからアンブロックスへの上首尾な変換のための生物変換プロセスに関する当分野における限定的開示は、ホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）の活性を有する野生型SHCポリペプチドを用いた、比較的低い濃度／体積のホモファルネソール基質（０．２５ｍＭから２ｍＭから１０ｍＭ、または大体０．０６ｇ／ｌから２．３６ｇ／ｌの濃度範囲内）のみに関するものである。HAC活性を有するSHC酵素は、（ｉ）SHC酵素を含む大腸菌ホスト細胞を破砕することと不溶性および可溶性SHC液体画分を分離することとのどちらかによって調製された抽出液、（ｉｉ）部分的に精製された膜画分、または（ｉｉｉ）（ｉ）反応混合物中にTriton X-100（Neumann and Simon 1986 同上、Seitz et al 2012 同上、JP2009060799参照）もしくは（ｉｉ）タウロデオキシコール酸（US2012/0135477A1に開示されている）どちらかを包含する可溶化剤を用いてホモファルネソールをアンブロックスに生物変換するための反応における使用のための、WT SHC遺伝子を発現しSHC酵素を産生する組み換え全細胞（recombinant whole cell）のいずれかであった。
これらのWT SHC抽出物および／またはSHC遺伝子を発現する組み換え微生物の全細胞を用いて、得られたホモファルネソールからアンブロックスへの変換率は、用いられるSHC酵素のソース、ホモファルネソール出発材料の量、および反応条件に応じて変わることが見いだされた。今までのところ、野生型SHC酵素を用いるホモファルネソールからアンブロックスへの１００％の変換パーセントは、報告された包含される濃度（０．０６～２．３６ｇ／ｌ）においては達成されていない。加えて、部位特異的変異導入研究を用いて調製されたSHC誘導体を用いる予備的な検討は、ポジティブな（すなわち改善された変換率）よりもむしろネガティブな（すなわち、減じたホモファルネソール変換率）結果のみを提供した。加えて、精製されたSHC酵素抽出物またはSHC膜結合画分が発表済みの研究に、またはWT SHC遺伝子を発現する組み換え微生物の全細胞がTriton X-100もしくはタウロデオキシコール酸などの可溶化剤を用いる特定の反応条件下において用いられたのみである。WTまたは変異体SHCどちらかを含む組み換え微生物が、最適化した反応条件を用いてホモファルネソールからアンブロックスへのより効率的で費用対効果の高い生物変換を提供し得るという証拠はない。従って、少なくとも、反応速度、特異性、収率、生産性を改善することと、コストを減ずることとによって（例えば、組み換え微生物の全細胞を用いて、または生体触媒産生および生物変換ステップ両方を組み合わせる「ワンポット」プロセスを用いることによってどちらかでプロセスを単純化することによって）、ホモファルネソールからアンブロックスを調製するための引用された公知のプロセスを改善することが望まれる。
本発明は種々の側面において、SHC／HAC誘導体と、SHC／HAC誘導体酵素を含むアミノ酸配列と、SHC／HAC誘導体酵素をコードするヌクレオチド配列と、SHC／HAC誘導体酵素をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、SHC／HAC誘導体酵素をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む組み換えホスト細胞と、特定の反応条件下において（－）－アンブロックスと呼称されるアンブロックス異性体および（副生成物としての）アンブロックス様分子を含むアンブロックス材料を調製するための方法に用いられるときの、SHC／HAC誘導体酵素またはWT SHC／HAC酵素どちらかを含む組み換えホスト細胞の適用とを提供する。当分野におけるAacSHCに関する開示とは違って、出願人は、SHC誘導体遺伝子を発現する全組み換え微生物（whole recombinant microorganizm）が、ホモファルネソールをアンブロックスに生物変換するために用いられ得るということを初めて示した。加えて、WT SHC遺伝子を発現するおよび／またはSHC酵素を産生する全組み換え微生物は、当分野において開示されていない特定の反応条件下において、ホモファルネソールをアンブロックスに生物変換するために用いられ得る。
驚くべきことに、本明細書において開示される通りWT SHC／HAC参照配列のアミノ酸配列中に最大で５つのアミノ酸変異を導入することにより、本明細書において開示される通りの未改変のSHC参照酵素と比較して、顕著に改善されたホモファルネソールからアンブロックスへの変換率を有するSHC／HAC誘導体酵素がもたらされるということもまた見いだされた。これらの新規SHC／HAC誘導体酵素は、単独でおよび組み合わせて、ホモファルネソール基質からのアンブロックス材料、特に（－）－アンブロックスの産生にとって有用である。
追加の驚くべき発見は、１つの変異体（Ｆ６０１Ｙ）を別にして、本明細書において開示されるSHC誘導体酵素は、典型的には、参照SHCポリペプチド配列の保存されていない部分のアミノ酸残基位置に非保存的な置換を含むということである。酵素の保存された領域の変化は蛋白質の保存されていない領域の変化よりも（少なくともその天然基質との関係において）酵素の機能を害する可能性が高いので、このことは予期せぬ発見である。
さらなる驚くべき発見は、本開示の特徴付けられたSHC誘導体酵素が、AacSHCなどの好熱性微生物の通常の反応温度である約６０℃よりもむしろ約３５℃で（ホモファルネソールなどの非天然基質について）至適に働くということである。より低い反応温度でホモファルネソールからアンブロックスを調製するための方法への本開示のSHC誘導体の適用は、産業スケールのアンブロックス産生サイクルにとって顕著なコスト利点を有する。
本発明の別の利点は、本開示のSHC誘導体酵素が効率的な生物変換プロセスを触媒するということであり、これは、従来技術の以前に記載されている濃度（例えば、１２５ｇ／ｌのＥＥＨ）と比較して比較的高い（例えば約５０倍の）ホモファルネソール基質濃度について最適化されたときにホモファルネソール基質の１００％の変換に至り得、一方で、参照WT SHC蛋白質は酵素／細胞の高濃度においてでさえも同じ基質の約１０％を変換するのみである。引用された従来技術の開示は全て、SHCを含む精製された膜抽出物もしくは精製されたSHC抽出物（SHC遺伝子を発現する微生物から調製される）の使用、または（例えば、特定の可溶化剤を用いる）特定の生物変換反応条件下におけるWT SHC遺伝子を発現する組み換え微生物の使用に関する。それでさえも、ずっと低いＥＥＨ濃度において１００％のホモファルネソール変換は報告されていない。また、第１のステップにおいて組み換え細胞が増殖し、SHC酵素を産生し、続いて同じ容器内でＥＥＨを（－）－アンブロックスに変換する「ワンポット」反応も報告されていない。本発明のさらなる利点は、SHC誘導体酵素を産生する組み換えホスト細胞が高い初期反応速度を示すということであり、これは、比較的短い期間内で生成物の高い量の産生を可能にし、一方で、生体触媒の比較的低い量のみを用いる。要するに、WT SHC／HACまたは特定のSHC／HAC誘導体酵素どちらかを含む組み換え微生物の選択および効率的発現、ならびに特定の生物変換反応条件下における適用は、より効率的な生物変換プロセスに至る。最終生成物（（－）－アンブロックス）は分離されかつ容易に精製され得る。引用された技術とは違って、SHC／HAC誘導体酵素は純粋な酵素としては用いられず、（生体触媒として）全細胞的な内容で用いられ、これは、追加の酵素精製および単離ステップが要求されないので、より費用対効果が高くならびによりユーザーおよび環境親和性のアプローチである。
概要としては、本開示は、組み換え微生物株においてアンブロックスを作るための生物変換／生体内変換の方法を提供し、これは（ｉ）経済的に魅力的、（ｉｉ）環境親和性であり、（ｉｉｉ）主要化合物としての（－）－アンブロックスの選択的な産生をもたらし、これは、選択的結晶化条件下において、最終生成物の嗅覚的な質に寄与しない他の副生成物から有効に分離される。
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる用語「SHC」は、表１０～１２に挙げられているソースのいずれかからのスクアレン－ホペンシクラーゼ酵素を意味する。好ましい態様において、用語SHCは、BASFのWO2010/139719、US2012/01345477A1、Seitz et al (2012 同上)、およびSeitz (2012 ＰｈＤ学位論文、同上)に開示されているジモモナス・モビリスSHC酵素およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスSHC酵素を包含する。参照の便宜のために、呼称「AacSHC」がアリシクロバチルス・アシドカルダリウスSHCに用いられ、呼称「ZmoSHC」がジモモナス・モビリスSHCに用いられ、呼称「BjpSHC」がブラディリゾビウム・ジャポニクムSHCに用いられる。WT AacSHCおよび互いに関するそれらの配列の配列同一性パーセント（これは、用いられるアルゴリズムに応じて変わり得る）が表１８および１９に記されている。
Hoshino and Sato (2002 同上)によって作製されたWT SHC配列のアラインメントは、複数のモチーフが全ての４つの配列中に検出されたということを示しており、コア配列Ｇｌｎ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｇｌｙ－Ｘ－Ｔｒｐからなり、これはＺ・モビリスおよびＡ・アシドカルダリウス両方のSHC配列中に６回見いだされる（Reipen et al 1995, Microbiology 141, 155-161の図３参照）。Hoshino and Sato (2002 同上)は、芳香族アミノ酸がSHC中に通常よりも豊富であるということと、SHC中において２つの特徴的なモチーフに着目したということとを報告している。１つは特定のアミノ酸モチーフ［（Ｋ／Ｒ）（Ｇ／Ａ）Ｘ２－３（Ｆ／Ｙ／Ｗ）（Ｌ／ＩＶ）３Ｘ３ＱＸ２－５ＧＸＷ］によって表されるＱＷモチーフであり、もう一つはＤＸＤＤＴＡモチーフである。Wendt et al (1997, Science 277, 1811-1815および1999, J Mol Biol 286, 175-187)はＡ・アシドカルダリウスSHCのＸ線構造解析について報告している。ＤＸＤＤＴＡモチーフはSHC活性部位と相関するようである。従来技術からの例示的な配列アラインメントは、本明細書の図２（Hoshino and Sato (2002 同上)から）および図３（Seitz ＰｈＤ学位論文(2012)から）に提供されている循環的な複数のモチーフを示している。
本明細書において用いられる参照（または野生型）AacSHC蛋白質は、配列番号１に開示されているAacSHC蛋白質を言う。本開示の参照AacSHC酵素は、ホモファルネソール基質とのSHCの生体触媒反応によるアンブロックス誘導体の産生に有用なホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）の活性を有する。参照AacSHCの主反応は、アンブロックスを産生するためのホモファルネソールなどの直鎖状または非直鎖状基質の環化である。
アンブロックス
本明細書において用いられる用語「アンブロックス」は、式（Ｉ）の（－）－アンブロックス、ならびに立体異性体的に純粋な形態のあるいは式（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の下記分子の少なくとも１種以上との混合物としての（－）－アンブロックスを包含する。
Figure 2023015116000001
（－）－アンブロックス
（－）－アンブロックスはアンブロックス（Firmenich）、アンブロキサン（Ambroxan）（Henkel）、Ambrofix（Givaudan）、Amberlyn（Quest）、Cetalox Laevo（Firmenich）、Ambermor（Aromor）、および／またはNorambrenolide Ether（Pacific）として商業的に知られている。
（－）－アンブロックスは産業的に重要な芳香化合物であり、フレグランス業界において長いこと用いられてきた。（－）－アンブロックスの特別な望ましい知覚的利益は、（＋）のものよりもむしろ（－）立体異性体から来る。（－）立体異性体の匂いはムスク様、ウッディー、ウォーム、またはアンバー様と表現され、その一方で、（＋）－アンブロックスエナンチオマーは比較的弱い匂いノートを有する。アンブロックス様生成物の匂いおよび匂い閾値もまた異なる。種々の（－）－アンブロックスが濃縮された材料が市販されてはいるが、高度に濃縮された（－）－アンブロックス材料、理想的には純粋な（－）－アンブロックスを産生することが望ましい。
（－）－アンブロックスの産生
（－）－アンブロックスは下記の通りの産生プロセスに従ってスクラレオリドから産生され得る。スクラレオールは天然の植物クラリセージから抽出される生成物である。しかしながら、天然の出発材料がこのプロセスにおいて用いられるので、これは多段階反応を包含し、その工程は遠回りであり、出発材料の供給の量および安定性が常に充分ではないこともあるかもしれず、クロム酸または過マンガン酸などの酸化剤が（＋）－スクラレオールの酸化的分解のステップにおいて用いられるので反応は環境親和性ではないかもしれないという潜在的問題がある。
Figure 2023015116000002
（－）－アンブロックスはまた、異なるルートを用いてホモファルネソールから合成される。例として、ホモファルネソールは、ネロリドールをブロモ化、シアノ化、および加水分解してホモファルネシル酸を得て、次に還元をすることによって得ることができる。代替的に、ホモファルネソールはファルネソール、ファルネシルクロリド、ベータ－ファルネセン、または他の基質から得てもよい。ベータ－ファルネセンは直接的にＥ，Ｅ－ホモファルネソール（ＥＥＨ）に、または、その後ＥＥＨに変換されるＥ，Ｅ－ホモファルネシル酸エステルを経由して間接的にＥＥＨに変換され得る。異なる基質からの（－）－アンブロックスの産生の概略は、US2012/0135477A1、WO2010/139719、US2013.0273619A1、WO2013/156398A1、ならびにSeitzのＰｈＤ学位論文(2012 同上)およびSchaefer 2011 (Chemie Unserer Zeit 45, 374-388)に見出すことができる。
ホモファルネソールは４つの異性体（３Ｚ，７Ｚ）、（３Ｅ，７Ｚ）、（３Ｚ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｅ）異性体の混合物として存在し得る一方で、文献からは、（－）－アンブロックスは（３Ｅ，７Ｅ）ホモファルネソールからしか得られないようである（Neumann and Simon (1986) 同上参照）。本明細書において用いられる（３Ｅ，７Ｅ）ホモファルネソールへの言及は、Ｅ，Ｅ－ホモファルネソールへの言及であり、これはＥＥＨともまた呼称される。
US2012/0135477A1は、ZmoSHC（配列番号２）を用いる（３Ｚ，７Ｅ）から（－）－アンブロックスへの変換について報告しているが（例２～４参照）、Schaefer (2011)（同上）の開示に従うと、（７Ｅ，３Ｚ）は、上で概説されているように（－）－アンブロックスではなく９ｂ－エピ－アンブロックス（すなわち化合物ＩＩＩ）にしか変換されない。本明細書において用いられる（３Ｚ，７Ｅ）ホモファルネソールへの言及はＥ，Ｚ－ホモファルネソールへの言及であり、これはＥＺＨともまた呼称される。
いくつかの態様において、好ましくは、ホモファルネソール出発材料は（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｚ，７Ｅ）の混合物を含み、本明細書においてはＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物と呼ばれる（特に、例および表２０の参照による。
ホモファルネソールのＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物は３５８２６－６７－６のＣＡＳ番号を有する。
Figure 2023015116000003
例が示しているように（例えば例５、７、９、１０、１１、１８、１９、および２０参照）、ある種の態様において、ホモファルネソール原料／出発材料は異性体の混合物である。
従って、いくつかの態様において、ホモファルネソール出発材料は、（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｚ，７Ｚ、および３Ｅ，７Ｚ）に対応する４つの異性体の混合物ＥＥ：ＥＺ：ＺＺ：ＺＥをもまた含み得る。
いくつかの態様において、好ましくは、ホモファルネソール出発材料は次の群：［（３Ｚ，７Ｚ）、（３Ｅ，７Ｚ）、（３Ｚ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｅ）］、［（３Ｚ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｅ）］、［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｚ）］、および／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］の１種以上から選択される。
好ましくは、ホモファルネソール出発材料は次の群：［（３Ｅ，７Ｅ）、（３Ｚ，７Ｅ）］ならびに／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ／７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］の１種以上から選択される。
従って、ある種の態様において、ＥＥＨ：ＥＺＨの比は約１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、６０：４０、５９：４１、５８：４２、５７：４３、５６：４４、５５：４５、５４：４６、５３：４７、５２：４８、５１：４９、または約５０：５０である。
いくつかの態様において、好ましくはホモファルネソール出発材料は、＞９０％のＥ，Ｅ－ホモファルネソール（ＥＥＨ）を含む。
他の態様において、ホモファルネソール出発材料は８６：１４のＥＥ：ＥＺ重量比を含む。
ある種の態様において、ホモファルネソール出発材料は８０：２０のＥＥ：ＥＺ重量重量比を含む。
ある種の態様において、ホモファルネソール出発材料は７０：３０のＥＥ：ＥＺ重量比を含む。
さらなる態様において、ホモファルネソール出発材料は６９：３１のＥＥ：ＥＺ重量比を含む。
いくつかの態様において、ホモファルネソール出発材料は、（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｚ，７Ｚ）および（３Ｅ，７Ｚ）に対応する４つの異性体の混合物ＥＥ：ＥＺ：ＺＺ：ＺＥからなるかまたは本質的にそれからなる。
いくつかの態様において、好ましくは、ホモファルネソール出発材料は、次の群：［（３Ｚ，７Ｚ）、（３Ｅ，７Ｚ）、（３Ｚ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｅ）］、［（３Ｚ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｅ）］、［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｚ）］、および／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］の１種以上から選択される異性体の混合物からなるかまたは本質的にそれからなる。
好ましくは、ホモファルネソール出発材料は、次の群：ｑ［（３Ｅ，７Ｅ）、（３Ｚ，７Ｅ）］、および／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］の１種以上から選択される異性体の混合物からなるかまたは本質的にそれからなる。
従って、ある種の態様において、ＥＥＨ：ＥＺＨ異性体の比は、約１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、６０：４０、５９：４１、５８：４２、５７：４３、５６：４４、５５：４５、５４：４６、５３：４７、５２：４８、５１：４９、または約５０：５０というＥＥＨ：ＥＺＨの比からなるかまたは本質的にそれからなる。
いくつかの態様において、好ましくはホモファルネソール出発材料は、＞９０％のＥ，Ｅ－ホモファルネソール（ＥＥＨ）からなるかまたは本質的にそれからなる。
他の態様において、ホモファルネソール出発材料は８６：１４のＥＥ：ＥＺ重量比からなるかまたは本質的にそれからなる。
ある種の態様において、ホモファルネソール出発材料は８０：２０のＥＥ：ＥＺ重量比からなるかまたは本質的にそれからなる。
ある種の態様において、ホモファルネソール出発材料は７０：３０のＥＥ：ＥＺ重量比からなるかまたは本質的にそれからなる。
さらなる態様において、ホモファルネソール出発材料は６９：３１のＥＥ：ＥＺ重量比からなるかまたは本質的にそれからなる。
本開示の態様において、アンブロックスはSHC／HAC誘導体酵素を用いて産生される。
SHC／HAC誘導体
本明細書において用いられる用語「SHC／HAC誘導体」は、SHC／HAC誘導体のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に従う参照（または野生型）SHC配列のアミノ酸配列と比較して変更されている、改変されたまたはバリアントのアミノ酸配列であるということを意味する。一般的に、SHC／HAC誘導体は、その基質（例えばＥＥＨ）に対する酵素の活性を改変する（例えば増大させる）少なくとも１つの変更を有するSHCの変更された形態を含む。
本開示のSHC／HAC誘導体はそれらのホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ活性について試験される。結果として、ホモファルネソールをアンブロックスに変換するこれらSHC／HAC誘導体は、本明細書においてはHAC誘導体およびSHC誘導体と言われる。例示的なSHC／HAC誘導体がアリシクロバチルス・アシドカルダリウス、ジモモナス・モビリス、ブラディリゾビウム・ジャポニクムの微生物株ソースに由来する酵素について提供されている一方で、本開示はまた他の微生物株ソース由来の同等なSHC／HAC誘導体をも対象とし、それらはメチロコッカス・カプスラタス、フランキア・アルニ、アセトバクター・パストゥリアナム（Acetobacter pasteurianum）、およびテトラヒメナ・ピリフォルミス（Tetrahymena pyriformis）由来のSHC／HAC酵素を包含するが、これに限定されない（例えば、WO2010/139719、US2012/01345477、WO2012/066059、および表１０～１２参照）。
本明細書において用いられる用語「アミノ酸変更」は、（例えば、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４の野生型（ＷＴ）アミノ酸配列などの）参照アミノ酸配列のアミノ酸配列に対して、２つのアミノ酸の間への１つ以上のアミノ酸の挿入、１つ以上のアミノ酸の欠失、または１つ以上の異なるアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換（これは保存的または非保存的であり得る）を意味する。アミノ酸変更は、（例えば、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４の野生型（ＷＴ）アミノ酸配列などの）参照アミノ酸配列のアミノ酸配列とのSHC／HAC誘導体アミノ酸配列のアミノ酸配列の比較によって容易に同定され得る。例示的なWT SHCアミノ酸配列アラインメントが図１～４および表１８および１９に提供されている。
保存的なアミノ酸置換は、例えば、包含されるアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいてなされ得る。上で概説されている２０個の天然に存在するアミノ酸は、次の６つの標準的なアミノ酸群にグループ分けされ得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性、親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の向きに影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
従って、本明細書において用いられる用語「保存的な置換」は、上に示されている６つの標準的なアミノ酸群の同じ群に挙げられている別のアミノ酸によるあるアミノ酸の交換を意味する。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように改変されたポリペプチドにおいて１つの負電荷を保持する。加えて、グリシンおよびプロリンは、アルファ－ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。上の６つの群の中のいくつかの好ましい保存的な置換は、次の下位群：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ、（ｉｉ）ＳｅｒおよびＴｈｒ、（ｉｉ）ＡｓｎおよびＧｌｎ、（ｉｖ）ＬｙｓおよびＡｒｇ、ならびに（ｖ）ＴｙｒおよびＰｈｅの中の交換である。公知の遺伝コードならびに組み換えおよび合成ＤＮＡ技術に鑑みて、熟練した科学者は保存的なアミノ酸バリアントをコードするＤＮＡを容易に構築し得る。
本明細書において用いられる「非保存的な置換」または「非保存的なアミノ酸交換」は、上に示されている６つの標準的なアミノ酸群（１）から（６）の異なる群に挙げられている別のアミノ酸によるあるアミノ酸の交換として定義される。
典型的には、本開示のSHC／HAC誘導体は、開示されるSHC／HAC誘導体の生物学的機能（例えばHAC活性）を変化させる非保存的な置換を用いて調製される。
参照の便宜のために、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される１文字アミノ酸記号は次のように示される。３文字コードもまた参照目的のために提供される。
Figure 2023015116000004
アミノ酸置換などのアミノ酸変更は、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的変異導入、ホスト細胞のトランスフェクション、およびインビトロ転写を包含する、組み換え遺伝子技術の既知のプロトコールを用いて導入することができ、これらはかかる変化をWT SHC配列に導入し、SHC／HAC誘導体酵素をもたらすために用いることができる。次いで、誘導体はSHC／HACの機能的活性についてスクリーニングされ得る。
SHC／HAC誘導体酵素
本発明は、SHC／HAC誘導体を提供し、少なくとも配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に従う参照（または野生型）SHC配列のアミノ酸配列に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される約１から約５０個の変異を有するアミノ酸配列を含む、ホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）活性を有する酵素を記載する。
種々の態様において、変異または変異の組み合わせは、この欠失／追加を示さない参照SHC酵素と比較して、ホモファルネソールをアンブロックスに変換するためのSHC／HAC誘導体の活性を増強する。本明細書に記載される蛋白質モデリングが、SHC参照配列におけるかかる置換、欠失、または挿入をガイドするために用いられ得る。例えば、SHCアミノ酸配列の構造モデルは、AacSHCの座標（例えば図１９および２０に示されている）を用いて作り出され得る。本明細書において示されているように、かかる相同性モデルは、ホモファルネソールを（－）－アンブロックスに変換するためのSHC酵素の改善へ向かわせる（directing）のに有用である。
それゆえに、種々の態様において、SHC／HAC誘導体は、少なくとも配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に従う参照（または野生型）SHC配列のアミノ酸配列に対して、約１から約４５個の変異、約１から約４０個の変異、約１から約３５個の変異、約１から約３０個の変異、約１から約２５個の変異、約１から約２０個の変異、約１から約１５個の変異、約１から約１０個の変異、または約１から約５個の変異を有し得る。
種々の態様において、SHC／HAC誘導体は、少なくとも配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に従う参照（または野生型）SHC配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも５または少なくとも１０個の変異を有するが約２０または３０個の変異よりも多くは有さない配列を含む。種々の態様において、SHC誘導体は、（例えば、配列番号１または２または３または４などの）参照SHCに対して、約１つの変異、約２つの変異、約３つの変異、約４つの変異、約５つの変異、約６つの変異、約７つの変異、約８つの変異、約９つの変異、約１０個の変異、約１１個の変異、約１２個の変異、約１３個の変異、約１４個の変異、約１５個の変異、約１６個の変異、約１７個の変異、約１８個の変異、約１９個の変異、約２０個の変異、約２１個の変異、約２２個の変異、約２３個の変異、約２４個の変異、約２５個の個の変異、約２６個の変異、約２７個の変異、約２８個の変異、約２９個の変異、約３０個の変異、約３１個の変異、約３２個の変異、約３３個の変異、約３４個の変異、約３５個の変異、約３６個の変異、約３７個の変異、約３８個の変異、約３９個の変異、約４０個の変異、約４１個の変異、約４２個の変異、約４３個の変異、約４４個の変異、約４５個の変異、約４６個の変異、約４７個の変異、約４８個の変異、約４９個の変異、または約５０個の変異を有し得る。
これらおよび他の態様において、SHC／HAC誘導体は、（例えば、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４などの）WT SHCと、または参照配列（例えば、AacSHC（配列番号１）および他のSHC配列（例えば、WO2010/139719のZmoSHCの間に少なくとも３４～５２％の同一性が示されている表１８および１９参照）の間において、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
種々の態様において、SHCバリアントは、ホモファルネソールをアンブロックスに変換するための野生型酵素よりも高い活性、例えば、（例えば、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４などの）参照野生型酵素よりも、ホモファルネソール基質との接触時に（－）－アンブロックスの高い産生を有する。
例えば、SHC／HAC誘導体は、（例えば配列番号１または２または３または４などの）参照SHCと、または参照配列（例えば、AacSHC（配列番号１）および他のSHC配列（例えばWO2010/139719のZmoSHC）の間に少なくとも３４～５２％の同一性が示されている表１８および１９参照）の間において、少なくとも約５０％の同一性、約５１％の同一性、約５２％の同一性、約５３％の同一性、約５４％の同一性、約５５％の同一性、約５６％の同一性、約５７％の同一性、約５８％の同一性、約５９％の同一性、約６０％の同一性、約６１％の同一性、約６２％の同一性、約６３％の同一性、約６４％の同一性、約６５％の同一性、約６６％の同一性、約６７％の同一性、約６８％の同一性、約６９％の同一性、約７０％の同一性、約７１％の同一性、約７２％の同一性、約７３％の同一性、約７４％の同一性、約７５％の同一性、約７６％の同一性、約７７％の同一性、約７８％の同一性、約７９％の同一性、約８０％の同一性、約８１％の同一性、約８２％の同一性、約８３％の同一性、約８４％の同一性、約８５％の同一性、約８６％の同一性、約８７％の同一性、約８８％の同一性、約８９％の同一性、約９０％の同一性、約９１％の配列同一性、約９２％の配列同一性、約９３％の配列同一性、約９４％の配列同一性、約９５％の配列同一性、約９６％の配列同一性、約９７％の配列同一性、約９８％の配列同一性、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
SHC酵素活性について試験された種々のSHC／HAC誘導体が表１～９の１つ以上に挙げられている。このように、種々の態様において、SHC／HAC誘導体は、表１～９の１つ以上から選択される少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、または少なくとも約１０個の変異を有し得る。いくつかの態様において、SHC／HAC誘導体は改変されたSHCポリペプチドであり、配列番号１に従う野生型／参照アミノ酸配列と比較して最大で４つの変異を有し、かつ配列番号１に対してＦ１２９Ｌおよび／またはＩ４３２Ｔの少なくともいずれか１つ以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６０１ＹまたはＭ１３２Ｒを含むアミノ酸配列を含み、大腸菌における発現および活性を補助するリーダー配列を任意に含む。
他の態様において、SHC／HAC誘導体は、改変されたSHCポリペプチドであり、配列番号１に従う野生型／参照アミノ酸配列（または、大腸菌による発現のために改変されたその対応物）と比較して最大で８つの変異を有し、かつ配列番号１に対して位置７７、９２、１２９、１３２、２２４、４３２、５７９、６０１、および６０５からなる群から選択される位置に１種以上の１アミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC／HAC誘導体は配列番号１に対して改変された（例えば増大した）酵素活性を有する。
１つの態様において、SHC誘導体は、配列番号１に対してＴ７７Ｘ、Ｉ９２Ｘ、Ｆ１２９Ｘ、Ｍ１３２Ｘ、Ａ２２４Ｘ、Ｉ４３２Ｘ、Ｑ５７９Ｘ、Ｆ６０１Ｙ、およびＦ６０５Ｗからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含み、
Ｔ７７Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｉ９２Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ１２９Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｍ１３２Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ａ２２４Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｉ４３２Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｑ５７９Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６０１Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６０５Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有する。
１つの態様において、SHC誘導体は、配列番号１に対してＴ７７Ａ、Ｉ９２Ｖ、Ｆ１２９Ｌ、Ｍ１３２Ｒ、Ａ２２４Ｖ、Ｉ４３２Ｔ、Ｑ５７９Ｈ、Ｆ６０１Ｙ、およびＦ６０５Ｗからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含む。
別の態様において、SHC誘導体は、配列番号２に対してＳ１２９Ｘ、Ｖ１４５Ｘ、Ｆ１８２Ｘ、Ｙ１８５Ｘ、Ｇ２８２Ｘ、Ｉ４９８Ｘ、Ｈ６４６Ｘ、およびＦ６９８Ｘからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含み、
Ｓ１２９Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｖ１４５Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ１８２Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｙ１８５Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｇ２８２Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｉ４９８Ｘは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｈ６４６Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６６８Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６９８Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有する。
１つの態様において、SHC誘導体は、表２に記されているように、配列番号２に対してＳ１２９Ａ、Ｖ１４５Ｖ、Ｆ１８２Ｌ、Ｙ１８５Ｒ、Ｇ２８２Ｖ、Ｉ４９８Ｔ、Ｈ６４６Ｈ、Ｆ６６８Ｙ、およびＦ６９８Ｘからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含む。
さらなる態様において、SHC誘導体は、配列番号３に対してＧ８５Ｘ、Ｖ１００Ｘ、Ｆ１３７Ｘ、Ｉ１４０Ｘ、Ｖ２３３Ｘ、Ｉ４５０Ｘ、Ｎ５９８Ｘ、Ｆ６２０Ｘ、およびＦ６２４Ｘからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含み、
Ｇ８５Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｖ１００Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ１３７Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｉ１４０Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｖ２３３Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｉ４５０Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｎ５９８Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６２０Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６２４Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有する。
１つの態様において、SHC誘導体は、表３および表３ａに記されているように、配列番号３に対してＧ８５Ａ、Ｖ１００Ｖ、Ｆ１３７Ｌ、Ｉ１４０Ｒ、Ｖ２３３Ｖ、Ｉ４５０Ｔ、Ｎ５９８Ｈ、Ｆ６２０Ｙ、およびＦ６２４Ｗからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含む。
さらなる態様において、SHC誘導体は、配列番号４に対してＡ８８Ｘ、Ｖ１０４Ｘ、Ｆ１４１Ｘ、Ｙ１４４Ｘ、Ｖ２４１Ｘ、Ｉ４５９Ｘ、Ｍ６０７Ｘ、Ｆ６２８Ｘ、およびＦ６５８Ｘからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含み、
Ａ８８Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｖ１０４Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ１４１Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｙ１４４Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｖ２４１Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｉ４５９Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｍ６０７Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６２８Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有し、
Ｆ６５８Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹから選択されるＸを有する。
さらなる態様において、SHC誘導体は、表４に記されているように、配列番号４に対してＡ８８Ａ、Ｖ１０４Ｖ、Ｆ１４１Ｌ、Ｙ１４４Ｒ、Ｖ２４１Ｖ、Ｉ４５９Ｔ、Ｍ６０７Ｈ、Ｆ６２８Ｙ、およびＦ６５８Ｗからなる群から選択される１種以上の置換を含む。
SHC誘導体の組み合わせ
１つの態様において、SHC誘導体は、表５に記されているように、配列番号１に対してＴ７７Ａ、Ｆ１２９Ｌ、Ｍ１３２Ｒ、Ｉ９２Ｖ、Ａ２２４Ｖ、Ｉ４３２Ｔ、Ｑ５７９Ｈ、およびＦ６０１Ｙからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含む。
１つの態様において、SHC誘導体は、表６に記されているように、配列番号２に対してＳ１２９Ａ、Ｖ１４５Ｖ、Ｆ１８２Ｌ、Ｙ１８５Ｒ、Ｇ２８２Ｖ、Ｉ４９８Ｔ、Ｈ６４６Ｈ、およびＦ６６８Ｙからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含む。
１つの態様において、SHC誘導体は、表７に記されているように、配列番号３に対してＧ８５Ａ、Ｖ１００Ｖ、Ｆ１３７Ｌ、Ｉ１４０Ｒ、Ｖ２３３Ｖ、Ｉ４５０Ｔ、Ｎ５９８Ｈ、およびＦ６２０Ｙからなる変異体の群から選択される１種以上の置換を含む。
さらなる態様において、SHC誘導体は、表８に記されているように、配列番号４に対してＡ８８Ａ、Ｖ１０４Ｖ、Ｆ１４１Ｌ、Ｙ１４４Ｒ、Ｖ２４１Ｖ、Ｉ４５９Ｔ、Ｍ６０７Ｈ、およびＦ６２８Ｙからなる群から選択される１種以上の置換を含む。
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好ましい態様において、SHC誘導体は、配列番号１に対して、Ｆ１２９Ｌおよび／またはＩ４３２Ｔの少なくともいずれか１種以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６０１ＹまたはＭ１３２Ｒを含む。
本開示において提供されるSHC3と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｆ６０１Ｙを含む。
Hoshino and Sato (2002 同上)は、原核生物および真核生物種のなかで高度に保存されたアミノ酸残基としてＦ６０１を同定した。SHC誘導体F601Yが（スクアレンではなく）オキシドスクアレン基質について大いに増大したＶｍａｘを示したということが報告されている。しかしながら、Ｆ６０１Ｙは、スクアレンが用いられるときに、WT AacSHCに対してアフィニティーの減少（すなわち、より高いＫＭ）および触媒効率／活性（Ｋｃａｔ／ＫＭ）の減少を示す。ホモファルネソールが酵素基質としてＦ６０１Ｙ変異体に用いられるときのAacSHC有効性についてのデータは、Hoshino and Sato (2002 同上)においては提供されていない。
本開示において提供されるSHC10と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｆ１２９Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC30と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｆ６０１ＹおよびＦ１２９Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC26と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｍ１３２ＲおよびＩ４３２Ｔを含む。
本開示において提供される215G2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｍ１３２Ｒ、Ｉ４３２Ｔ、およびＡ２２４Ｖを含む。
本開示において提供されるSHC32と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｆ６０１Ｙ、Ｍ１３２Ｒ、およびＩ４３２Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC31と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｆ１２９Ｌ、Ｍ１３２Ｒ、およびＩ４３２Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC33と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｆ６０１Ｙ、Ｆ１２９Ｌ、Ｍ１３２ＲおよびＩ４３２Ｔを含む。
本開示において提供される101A10と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｆ６０１ＹおよびＱ５７９Ｈを含む。
本開示において提供される111C8と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号１）と比較して下記置換Ｔ７７Ａ＋Ｉ９２ＶおよびＦ１２９Ｌを含む。
好ましい態様において、SHC誘導体は、配列番号２に対して、Ｆ１８２Ｌおよび／またはＩ４９８Ｔの少なくともいずれか１種以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６６８ＹまたはＹ１８５Ｒを含む。
本開示において提供されるSHC3ZM1と呼ばれるSHC誘導体は参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｆ６６８Ｙを含む。
Hoshino and Sato (2002 同上)は、原核生物および真核生物種のなかで高度に保存されたアミノ酸残基としてＦ６０１を同定した。SHC誘導体F601Yが（スクアレンではなく）オキシドスクアレン基質について大いに増大したＶｍａｘを示したということが報告されている。しかしながら、Ｆ６０１Ｙは、スクアレンが用いられるときに、WT AacSHCに対してアフィニティーの減少（すなわち、より高いＫＭ）および触媒効率／活性（Ｋｃａｔ／ＫＭ）の減少を示す。ホモファルネソールが酵素基質としてＦ６０１Ｙ変異体に用いられるときのAacSHC有効性についてのデータは、Hoshino and Satoにおいては提供されていない。ZmoSHC1においてＦ６０１Ｙと同等なSHC誘導体はＦ６６８Ｙである。
本開示において提供されるSHC10ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｆ１８２Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC30ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｆ６６８ＹおよびＦ１８２Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC26ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｙ１８５ＲおよびＩ４９８Ｔを含む。
本開示において提供される215G2ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｙ１８５Ｒ、Ｉ４９８Ｔ、およびＧ２８２Ｖを含む。
本開示において提供されるSHC32ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｆ６６８Ｙ、Ｙ１８５Ｒ、およびＩ４９８Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC31ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｆ１８２Ｌ、Ｙ１８５Ｒ、およびＩ４９８Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC33ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｆ６６８Ｙ、Ｆ１８２Ｌ、Ｙ１８５Ｒ、およびＩ４９８Ｔを含む。
本開示において提供される101A10ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｆ６６８ＹおよびＨ６４６Ｈを含む。
本開示において提供される111C8ZM1と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号２）と比較して下記置換Ｓ１２９Ａ＋Ｖ１４５ＶおよびＦ１８２Ｌを含む。
好ましい態様において、SHC誘導体は、配列番号３に対して、Ｆ１３７Ｌおよび／またはＩ４５０Ｔの少なくともいずれか１種以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６２０ＹまたはＩ１４０Ｒを含む。
本開示において提供されるSHC3ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｆ６２０Ｙを含む。
Hoshino and Sato (2002 同上)は、原核生物および真核生物SHC種のなかで高度に保存されたアミノ酸残基としてＦ６０１を同定した。AacSHC誘導体F601Yが（スクアレンではなく）オキシドスクアレン基質について大いに増大したＶｍａｘを示したということが報告されている。しかしながら、Ｆ６０１Ｙは、スクアレンが用いられるときに、WT AacSHCに対してアフィニティーの減少（すなわち、より高いＫＭ）および触媒効率／活性（Ｋｃａｔ／ＫＭ）の減少を示す。ホモファルネソールが酵素基質としてＦ６０１Ｙ変異体に用いられるときのAacSHC有効性についてのデータは、Hoshino and Sato(2002)においては提供されていない。ZmoSHC2においてＦ６０１Ｙと同等なSHC誘導体はＦ６２０Ｙである。
本開示において提供されるSHC10ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｆ１３７Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC30ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｆ６２０ＹおよびＦ１３７Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC26ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｉ１４０ＲおよびＩ４５０Ｔを含む。
本開示において提供される215G2ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｉ１４０Ｒ、Ｉ４５０Ｔ、およびＶ２３３Ｖを含む。
本開示において提供されるSHC32ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｆ６２０Ｙ、Ｉ１４０Ｒ、およびＩ４５０Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC31ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｆ１３７Ｌ、Ｉ１４０Ｒ、およびＩ４５０Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC33ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｆ６２０Ｙ、Ｆ１３７Ｌ、Ｉ１４０Ｒ、およびＩ４５０Ｔを含む。
本開示において提供される101A10ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｆ６２０ＹおよびＮ５９８Ｈを含む。
本開示において提供される111C8ZM2と呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号３）と比較して下記置換Ｇ８５Ａ＋Ｖ１００ＶおよびＦ１３７Ｌを含む。
好ましい態様において、SHC誘導体は、配列番号４に対して、Ｆ１４１Ｌおよび／またはＩ４５９Ｔの少なくともいずれか１種以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６２８ＹまたはＹ１４４Ｒを含む。
本開示において提供されるSHC3Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｆ６２８Ｙを含む。
Hoshino and Sato (2002 同上)は、原核生物および真核生物種のなかで高度に保存されたアミノ酸残基としてＦ６０１を同定した。SHC誘導体F601Yが（スクアレンではなく）オキシドスクアレン基質について大いに増大したＶｍａｘを示したということが報告されている。しかしながら、Ｆ６０１Ｙは、スクアレンが用いられるときに、WT AacSHCに対してアフィニティーの減少（すなわち、より高いＫＭ）および触媒効率／活性（Ｋｃａｔ／ＫＭ）の減少を示す。ホモファルネソールが酵素基質としてＦ６０１Ｙ変異体に用いられるときのAacSHC有効性についてのデータは、Hoshino and Satoにおいては提供されていない。BjpSHCにおいてＦ６０１Ｙと同等なSHC誘導体はＦ６２８Ｙである。
本開示において提供されるSHC10Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｆ１４１Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC30Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｆ６２８ＹおよびＦ１４１Ｌを含む。
本開示において提供されるSHC26Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｙ１４４ＲおよびＩ４５９Ｔを含む。
本開示において提供される215G2Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｙ１４４Ｒ、Ｉ４５９Ｔ、およびＶ２４１Ｖを含む。
本開示において提供されるSHC32Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｆ６２８Ｙ、Ｙ１４４Ｒ、およびＩ４５９Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC31Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｆ１４１Ｌ、Ｙ１４４Ｒ、およびＩ４５９Ｔを含む。
本開示において提供されるSHC33Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｆ６２８Ｙ、Ｆ１４１Ｌ、Ｙ１４４Ｒ、およびＩ４５９Ｔを含む。
本開示において提供される101A10Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ｆ６２８ＹおよびＭ６０７Ｈを含む。
本開示において提供される111C8Bjpと呼ばれるSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（配列番号４）と比較して下記置換Ａ８８Ａ＋Ｖ１０４ＶおよびＦ１４１Ｌを含む。
アミノ酸配列
いくつかの態様において、AacSHC／HAC誘導体は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、および／または１７１の１つ以上に記されているポリペプチドの１種以上を含む。
好ましくは、本開示のAacSHC／HAC誘導体は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、および／または配列番号１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
他の態様において、ZmoSHC1／HAC誘導体は、配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、および／または１７３の１つ以上に記されているポリペプチドの１種以上を含む。
好ましくは、本開示のZmoSHC1／HAC誘導体は、配列番号５７、配列番号５９，配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、および／または配列番号１７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
さらなる態様において、ZmoSHC2／HAC誘導体は、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、および／または配列番号１７５の１つ以上に記されているポリペプチドの１種以上を含む。
追加の態様において、BjpSHC／HAC誘導体は、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、および／または配列番号１７７の１つ以上に記されているポリペプチドの１種以上を含む。
配列アラインメント
例えばAacSHC、ZmoSHC1、ZmoSHC2、およびBjpSHCポリペプチド配列などのSHC参照配列の異なる長さを原因として、参照AacSHC配列（配列番号１）の位置Ｘのアミノ酸残基は、ZmoSHC1参照配列（配列番号２）上の異なるアミノ酸位置Ｂ、ZmoSHC2参照配列（配列番号３）上の異なるアミノ酸位置Ｊ、およびBjpSHC参照配列（配列番号４）上の異なるアミノ酸位置Ｚに対応する。加えて、SHC参照配列の変更もまた参照SHC配列に対してSHC誘導体配列を改変し得る。
用語「位置」は、アミノ酸の特定の付番によって同定される、参照SHC蛋白質中に存在する特定のアミノ酸残基を言う。アミノ酸の挿入または欠失どちらかによるSHC参照蛋白質の変更は、参照SHCアミノ酸配列およびSHC誘導体アミノ酸配列の間で異なる付番となる。例として、アミノ酸が参照SHC蛋白質のアミノ酸５０９および５１０の間に挿入される場合には、挿入の次のアミノ酸はSHC誘導体蛋白質において付番５１１を有するであろう一方で、それはSHC参照蛋白質においては付番５１０を保持する。
WT SHC／HACおよびSHC／HAC誘導体の活性を決定するためのアッセイ
WT SHC／HACおよび／またはSHC／HAC誘導体酵素活性を決定および定量するためのアッセイは本明細書に記載されており、当分野において公知である。例として、WT SHC／HACおよび／またはSHC／HAC誘導体活性は、ホスト細胞からの精製されたSHC／HAC酵素もしくは抽出物、またはSHC／HAC酵素を産生した完全な組み換えホスト生物を適切な条件下において適切な基質とインキュベーションすることと、（例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）またはＨＰＬＣ分析による）反応生成物の分析を行うこととによって決定され得る。SHC／HACおよび／またはSHC／HAC酵素活性アッセイならびに反応生成物の分析のさらなる詳細は例において提供されている。これらのアッセイは、組み換えホスト細胞（例えば大腸菌）によってSHC誘導体を産生することを包含する。
本明細書において用いられる用語「活性」は、基質と反応してターゲット生成物を提供するための酵素の能力を意味する。活性は、活性試験として公知であるものにおいて、時間の関数としてのターゲット生成物の増大、基質（もしくは出発材料）の減少、またはそれらのパラメータの組み合わせによって決定され得る。本開示のSHC／HAC誘導体は、ホモファルネソールを（－）－アンブロックスに生物変換するそれらの能力を特徴とし、HAC活性などの生物学的活性を示す。
本明細書において用いられる「生物学的活性」は、ポリペプチドが示し得るあらゆる活性を言い、限定なしに、酵素活性、別の化合物への結合活性（例えば、別のポリペプチドへの結合、特に受容体への結合、または核酸への結合）、阻害活性（例えば、酵素阻害活性）、活性化活性（例えば酵素活性化活性）、または毒性作用を包含する。バリアントまたは誘導体がかかる活性を親のポリペプチドと同じ程度まで示すということは要求されない。バリアントは、本願の文脈においては、それが親のポリペプチドの活性の少なくとも１０％の程度まで関連する活性を示す場合にバリアントと見なされる。同様に、誘導体は、本願の文脈においては、（用語誘導体およびバリアントが本開示において交換可能に用いられるように）それが親のポリペプチドの活性の少なくとも１０％の程度まで関連する生物学的活性を示す場合に誘導体と見なされる。
他の態様において、本開示のSHC／HAC誘導体は参照SHC蛋白質よりも良いターゲット収率を示す。用語「ターゲット収率」は、原料グラム当たりの回収可能な生成物のグラムを言う（これはパーセントのモル変換率として計算され得る）。
追加の態様において、本開示のSHC／HAC誘導体は、参照SHC蛋白質に対して改変された（例えば増大した）ターゲット生産性を示す。用語「ターゲット生産性」は、生物変換時間（すなわち、基質が追加された後の時間）の時間当たり、発酵キャパシティのリットル当たりのグラムによる回収可能なターゲット生成物の量を言う。
さらなる態様において、本開示のSHC／HAC誘導体は、参照SHC蛋白質よりも改変されたターゲット収率係数を示す。用語「ターゲット収率係数」は、反応媒体中の得られる生成物濃度およびSHC誘導体の濃度（例えば、精製されたSHC酵素、またはSHC酵素を発現する組み換えホスト細胞からの抽出物）の間の比を言う。
種々の態様において、本開示のSHC誘導体は、参照SHC蛋白質（例えば配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４）に対して、酵素活性の改変された（例えば増大した）～倍の増大（例えば、改変された／増大したホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）活性）を示す。活性のこの増大は、少なくとも係数の２、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および／または１００ぶんだけである。
ヌクレオチド配列
本開示は、さらに、本明細書に記載されるSHC誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
本明細書において用いられる用語「核酸分子」は、具体的には、本開示のポリヌクレオチドを言うものとし、これはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡであり得、二本鎖もしくは一本鎖、センスおよび／またはアンチセンス鎖であり得る。用語「核酸分子」は、特に、例えば全長ヌクレオチド配列またはその断片もしくは部分として本明細書において用いられるポリヌクレオチド（単数または複数）に適用されるものとし、これらはそれぞれ酵素活性を有するポリペプチド、例えば代謝経路の酵素、またはその断片もしくは部分をコードする。
用語は別の分子をもまた包含し、例えば、対応するゲノムＤＮＡがイントロンを、それゆえに異なる配列を有するｃＤＮＡ、隣接する遺伝子の少なくとも１つを欠くゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生され、隣接する遺伝子の少なくとも１つを欠くｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの断片、隣接する遺伝子の少なくとも１つを欠く制限断片、融合蛋白質（例えばＨｉｓタグ）、ムテイン、または所与の蛋白質の断片などの天然に存在しない蛋白質をコードするＤＮＡ、およびｃＤＮＡまたは天然に存在する核酸の縮重バリアントである核酸である。加えて、これは、ハイブリッド遺伝子、すなわち天然に存在しない融合蛋白質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列を包含する。融合蛋白質は（ヒスチジン（Ｈｉｓ）などだが、これに限定されない）１種以上のアミノ酸を蛋白質に付加することができ、これは通常、蛋白質のＮ末端に付加されるが、Ｃ末端においてもまた、もしくは蛋白質領域内に融合されて付加される。かかる融合蛋白質またはかかる蛋白質をコードする融合ベクターは、典型的には３つの目的、（ｉ）組み換え蛋白質の産生を増大させること、（ｉｉ）組み換え蛋白質の可溶性を増大させること、および（ｉｉｉ）アフィニティー精製のためのリガンドを提供することによって組み換え蛋白質の精製を補助すること、を果たす。用語「核酸分子」はまた、特定の微生物ホスト細胞（例えば大腸菌ホスト細胞）による発現にとって好適なコドン最適化した配列をも包含する。本明細書において用いられる用語「コドン最適化した」は、細菌（例えば大腸菌）ホスト細胞遺伝子中において頻繁に用いられるコドンによるコドンの１種以上または好ましくはかなりの数の置換によって、原核または真核生物ホスト細胞、特に大腸菌ホスト細胞などの細菌ホスト細胞による発現に適応した核酸の蛋白質コード配列を意味する。この点で、参照配列の配列番号１、２、３、および／または４ならびにその全てのバリアント／誘導体をコードするヌクレオチド配列は、ソース（例えばそれぞれAacSHC、ZmoSHC1、ZmoSHC2、またはBjpSHC）中に見いだされる元のものであり得るか、または遺伝子は、例えば大腸菌などの選択されたホスト生物に対してコドン最適化され得る。
リボ核酸（ＲＮＡ）分子はインビトロ転写によって産生され得る。ＤＮＡ分子のセグメントもまた本開示の範囲内で考えられ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生されるかまたは１種以上の制限エンドヌクレアーゼによる処置によって生み出され得る。核酸分子のセグメント、特に部分的な遺伝子であるものは、遺伝子のＤＮＡ断片と言われ得る。断片は、同じＯＲＦまたは異なるＯＲＦのリピートどちらかの、いくつかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をもまた含有し得る。用語は、具体的にはコードヌクレオチド配列を言うものとするが、非コード、例えば非転写もしくは非翻訳配列であるか、またはポリペプチドを全体的にもしくは部分的にコードするヌクレオチド配列をもまた包含するものとする。例えばアセンブリ、多様化、または組み換えのために本明細書において用いられる遺伝子は、非コード配列、またはポリペプチドをコードする配列もしくは蛋白質コード配列、またはその部分もしくは断片であり得、所望の組み換えイベントのために十分な配列長を有する。より具体的には、前記の遺伝子は３ｂｐ、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３００ｂｐという最小長を有する。
単離されたＤＮＡへの言及が、例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリーまたは例えば制限消化反応混合物もしくは電気泳動ゲルスライス中のゲノムＤＮＡ制限消化物の中の、他のＤＮＡ分子の数百から数百万のなかに存在するＤＮＡを意味しないということは前述から明らかであろう。本開示の単離された核酸分子は、そのものとしては天然の状態で見いだされないセグメントを包含する。
本明細書において用いられる用語「単離されたＤＮＡ」は、（１）あらゆる天然に存在する配列のものと同一でない配列、天然に存在しないポリヌクレオチドもしくは核酸を含有するＤＮＡ（例えば、ヒトの介入による２つのさもなければ分離された配列セグメントの人為的組み合わせ（例えば、例えば遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの人為的操作）によって作られる）、または（２）天然に存在する配列を有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の内容において、目的ＤＮＡを含有する遺伝子が天然に存在する生物のゲノム中において目的ＤＮＡを含有する遺伝子に隣接する遺伝子の少なくとも１つを含まないＤＮＡについて言及し得る。
具体的に核酸配列に関して本明細書において用いられる用語「単離されたＤＮＡ」は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される核酸またはポリヌクレオチド、例えば、ホスト細胞にとって異種のポリヌクレオチドを含み、任意にホスト細胞に組み込まれるＤＮＡコンストラクトについてもまた言及し得る。キメラヌクレオチド配列は具体的には組み換え分子として産生され得る。用語「組み換え」は、具体的にはポリヌクレオチド同士のアセンブリに適用されるものとし、交叉または遺伝子モザイクを達成するための組み換えを有してまたは組み換えなしに、かかるポリヌクレオチドまたはその部分をつなぎ合わせる。例えば、これは、所望の機能の核酸セグメント同士をつなぎ合わせて機能の所望の組み合わせを生み出すために実施される。本明細書に記載されるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに好適な１種以上の制御領域にセンスの向きで作動可能に連結された、そのポリペプチドのコード配列を包含する。多くの微生物はポリシストロンｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現することが可能であるので、望ましい場合には、複数のポリペプチドがそれらの微生物のための単一の制御領域のコントロール下において発現され得る。コード配列および制御領域は、制御領域およびコード配列が、制御領域が配列の転写または翻訳を制御するために有効であるように位置するときに、作動可能に連結されていると考えられる。
本明細書において用いられる用語「組み換え」は、具体的には酵素に関して、組み換えＤＮＡ技術によって産生される、すなわち所望の酵素をコードする外来性ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞から産生される、酵素を言うものとする。「合成」酵素は化学合成によって調製されたものである。キメラ酵素は具体的には組み換え分子として産生され得る。それゆえに、用語「組み換えＤＮＡ」は、ベクターに、自己複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ（もしくは、天然の染色体上の位置以外の位置において、相同な細胞のゲノム）に組み込まれた組み換えＤＮＡを包含する。
さらなる側面において、本開示の核酸分子（単数または複数）は、原核生物および／または真核生物ホスト細胞による発現を可能にする発現コントロール配列に作動的に連結される。本明細書において用いられる「作動的に連結される」は、発現コントロール配列が対象のコード配列の発現を有効にコントロールするように遺伝子コンストラクトに組み込まれていることを意味する。上で言及した転写／翻訳制御エレメントは、誘導性および非誘導性、構成的、細胞周期により制御される、代謝により制御されるプロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサー、ならびに当業者に公知であり、遺伝子発現を駆動または別様に制御する他のエレメントを包含するが、これに限定されない。かかる制御エレメントは、構成的発現に向かわせるかあるいは、例えばCUP-1プロモーター、例えばｔｅｔオンまたはｔｅｔオフシステムに採用されるｔｅｔリプレッサー、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム制御エレメントのように誘導性発現を可能にする、制御エレメントを包含するが、これに限定されない。例として、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は１００μＭから１．０ｍＭの濃度範囲内において遺伝子発現の有効な誘導因子である。この化合物はｌａｃオペロンの転写を誘発するラクトース代謝物質アロラクトースの分子模倣体であり、それゆえに、遺伝子がｌａｃオペレーターのコントロール下にあるときに遺伝子発現を誘導するために用いられる。遺伝子発現を誘導する制御エレメントの別の例はラクトースである。
同様に、本開示の核酸分子（単数または複数）は、追加のポリペプチド配列、例えばマーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成し得る。マーカーおよびレポーター遺伝子の例は、ベータ－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（ベータ－ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）を包含する。本開示の実施に関係する標準的な手順の多くと同じく、当業者は追加の有用な試薬、例えばマーカーまたはレポーターの機能を果たし得る追加の配列を知っているであろう。
いくつかの態様において、本開示はWT SHCまたは上記SHC／HAC誘導体をコードする組み換えポリヌクレオチドを提供し、これは発現および任意の精製のためにベクター中に挿入され得る。ベクターの１つの型は、その中に追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされている環状二本鎖ＤＮＡループを表す、プラスミドである。ある種のベクターは、それらが機能的に連結された遺伝子の発現をコントロールし得る。それらのベクターは「発現ベクター」と呼ばれる。通常は、ＤＮＡ組み換え技術に好適な発現ベクターはプラスミド型である。典型的には、発現ベクターは、本明細書に記載されるWT SHCまたはSHC／HACバリアントなどの遺伝子を含む。プラスミドは最も多くの場合に用いられるベクター型であるので、本明細書において、用語「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。
かかるベクターは、ホスト細胞中に天然には存在しないＤＮＡ配列、通常はＲＮＡに転写または蛋白質に翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、および非組み換えホストに導入したい他の遺伝子またはＤＮＡ配列を包含するが、これに限定されないＤＮＡ配列を包含し得る。典型的には、本明細書に記載される組み換えホストのゲノムは１種以上の組み換え遺伝子の安定な導入によって拡張されるということが理解されるであろう。しかしながら、自己または複製プラスミドもしくはベクターもまた本開示の範囲内において用いられ得る。さらに、本開示は、低コピー数、例えばシングルコピー、または高コピー数（本明細書において例示されている）プラスミドまたはベクターを用いて実施され得る。
好ましい態様において、本開示のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工細菌および人工酵母染色体、ノックアウトまたはノックインコンストラクト、合成核酸配列、あるいはカセットを含み、一部は直鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、メガプラスミド、合成または人工染色体、例えば植物、細菌、哺乳類、または酵母人工染色体の形態で産生され得る。
導入されたポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質はベクターの導入時に細胞内で発現されることが好ましい。多様な遺伝子基質がプラスミド中に組み込まれ得る。プラスミドは多くの場合、標準的なクローニングベクター、例えば細菌マルチコピープラスミドである。基質同士は同じかまたは異なるプラスミド中に組み込まれ得る。多くの場合、選択可能なマーカーの異なる型を有するプラスミドの少なくとも２つの異なる型が用いられて、ベクターの少なくとも２つの型を含有する細胞の選択を可能にする。
典型的には、細菌または酵母細胞が、当分野において周知であるように下記ヌクレオチド配列のいずれか１種以上によって形質転換され得る。インビボ組み換えのためには、ゲノムまたは他の遺伝子と組換えられるべき遺伝子が、標準的な形質転換技術を用いてホストを形質転換するために用いられる。好適な態様においては、複製起点を提供するＤＮＡがコンストラクト中に包含される。複製起点は当業者によって好適に選択され得る。遺伝子の性質に応じて、それら自体で複製起点として作動可能である配列が遺伝子またはゲノムに既に存在する場合には、補足的な複製起点は要求されないこともある。
細菌または酵母細胞は、かかるＤＮＡが細胞内に導入されたときに、外来性または異種ＤＮＡによって形質転換され得る。形質転換ＤＮＡは統合され（integrated）、すなわち細胞のゲノム中に共有結合的に連結されてもよく、もしくは統合されなくてもよい。原核生物および酵母において、例えば、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントとして維持され得る。真核生物細胞に関して、安定にトランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションされたＤＮＡが、それが染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように染色体に統合されたものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団で構成される細胞株またはクローンを樹立する真核生物細胞の能力によって示される。
一般的に、導入されるＤＮＡは、ＤＮＡの受容者であるホストに元々内在してはいないが、所与のホストからＤＮＡセグメントを単離し、引き続いてそのＤＮＡの１種以上の追加のコピーを同じホストに導入して、例えば遺伝子産物の産生を増強するかまたは遺伝子の発現パターンを変更することは本開示の範囲内である。いくつかの場合には、導入されたＤＮＡは、内因性の遺伝子またはＤＮＡ配列を例えば相同組み換えまたは部位特異的変異導入によって改変するか、またはさらには置き換えるであろう。好適な組み換えホストは微生物、植物細胞、および植物を包含する。
本開示はまた、組み換えホストをも特徴とする。用語「組み換えホスト」は、「遺伝子改変ホスト細胞」または「トランスジェニック細胞」ともまた言われ、異種核酸を含むか、またはそのゲノムが少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列によって拡張されたホスト細胞を指す。本開示のホスト細胞は、上で概説されているようにポリヌクレオチドまたはベクターによって遺伝子改変され得る。
本開示の目的のために用いられ得るホスト細胞は、例えば、本開示のポリヌクレオチド分子を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、細菌人工染色体、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換され得る細菌（例えば大腸菌および枯草菌）などの原核生物細胞、例えば、本開示のポリヌクレオチド分子を含有する組み換え酵母発現ベクターによって形質転換され得る酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）およびピキア（Pichia））のような単純な真核生物細胞を包含するが、これに限定されない。本開示のポリヌクレオチドを導入するために用いられるホスト細胞およびそれぞれのベクターに応じて、ポリヌクレオチドは例えば染色体もしくはミトコンドリアＤＮＡに統合し得るか、または例えばエピソームに、のように染色体外に、維持され得るか、または一過性にのみ細胞内に含まれ得る。
特に遺伝子工学、および１種以上の遺伝子または遺伝子の集合クラスターを細胞に導入することを参照して本明細書において用いられる用語「細胞」または産生細胞は、いずれかの原核生物または真核生物細胞を言うと理解される。原核生物および真核生物ホスト細胞は両方とも本開示に従った使用を企図され、大腸菌もしくはバシラス種のような細菌ホスト細胞、Ｓ・セレビシエなどの酵母ホスト細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptora frugiperda）などの昆虫ホスト細胞、またはHeLaおよびJurkatなどのヒトホスト細胞を包含する。
具体的には、細胞は真核生物細胞、好ましくは真菌、哺乳類もしくは植物細胞、または原核生物細胞である。好適な真核細胞は、例えば限定なしに哺乳類細胞、酵母細胞、または（Sf9を包含する）昆虫細胞、（黒色素胞細胞を包含する）両生類細胞、または（カエノラブディティス・エレガンスを包含する）カエノラブディティスの細胞を包含する蠕虫細胞を包含する。好適な哺乳類細胞は、例えば限定なしに（Cos-1およびCos-7を包含する）COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、HEK293 T-RexTM細胞、または他のトランスフェクション可能な真核細胞株を包含する。好適な細菌細胞は限定なしに大腸菌を包含する。
好ましくは、大腸菌、バシラス、ストレプトミセス（Streptomyces）などの原核生物、またはHeLa細胞もしくはJurkat細胞のような哺乳類細胞、またはシロイヌナズナ（Arabidopsis）のような植物細胞が用いられ得る。
好ましくは、細胞はAspergillus sp.または真菌細胞であり、好ましくは、これは属サッカロミセス、カンジタ、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ハンゼヌラ（Hansenula）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、ヤロウィア（Yarrowia）、ピキア、およびアスペルギルス（Aspergillus）からなる群から選択され得る。
好ましくは、大腸菌ホスト細胞は、産業界および規制当局によって認識されている大腸菌ホスト細胞である（大腸菌 K12ホスト細胞または例に示されている大腸菌 BL21ホスト細胞を包含するが、これに限定されない）。
本開示で用いるための１つの好ましいホスト細胞は大腸菌であり、これは本明細書に記載されているように組み換え的に調製され得る。それゆえに、組み換えホストは組み換え大腸菌ホスト細胞であり得る。大腸菌について利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を増強するための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。サッカロミセスについて上で記載されているものと類似の方法が組み換え大腸菌微生物を作るために用いられ得る。
１つの態様において、組み換え大腸菌微生物は、（例えば、本明細書の表１０、１１、および１２のいずれか１つ以上に開示されているSHC遺伝子をコードするヌクレオチド配列、またはそのバリアント、ホモログ、変異体、誘導体、または断片を包含するが、これに限定されないその機能的同等物／相同物を含む。
好ましくは、組み換え大腸菌微生物は図５および２１に提供されているベクターコンストラクトを含む。
別の好ましい態様において、組み換え大腸菌微生物は、WT SHC／HACおよびWT SHC／HAC誘導体遺伝子をコードするヌクレオチド配列、または表１３、表１４、表１５、表１６、表１７、および／または表４ａのいずれか１つ以上に記されているそのバリアント、ホモログ、変異体、誘導体、もしくは断片を包含するがこれに限定されないその機能的同等物／相同物を含む。
本開示に使用するための別の好ましいホスト細胞はＳ・セレビシエであり、これは合成生物学においてシャシー生物として広く用いられている。それゆえに、組み換えホストはＳ・セレビシエであり得る。Ｓ・セレビシエについて利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を増強するための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。組み換えＳ・セレビシエ微生物を作るための方法は公知である。
細胞の培養は従来の様式で実施される。培養培地は炭素源、少なくとも１つの窒素源、および無機塩を含有し、ビタミンがそれに追加される。この培地の構成成分は、当の微生物種を培養するために従来用いられているものであり得る。
本方法への使用の炭素源は、組み換えホスト細胞によって代謝されて増殖および／または（－）－アンブロックスの産生を促進し得るあらゆる分子を包含する。好適な炭素源の例は、（例えばモラセス中に見いだされる）スクロース、フルクトース、キシロース、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオース、または他のグルコース含有ポリマーを包含するが、これに限定されない。
ホストとして酵母を採用する態様においては、例えばスクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースなどの炭素源が好適である。炭素源は培養期間に渡ってホスト生物に提供され得るか、または代替的には、生物は別のエネルギー源、例えば蛋白質の存在下においてある期間増殖させられ、それから流加相（fed-batch phase）の間のみ炭素源を提供され得る。
本開示の方法において使用するための組み換えホスト細胞微生物の好適性は、周知の方法を用いる単純な試験手順によって決定され得る。例えば、試験されるべき微生物は、微生物の増殖のために一般的に用いられるｐＨ、温度、および通気条件において富栄養培地（例えば、ＬＢ培地、バクトトリプトン酵母エキス培地、栄養培地等）で増殖させられ得る。ひとたび生物変換の所望の生成物を産生する組み換え微生物（すなわち組み換えホスト細胞）が選択されれば、生成物は、典型的には産生ホスト細胞株によって大スケールで、好適な発現システムおよび発酵によって、例えば細胞培養物中の微生物産生によって産生される。
本開示の１つの態様においては、Ｍ９Ａなどの限定最少培地が細胞培養に用いられる。
Ｍ９Ａ培地の構成成分は、１４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１６ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ｌのクエン酸Ｎａ３．２Ｈ２Ｏ、７．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌのグルコース、および１．２５ｇ／ｌの酵母エキストラクトを含む）。
本開示の別の態様においては、ＬＢなどの富栄養培地が用いられた。ＬＢ培地の構成成分は１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキストラクト、５ｇ／ｌのＮａＣｌを含む。
ミネラル培地およびＭ９ミネラル培地の他の例は例えばUS6524831B2およびUS2003/0092143A1に開示されている。
組み換え微生物は、バッチ（batch）、流加（fed batch）、もしくは連続プロセス、またはその組み合わせによって増殖させることができる。典型的には、組み換え微生物は発酵槽（fermentor）内で定められた温度（単数または複数）で好適な栄養源、例えば炭素源の存在下において所望の期間増殖させ、ホモファルネソールをアンブロックスに生物変換するためおよび（－）－アンブロックスを包含するアンブロックスの所望の量を産生するために十分な酵素を産生する。
組み換えホスト細胞はいずれかの好適な様式で、例えばバッチ培養または流加培養によって培養され得る。
本明細書において用いられる用語「バッチ培養」は、培養培地が培養の間に追加も取り出しもされない培養方法である。
本明細書において用いられる用語「流加」は、培養培地が培養の間に追加されるが、培養培地は取り出されない培養方法を意味する。
本開示の１つの態様は、細胞系システムにおいてアンブロックスを産生する方法を提供し、WT SHCまたはSHC／HAC誘導体を好適な条件下において細胞系システムにおいて発現することと、ホモファルネソールを細胞系システムに供給する（feed）ことと、細胞系システムを用いて産生されたSHCまたはSHC／HAC誘導体を用いてホモファルネソールをアンブロックスに変換することと、細胞系システムからアンブロックスを集めることと、任意にシステムから（－）－アンブロックス材料を単離することとを含む。他のヌクレオチド配列の発現は、方法を増強するために役立つ。生物変換方法は、細胞系システムによる他のヌクレオチド配列の追加の発現を包含し得る。他のヌクレオチド配列の発現は（－）－アンブロックスを作るための生物変換経路を増強し得る。
本開示のさらなる態様は、（－）－アンブロックスを作る生物変換方法であり、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体遺伝子を含むホスト細胞を増殖させることと、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体をホスト細胞において産生することと、ホモファルネソール（例えばＥＥＨ）をホスト細胞に供給することと、ホモファルネソールからアンブロックスへの変換を促進するために好適なｐＨ、温度、および可溶化剤の条件下においてホスト細胞をインキュベーションすることと、（－）－アンブロックスを集めることとを含む。ホスト細胞によるWT SHC／HACおよび／またはSHC／HAC誘導体の産生は、ホモファルネソールが好適な反応条件下においてホスト細胞に追加されたときに（－）－アンブロックスを作る方法を提供する。達成される変換は、より多くの生体触媒およびＳＤＳを反応混合物に追加することによって増強され得る。
組み換えホスト細胞微生物は、引き続く生物変換ステップのためのWT SHCまたはSHC／HAC誘導体を発現する好適な量の細胞を提供するためにいくつものやり方で培養され得る。生物変換ステップのための適用可能な微生物は大幅に変わるので（例えば酵母、細菌、および真菌）、当然のことながら、培養条件はそれぞれの種の特定の要件に合わせて調整され、それらの条件は周知であり文書化されている。組み換えホスト細胞微生物の細胞を増殖させるための当分野において公知の方法のいずれかが、本開示の引き続く生物変換ステップに利用可能な細胞を産生するために用いられ得る。典型的には、細胞は、生物変換反応のための十分なバイオマスを産生するために特定の密度（光学密度（ＯＤ）として測定可能）まで増殖させる。
選ばれる培養条件は得られる細胞（バイオマス）の量に影響するのみならず、培養条件の質もまたどのようにバイオマスが生体触媒になるかに影響する。WT SHCまたはSHC／HAC誘導体遺伝子を発現しWT SHCまたはSHC／HAC誘導体酵素を産生する組み換えホスト細胞微生物は、生物変換反応への使用に好適である生体触媒と呼ばれる。いくつかの態様において、生体触媒は、WT SHCもしくはSHC／HAC誘導体を産生する組み換え全細胞であるか、またはそれは懸濁液もしくは固定されたフォーマットであり得る。他の態様において、生体触媒は、（例えばSeitz et al 2012 - 同上に開示されている）WT SHCまたはSHC／HAC誘導体を産生する組み換え全細胞から調製された膜画分または液体画分である。
WT SHCまたはSHC／HAC誘導体を産生する組み換え全細胞は、発酵槽から（生物変換反応のために）集められた全細胞または発酵槽内の細胞（これは次いでワンポット反応に用いられる）を包含する。WT SHCまたはSHC／HAC誘導体を産生する組み換え全細胞は無傷の組み換え全細胞および／または細胞片（debris）を包含し得る。いずれにせよ、WT SHCまたはSHC／HAC誘導体は基質（例えばホモファルネソール）を受け取るおよび／またはそれと相互作用するために何らかのやり方で（細胞膜などの）膜と結びついており、（細胞膜などの）この膜は全細胞（例えば、組み換え全細胞）の一部であるかまたは全細胞を含み得る。WT SHCまたはSHC／HAC誘導体は、WT SHCまたはSHC／HAC誘導体が基質（例えばホモファルネソール）と相互作用することを可能にする固定された形態であってもよく（例えば、酵素キャリアと結びつけられる）。WT SHCまたはSHC／HAC誘導体は、可溶性形態で用いられてもよい。
１つの態様においては、生体触媒は、（十分なバイオマスを作り出すために）十分量で産生され、収穫され、生物変換ステップの前に洗浄される（かつ、任意に保存される（例えば凍結または凍結乾燥される））。
さらなる態様においては、細胞は（十分な生体触媒を作り出すために）十分量で産生され、次いで反応条件が調整され、生物変換反応のために生体触媒を収穫および洗浄する必要はない。このワンステップ（または「ワンポット」）方法は、それがコストを減じながらプロセスを単純化するので有利である。細胞を増殖させるために用いられる培養培地は、反応条件が生物変換反応を促進するように調整されている場合には、生物変換反応への使用にもまた好適である。
細胞を増殖させるための至適ｐＨは６．０～７．０の範囲内である。生物変換反応の至適ｐＨは生物変換反応に用いられるSHC／HAC酵素の型に依存する。ｐＨは当業者に周知である技術を用いて制御される。
例９が示しているように、１００％の変換率でホモファルネソールを（－）－アンブロックスに生物変換するよう「ワンポット」方法が用いられている。例１８が示しているように、９９％の変換率でホモファルネソールを（－）－アンブロックスに生物変換するよう「ワンポット」方法が用いられている。
本明細書において用いられる、本明細書におけるホモファルネソール基質から（－）－アンブロックスへの９９％／１００％変換率へのあらゆる言及は、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素を用いて（－）－アンブロックスへの変換が可能なホモファルネソール異性体（すなわちＥＥＨ）の９９％／１００％の変換への言及である。
用語「混合物」または「反応混合物」は、（特にそれが「ワンポット」反応に関する際に）本開示において用語「培地」と交換可能に用いられ得る一方で、十分なバイオマスを作り出すために細胞を増殖させることは細胞培養／発酵培地を要求するが、培地は生物変換ステップには要求されないということに注意すべきである。なぜなら、好適なｐＨの反応緩衝液で十分であろうからである。
本開示の生物変換方法は、ホモファルネソール原料ストックから（－）－アンブロックスへの変換をもたらすための時間、温度、ｐＨ、および可溶化剤の条件下において行われる。反応混合物のｐＨは、SHC／HAC誘導体酵素では４～８、好ましくは５から６．５、より好ましくは４．８～６．０の範囲内、WT SHC酵素では約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０の範囲内であってもよく、反応混合物への緩衝液の追加によって維持され得る。この目的のための例示的な緩衝液はクエン酸緩衝液である。好ましい温度は約１５℃および約４５℃の間、好ましくは約２０℃および約４０℃の間であるが、これは好熱性生物では、特に好熱性微生物からのＷＴ酵素（例えばWT SHC／HAC）が用いられる場合にはより高く、最大で５５℃であり得る。温度は生物変換プロセスの間は一定に保たれてもよく、または変更されてもよい。
出願人は、可溶化剤（例えば界面活性剤、洗剤、可溶性増強剤、水混和性有機溶媒等）を生物変換反応中に包含することが有用であり得るということを示している。本明細書において用いられる用語「界面活性剤」は、２つの液体間のまたは液体および固体の間の表面張力（または界面張力）を低下させる構成成分を意味する。界面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、起泡剤、および分散剤として作用し得る。界面活性剤の例は、Triton X-100、Tween 80、タウロデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および／またはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を包含するが、これに限定されない。
Triton X-100はWT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素を（可溶性または膜画分／懸濁液形態で）部分的に精製するために用いられ得る一方で、これは生物変換反応にもまた用いられ得る（例えば、Seitz (2012 ＰｈＤ学位論文、同上)の開示およびNeumann and Simon (1986 - 同上)の開示およびJP2009060799参照。
しかしながら、驚くべきことに、例１４が示しているように、出願人は、他のより有用でない可溶化剤の長いリストから、特に有用な可溶化剤としてＳＤＳを選択および同定した。特に、出願人は、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換反応（ＥＥＨが４ｇ／ｌおよび１２５ｇ／ｌで用いられるとき両方）の反応速度および収率の観点から、例えばTriton X-100よりも顕著に優れた可溶化剤としてＳＤＳを同定した。例１２の比較データによって示されているように、出願人は、少なくとも１つのSHC／HAC誘導体酵素について、反応中に（約０．００５％から０．４８％の濃度範囲の）Triton X-100を用いたホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの最高の生物変換活性は、（約０．０７％の濃度の）ＳＤＳで得られる活性のおよそ２０％に過ぎないということを示した。
理論によって拘束されることを望むものではないが、組み換え微生物ホスト細胞へのＳＤＳの使用は、ＳＤＳがSHC酵素（これは膜結合酵素である）をホモファルネソール基質に対してよりアクセス可能にするためにホスト細胞膜と有利に相互作用し得るので有利であり得る。加えて、反応混合物中への好適なレベルのＳＤＳの包含は、エマルジョン（水中のホモファルネソール）の特性を改善し、および／またはホスト細胞内のSHC酵素へのホモファルネソール基質のアクセスを改善し得る一方で、同時に破壊（例えば、SHC（WTまたはSHC／HAC誘導体）酵素の変性）を防ぐ。
生物変換反応に用いられる可溶化剤（例えばＳＤＳ）の濃度は、バイオマス量および基質（ＥＥＨ）濃度によって影響される。すなわち、可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度、バイオマス量、および基質（ＥＥＨ）濃度の間にはある程度の相互依存性がある。例として、ホモファルネソール基質の濃度が増大すると、効率的な生物変換反応が起こるために十分量の生体触媒および可溶化剤（例えばＳＤＳ）が要求される。例えば可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度が低すぎる場合には、準至適な（suboptimal）ホモファルネソール変換が観察され得る。他方で、例えば可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度が高すぎる場合には、生体触媒が無傷の微生物細胞の破壊および／またはSHC／HAC酵素の変性／不活性化どちらかによって影響されるというリスクが存在し得る。
バイオマス量および基質（ＥＥＨ）濃度の内容におけるＳＤＳの好適な濃度の選択は当業者の知識の範囲内である。例として、好適なＳＤＳ、基質（ＥＥＨ）、およびバイオマス濃度を決定するための予測モデルが当業者に利用可能である。さらなる例として、例３は、４ｇ／ｌのＥＥＨおよび１０．０のＯＤ（６５０ｎｍ）の生体触媒が用いられるときに、０．０１０～０．０７５％の範囲内のＳＤＳが適切であるということを示している。例７は、１２５ｇ／ｌのＥＥＨが２×バイオマスの湿重量で用いられるときに、調整されたＳＤＳ濃度（１．５５％）が適切であるということを示している。しかしながら、異なるＳＤＳ／細胞比の値を用いる（－）－アンブロックスへのＥＥＨ変換パーセントの検討は、生体触媒、ホモファルネソール基質、および可溶化剤（例えばＳＤＳ）の比の正しい選択が、着実な生物変換反応システムの開発を促進するということを示しており、これはＳＤＳ濃度（例えば図１７参照）およびｐＨ範囲（例１５、図１８参照）のある範囲に対してある程度の許容性を示す。
WT SHC酵素（例えばAacSHC）の生物変換反応の温度は約４５～６０℃、好ましくは５５℃である。
WT SHC酵素（例えばAacSHC）の生物変換反応のｐＨ範囲は約５．０から７．０、より好ましくは約５．６から約６．２、さらにはより好ましくは約６．０である。
SHC／HAC誘導体酵素の生物変換反応の温度は約３４℃から約５０℃、好ましくは約３５℃である。
SHC／HAC誘導体酵素の生物変換反応のｐＨは約４．８～６．４、好ましくは約５．２～６．０である。
好ましくは、生物変換反応に用いられる可溶化剤はＳＤＳである。
WT SHC酵素（例えばAacSHC）の生物変換反応に用いられるＳＤＳ濃度は、約４ｇ／ｌのＥＥＨが用いられるときに約０．０１０～０．０７５％の範囲内、好ましくは約０．０３０％である。
SHC／HAC誘導体酵素の生物変換反応に用いられるＳＤＳ濃度は、約４ｇ／ｌのＥＥＨが用いられるときに約０．００２５～０．０９０％の範囲内、好ましくは約０．０５０％である。
生体触媒は、ホモファルネソールが約４ｇ／ｌのＥＥＨのＥＥＨ濃度で反応に投入されるときに、１０．０のＯＤ（６５０ｎｍ）で反応に投入される。
［ＳＤＳ］／［細胞］比は、生体触媒対ＥＥＨホモファルネソールの比が約２：１であるときに、約１０：１～２０：１の範囲内、好ましくは約１５：１～１８：１、好ましくは約１６：１である
SHCバリアント酵素の生物変換反応におけるＳＤＳ濃度は、ホモファルネソール濃度が約１２５ｇ／ｌのＥＥＨであり、生体触媒濃度が２５０ｇ／ｌである（約１７５のＯＤ（６５０ｎｍ）に対応する）ときに、約１～２％の範囲内、好ましくは約１．４～１．７％の範囲内、さらにはより好ましくは約１．５％である。
生体触媒対ＥＥＨホモファルネソール基質の比は約０．５：１～２：１の範囲内、いくつかの態様においては２：１、好ましくは約１：１または０．５：１である。
いくつかの態様において、アンブロックスは生体触媒を用いて産生され、それにホモファルネソール基質が追加される。公知の手段（例えばペリスタポンプ、注入シリンジ等）を用いて供給することによって基質を追加することが可能である。ホモファルネソールは油可溶性化合物であり、油フォーマットで提供される。生体触媒（無傷の組み換え全細胞などの微生物細胞および／または細胞片および／または固定された酵素）が水相に存在するということに鑑みて、生物変換反応は、ホモファルネソールが生物変換反応混合物に追加されるときに（水相、固相、および油相を含む）３相システムと見なすことができる。これはＳＤＳが存在するときでさえも当てはまる。明瞭化のために、可溶性のWT SHCまたはSHC／HAC誘導体が生体触媒として用いられるときには、これは２相システムと考えられる。
存在するホモファルネソール異性体の数は反応のスピードに影響し得る。例１１が示しているように、SHC／HAC誘導体酵素はホモファルネソール異性体の複雑な混合物（例えばＥＥ：ＥＺ：ＺＥ：ＺＺ）からＥ，Ｅ－ホモファルネソールを（－）－アンブロックスに生物変換することが可能である。しかしながら、より低い変換率が典型的には観察され、これは、ＥＥＨ以外のホモファルネソール異性体がSHC／HAC誘導体酵素へのアクセスについてＥＥＨと競合することがあり、それゆえにＥＥＨから（－）－アンブロックスへの変換の競合阻害剤として作用し得るおよび／または代替的な基質としてもまた作用し得るという見解と一致している。
従って、好ましくは、ホモファルネソール基質は２～４種の異性体、好ましくは２種の異性体の立体異性体混合物を含む。
従って、好ましくは、ホモファルネソール基質は２～４種の異性体、好ましくは２種の異性体の立体異性体混合物からなるかまたは本質的にそれからなる。
好ましくは、ホモファルネソール基質はＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
好ましくは、ホモファルネソール基質はＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物からなるかまたは本質的にそれからなる。
例９が示しているように、８７：１３の重量比のＥＥ：ＥＺの１００％の変換が、「ワンポット」発酵および２２．５日の期間行われた生物変換反応において観察された。約１０ｇのＥＥＨがこの期間に変換された。
例７に詳細に記載されているように、好ましい態様においては、発酵槽を用いて、SHC／HAC誘導体遺伝子を発現しかつ活性なSHC／HAC誘導体酵素を産生する組み換えホスト細胞を、生体触媒としての使用にとって好適な十分なバイオマス濃度まで、ホモファルネソール源を副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ、例えば図１２に開示されている）の１種以上との混合物として（－）－アンブロックスに変換するために用いられる同じ発酵槽容器内で増殖させる。得られた（－）－アンブロックスは、蒸気抽出／蒸留または非水混和性溶媒を用いる有機溶媒抽出（水相に留まる生体触媒から反応生成物および未反応の基質を分離するため）、次に続く溶媒の蒸発によって単離されてもよく、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって決定される粗反応生成物を得る。蒸気抽出／蒸留および有機溶媒抽出方法は当業者に公知である。
例として、得られた（－）－アンブロックスは、非水混和性溶媒（例えばトルエン）などの有機溶媒を用いて全反応混合物から抽出され得る。代替的には、得られた（－）－アンブロックスは、水混和性溶媒（例えばエタノール）または非水混和性溶媒（例えばトルエン）を用いて反応混合物の固相（例えば遠心または濾過によって得られる）から抽出され得る。さらなる例として、（－）－アンブロックスは結晶としてまたは非晶質形態で固相に存在し、残りの固相（細胞材料またはその破片）からおよび濾過の手段によって液相からもまた分離され得る。さらなる例として、（－）－アンブロックスの融点（大体７５℃）よりも上の温度において、（－）－アンブロックスは水相の上に油層を形成することがあり、この油層は取り除かれ、集めることができる。油層が取り除かれた後の（－）－アンブロックスの完全な回収を保証するために、バイオマス中またはその上またはその周りに含有されるいずれかの残留（－）－アンブロックスを抽出するために、有機溶媒がバイオマスを含有する水相に追加され得る。有機層は、（－）－アンブロックスを単離および精製するために全部がさらに処理される前に油層と組み合わせることができる。
（－）－アンブロックスはさらに選択的に結晶化されて、副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）、ならびに何らかの未反応のホモファルネソール基質は最終的な（－）－アンブロックス生成物から取り除かれてもよい。用語「選択的結晶化」は、それによって（－）－アンブロックスが溶媒からの結晶化が生じる一方で、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）は、単離された結晶材料が（－）－アンブロックス生成物のみを含有するか、またはそれが他の化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）のいずれかを含有する場合には、それらは嗅覚的に許容可能な量でしか存在しない程度まで、結晶化溶媒中に溶解したままであるプロセスステップを言う。
選択的結晶化ステップは水混和性溶媒、例えばエタノール等を用い得る。最終的な（－）－アンブロックス生成物の嗅覚的純度は、水中の１０％エタノール抽出物を用いてまたは結晶材料を試験することによって決定される。最終的な（－）－アンブロックス生成物はその嗅覚的純度、質、およびその知覚的プロファイルについて（－）－アンブロックス生成物の市販の参照と対比して試験される。（－）－アンブロックス材料は、材料がその知覚刺激プロファイルに関して規格を満たすかどうかを決定するために専門家による適用研究においてもまた試験される。（－）－アンブロックスの種々の適用は、ファインフレグランスまたは消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および清掃製品を包含するが、これに限定されず、現在利用可能なアンブロックス成分が商業的に用いられている全ての製品を本質的に包含し、アンブロックス（Firmenich）、アンブロキサン（Henkel）、Ambrofix（Givaudan）、Amberlyn（Quest）、Cetalox Laevo（Firmenich）、Ambermor（Aromor）、およびNorambrenolide Ether（Pacific）製品を包含するが、これに限定されない。
（－）－アンブロックスの選択的結晶化は、未反応のホモファルネソール基質の存在、ならびに（－）－アンブロックス対他の検出可能な副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および／または（ＩＶ）の比によってもまた影響され得る。（例７においてWT SHC／HAC酵素を用いて示されているように）ホモファルネソール基質から（－）－アンブロックスへの１０％の変換しか得られない場合でさえも、（－）－アンブロックスの選択的結晶化はなお可能である。
（－）－アンブロックスの抽出および／または選択的結晶化への使用に適する好適な水混和性および非水混和性有機溶媒の例は、脂肪族炭素水素、好ましくは５から８つの炭素原子を有するもの、例えばペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、またはシクロオクタン、ハロゲン化脂肪族炭素水素、好ましくは１つまたは２つの炭素原子を有するもの、例えばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、またはテトラクロロエタン、芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、またはジクロロベンゼン、脂肪族の非環式および環式エーテルもしくはアルコール、好ましくは４から８つの炭素原子を有するもの、例えばエタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、またはエステル、例えば酢酸エチルもしくは酢酸ｎ－ブチル、またはケトン、例えばメチルイソブチルケトン、またはジオキサン、あるいはそれらの混合物を包含するが、これに限定されない。特に好ましく用いられる溶媒は、上述のヘプタン、（ＭＴＢＥ、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、三級ブチルメチルエーテル、およびｔＢＭＥとしてもまた知られている）メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、および／またはその混合物である。
好ましくは、エタノールなどの水混和性溶媒が反応混合物の固相からの（－）－アンブロックスの抽出に用いられる。エタノールの使用は、それが取り扱いが容易であり、それが非毒性であり、それが環境親和性であるので有利である。
本明細書において用いられる用語「単離された」は、それに付随する構成成分から分離または精製された（－）－アンブロックスなどの生物変換生成物を言う。それが天然に起源とするソースとは異なる細胞系システムによって産生される存在物は「単離」されている。なぜならそれは、それに天然に付随する構成成分を必然的に含まないであろうからである。単離または純度の程度は、いずれかの適切な方法、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ＨＰＬＣ、またはＮＭＲ分析によって測定され得る。
いくつかの態様において、最終生成物（（－）－アンブロックス）は均質（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、もしくは８９．５％純粋、または９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％純粋）になるまで単離および精製される。
望ましくは、産生される（－）－アンブロックスの量は、約１ｍｇ／ｌから約２０，０００ｍｇ／ｌ（２０ｇ／ｌ）以上、例えば約２０ｇ／ｌから約２００ｇ／ｌまたは１００～２００ｇ／ｌ、好ましくは約１２５ｇ／ｌまたは１５０ｇ／ｌまたは約１８８ｇ／ｌであり得る。
例７が示しているように、少なくとも１２５ｇ／ｌの（－）－アンブロックスが、約２日に渡ってSHC／HAC誘導体酵素を産生する組み換え大腸菌ホスト細胞を用いる生物変換反応によって産生される。
例１９が示しているように、効率的な混合が達成される場合には、１８８ｇ／ｌのＥＥＨ以上で生物変換を実施することが可能である。なぜなら、撹拌効率はシステムの唯一の限定であるように見えるからである。加えて、（例えば、さらに改善された活性を有するSHCバリアントの観点から、または増大したSHC酵素産生の観点から）改善された活性を有する生体触媒は、より少ないバイオマスを用いて生産性を改善または維持することができ、これは混合効率に関して有利である。
例えば、（－）－アンブロックスの約１から約１００ｍｇ／ｌ、約３０から約１００ｍｇ／ｌ、約５０から約２００ｍｇ／ｌ、約１００から約５００ｍｇ／ｌ、約１００から約１，０００ｍｇ／ｌ、約２５０から約５，０００ｍｇ／ｌ、約１，０００（１ｇ／ｌ）から約１５，０００ｍｇ／ｌ（１５ｇ／ｌ）、または約２，０００（２ｇ／ｌ）から約１０，０００ｍｇ／ｌ（１０ｇ／ｌ）または約２，０００（２ｇ／ｌ）から約２５，０００ｍｇ／ｌ（２５ｇ／ｌ）または約２，０００（２ｇ／ｌ）から約２５，０００ｍｇ／ｌ（２５ｇ／ｌ）、２６，０００ｍｇ／ｌ（２６ｇ／ｌ）、２７，０００ｍｇ／ｌ（２７ｇ／ｌ）、２８，０００ｍｇ／ｌ（２８ｇ／ｌ）、２９，０００ｍｇ／ｌ（２９ｇ／ｌ）、３０，０００ｍｇ／ｌ（３０ｇ／ｌ）、４０ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌ、６０ｇ／ｌ、７０ｇ／ｌ、８０ｇ／ｌ、９０ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌ、１１０ｇ／ｌ、１２０ｇ／ｌ、１２５ｇ／ｌ、１３０ｇ／ｌ、１４０ｇ／ｌ、１５０ｇ／ｌ、１６０ｇ／ｌ、１７０ｇ／ｌ、１８０ｇ／ｌ、１９０ｇ／ｌ、または２００ｇ／ｌまたは３００ｇ／ｌまたは４００ｇ／ｌまたは５００ｇ／ｌが産生される。
好ましくは、少なくとも１００ｇ／ｌの濃度の（－）－アンブロックスが４８から７２時間の期間内に産生される。
好ましくは、約１５０ｇ／ｌの濃度の（－）－アンブロックスが約４８から７２時間の期間内に産生される。
好ましくは、約２００ｇ／ｌの濃度の（－）－アンブロックスが約４８から７２時間の期間内に産生される。
好ましくは、約２５０ｇ／ｌの濃度の（－）－アンブロックスが約４８から７２時間の期間内に産生される。
当業者は、より高い累積産生力価が、連続的なプロセス、例えば生成物を取り除き、基質原料、およびバイオマス追加または（部分的な）置き換えを実行することによって達成され得るということを理解するであろう。
好ましくは、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体を含む組み換えホスト細胞の存在下におけるＥＥＨから（－）－アンブロックスへの生物変換は、ｍｏｌパーセントで与えられかつ採用されるＥＥＨのｍｏｌに基づく５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００のアンブロックス収率を生み出す。特に好ましくは、収率は５および１００、１０および１００、および１００、２５および１００、３０および１００、３５および１００の間、特に４０および１００、４５および１００、５０および１００、６０および１００、７０および１００ｍｏｌパーセントの間である。
SHC／HAC酵素の活性は、ｍｏｌパーセントの反応速度（生成物の量／（生成物の量＋残りの出発材料の量））×１００）によって定義される。好ましくは、WT SHCまたはSHC／HAC誘導体酵素の存在下におけるＥＥＨから（－）－アンブロックスへの生物変換は、ｍｏｌパーセントで与えられかつ採用されるＥＥＨのｍｏｌに基づく５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００の（－）－アンブロックス収率を産生する。特に好ましくは、収率は５および１００、１０および１００、２０および１００、２５および１００、３０および１００、３５および１００の間、特に４０および１００、４５および１００、５０および１００、６０および１００、７０および１００の間である。
本発明の好ましい態様において、収率および／または反応速度は、例えば４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、３６、または４８時間という定められた期間に渡って決定され、その間にＥＥＨは本開示に従ってWT SHCまたはSHC／HAC誘導体酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えホスト細胞によって（－）－アンブロックスに変換される。さらなるバリアントにおいて、反応は例えば２５℃、３０℃、４０℃、５０℃、または６０℃という細かく定められた条件下において行われる。特に、収率および／または反応速度は、２４～７２時間の期間に渡って３５℃で本発明に従ってSHC／HAC誘導体酵素によりＥＥＨを（－）－アンブロックスに変換する反応を行うことによって決定される。
本発明のさらなる態様において、SHC／HAC誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えホスト細胞は、それが、同じ条件下におけるWT SHCまたはSHC／HAC誘導体酵素と比較して、（－）－アンブロックスを与えるためのホモファルネソールの反応において２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、５００、１０００倍以上の収率および／または反応速度を示すということを特徴とする。ここで、用語条件は、基質濃度、酵素濃度、反応期間、および／または温度などの反応条件に関する。
WT／参照SHCまたはSHC／HAC誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む大腸菌の組み換え株によってホモファルネソールから（－）－アンブロックスを作るための生物変換プロセスの所望の開発は、（－）－アンブロックス産生のための低いコストおよび産業的に経済的なプロセスを提供し得る。
例７が示しているように、本開示は、最適化したSHC／HAC誘導体とのインキュベーションの４８時間後に、Ｅ，Ｅ－ホモファルネソール（１２５ｇ／ｌ）から（－）－アンブロックスへの１００％の変換をもたらし、WT AacSHC酵素と比較してAacSHC誘導体が用いられるときには収率において８倍の改善がある（図１１参照）。
本明細書に記載されるWT参照SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体ポリペプチドの機能的ホモログもまた、組み換えホストによってアンブロックスを産生することへの使用に好適である。それゆえに、組み換えホストは、上記に記載されるポリペプチドの機能的ホモログをコードする１種以上の異種核酸（単数または複数）および／または本明細書に記載されるSHC／HAC誘導体酵素をコードする異種核酸を包含し得る。
機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対する配列類似性を有しかつ参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（単数または複数）の１種以上を有するポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは天然の存在するポリペプチドであってもよく、配列類似性は収束または分岐進化イベントを原因とし得る。そこで、機能的ホモログは場合によっては文献中でホモログまたはオーソログまたはパラログと呼称される。天然に存在する機能的ホモログのバリアント、例えば野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドは、それら自体が機能的ホモログであり得る。機能的ホモログはまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異導入によってまたは異なる天然に存在するポリペプチド同士のコード配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によっても作り出され得る。本明細書に記載される機能的ホモログをコードする遺伝子を改変するための技術は公知であり、とりわけ、進化工学技術、部位特異的変異導入技術、およびランダム変異導入技術を包含し、ポリペプチドの特異的活性を増大させるか、基質特異性を変更するか、発現レベルを変更するか、細胞内の位置を変更するか、または所望の様式でポリペプチド：ポリペプチド相互作用を改変するために有用であり得る。かかる改変されたポリペプチドは機能的ホモログと考えられる。用語「機能的ホモログ」は、場合によっては、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
機能的ホモログはヌクレオチドおよびポリペプチド配列アラインメントの分析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベース上でクエリー（query）を実施することは、SHC誘導体ポリペプチド等をコードする核酸配列のホモログを同定し得る。
ハイブリダイゼーションもまた、機能的ホモログを同定するためにおよび／または２つの核酸配列の間の相同性の測定として用いられ得る。本明細書において開示される蛋白質のいずれかをコードする核酸配列またはその部分が、ハイブリダイゼーションプローブとして標準的なハイブリダイゼーション技術に従って用いられ得る。試験ソース（例えば哺乳類細胞）からのＤＮＡまたはＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションは、試験ソース中の関連するＤＮＡまたはＲＮＡの存在の指標である。ハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991に見いだされ得る。穏やかなハイブリダイゼーション条件は、３０℃の２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次に５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄と同等のものとして定義される。高度に厳しい条件は、４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次に６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄と同等のものとして定義される。
機能的ホモログを同定するための配列分析は、関連するアミノ酸配列を参照配列として用いる必須の（non-redundant）データベースのBLAST、Reciprocal BLAST、またはPSI-BLAST分析をもまた包含し得る。アミノ酸配列はいくつかの場合にはヌクレオチド配列から推定される。４０％超の配列同一性を有するデータベース中のポリペプチドは、SHC／HAC生物変換反応への使用にとっての適性についてのさらなる評価の候補である。アミノ酸配列類似性は、保存的なアミノ酸置換、例えば１つの疎水性残基による別のものの置換または１つの極性残基による別のものの置換を可能にする。望ましい場合には、かかる候補のマニュアル検査が、さらに評価されるべき候補の数を絞り込むために行われ得る。マニュアル検査は、例えば保存された機能ドメインを有するように見える候補を選択することによって実施され得る。
典型的には、少なくとも約３０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが、保存された領域を同定するために有用である。近縁のポリペプチドの保存された領域同士は、少なくとも３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％のアミノ酸配列同一性を示す。いくつかの態様において、保存された領域は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を示す。配列同一性は、上および下で示されているように決定され得る。
産生されるWT SHCおよび／またはSHC／HAC誘導体は、アミノ酸配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３もしくは配列番号４、またはそのバリアント、ホモログ、変異体、誘導体、もしくは断片に基づく。
産生されるSHCは、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４との少なくとも３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列に基づく。
加えて、産生される参照SHCは大腸菌から産生されるアミノ酸配列に基づく。
「同一性パーセント（％）」は、遺伝子のヌクレオチド配列に関して、配列をアラインメントし必要な場合にはギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後に、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドと同一である候補ＤＮＡ配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義され、配列同一性の一部としてのいずれかの保存的な置換は考慮しない。ヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば公に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当分野の技能の範囲内である種々の方法で達成することができる。当業者は、比較されるべき配列同士の全長に渡って最高のアラインメントを達成するために必要とされるいずれかのアルゴリズムを包含する、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
用語「ポリペプチド」および「蛋白質」は本明細書において交換可能に用いられ、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、いずれかのペプチドによって連結されたアミノ酸鎖を意味する。
本明細書において用いられる用語「誘導体」はバリアントを包含するが、これに限定されない。用語「誘導体」および「バリアント」は本明細書において交換可能に用いられる。
本明細書において用いられる用語「バリアント」は、それからそれが由来するポリペプチドと比較して、アミノ酸配列の１つ以上の変化だけ異なるポリペプチドとして理解されるべきである。それからバリアントが由来するポリペプチドは親のまたは参照のポリペプチドとしてもまた公知である。典型的には、バリアントは人為的に、好ましくは遺伝子テクノロジー手段によって構築される。典型的には、それからバリアントが由来するポリペプチドは野生型蛋白質または野生型蛋白質ドメインである。しかしながら、本開示に使用可能なバリアントは、親のポリペプチドのホモログ、オーソログ、もしくはパラログから、またはバリアントが親のポリペプチドの少なくとも１種の生物学的活性を示す場合には、人為的に構築されたバリアントからもまた由来し得る。アミノ酸配列の変化はアミノ酸交換、挿入、欠失、Ｎ末端短縮、もしくはＣ末端短縮、またはそれらの変化のいずれかの組み合わせであってもよく、これは１つまたはいくつかの部位において起こり得る。
好ましい態様において、本開示に使用可能なバリアントは、アミノ酸配列中の変化（すなわち交換、挿入、欠失、Ｎ末端短縮、および／またはＣ末端短縮）の最大で２００（最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００）という合計数を示す。アミノ酸交換は保存的および／または非保存的であり得る。好ましい態様において、本開示に使用可能なバリアントは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のアミノ酸交換、好ましくは保存的なアミノ酸変化だけ、それからそれが由来する蛋白質またはドメインと異なる。バリアントは、加えてまたは代替的にアミノ酸の欠失を含んでもよく、これはＮ末端短縮、Ｃ末端短縮、もしくは内部欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。Ｎ末端短縮、Ｃ末端短縮、および／または内部欠失を含むかかるバリアントは本願の文脈において「欠失バリアント」または「断片」と言われる。用語「欠失バリアント」および「断片」は本明細書において交換可能に用いられる。欠失バリアントは天然に存在し得るか（例えばスプライスバリアント）、またはそれは人為的に、好ましくは遺伝子テクノロジー手段によって構築され得る。典型的には、それから欠失バリアントが由来する蛋白質または蛋白質ドメインは野生型蛋白質である。しかしながら、本開示の欠失バリアントは、親のポリペプチドのホモログ、オーソログ、もしくはパラログから由来してもよく、または欠失バリアントが親ポリペプチドの少なくとも１種の生物学的活性を示す場合には人為的に構築されたバリアントからもまた由来し得る。好ましくは、欠失バリアント（または断片）は、親ポリペプチドと比較して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸の欠失をそのＮ末端におよび／またはそのＣ末端におよび／または内部に有する。
本明細書において用いられる「バリアント」は、代替的にまたは加えて、それからそれが由来する親ポリペプチドに対する配列同一性の一定の程度によって特徴づけされ得る。本開示のWT／参照SHC／HACのバリアントまたはSHC／HAC誘導体は、それぞれの参照ポリペプチドまたはそれぞれの参照ポリヌクレオチドと少なくとも４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性という配列同一性を有し得る。
表現「少なくとも３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％，７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性」は、本明細書においてはポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列比較に関して用いられる。
本明細書において開示される酵素または蛋白質のいずれかのファミリーに属するポリヌクレオチドは、それぞれ関連する遺伝子または蛋白質に対するその類似性に基づいて同定され得る。例えば、同定は配列同一性に基づき得る。ある種の好ましい態様において、本開示は、（ａ）配列番号５～１６３のポリペプチドをコードする核酸分子（本明細書において提供されている表１４～１７および表４ａ参照）、（ｂ）配列番号６～１６８、１６９、１７０、１７２、１７４、および１７６のヌクレオチド配列（本明細書において提供されている表１４～１７および表４ａ参照）、ならびに（ｃ）配列番号６～１６８、１６９、１７０、１７２、１７４、および１７６の少なくとも３０（例えば、少なくとも３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、８５０、９００、９５０、１０００、または１０１０）ヌクレオチドのセグメントを包含する核酸分子（本明細書において提供されている表１４～１７および表４ａ参照）と少なくとも３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、単離された核酸分子を特徴とする。
好ましくは、当のポリペプチドおよび参照ポリペプチドは、示されている配列同一性を、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のアミノ酸の連続的伸長（stretch）に渡って示す。好ましくは、当のポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドは、示されている配列同一性を、６０、９０、１２０、１３５、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００以上のヌクレオチドの連続的伸長に渡って示す。２つの配列が比較され、かつそれと比較して配列同一性パーセンテージが計算されるべき参照配列が規定されていない場合、具体的に別様に示されていない場合には、配列同一性は、比較されるべき２つの配列のより長いものを参照して計算されるべきである。参照配列が示されている場合、具体的に別様に示されていない場合には、配列同一性は、配列番号１、２、３、および／または４によって示されている参照配列の全長に基づいて決定される。
例えば、６３１アミノ酸残基を有する参照SHCの全長のアミノ酸と比較された１３０アミノ酸からなるペプチド配列は２０．６％という配列同一性最大パーセンテージを示してもよく（１３０／６３１×１００）、一方で、３００アミノ酸長を有する配列は４７．５％という配列同一性最大パーセンテージを示し得る（３００／６３１×１００）。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントによって決定され得る。かかるアラインメントはいくつかの当分野において公知のアルゴリズムによって行われることができ、好ましくはKarlin and Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)の計算アルゴリズムによって、hmmalign（HMMERパッケージ、http:／hmmer.wustl.edu/）によって、または例えば
http:／www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/もしくは
http:／www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlもしくは
http:／npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlにおいて利用可能なCLUSTALアルゴリズム（Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80）、または本明細書の表１８に提供されているWT SHCに対する配列アラインメントに利用されたGAPプログラム（アイオワ大学の計算アルゴリズム）、または本明細書において提供されている表１９のWT SHC配列アラインメントにおいて開示および利用されているMyers and Miller (1989 - Cabios 4: 11-17)の計算アルゴリズムによる。
用いられる好ましいパラメータは、
http:／www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/または
http:／www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html
においてそれらが設定されているデフォルトパラメータである。
配列同一性のグレード（配列マッチ）は例えばBLAST、BLAT、またはBlastZ（もしくはBlastX）を用いて計算され得る。類似のアルゴリズムがAltschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410のBLASTNおよびBLASTPプログラムに組み込まれている。BLASTポリヌクレオチド検索がBLASTNプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２によって実施され、関連する蛋白質をコードする核酸に相同であるポリヌクレオチド配列を得る。
BLAST蛋白質検索がBLASTPプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によって実施され、SrKOポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得る。比較目的のためにギャップありのアラインメントを得るためには、Gapped BLASTがAltschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402に記載されているように利用される。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータが用いられる。配列マッチ分析は、Shuffle-LAGAN（Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162）またはマルコフランダムフィールドのような確立された相同性マッピング技術によって補われ得る。本願において配列同一性のパーセンテージが参照されるときには、それらのパーセンテージは、具体的に別様に示されていない場合には、より長い配列の全長との関係によって計算される。
知覚
本開示に従うホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換は主要化合物として（－）－アンブロックスを産生するが、（－）－アンブロックス以外の化合物をもまた産生することがあり、これは生物変換混合物に心地よい嗅覚的ノートを付与するかもしれずまたは付与しないかもしれず、そのため、（－）－アンブロックス最終生成物の知覚特性にポジティブなまたはネガティブな様式で寄与し得る。従って、試験が、化学的に関連するターゲット生成物が、参照生成物に対して嗅覚的に関連する最終生成物でもあるかどうかを決定する助けとなり得るように、知覚分析は、熟練の専門家（例えば香水業者）によって利用される良く確立された知覚試験を用いて行われる。例２２の知覚分析が示しているように、（－）－アンブロックスからの１種以上の副生成物化合物の除去は、除去された化合物それ自体が実際には無臭の化合物である場合でさえも、残りの化合物（（－）－アンブロックス）の匂いを改善し得る。すなわち、（－）－アンブロックスの匂いの増強が化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの非存在下において観察された。
本発明の側面
１． （－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセスであって、（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物に酵素的に変換され、酵素的な変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下においてSHC／HAC酵素を用いて行われ、ＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、それぞれ［ＥＥ：ＥＺ］、［ＥＥ：ＺＥ］、ならびに［ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ］ともまた呼称される［（３Ｅ，７Ｅ）および［（３Ｚ，７Ｅ）］ならびに／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］ならびに／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］からなる群から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になる。
２． （－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセスであって、（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物が酵素的に変換されて、（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を与え、SHC／HAC酵素を用いる酵素的な変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において行われ、反応が可溶化剤の存在下において行われる場合には、Triton X-100またはタウロデオキシコール酸が野生型SHC／HAC酵素との組み合わせで用いられない。
３． （－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセスであって、（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物に酵素的に変換され、酵素的変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下においてSHC／HAC酵素を用いて行われ、ＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、それぞれ［ＥＥ：ＥＺ］、［ＥＥ：ＺＥ］、ならびに［ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ］ともまた呼称される［（３Ｅ，７Ｅ）および［（３Ｚ，７Ｅ）］ならびに／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］ならびに／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］からなる群から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になり、反応が、水相、固相、および油相を含む３相システムにおいて起こる。
４． パラグラフ１またはパラグラフ２またはパラグラフ３に従うプロセスであって、プロセスが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４からなる群から選択されるSHC／HAC酵素ポリペプチド配列、あるいは表１、表５、表２、表６、表３、表７、表４、表８、もしくは表１３、表１４から選択されるかまたは配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、１７１、１７３、１７５、１７７、および／もしくは１７８から選択されるSHC／HAC誘導体、あるいは配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４と少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を用いて行われる。
５． パラグラフ１～４のいずれか１つのプロセスであって、プロセスが、SHC／HAC酵素を産生する組み換えホスト細胞を用いる。
６． パラグラフ４またはパラグラフ５に従うプロセスであって、SHC／HAC酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、または配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および／もしくは１７０、１７２、１７４および／もしくは１７６からなる群から選択される。
７． パラグラフ１～６のいずれか１つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が３０℃から６０℃の範囲内の温度で約４～８の範囲内のｐＨにおいて起こる。
８． パラグラフ１～７のいずれか１つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されている野生型SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１種以上を用いて、好ましくは５．０から６．２のｐＨ範囲において、好ましくは３５℃の温度で起こる。
９． パラグラフ３～８のいずれか１つに従うプロセスであって、生体触媒対ＥＥＨの比が約２：１であるときにＳＤＳ／細胞比が１０：１から２０：１の範囲内に、好ましくは１６：１にある。
１０． パラグラフ３～９のいずれか１つに従うプロセスであって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５～２：１の範囲内、好ましくは約１：１または０．５：１である。
１１． パラグラフ３～１０のいずれか１つに従うプロセスであって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
１２． パラグラフ２に従うプロセスであって、ホモファルネソール基質が１種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
１３． パラグラフ１２に従うプロセスであって、ホモファルネソール基質が２種のホモファルネソール立体異性体を含むかまたは本質的にそれらからなる。
１４． パラグラフ１３に従うプロセスであって、ホモファルネソール基質がＥＥ：ＥＺ立体異性体を含むかまたは本質的にそれらからなる。
１５． パラグラフ１４のいずれか１つに従うプロセスであって、ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、および６０：４０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
１６． パラグラフ１５に従うプロセスであって、ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９２：８、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、およびＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
１７． パラグラフ１５またはパラグラフ１６に従うプロセスであって、ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
１８． パラグラフ１～１７のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の少なくとも１種以上との混合物として産生される。
１９． パラグラフ１～１８のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
２０． パラグラフ１～１９のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが、有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物の固相から単離される。
２１. パラグラフ１９またはパラグラフ２０に従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
２２． パラグラフ２１に従うプロセスであって、（－）－アンブロックスがエタノールまたはトルエンを用いて反応混合物から単離される。
２３． パラグラフ１９～２２のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
２４． パラグラフ２３に従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない。
２５． パラグラフ１～２４のいずれか１つに従うプロセスであって、約１２５～２００ｇ／ｌの濃度範囲内の（－）－アンブロックスが産生される。
２６． パラグラフ１～２５のいずれか１つの方法によって得られ得る（－）－アンブロックスであって、（－）－アンブロックスが約０．１から約０．５ｎｇ／ｌの匂い閾値を有する。
２７． 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ２６の（－）－アンブロックス。
２８． （－）－アンブロックスを含有する製品を作るためのプロセスであって、パラグラフ２６またはパラグラフ２７のいずれか１つの（－）－アンブロックスを製品に組み込むことを含む。
２９． パラグラフ２８のプロセスであって、製品がフレグランス製品、化粧品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品である。
３０． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ２６またはパラグラフ２７のいずれか１つの（－）－アンブロックスを含む。
３１． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ２６またはパラグラフ２７の（－）－アンブロックスと１種以上の追加の構成成分とを含む。
３２． フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および／または清掃製品の一部としての、パラグラフ２６またはパラグラフ２７の（－）－アンブロックスの使用。
３３． フレグランス組成物の芳香を拡張、増強、または付与するためのプロセスであって、
（ａ）副生成物化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の１種以上との混合物としての（－）－アンブロックスを含む反応混合物を調製するステップと、
Figure 2023015116000016
 （ｂ）副生成物化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の１種以上との混合物としての（－）－アンブロックスを抽出するステップと、
（ｃ）抽出混合物から（－）－アンブロックスを選択的に結晶化するステップと、
を含むプロセスに従って産生される芳香拡張または増強生成物を前記のフレグランス組成物と混合するステップを含み、
（－）－アンブロックスが、SHC／HAC酵素を用いて（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において、（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物の酵素的な変換によって調製され、
ＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、それぞれ［ＥＥ：ＥＺ］、［ＥＥ：ＺＥ］、ならびに［ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ］ともまた呼称される［（３Ｅ，７Ｅ）および［（３Ｚ，７Ｅ）］ならびに／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］ならびに／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］からなる群から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になる。
３４． パラグラフ３３のプロセスであって、反応が、水相、固相、および油相を含む３相システムにおいて起こる。
３５． パラグラフ３３またはパラグラフ３４に従うプロセスであって、プロセスが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４からなる群から選択されるSHC／HAC酵素ポリペプチド配列、あるいは表１、表５、表２、表６、表３、表７、表４、表８、もしくは表１４から選択されるかまたは配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、１７１、１７３、１７５、および／もしくは１７７から選択されるSHC／HAC誘導体、あるいは配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４と少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を用いて行われる。
３６． パラグラフ３３～３５のいずれか１つのプロセスであって、プロセスが、SHC／HAC酵素を産生する組み換えホスト細胞を用いる。
３７． パラグラフ３５またはパラグラフ３６に従うプロセスであって、SHC／HAC酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、または配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、および／もしくは１７０、１７２、１７４、および／もしくは１７６からなる群から選択される。
３８． パラグラフ３３～３７のいずれか１つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、３０℃から６０℃の範囲内の温度で約４～８の範囲内のｐＨにおいて起こる。
３９． パラグラフ３３～３８のいずれか１つに従うプロセスであって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されている野生型SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１つ以上を用いて、好ましくは５．０から６．２のｐＨ範囲において、好ましくは３５℃の温度で起こる。
４０． パラグラフ３４～３９のいずれか１つに従うプロセスであって、生体触媒対ＥＥＨの比が約２：１であるときにＳＤＳ／細胞比が１０：１から２０：１の範囲内、好ましくは１６：１にある。
４１． パラグラフ３４～４０のいずれか１つに従うプロセスであって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５～２：１の範囲内、好ましくは約１：１または０．５：１である。
４２． パラグラフ３４～４１のいずれか１つに従うプロセスであって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
４３． パラグラフ３３～４２のいずれか１つに従うプロセスであって、ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、および６０：４０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
４４． パラグラフ４３に従うプロセスであって、ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９２：０８、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、およびＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
４５． パラグラフ４３またはパラグラフ４４に従うプロセスであって、ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる。
４６． パラグラフ３３～４５のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の少なくとも１種以上との混合物として産生される。
４７． パラグラフ３３～４６のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
４８． パラグラフ３３～４７のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物の固相から単離される。
４９． パラグラフ４７またはパラグラフ４８に従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
５０． パラグラフ４９に従うプロセスであって、（－）－アンブロックスがエタノールまたはトルエンを用いて反応混合物から単離される。
５１． パラグラフ４７～４９のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
５２． パラグラフ５１に従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない。
５３． パラグラフ３３～５２のいずれか１つに従うプロセスであって、約１２５～２００ｇ／ｌの濃度範囲内の（－）－アンブロックスが産生される。
５４． パラグラフ３３～５３のいずれか１つに従うプロセスであって、（－）－アンブロックスが約０．１から約０．５ｎｇ／ｌの匂い閾値を有する。
本発明の追加の側面
１． スクアレン－ホペンシクラーゼ（SHC）／ホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）誘導体であって、配列番号１に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～５０個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
２． パラグラフ１に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号１に対して１から４０個の変異、１～３０個の変異、１～２０個の変異、１～１０個の変異、または１～６つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
３． パラグラフ１またはパラグラフ２に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC／HAC誘導体が、配列番号１に対して、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
４． パラグラフ３に従うSHC／HAC誘導体であって、SHCバリアントが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
５． SHC／HAC誘導体であって、配列番号１に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～１０個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の１つ以上の変異がSHC酵素のドメイン２（図１９および／または２０）内に位置する。
６． パラグラフ１～５のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号１に対して１つ以上の変異が表１から選択され、１つの変異のみが選択される場合には、それはＦ６０１Ｙではない。
７． パラグラフ６に従うSHC／HAC誘導体であって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が表１または表５から選択される。
８． パラグラフ２のSHC／HAC誘導体であって、配列番号１に対して最大で６つの変異を有し、かつＦ１２９Ｌおよび／またはＩ４３２Ｔの少なくともいずれか１つ以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６０１ＹまたはＭ１３２Ｒを含むアミノ酸配列を含む。
９． パラグラフ７のSHC／HAC誘導体であって、配列番号１に対して最大で８つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号１に対して位置７７、１２９、１３２、１９２、２２４、４３２、５７９、６０１、および６０５からなる群から選択される位置に１つまたは１つよりも多くのアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC／HAC誘導体が配列番号１に対して増大したHAC酵素活性を有する。
１０． パラグラフ９に従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号１に対して、Ｔ７７Ａ、Ｆ１２９Ｌ、Ｍ１３２Ｒ、Ｉ９２Ｖ、Ａ２２４Ｖ、Ｉ４３２Ｔ、Ｑ５７９Ｈ、Ｆ６０１Ｙ、および／またはＦ６０５Ｗからなる群から選択される１種以上の置換を含む。
１１． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６０１Ｙを含む。
１２． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ１２９Ｌを含む。
１３． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６０１ＹおよびＦ１２９Ｌを含む。
１４． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｍ１３２ＲおよびＩ４３２Ｔを含む。
１５． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにアミノ酸置換Ａ２２４Ｖを含む。
１６． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６０１Ｙを含む。
１７． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ１２９Ｌを含む。
１８． パラグラフ１７に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６０１Ｙを含む。
１９． パラグラフ１１に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＱ５７９Ｈを含む。
２０． パラグラフ１０に従うSHC誘導体であって、Ｔ７７ＡおよびＩ９２ＶおよびＦ１２９Ｌを含む。
２１． 先行するパラグラフのいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、および／または１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
２２． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC誘導体をコードする単離されたヌクレオチド配列。
２３． パラグラフ２２に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、および／または１７０からなる群から選択される。
２４． パラグラフ２２またはパラグラフ２３のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
２５． パラグラフ２４に従うコンストラクトであって、パラグラフ２２または２３のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
２６． パラグラフ２５のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
２７． パラグラフ２４～２６のいずれか１つに従うコンストラクトを含むベクター。
２８． パラグラフ２７のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
２９． パラグラフ２８に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞による発現に向かわせること（directing）が可能である。
３０． パラグラフ２４～２６のいずれか１つのコンストラクトまたはパラグラフ２７～２９のいずれか１つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
３１． 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、またはパラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクターを含む。
３２． パラグラフ３１に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア（Escherichia）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、およびラクトコッカス（Lactococcus）の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
３３． パラグラフ３２の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌（E.coli）ホスト細胞である。
３４． パラグラフ３３の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC／HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
３５． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体を調製する方法であって、SHC／HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う１種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
３６． パラグラフ３５の方法であって、細胞培養が、生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
３７． （－）－アンブロックスを調製する方法であって、パラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC／HACをコードする配列番号１６９または配列番号１６５を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを（－）－アンブロックスに変換することを含み、WT SHC／HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換がTriton X-100またはタウロデオキシコール酸以外の可溶化剤によって行われる。
３８． パラグラフ３７に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
３９． パラグラフ３７または３８に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適なｐＨ、温度、可溶化剤濃度において起こる。
４０． パラグラフ３９に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、３０℃から６０℃の範囲内の温度で約４～８の範囲内のｐＨにおいて、WT SHC／HAC酵素についてはTriton X-100またはタウロデオキシコール酸以外の可溶化剤の存在下において起こる。
４１． パラグラフ３７～４０のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されているWT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１つ以上を用いて起こる。
４２． パラグラフ３７～４１のいずれか１つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５：１から２：１の範囲内、好ましくは約１：１または０．５：１である。
４３． パラグラフ３７～４２のいずれか１つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
４４． パラグラフ３７～４３のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が１種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
４５． パラグラフ４４の方法であって、ホモファルネソール基質が２種のホモファルネソール立体異性体を含む。
４６． パラグラフ４５の方法であって、ホモファルネソール基質がＥＥ：ＥＺ立体異性体を含む。
４７． パラグラフ４４～４６のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、および７０：３０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４８． パラグラフ４７の方法であって、ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、およびＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４９． パラグラフ３５または３６の方法であって、ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
５０． パラグラフ３７～４９のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の１種以上との混合物として産生される。
５１． パラグラフ３７～５０のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは蒸気抽出／蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物から単離されるか、または（－）－アンブロックス結晶が濾過の手段によって生物変換反応混合物から直接的に単離される。
５２． パラグラフ５１に従う方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
５３． パラグラフ５２の方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
５４． パラグラフ５２または５３の方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない。
５５． パラグラフ５１～５４のいずれか１つの方法によって得られ得る（－）－アンブロックス。
５６． 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ５５の（－）－アンブロックス。
５７． （－）－アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
５８． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを含む。
５９． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスと１種以上の追加の構成成分とを含む。
６０． フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および／または清掃製品の一部としての、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスの使用。
６１． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体酵素、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、パラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、パラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクター、またはパラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC／HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC／HAC 酵素が、Triton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
６２． （－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスの立体異性体混合物を調製するための方法であって、（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソールまたは（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソールの立体異性体混合物が酵素的に変換されて（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスの立体異性体混合物を与え、SHC／HAC酵素を用いる酵素的な変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において行われ、反応が可溶化剤の存在下において行われる場合には、Triton X-100がWT SHC／HAC酵素との組み合わせで用いられない。
６３． パラグラフ６２に従うプロセスであって、プロセスが、AacSHC（配列番号１）、ZmoSHC1（配列番号２）、ZmoSHC2（配列番号３）、BjpSHC（配列番号４）からなる群から選択されるSHC／HAC酵素、表１、表５、表２、表６、表３、表７、表４、および／もしくは表８から選択されるSHC／HAC誘導体、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／もしくは配列番号４に対して少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、もしくは少なくとも６０％の同一性、もしくは少なくとも７０％の同一性、もしくは少なくとも８０％の同一性、もしくは少なくとも９０％の同一性、もしくは少なくとも９５％の同一性、もしくは少なくとも９６％の同一性、もしくは少なくとも９７％の同一性、もしくは少なくとも９８％の同一性、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を用いて行われる。
６４． パラグラフ６３に従うプロセスであって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、３０℃から６０℃の範囲内の温度で、４～８の範囲内のｐＨにおいて、WT SHCについてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
６５． パラグラフ６４に従うプロセスであって、表２４または表２４ａに記されているWT SHC／HACまたはそれぞれのSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件が用いられる。
６６． パラグラフ６２～６５のいずれか１つに従うプロセスであって、プロセスが、Ｅ，Ｅ－ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換に先立って、（ａ）WT SHCまたはSHC／HAC誘導体ポリペプチドの発現を許容する条件下において、WT SHCまたはSHC誘導体酵素を発現する１種以上の組み換えホスト細胞を培養することを含む。
６７． パラグラフ６６に従うプロセスであって、培養ステップおよび引き続く変換ステップが同じ反応容器内で異なる反応条件下において起こる。
６８． パラグラフ６７に従うプロセスであって、培養ステップが約６から約７のｐＨ範囲においてであり、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへのステップが約４．８～５．５のｐＨ範囲においてである。
６９． パラグラフ６２～６８のいずれか１つに従うプロセスであって、ホモファルネソール基質がＥＥ：ＥＺ立体異性体を含む。
７０． パラグラフ６９に従うプロセスであって、ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、およびＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
７１． パラグラフ７０のプロセスであって、ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺを含む。
７２． パラグラフ６２～７１のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の１種以上との混合物として産生される。
７３． パラグラフ６２～７２のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが、有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて反応混合物から単離される。
７４． パラグラフ７３に従う方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
７５． パラグラフ７４の方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される。
７６． パラグラフ７４または７５の方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない。
７７． パラグラフ７２～７６のいずれか１つの方法によって得られ得る（－）－アンブロックス。
７８． 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ２６の（－）－アンブロックス。
７９． 製品を作るための方法であって、パラグラフ７７または７８の（－）－アンブロックスを製品に組み込むことを含む。
８０． パラグラフ７９の方法であって、製品がフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品である。
８１． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ７７または７８の（－）－アンブロックスを含む。
８２． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ７７または７８の（－）－アンブロックスと追加の構成成分とを含む。
８３． フレグランスまたは化粧品消費者ケア製品の一部としての、パラグラフ７７または７８の（－）－アンブロックスの使用。
本発明の追加の側面（ZmoSHC1）
１． スクアレン－ホペンシクラーゼ（SHC）／ホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）誘導体であって、配列番号２に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～５０個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
２． パラグラフ1に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号２に対して１から４０個の変異、１～３０個の変異、１～２０個の変異、１～１０個の変異、または１～６つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
３． パラグラフ１またはパラグラフ２に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC／HAC誘導体が、配列番号２に対して、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
４． パラグラフ３に従うSHC／HAC誘導体であって、SHCバリアントが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
５． SHC／HAC誘導体であって、配列番号２に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～１０個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の１つ以上の変異がSHC酵素のドメイン２（図１９および／または２０）内に位置する。
６． パラグラフ１～５のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号２に対して１つ以上の変異が表２から選択され、１つの変異のみが選択される場合には、それはＦ６６８Ｙではない。
７． パラグラフ６のSHC／HAC誘導体であって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が表２および／または表６から選択される。
８． パラグラフ２のSHC／HAC誘導体であって、配列番号２に対して最大で６つの変異を有し、かつＦ１８２Ｌおよび／またはＩ４９８Ｔの少なくともいずれか１種以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６６８ＹまたはＹ１８５Ｒを含むアミノ酸配列を含む。
９． パラグラフ７のSHC／HAC誘導体であって、配列番号２に対して最大で８つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号２に対して位置１２９、１４５、１８２、１８５、２８２、４９８、６４７、および６６８からなる群から選択される位置に１つ以上のアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC／HAC誘導体が配列番号２に対して増大したHAC酵素活性を有する。
１０． パラグラフ９に従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号２に対して、Ｓ１２９Ａ、Ｖ１４５Ｖ、Ｆ１８２Ｌ、Ｙ１８５Ｒ、Ｇ２８２Ｖ、Ｉ４９８Ｔ、Ｈ６４６Ｈ、およびＦ６６８Ｙからなる群から選択される１種以上の置換を含む。
１１． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６６８Ｙを含む。
１２． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ１８２Ｌを含む。
１３． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６６８ＹおよびＦ１８２Ｌを含む。
１４． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｙ１８５ＲおよびＩ４９８Ｔを含む。
１５． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＧ２８２Ｖを含む。
１６． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６６８Ｙを含む。
１７． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ１８２Ｌを含む。
１８． パラグラフ１７に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６６８Ｙを含む。
１９． パラグラフ１１に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＨ６４６Ｈを含む。
２０． パラグラフ１０に従うSHC誘導体であって、Ｓ１２９ＡおよびＶ１４５ＶおよびＦ１８２Ｌを含む。
２１． 先行するパラグラフのいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、および／または７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
２２． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC誘導体をコードする単離されたヌクレオチド配列。
２３． パラグラフ２２に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、および／または７６からなる群から選択される。
２４． パラグラフ２２またはパラグラフ２３のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
２５． パラグラフ２４に従うコンストラクトであって、パラグラフ２２または２３のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
２６． パラグラフ２５のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
２７． パラグラフ２４～２６のいずれか１つに従うコンストラクトを含むベクター。
２８． パラグラフ２７のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
２９． パラグラフ２８に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞による発現に向かわせることが可能である。
３０． パラグラフ２４～２６のいずれか１つのコンストラクトまたはパラグラフ２７～２９のいずれか１つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
３１． 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、またはパラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクターを含む。
３２． パラグラフ３１に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア（Escherichia）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、およびラクトコッカス（Lactococcus）の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
３３． パラグラフ３２の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌ホスト細胞である。
３４． パラグラフ３３の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC／HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
３５． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体を調製する方法であって、SHC／HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う１種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
３６． パラグラフ３５の方法であって、細胞培養が、生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
３７． （－）－アンブロックスを調製する方法であって、パラグラフ3１～34のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC／HACをコードする配列番号１６６を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを（－）－アンブロックスに変換することを含み、WT SHC／HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換がTriton X-100以外の可溶化剤によって行われる。
３８． パラグラフ３７に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
３９． パラグラフ３７または３８に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適なｐＨ、温度、可溶化剤濃度において起こる。
４０． パラグラフ３９に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、３０℃から６０℃の範囲内の温度で約４～８の範囲内のｐＨにおいて、WT SHC／HAC酵素についてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
４１． パラグラフ３７～４０のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されているWT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１つ以上を用いて起こる。
４２． パラグラフ３７～４１のいずれか１つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５：１から２：１の範囲内、好ましくは約１：１または０．５：１である。
４３． パラグラフ３７～４２のいずれか１つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
４４． パラグラフ３７～４３のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が１種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
４５． パラグラフ４４の方法であって、ホモファルネソール基質が２種のホモファルネソール立体異性体を含む。
４６． パラグラフ４５の方法であって、ホモファルネソール基質がＥＥ：ＥＺ立体異性体を含む。
４７． パラグラフ４４～４６のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、および７０：３０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４８． パラグラフ４７の方法であって、ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、およびＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４９． パラグラフ３５または３６の方法であって、ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
５０． パラグラフ３７～４９のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の１種以上との混合物として産生される。
５１． パラグラフ３７～５０のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
５２． パラグラフ５１に従う方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
５３． パラグラフ５２の方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて（－）－アンブロックスから選択的に結晶化される。
５４． パラグラフ５２または５３の方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない。
５５． パラグラフ５１～５４のいずれか１つの方法によって得られ得る（－）－アンブロックス。
５６． 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ５５の（－）－アンブロックス。
５７． （－）－アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
５８． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを含む。
５９． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスと１種以上の追加の構成成分とを含む。
６０． フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および／または清掃製品の一部としての、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスの使用。
６１． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体酵素、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、パラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、パラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクター、またはパラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC／HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC／HAC酵素が、Triton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
本発明のさらなる側面（ZmoSHC2）
１． スクアレン－ホペンシクラーゼ（SHC）／ホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）誘導体であって、配列番号３に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～５０個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
２． パラグラフ１に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号３に対して１から４０個の変異、１～３０個の変異、１～２０個の変異、１～１０個の変異、または１～６つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
３． パラグラフ１またはパラグラフ２に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC／HAC誘導体が、配列番号３に対して、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
４． パラグラフ３に従うSHC／HAC誘導体であって、SHCバリアントが配列番号３との少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
５． SHC／HAC誘導体であって、配列番号３に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～１０個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の１つ以上の変異がSHC酵素のドメイン２（図１９および／または２０）内に位置する。
６． パラグラフ１～５のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号３に対して１つ以上の変異が表３から選択され、１つの変異のみが選択される場合には、それはＦ６２０Ｙではない。
７． パラグラフ６のSHC／HAC誘導体であって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が表３および／または表７から選択される。
８． パラグラフ２のSHC／HAC誘導体であって、配列番号３に対して最大で６つの変異を有し、かつＦ１３７Ｌおよび／またはＩ４５０Ｔの少なくともいずれか１種以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６２０ＹまたはＩ１４０Ｒを含むアミノ酸配列を含む。
９． パラグラフ７のSHC／HAC誘導体であって、配列番号３に対して最大で８つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号３に対して位置８５、１００、１３７、１４０、２３３、４５０、５９８、および６２０からなる群から選択される位置に１つ以上のアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC／HAC誘導体が配列番号３に対して増大したHAC酵素活性を有する。
１０． パラグラフ9に従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号３に対して、Ｇ８５Ａ、Ｖ１００Ｖ、Ｆ１３７Ｌ、Ｉ１４０Ｒ、Ｖ２３３Ｖ、Ｉ４５０Ｔ、Ｎ５９８Ｈ、およびＦ６２０Ｙからなる群から選択される１種以上の置換を含む。
１１． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６２０Ｙを含む。
１２． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ１３７Ｌを含む。
１３． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６２０ＹおよびＦ１３７Ｌを含む。
１４． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｉ１４０ＲおよびＩ４５０Ｔを含む。
１５． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＶ２３３Ｖを含む。
１６． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６２０Ｙを含む。
１７． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ１３７Ｌを含む。
１８． パラグラフ１７に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６２０Ｙを含む。
１９． パラグラフ１１に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＮ５９８Ｈを含む。
２０． パラグラフ１０に従うSHC誘導体であって、Ｇ８５ＡおよびＶ１００ＶおよびＦ１３７Ｌを含む。
２１． 先行するパラグラフのいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、および／または１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
２２． 単離されたヌクレオチド配列であって、パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC誘導体をコードする。
２３． パラグラフ２２に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、および／または１１２からなる群から選択される。
２４． パラグラフ２２またはパラグラフ２３のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
２５． パラグラフ２４に従うコンストラクトであって、パラグラフ２２または２３のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
２６． パラグラフ２５のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
２７． パラグラフ２４～２６のいずれか１つに従うコンストラクトを含むベクター。
２８． パラグラフ２７のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
２９． パラグラフ２８に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞における発現に向かわせることが可能である。
３０． パラグラフ２４～２６のいずれか１つのコンストラクトまたはパラグラフ２７～２９のいずれか１つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
３１． 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、またはパラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクターを含む。
３２． パラグラフ３１に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア（Escherichia）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、およびラクトコッカス（Lactococcus）の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
３３． パラグラフ３２の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌ホスト細胞である。
３４． パラグラフ３３の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC／HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
３５． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体を調製する方法であって、（ａ）SHC／HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う１種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
３６． パラグラフ３５の方法であって、細胞培養が生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
３７． （－）－アンブロックスを調製するための方法であって、パラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC／HACをコードする配列番号１６７を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを（－）－アンブロックスに変換することを含み、WT SHC／HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換がTriton X-100以外の可溶化剤によって行われる。
３８． パラグラフ３７に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
３９． パラグラフ３７または３８に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適なｐＨ、温度、可溶化剤濃度において起こる。
４０． パラグラフ３９に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、３０℃から６０℃の範囲内の温度で、約４～８の範囲内のｐＨにおいて、WT SHC／HAC酵素についてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
４１． パラグラフ３７～４０のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されているWT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１つ以上を用いて起こる。
４２． パラグラフ３７～４１のいずれか１つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５：１から２：１の範囲内、好ましくは約１：１または０．５：１である。
４３． パラグラフ３７～４２のいずれか１つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
４４． パラグラフ３７～４３のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が１種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
４５． パラグラフ４４の方法であって、ホモファルネソール基質が２種のホモファルネソール立体異性体を含む。
４６． パラグラフ４５の方法であって、ホモファルネソール基質がＥＥ：ＥＺ立体異性体を含む。
４７． パラグラフ４４～４６のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、および７０：３０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４８． パラグラフ４７の方法であって、ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、およびＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４９． パラグラフ３５または３６の方法であって、ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
５０． パラグラフ３７～４９のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の１種以上との混合物として産生される。
５１． パラグラフ３７～５０のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
５２． パラグラフ５１に従う方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
５３． パラグラフ５２の方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて（－）－アンブロックスから選択的に結晶化される。
５４． パラグラフ５２または５３の方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない。
５５． パラグラフ５１～５４のいずれか１つの方法によって得られ得る（－）－アンブロックス。
５６． 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ５５の（－）－アンブロックス。
５７． （－）－アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
５８． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを含む。
５９． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスと１種以上の追加の構成成分とを含む。
６０． フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および／または清掃製品の一部としての、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスの使用。
６１． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体酵素、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、パラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、パラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクター、またはパラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC／HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC／HAC酵素が、Triton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
本発明の追加の側面（BJpSHC）
１． スクアレン－ホペンシクラーゼ（SHC）／ホモファルネソール－アンブロックスシクラーゼ（HAC）誘導体であって、配列番号４に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～５０個の変異を有するアミノ酸配列を含む。
２． パラグラフ１に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC誘導体が、配列番号４に対して１から４０個の変異、１～３０個の変異、１～２０個の変異、１～１０個の変異、または１～６つの変異を有するアミノ酸配列を含む。
３． パラグラフ１またはパラグラフ２に従うSHC／HAC誘導体であって、SHC／HAC誘導体が、配列番号４に対して、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
４． パラグラフ3に従うSHC／HAC誘導体であって、SHCバリアントが配列番号４との少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
５． SHC／HAC誘導体であって、配列番号４に対して、置換、欠失、または挿入から独立して選択される１～１０個の変異を含み、SHC活性部位変異以外の１つ以上の変異がSHC酵素のドメイン２（図１９および／または２０）内に位置する。
６． パラグラフ１～５のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号４に対して１つ以上の変異が表４から選択され、１つの変異のみが選択される場合には、それはＦ６２８Ｙではない。
７． パラグラフ６のSHC／HAC誘導体であって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が表４および／または表８から選択される。
８． パラグラフ２のSHC／HAC誘導体であって、配列番号４に対して最大で６つの変異を有し、かつＦ１３７Ｌおよび／またはＩ４５０Ｔの少なくともいずれか１種以上との組み合わせで、少なくとも置換Ｆ６２８ＹまたはＩ１４０Ｒを含むアミノ酸配列を含む。
９． パラグラフ７のSHC／HAC誘導体であって、配列番号４に対して最大で８つのアミノ酸変更を有し、かつ配列番号４に対して位置８８、１０４、１４１、１４４、２４１、４５９、６０７、および６２８からなる群から選択される位置に１つまたは１つよりも多くのアミノ酸変更を含むアミノ酸配列を含み、SHC／HAC誘導体が配列番号４に対して増大したHAC酵素活性を有する。
１０． パラグラフ９に従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号４に対して、Ａ８８Ａ、Ｖ１０４Ｖ、Ｆ１４１Ｌ、Ｙ１４４Ｒ、Ｖ２４１Ｖ、Ｉ４５９Ｔ、Ｍ６０７Ｈ、およびＦ６２８Ｙからなる群から選択される１種以上の置換を含む。
１１． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６２８Ｙを含む。
１２． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ１４１Ｌを含む。
１３． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｆ６２８ＹおよびＦ１４１Ｌを含む。
１４． パラグラフ１０に従うSHC／HAC誘導体であって、Ｙ１４４ＲおよびＩ４５９Ｔを含む。
１５． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＶ２４１Ｖを含む。
１６． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６２８Ｙを含む。
１７． パラグラフ１４に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ１４１Ｌを含む。
１８． パラグラフ１７に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＦ６２８Ｙを含む。
１９． パラグラフ１１に従うSHC／HAC誘導体であって、さらにＭ６０７Ｈを含む。
２０． パラグラフ１０に従うSHC誘導体であって、Ｓ１２９ＡおよびＶ１４５ＶおよびＦ１８２Ｌを含む。
２１． 先行するパラグラフのいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体であって、配列番号１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、および／または１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
２２． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC誘導体をコードする単離されたヌクレオチド配列。
２３． パラグラフ２２に従う単離されたヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、配列番号１１４、１１６、１１８、１２０、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、および／または１４８からなる群から選択される。
２４． パラグラフ２２またはパラグラフ２３のヌクレオチド配列を含むコンストラクト。
２５． パラグラフ２４に従うコンストラクトであって、パラグラフ２２または２３のヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。
２６． パラグラフ２５のコンストラクトであって、プロモーターが誘導性または構成的プロモーターである。
２７． パラグラフ２４～２６のいずれか１つに従うコンストラクトを含むベクター。
２８． パラグラフ２７のベクターであって、ベクターがプラスミドである。
２９． パラグラフ２８に従うベクターであって、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞による発現に向かわせることが可能である。
３０． パラグラフ２４～２６のいずれか１つのコンストラクトまたはパラグラフ２７～２９のいずれか１つに従うベクターであって、コンストラクトまたはベクターが、原核生物、酵母、植物、および昆虫ホスト細胞から選択されるホスト細胞のゲノムへの統合が可能である。
３１． 組み換えホスト細胞であって、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、またはパラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、またはパラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクターを含む。
３２． パラグラフ３１に従う組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が、属エスケリキア（Escherichia）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、およびラクトコッカス（Lactococcus）の細菌からなる原核生物ホスト細胞の群から選択される。
３３． パラグラフ３２の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞が大腸菌ホスト細胞である。
３４． パラグラフ３３の組み換えホスト細胞であって、ホスト細胞がSHC／HAC誘導体をコードする遺伝子を過剰発現する。
３５． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体を調製する方法であって、（ａ）SHC／HAC誘導体酵素の産生を許容する条件下において、パラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う１種以上の組み換えホスト細胞を培養するステップを含む。
３６． パラグラフ３５の方法であって、細胞培養が生体触媒産生にとって好適な条件下において起こる。
３７． （－）－アンブロックスを調製する方法であって、パラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞を用いて、またはWT SHC／HACをコードする配列番号１６８を含む組み換えホスト細胞を用いることによってホモファルネソールを（－）－アンブロックスに変換することを含み、WT SHC／HACが用いられる場合には、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換がTriton X-100以外の可溶化剤によって行われる。
３８． パラグラフ３７に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適な生物変換反応条件下においてである。
３９． パラグラフ３７または３８に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、WT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素にとって好適なｐＨ、温度、可溶化剤濃度において起こる。
４０． パラグラフ３９に従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、３０℃から６０℃の範囲内の温度で、約４～８の範囲内のｐＨにおいて、WT SHC／HAC酵素についてはTriton X-100以外の可溶化剤の存在下において起こる。
４１． パラグラフ３７～４０のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されているWT SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１つ以上を用いて起こる。
４２． パラグラフ３７～４１のいずれか１つの方法であって、生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５：１から２：１の範囲内、好ましくは約１：１または０．５：１である。
４３． パラグラフ３７～４２のいずれか１つに従う方法であって、細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる。
４４． パラグラフ２７～３１のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソール基質が１種以上のホモファルネソール立体異性体を含む。
４５． パラグラフ４４の方法であって、ホモファルネソール基質が２種のホモファルネソール立体異性体を含む。
４６． パラグラフ４５の方法であって、ホモファルネソール基質がＥＥ：ＥＺ立体異性体を含む。
４７． パラグラフ４４～４６のいずれか１つに従う方法であって、ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、および７０：３０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４８． パラグラフ４７の方法であって、ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、およびＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
４９． パラグラフ３５または３６の方法であって、ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含む。
５０． パラグラフ３７～４９のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の１種以上との混合物として産生される。
５１． パラグラフ３７～５０のいずれか１つの方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される。
５２． パラグラフ５１に従う方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される。
５３． パラグラフ５２の方法であって、（－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて（－）－アンブロックスから選択的に結晶化される。
５４． パラグラフ５２または５３の方法であって、（－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない。
５５． パラグラフ５１～５４のいずれか１つの方法によって得られ得る（－）－アンブロックス。
５６． 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の、パラグラフ５５の（－）－アンブロックス。
５７． （－）－アンブロックスを含有する製品を作るための方法であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを製品、好ましくはフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品に組み込むことを含む。
５８． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスを含む。
５９． フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物であって、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスと１種以上の追加の構成成分とを含む。
６０． フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および／または清掃製品の一部としての、パラグラフ５５または５６の（－）－アンブロックスの使用。
６１． パラグラフ１～２１のいずれか１つに従うSHC／HAC誘導体酵素、パラグラフ２２もしくは２３に従うヌクレオチド配列、パラグラフ２４～２６もしくは３０のいずれか１つに従うコンストラクト、パラグラフ２７～３０のいずれか１つに従うベクター、またはパラグラフ３１～３４のいずれか１つに従う組み換えホスト細胞、またはWT SHC／HACを発現する組み換えホスト細胞の、ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換への使用であって、WT SHC／HAC酵素がTriton X-100以外の可溶化剤と生物変換反応に用いられる。
別の側面においては、本明細書に記載されるSHCまたは誘導体のアミノ酸配列によるSHCの構造座標に基づくSHCの結晶モデル構造（ＣＭＳ）が提供される。SHCのＣＭＳは、スクアレン／ホモファルネソール結合ポケット（ＳＨＢＰ）を含むスクアレン／ホモファルネソール結合ポケットドメイン（ＳＨＢＤ）とＳＢＤに結合したスクアレン／ホモファルネソール基質とを含む（例えば図１９および２０参照）。このSHC結晶モデル構造（ＣＭＳ）は潜在的なSHC／HAC誘導体酵素候補のインシリコ試験を容易にする。
それゆえに、なお他の態様において、本開示はＳＨＢＤに結合することが可能な酵素（例えばSHC／HAC誘導体）をスクリーニングする方法を提供し、方法はSHC／HACのＣＭＳの使用を含む。別の側面において、本開示はＳＨＢＰに結合することが可能な酵素（例えば参照SHCまたはSHC／HAC誘導体）をスクリーニングするための方法を提供し、方法は、ＳＨＢＰを試験化合物（例えばＳＨＣ誘導体）と接触させることと前記試験化合物が前記ＳＨＢＰに結合するかどうかを決定することとを含む。いくつかの態様において、方法は、SHC誘導体酵素の活性を調節することに有用な試験化合物（例えば調節薬）をスクリーニングすることである。
別の側面において、本開示は、スクアレン／ホモファルネソール結合ドメイン（ＳＨＢＤ）を有する参照SHCおよび／またはSHC／HAC誘導体の分子的特徴および／または分子間相互作用を予測、シミュレーション、またはモデリングするための方法を提供し、これはコンピュータモデルの使用を含み、前記コンピュータモデルは、上で定義されているスクアレン／ホモファルネソール結合ドメインの構造座標を含むか、用いるか、または描画して、前記リガンド結合ドメインのイメージを提供し、任意に前記イメージを表示する。
本明細書および次の請求項において、文脈が別様に要求しない限り、単語「含む（comprise）」ならびに「comprises」および「comprising」などの変形は、いずれかの他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外ではなく、記載される整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を含意すると理解される。用語「含む」は「包含する」および「からなる」をもまた意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物はもっぱらＸからなり得るか、または追加の何かを包含してもよく、例えばＸ＋Ｙである。本明細書および添付の請求項において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、内容が明白に別様に書かれていない限り複数の指示物を包含するということにもまた注意しなければならない。例として、「遺伝子」または「酵素」への言及は「１種以上の遺伝子」または「１種以上の酵素」への言及である。
本開示が、それらが変わり得るような本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないということが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は特定の態様を記載する目的のみのためであり、添付の請求項によってのみ限定される本開示の範囲を限定することは意図されていないということもまた理解されるべきである。別様に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。本開示に従って、従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術が採用されてもよく、これは当分野の技能のうちである。
本開示は、その適用について、下記記載に記載されるかまたは図面に図示される構成成分の構築および配置の詳細に限定されない。本開示は、他の態様が可能であり、および種々のやり方で実施または行われることが可能である。本明細書において用いられる言い回しおよび専門用語もまた説明の目的のためであって、限定と見なされるべきではない。
好ましくは、本明細書において用いられる用語は"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されているように定義される。
いくつかの文献が本明細書の本文中で引用されている。本明細書において引用される文献（全ての特許、特許出願、科学的な発表、製造者の仕様書、説明書、GenBankアクセッション番号、配列のサブミッションなどを包含する）のそれぞれは、上記または下記にかかわらず、その全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される例は本開示について例示的であり、それの限定であることは意図されていない。本開示の異なる態様を本開示に従って記載した。多くの改変および変形は、本開示の趣旨および範囲から外れることなしに本明細書に記載および図示される技術になり得る。従って、例は例示的であるに過ぎず、本開示の範囲の限定ではないということが理解されるべきである。
Figure 2023015116000017
Figure 2023015116000018
Figure 2023015116000019
Figure 2023015116000020
Figure 2023015116000021
Figure 2023015116000022
Figure 2023015116000023
Figure 2023015116000024
配列番号１（アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius））、AacSHC
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
配列番号２（ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis））、ZmoSHC1
MGIDRMNSLSRLLMKKIFGAEKTSYKPASDTIIGTDTLKRPNRRPEPTAKVDKTIFKTMGNSLNNTLVSACDWLIGQQKPDGHWVGAVESNASMEAEWCLALWFLGLEDHPLRPRLGNALLEMQREDGSWGVYFGAGNGDINATVEAYAALRSLGYSADNPVLKKAAAWIAEKGGLKNIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNLPPEIIWFPDNFVFSIYNFAQWARATMVPIAILSARRPSRPLRPQDRLDELFPEGRARFDYELPKKEGIDLWSQFFRTTDRGLHWVQSNLLKRNSLREAAIRHVLEWIIRHQDADGGWGGIQPPWVYGLMALHGEGYQLYHPVMAKALSALDDPGWRHDRGESSWIQATNSPVWDTMLALMALKDAKAEDRFTPEMDKAADWLLARQVKVKGDWSIKLPDVEPGGWAFEYANDRYPDTDDTAVALIALSSYRDKEEWQKKGVEDAITRGVNWLIAMQSECGGWGAFDKDNNRSILSKIPFCDFGESIDPPSVDVTAHVLEAFGTLGLSRDMPVIQKAIDYVRSEQEAEGAWFGRWGVNYIYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYITKACDWLVAHQQEDGGWGESCSSYMEIDSIGKGPTTPSQTAWALMGLIAANRPEDYEAIAKGCHYLIDRQEQDGSWKEEEFTGTGFPGYGVGQTIKLDDPALSKRLLQGAELSRAFMLRYDFYRQFFPIMALSRAERLIDLNN
配列番号３（ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis））、ZmoSHC2
MTVSTSSAFHHSPLSDDVEPIIQKATRALLEKQQQDGHWVFELEADATIPAEYILLKHYLGEPEDLEIEAKIGRYLRRIQGEHGGWSLFYGGDLDLSATVKAYFALKMIGDSPDAPHMLRARNEILARGGAMRANVFTRIQLALFGAMSWEHVPQMPVELMLMPEWFPVHINKMAYWARTVLVPLLVLQALKPVARNRRGILVDELFVPDVLPTLQESGDPIWRRFFSALDKVLHKVEPYWPKNMRAKAIHSCVHFVTERLNGEDGLGAIYPAIANSVMMYDALGYPENHPERAIARRAVEKLMVLDGTEDQGDKEVYCQPCLSPIWDTALVAHAMLEVGGDEAEKSAISALSWLKPQQILDVKGDWAWRRPDLRPGGWAFQYRNDYYPDVDDTAVVTMAMDRAAKLSDLHDDFEESKARAMEWTIGMQSDNGGWGAFDANNSYTYLNNIPFADHGALLDPPTVDVSARCVSMMAQAGISITDPKMKAAVDYLLKEQEEDGSWFGRWGVNYIYGTWSALCALNVAALPHDHLAVQKAVAWLKTIQNEDGGWGENCDSYALDYSGYEPMDSTASQTAWALLGLMAVGEANSEAVTKGINWLAQNQDEEGLWKEDYYSGGGFPRVFYLRYHGYSKYFPLWALARYRNLKKANQPIVHYGM
配列番号４（ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum））、BjpSHC
MTVTSSASARATRDPGNYQTALQSTVRAAADWLIANQKPDGHWVGRAESNACMEAQWCLALWFMGLEDHPLRKRLGQSLLDSQRPDGAWQVYFGAPNGDINATVEAYAALRSLGFRDDEPAVRRAREWIEAKGGLRNIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNIPPEVIWFPLWFPFSIYNFAQWARATLMPIAVLSARRPSRPLPPENRLDALFPHGRKAFDYELPVKAGAGGWDRFFRGADKVLHKLQNLGNRLNLGLFRPAATSRVLEWMIRHQDFDGAWGGIQPPWIYGLMALYAEGYPLNHPVLAKGLDALNDPGWRVDVGDATYIQATNSPVWDTILTLLAFDDAGVLGDYPEAVDKAVDWVLQRQVRVPGDWSMKLPHVKPGGWAFEYANNYYPDTDDTAVALIALAPLRHDPKWKAKGIDEAIQLGVDWLIGMQSQGGGWGAFDKDNNQKILTKIPFCDYGEALDPPSVDVTAHIIEAFGKLGISRNHPSMVQALDYIRREQEPSGPWFGRWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYIGRACDWLVAHQQADGGWGESCASYMDVSAVGRGTTTASQTAWALMALLAANRPQDKDAIERGCMWLVERQSAGTWDEPEFTGTGFPGYGVGQTIKLNDPALSQRLMQGPELSRAFMLRYGMYRHYFPLMALGRALRPQSHS
配列番号１４９（バークホルデリア・アンビファリア（Burkholderia ambifaria））
MNDLTEMATLSAGTVPAGLDAAVASATDALLAAQNADGHWVYELEADSTIPAEYVLLVHYLGETPNLELEQKIGRYLRRVQQADGGWPLFTDGAPNISASVKAYFALKVIGDDENAEHMQRARRAIQAMGGAEMSNVFTRIQLALYGAIPWRAVPMMPVEIMLLPQWFPFHLSKVSYWARTVIVPLLVLNAKRPIAKNPRGVRIDELFVDPPVNAGLLPRQGHQSPGWFAFFRVVDHALRAADGLFPNYTRERAIRQAVSFVDERLNGEDGLGAIYPAMANAVMMYDVLGYAEDHPNRAIARKSIEKLLVVQEDEAYCQPCLSPVWDTSLAAHALLETGDARAEEAVIRGLEWLRPLQILDVRGDWISRRPHVRPGGWAFQYANPHYPDVDDTAVVAVAMDRVQKLKHNDAFRDSIARAREWVVGMQSSDGGWGAFEPENTQYYLNNIPFSDHGALLDPPTADVSGRCLSMLAQLGETPLNSEPARRALDYMLKEQEPDGSWYGRWGMNYVYGTWTALCALNAAGLTPDDPRVKRGAQWLLSIQNKDGGWGEDGDSYKLNYRGFEQAPSTASQTAWALLGLMAAGEVNNPAVARGVEYLIAEQKEHGLWDETRFTATGFPRVFYLRYHGYRKFFPLWALARYRNLKRNNATRVTFGL
配列番号１５１（バークホルデリア・アンビファリア（Burkholderia ambifaria））
MIRRMNKSGPSPWSALDAAIARGRDALMRLQQPDGSWCFELESDATITAEYILMMHFMDKIDDARQEKMARYLRAIQRLDTHGGWDLYVDGDPDVSCSVKAYFALKAAGDSEHAPHMVRARDAILELGGAARSNVFTRILLATFGQVPWRATPFMPIEFVLFPKWVPISMYKVAYWARTTMVPLLVLCSLKARARNPRNIAIPELFVTPPDQERQYFPPARGMRRAFLALDRVVRHVEPLLPKRLRQRAIRHAQAWCAERMNGEDGLGGIFPPIVYSYQMMDVLGYPDDHPLRRDCENALEKLLVTRPDGSMYCQPCLSPVWDTAWSTMALEQARGVAVPEAGAPASALDELDARIARAYDWLAERQVNDLRGDWIENAPADTQPGGWAFQYANPYYPDIDDSAVVTAMLDRRGRTHRNADGSHPYAARVARALDWMRGLQSRNGGFAAFDADCDRLYLNAIPFADHGALLDPPTEDVSGRVLLCFGVTKRADDRASLARAIDYVKRTQQPDGSWWGRWGTNYLYGTWSVLAGLALAGEDPSQPYIARALAWLRARQHADGGWGETNDSYIDPALAGTNAGESTSNCTAWALLAQMAFGDGESESVRRGIAYLQSVQQDDGFWWHRSHNAPGFPRIFYLKYHGYTAYFPLWALARYRRLAGGVSAAGAHAVPASTGADAALA
配列番号１５３（炭疽菌（Bacillus anthracis））
MLLYEKAHEEIVRRATALQTMQWQDGTWRFCFEGAPLTDCHMIFLLKLLGRDKEIEPFVERVASLQTNEGTWKLHEDEVGGNLSATIQSYAALLASKKYTKEDANMKRAENFIQERGGVARAHFMTKFLLAIHGEYEYPSLFHLPTPIMFLQNDSPFSIFELSSSARIHLIPMMLCLNKRFRVGKKLLPNLNHIAGGGGEWFREDRSPVFQTLLSDVKQIISYPLSLHHKGYEEIERFMKERIDENGTLYSYATASFYMIYALLALGHSLQSSMIQKAIAGITSYIWKMERGNHLQNSPSTVWDTALLSYALQEAQVSKDNKMIQNATAYLLKKQHTKKADWSVHAPALTPGGWGFSDVNTTIPDIDDTTAVLRALARSRGNKNIDNAWKKGGNWIKGLQNNDGGWGAFEKGVTSKLLAKLPIENASDMITDPSTPDITGRVLEFFGTYAQNELPEKQIQRAINWLMNVQEENGSWYGKWGICYLYGTWAVMTGLRSLGIPSSNPSLTRAASWLEHIQHEDGGWGESCHSSVEKRFVTLPFSTPSQTAWALDALISYYDTETPAIRKGVSYLLSNPYVNERYPTGTGLPGAFYIRYHSYAHIYPLLTLAHYIKKYRK
配列番号１５５（フランキア・アルニ（Frankia alni））
MPAGVGVLVWLDQRLRAMGRPDLVTTTGGAEIPFVLVAATASTVGVALALRRPRHPVGWLFLALGGVLLLSGGTQGYAAYGAVARPGRLPAADLVAIYADAGFIPWLVLVALILHLTPTGRPLSARWGRIALATAVAGGLWLLVGLVTTETMQPPFQSVTNPLLIGGPLGPLLVARRVLGLATGAGVVLAAVSLIVRFRRSVDVERRQLLWVAVAAVPLPVLMAASFAASYAGNNTAAGLAAATLIGLLAIGAGLAIGQYHLYDVEEILSRAVTYLLVSGLLAASYATVVIVVGQSLAGRTGRSQISAVLATLAAVAVTAPAYRKIQEGVDRRFSRRRFETLQVIRRYLRDPDPDVAVEEVLRRALGDPTLAVAYLVDDRRQWVSADGQPANPGNSFMAAVEVYRRGRPIARVTFDRGRAQPGLVRAAATAATAELDNAGLRAAVALQLVEVRQSRTRIAAAQFAERRTIERNLHDGAQQRLLALALQLRAVQLGGDEASLRQAISTGIDQLQAAVVELRELANGLHPAVLADGGLAAALDDVAARTPVPIKISAPDRRYPPDLEAAAWFIACEAMANAVKHAHPTTIAVDVSAPDGQLIVEVRDDGIGGAQPSGPGLRGIADRAEAFGGSLTVHTDPGTGTTIRALLHRRSPLSSGRRSVMIEGCVDVVAVRRFRCRSSRGSGSRRRRSSWRCGGICGSRCRTGMSRSCSRNAASKLIT
配列番号１５７（ロドシュードモナス・パレント（Rhodopseudomonas patent））
MDSILAPRADAPRNIDGALRESVQQAADWLVANQKPDGHWVGRAETNATMEAQWCLALWFLGLEDHPLRVRLGRALLDTQRPDGAWHVFYGAPNGDINATVEAYAALRSLGHRDDEEPLRKARDWILSKGGLANIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNILPEVIWLPTWFPFSIYNFAQWARATLMPIAVLSAHRPSRPLAPQDRLDALFPQGRDSFNYDLPARLGAGVWDVIFRKIDTILHRLQDWGARRGPHGIMRRGAIDHVLQWIIRHQDYDGSWGGIQPPWIYGLMALHTEGYAMTHPVMAKALDALNEPGWRIDIGDATFIQATNSPVWDTMLSLLAFDDAGLGERYPEQVERAVRWVLKRQVLVPGDWSVKLPDVKPGGWAFEYANNFYPDTDDTSVALMALAPFRHDPKWQAEGIEDAIQRGIDWLVAMQCKEGGWGAFDKDNDKKILAKIPFCDFGEALDPPSADVTAHIIEAFAKVGLDRNHPSIVRALDYLKREQEPEGPWFGRWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMRQPYIARACDWLIARQQANGGWGESCVSYMDAKQAGEGTATASQTAWALMALIAADRPQDRDAIERGCLYLTETQRDGTWQEVHYTGTGFPGYGVGQTIKLNDPLLSKRLMQGPELSRSFMLRYDLYRHYFPMMAIGRVLRQRGDRSGH
配列番号１５９（ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor））
MTATTDGSTGASLRPLAASASDTDITIPAAAAGVPEAAARATRRATDFLLAKQDAEGWWKGDLETNVTMDAEDLLLRQFLGIQDEETTRAAALFIRGEQREDGTWATFYGGPGELSTTIEAYVALRLAGDSPEAPHMARAAEWIRSRGGIASARVFTRIWLALFGWWKWDDLPELPPELIYFPTWVPLNIYDFGCWARQTIVPLTIVSAKRPVRPAPFPLDELHTDPARPNPPRPLAPVASWDGAFQRIDKALHAYRKVAPRRLRRAAMNSAARWIIERQENDGCWGGIQPPAVYSVIALYLLGYDLEHPVMRAGLESLDRFAVWREDGARMIEACQSPVWDTCLATIALADAGVPEDHPQLVKASDWMLGEQIVRPGDWSVKRPGPPGGWAFEFHNDNYPDIDDTAEVVLALRRVRHHDPERVEKAIGRGVRWNLGMQSKNGAWGAFDVDNTSAFPNRLPFCDFGEVIDPPSADVTAHVVEMLAVEGLAHDPRTRRGIQWLLDAQETDGSWFGRWGVNYVYGTGSVIPALTAAGLPTSHPAIRRAVRWLESVQNEDGGWGEDLRSYRYVREWSGRGASTASQTGWALMALLAAGERDSKAVERGVAWLAATQREDGSWDEPYFTGTGFPWDFSINYNLYRQVFPLTALGRYVHGEPFAKKPRAADAPAEAAPAEVKGS
配列番号１６９
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアント101A10（配列番号３０）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCACCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCATTACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアント101A10（配列番号２９）
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVHYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGYPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
バリアント111C8（（配列番号２８）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCGCGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCGTCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアント111C8（配列番号２７）
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGAWALYPGGPPDLDTTVEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVLTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
バリアントSHC215G2（配列番号２２）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC215G2（配列番号２１）
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
バリアントSHC3（配列番号２６）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC3（配列番号２５）
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGYPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
バリアントSHC10（配列番号３２）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC10（配列番号３１）
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVLTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
バリアントSHC26（配列番号２４）
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バリアントSHC26（配列番号２３）
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バリアントSHC30（配列番号３４）
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バリアントSHC30（配列番号３３）
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バリアントSHC31（配列番号３６）
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バリアントSHC31（配列番号３５）
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バリアントSHC32（配列番号３８）
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バリアントSHC32（配列番号３７）
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バリアントSHC33（配列番号４０）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGCTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTACCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
バリアントSHC33（配列番号３９）
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バリアントF605W（配列番号１７０）
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バリアントF605W（配列番号１７１）
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDWYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
配列番号１６６（ZmoSHC1）
ATGGGTATTGACAGAATGAATAGCTTAAGTCGCTTGTTAATGAAGAAGATTTTCGGGGCTGAAAAAACCTCGTATAAACCGGCTTCCGATACCATAATCGGAACGGATACCCTGAAAAGACCGAACCGGCGGCCTGAACCGACGGCAAAAGTCGACAAAACGATATTCAAGACTATGGGGAATAGTCTGAATAATACCCTTGTTTCAGCCTGTGACTGGTTGATCGGACAACAAAAGCCCGATGGTCATTGGGTCGGTGCCGTGGAATCCAATGCTTCGATGGAAGCAGAATGGTGTCTGGCCTTGTGGTTTTTGGGTCTGGAAGATCATCCGCTTCGTCCAAGATTGGGCAATGCTCTTTTGGAAATGCAGCGGGAAGATGGCTCTTGGGGAGTCTATTTCGGCGCTGGAAATGGCGATATCAATGCCACGGTTGAAGCCTATGCGGCCTTGCGGTCTTTGGGGTATTCTGCCGATAATCCTGTTTTGAAAAAAGCGGCAGCATGGATTGCTGAAAAAGGCGGATTAAAAAATATCCGTGTCTTTACCCGTTATTGGCTGGCGTTGATCGGGGAATGGCCTTGGGAAAAGACCCCTAACCTTCCCCCTGAAATTATCTGGTTCCCTGATAATTTTGTCTTTTCGATTTATAATTTTGCCCAATGGGCGCGGGCAACCATGGTGCCGATTGCTATTCTGTCCGCGAGACGACCAAGCCGCCCGCTGCGCCCTCAAGACCGATTGGATGAACTGTTTCCAGAAGGCCGCGCTCGCTTTGATTATGAATTGCCGAAAAAAGAAGGCATCGATCTTTGGTCGCAATTTTTCCGAACCACTGACCGTGGATTACATTGGGTTCAGTCCAATCTGTTAAAGCGCAATAGCTTGCGTGAAGCCGCTATCCGTCATGTTTTGGAATGGATTATCCGGCATCAGGATGCCGATGGCGGTTGGGGTGGAATTCAGCCACCTTGGGTCTATGGTTTGATGGCGTTACATGGTGAAGGCTATCAGCTTTATCATCCGGTGATGGCCAAGGCTTTGTCGGCTTTGGATGATCCCGGTTGGCGACATGACAGAGGCGAGTCTTCTTGGATACAGGCCACCAATAGTCCGGTATGGGATACAATGTTGGCCTTGATGGCGTTAAAAGACGCCAAGGCCGAGGATCGTTTTACGCCGGAAATGGATAAGGCCGCCGATTGGCTTTTGGCTCGACAGGTCAAAGTCAAAGGCGATTGGTCAATCAAACTGCCCGATGTTGAACCCGGTGGATGGGCATTTGAATATGCCAATGATCGCTATCCCGATACCGATGATACCGCCGTCGCTTTGATCGCCCTTTCCTCTTATCGTGATAAGGAGGAGTGGCAAAAGAAAGGCGTTGAGGACGCCATTACCCGTGGGGTTAATTGGTTGATCGCCATGCAAAGCGAATGTGGCGGTTGGGGAGCCTTTGATAAGGATAATAACAGAAGTATCCTTTCCAAAATTCCTTTTTGTGATTTCGGAGAATCTATTGATCCGCCTTCAGTCGATGTAACGGCGCATGTTTTAGAGGCCTTTGGCACCTTGGGACTGTCCCGCGATATGCCGGTCATCCAAAAAGCGATCGACTATGTCCGTTCCGAACAGGAAGCCGAAGGCGCGTGGTTTGGTCGTTGGGGCGTTAATTATATCTATGGCACCGGTGCGGTTCTGCCTGCTTTGGCGGCGATCGGTGAAGATATGACCCAGCCTTACATCACCAAGGCTTGCGATTGGCTGGTCGCACATCAGCAGGAAGACGGCGGTTGGGGCGAAAGCTGCTCTTCCTATATGGAGATTGATTCCATTGGGAAGGGCCCAACCACGCCGTCCCAGACTGCTTGGGCTTTGATGGGGTTGATCGCGGCCAATCGTCCCGAAGATTATGAAGCCATTGCCAAGGGATGCCATTATCTGATTGATCGCCAAGAGCAGGATGGTAGCTGGAAAGAAGAAGAATTCACCGGCACCGGATTCCCCGGTTATGGCGTGGGTCAGACGATCAAGTTGGATGATCCGGCTTTATCGAAACGATTGCTTCAAGGCGCTGAACTGTCACGGGCGTTTATGCTGCGTTATGATTTTTATCGGCAATTCTTCCCGATTATGGCGTTAAGTCGGGCAGAGAGACTGATTGATTTGAATAATTGA
Figure 2023015116000025
Figure 2023015116000026
Figure 2023015116000027
Figure 2023015116000028
本開示のより良い理解のために、付属の図面が参照される。
図１～４は、AacSHCの配列番号１に対する選択されたAacSHC誘導体の配列アラインメントを示す。掲載の降順に、図１の配列番号は、配列番号１、配列番号２９、配列番号２７、配列番号２１、配列番号１９、配列番号９、配列番号２３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、および配列番号３９である。 図５はプラスミドマップを示す。 図６は、標準的な条件下（ｐＨ６．０、５５℃、０．０５０％ＳＤＳ、ＯＤ６５０ｎｍが１０の細胞）における表２４に記されている野生型AacSHCおよびAacSHC誘導体の相対的なHAC活性を示す。 図７ａは、WT AacSHCに対するAacSHC誘導体のHAC活性プロファイルを、ホモファルネソールの質ＥＥＨ：ＥＺＨ８７：１３を用い、ホモファルネソールの純度９６％（ＮＭＲを用いて決定された）において示す。図７ｂは、AacSHC誘導体のWT SHCに対する相対的な改善（４ｈ（初期速度）および２２ｈの収率）を、ホモファルネソールの質ＥＥＨ:ＥＺＨ８７：１３を用い、ホモファルネソールの純度９６％（ＮＭＲを用いて決定された）において示す。 図８ａは、WT AacSHCに対するAacSHC誘導体のHAC活性プロファイルを、ホモファルネソールの質ＥＥＨ：ＥＺＨ９２：０８を用い、ホモファルネソールの純度１００％（ＮＭＲを用いて決定された）において示す。図８ｂは、WT SHCに対するAacSHC誘導体の相対的な改善（４ｈ（初期速度）および２２ｈの収率）を、ホモファルネソールの質ＥＥＨ：ＥＺＨ９２：０８を用い、ホモファルネソールの純度１００％（ＮＭＲを用いて決定された）において示す。 図９ａは、WT AacSHCに対する表２４に記されているAacSHC誘導体のHAC活性プロファイルを、ホモファルネソール品質ＥＥＨ：ＥＺＨ６６：３３を用い、ホモファルネソールの７６％純度（ＮＭＲを用いて決定された）において示す。図９ｂは、WT SHCに対するAacSHC誘導体の相対的な改善（４ｈ（初期速度）および２２ｈの収率）を、ホモファルネソール品質ＥＥＨ：ＥＺＨ６６：３３を用い、ホモファルネソールの７６％純度（ＮＭＲを用いて決定された）において示す。 図１０は、野生型AacSHC／HAC酵素に対しておよそ１０倍（215G2）、７倍（SHC26）、および６倍（SHC32）の改善を示す３つのSHC誘導体についてHAC活性結果を示す。 図１１は、SHC／HAC誘導体（215G2 SHC）およびWT AacSHCによって観察されたアンブロックスへのＥ，Ｅ－ホモファルネソール変換を示す。７時間の反応において（初期反応速度の概算）、バリアント215G2 SHCによる変換は野生型SHCによって達成されたものよりも１３倍高かった。４８時間の反応においては、バリアントによる変換は野生型酵素のものの約８倍であった。 図１２は、（WT SHCおよび／またはSHC／HAC誘導体による生物変換に）ＥＥＨが出発材料として用いられるときに産生される反応生成物（アンブロックスおよび生成物（ＩＶ））、ならびにＥＥ：ＥＺが出発材料として用いられるときに産生される反応生成物（（－）－アンブロックス（Ｉ）ならびに生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）（表２１参照））を示している。参照の便宜のために、化合物Ｉ～ＩＶは下記のように同定され得る。 Ｉ：（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）－３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フラン（－）－アンブロックス ＩＩ：（７ａＳ，１１ａＳ，Ｚ）－５，８，８，１１ａ－テトラメチル－２，３，６，７，７ａ，８，９，１０，１１，１１ａ－デカヒドロベンゾ［ｂ］オキソニン ＩＶ：（３ａＳ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＳ）－３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フラン ＩＩＩ：（３ａＲＳ，５ａＳＲ，９ａＳＲ，９ｂＳＲ）－３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フラン９－エピ－アンブロックス。 図１３は、表２５のアンブロックスならびに生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）について反応生成物のＧＣ分析を示している。 図１４は、表２５のアンブロックスならびに生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）について反応生成物のＧＣ分析を示している。 図１５は、Triton X-100またはＳＤＳどちらかの存在下における全細胞生物変換アッセイによる215G2 SHCバリアント活性について、比較データを提供している。 図１６は、異なるＳＤＳ／細胞比について、変換されたＥＥＨのパーセントを示す。 図１７は、３つの異なるＳＤＳ濃度について、標準的な生物変換反応（例７に記載されている）におけるＥＥＨ変換の％を示す。 図１８は、３つの異なるｐＨ値について、標準的な生物変換反応（例７に記載されている）におけるＥＥＨ変換の％を示す。 図１９は、SHC結晶構造上のSHC／HACバリアント101A10、111C8、および215G2の同定された変異の位置を示す（カラー）。バリアント215G2は赤色、バリアント101A10は紫色（ワインレッド）、バリアント111C8は緑色である。増大した活性の要因であると同定されたアミノ酸については、側鎖が共結晶化した基質アナログにおいて黄色で強調されている。改善されていない活性を有する同定されたバリアントの他の変異は青色でマークされている。青色の変異は酵素の２つのドメイン上に約半々（すなわち５０：５０）で散在しており、その一方で、同定された有益なAacSHC変異は大部分が（１つを別にして）ドメイン２内に位置するということが着目される。唯一の例外は変異Ｆ６０１Ｙであり、これは活性部位の近傍にある。 図２０は下記変異を示す（白黒）。SHC／HAC活性に及ぼす有益な効果を有さない変異は黒色で示されており、これらはSHC酵素の２つのドメイン上に散在している。改善されたSHC／HAC活性を示すSHCバリアント（101A10、111C8、および215G2）中の同定された変異は灰色で示されており、たった１つの例外があるが、これらはSHC酵素のドメイン２内に位置する。バリアントの改善された活性に寄与する変異の側鎖は強調されている。 図２１はプラスミドpET-28a(+)のクローニングおよび発現領域を示す。図２１の配列における配列番号は下記の通りである。pET28a（ヌクレオチド配列）：配列番号１７９、pET28a（アミノ酸配列）：配列番号１８０、pET28b（ヌクレオチド配列）：配列番号１８１、pET28b（アミノ酸配列）：配列番号１８２、pET28c（ヌクレオチド配列）：配列番号１８３、およびpET28c（アミノ酸配列）：配列番号１８４。 図２２は、細胞３７５ｇ／ｌ、ＥＥＨ１８８ｇ／ｌ、ＳＤＳ２．３３％を含有する１．５×濃縮ＥＥＨ生物変換反応の、体積当たりの生産性を、平行してＥＥＨ１２５ｇ／ｌ、細胞２５０ｇ／ｌ、ＳＤＳ１．５５％において実施された標準の生物変換（例７）の体積当たりの生産性と比較して示している。 図２３は、例７に記載されているように実施された標準の生物変換（ＥＥＨ１２５ｇ／ｌ、細胞２５０ｇ／ｌ、ＳＤＳ１．５５％）を示す。クエン酸緩衝液ｐＨ５．４は０．５％または０．９％ＮａＣｌどちらかに取りかえたが、全ての他の反応パラメータは不変であった。クエン酸緩衝液中での生物変換を平行してコントロールとして実施した。 図２４は、トルエン洗浄による（－）－アンブロックスの固相抽出の経過を、２００ｍｌの全反応ブロス中に最初に存在した（－）－アンブロックス量の％として示す（体積比ブロス／トルエンのため、第１の抽出物における％は１００％を超える）。 図２５は、エタノール洗浄による（－）－アンブロックスの固相抽出の経過を、最初に存在した（－）－アンブロックス量のパーセントとして示す。４回の洗浄（合計６４０ｍｌのＥｔＯＨ、すなわち３．２×最初の全反応ブロス体積または８×固相体積）後に、反応ブロス中に最初に存在した（－）－アンブロックスの約９９％が回収された。
疑義の回避のために、WT SHCおよびSHCバリアントへの全ての言及はWT AacSHC（配列番号１）およびそのバリアント（例えば、表２３および／または表２４に挙げられている）への言及である。
例１
生体触媒産生
方法１
SHCプラスミド調製
アリシクロバチルス・アシドカルダリウス スクアレン－ホペンシクラーゼ（AacSHC）をコードする遺伝子をプラスミドpET-28a(+)に挿入した。そこでそれは大腸菌による蛋白質産生のためのＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターのコントロール下にある（図５および２１参照）。プラスミドを標準的なヒートショック形質転換プロトコールを用いて大腸菌株BL21(DE3)に形質転換した。
エルレンマイヤーフラスコ培養
蛋白質産生のためには、複雑な（ＬＢ）または最少培地どちらかを用いた。Ｍ９は最少培地の１つの例であり、これを用いて成功した。
培地調製
デフォルトとして選んだ最少培地は、３５０ｍｌ培養のために下記のように調製した。３５ｍｌクエン酸／リン酸ストック（１３３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、４０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１７ｇ／ｌクエン酸．Ｈ２Ｏ、ｐＨは６．３に調整）に３０７ｍｌのＨ２Ｏを加え、ｐＨは必要に応じて３２％ＮａＯＨで６．８に調整した。０．８５０ｍｌの５０％ＭｇＳＯ４をオートクレーブした後に、０．０３５ｍｌ微量元素溶液（次項の組成物）溶液、０．０３５ｍｌチアミン溶液、および７ｍｌの２０％グルコースを加えた。
SHC生体触媒産生（生体触媒産生）
小スケールの生体触媒産生（野生型SHCまたはSHCバリアント）、３５０ｍｌ培養（培地に５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補った）に、SHC産生プラスミドを含有する大腸菌株BL21(DE3)の前培養から植菌した。細胞は、一定の撹拌（２５０ｒｐｍ）をしながら３７℃でおよそ０．５の光学密度（ＯＤ６５０ｎｍ）まで増殖させた。
次いで、３００μＭの濃度のＩＰＴＧの添加によって蛋白質産生を誘導し、次に一定の振盪をしながらさらなる５～６時間のインキュベーションをした。得られたバイオマスは最終的に遠心によって集め、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５によって洗浄した。細胞はさらなる使用まで４℃または－２０℃でペレットとして保存した。一般的に、用いた培地からは独立して、培養１リットルから、２．５から４グラムの細胞（湿重量）が得られた。
発酵を調製し、７５０ｍｌのInforsHT反応容器内で実施した。発酵容器に脱イオン水１６８ｍｌを加えた。反応容器には全ての必要なプローブ（ｐＯ２、ｐＨ、サンプリング、消泡剤）、Ｃ＋Ｎフィード（feed）および水酸化ナトリウムのボトルを用意し、オートクレーブした。オートクレーブの後に、反応容器に、
２０ｍｌ １０×リン酸／クエン酸緩衝液
１４ｍｌ ５０％グルコース
０．５３ｍｌ ＭｇＳＯ４溶液
２ｍｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４溶液
０．０２０ｍｌ 微量元素溶液
０．４００ｍｌ チアミン溶液
０．２００ｍｌ カナマイシンストック
を加えた。
実施パラメータは下記の通りであった。ｐＨ＝６．９５、ｐＯ２＝４０％、Ｔ＝３０℃、３００ｒｐｍでの撹拌。カスケード：３００でのｒｐｍセットポイント、ｍｉｎ３００、ｍａｘ１０００、フロー（flow）ｌ／ｍｉｎセットポイント０．１、ｍｉｎ０、ｍａｘ０．６。消泡剤コントロール：１：９。
種培養から、発酵槽に０．４～０．５のＯＤ６５０ｎｍになるよう植菌した。この種培養をＬＢ培地（＋カナマイシン）中で３７℃、２２０ｒｐｍで８ｈ増殖させた。発酵は最初にバッチモードで１１．５ｈ実施し、その後にフィード溶液（滅菌グルコース溶液（１４３ｍｌ Ｈ２Ｏ＋３５ｇグルコース）によるＣ＋Ｎフィードを開始した。これには、滅菌の後に、１７．５ｍｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液、１．８ｍｌのＭｇＳＯ４溶液、０．０１８ｍｌ微量元素溶液、０．３６０ｍｌチアミン溶液、０．１８０ｍｌカナマイシンストックが添加されていた。およそ４．２ｍｌ／ｈの一定の流速でフィードを実施した。グルコースおよびＮＨ４ ＋測定が外部からなされて、培養物中のＣおよびＮ源の利用可能性を評価した。通常は、グルコースレベルは非常に低いままである。
培養は合計およそ２５時間増殖させ、そこでそれらは典型的には４０～４５のＯＤ６５０ｎｍに達した。それから、（ＩＰＴＧパルスとして、または注入シリンジを用いて３～４時間の期間かけて）発酵槽にＩＰＴＧをおよそ１ｍＭの濃度に追加し、温度を４０℃に、ｐＯ２を２０％に設定することによってSHC産生を開始した。SHC産生の誘導は４０℃で１６ｈ続いた。誘導の終了時に、細胞を遠心によって集め、０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４によって洗浄し、さらなる使用まで４℃または－２０℃でペレットとして保存した。
結果１ａ
一般的に、全ての他の条件は不変で、産生された生体触媒の特異的活性は、複雑な培地と比較して最少培地を用いたときにより高かった。誘導は３０または３７℃で成功した。誘導が４０～４３℃でなされたときには、より高い特異的活性の生体触媒が得られたということが着目された。
結果１ｂ
下記表２２は、２つの例について、誘導開始および誘導終了両方における培養体積、光学密度、および細胞の量と、集められたバイオマスの量（湿重量）とを示している。
Figure 2023015116000029
例２
SHCバリアントの調製および活性スクリーニング
方法２
疑義の回避のために、ＥＥは（３Ｅ，７Ｅ）に対応し、ＥＺ混合物は（３Ｚ，７Ｅ）に対応し、ＺＥは（７Ｚ，３Ｅ）に対応し、ＺＺは（７Ｚ，３Ｚ）に対応し、ＥＥＨは（３Ｅ，７Ｅ）に対応する。
酵素進化プログラムを、野生型（WT）アリシクロバチルス・アシドカルダリウスSHC（AacSHC）遺伝子をテンプレートとして用いて行った（GenBank M73834、Swissprot P33247）。約１０５００個のSHCバリアントのライブラリーを産生し、増大したＥＥＨ環化能力を示すバリアントについてスクリーニングした。スクリーニングは４ｇ／ｌのＥＥＨおよび０．０５０％ＳＤＳを含有するクエン酸緩衝液ｐＨ６．０（０．１５０ｍｌ）中での反応において５５℃で一定の撹拌下において実施した。
検証のために選択されたヒットしたものによって、標準的な試験を４ｇ／ｌのＥＥＨ、０．０５０％ＳＤＳ、１０．０のＯＤ６００ｎｍのSHCバリアントを発現した細胞を含有するクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中において実施した。最終的な体積は１ｍｌであり、反応は５５℃でインキュベーションし、マグネティックスターラー上で激しく撹拌した。経時的な反応のサンプリングは、ガスクロマトグラフィー分析（下の分析方法参照）によって決定される活性プロファイル（（－）－アンブロックスへのＥＥＨ変換）を検討することを可能にした。
この検証ラウンドから、改善されたＥＥＨ環化活性を有する３つのバリアント（101A10、111C8、および215G2）を得て、次いでそれらの３つのバリアント中に合計８つの変異を同定した。それから変異研究を実施して、それらの変異のどれがアンブロックスへのＥＥＨ環化に関して有益であるのかを同定した。このAacSHC誘導体に加えて、別のAacSHCバリアントを構築し、これは同定された有益な変異の全てを含有した（下の表２３に概説されているSHC33）。スクリーニング条件は４ｇ／ｌのＥＥＨ、ＯＤ６５０ｎｍが１０．０の細胞、０．０５％および０．１％のＳＤＳ（２つの濃度）であり、反応は５５℃で一定の撹拌下において実施した。
結果２ａ
Figure 2023015116000030
結果２ｂ
３つの選択された変異（101A10、111C8、および215G2）のうち、215G2が最良の活性を示した。
例３
SHCバリアントの最適化した反応条件
検討した反応パラメータ：温度、ＳＤＳ濃度、およびｐＨ
方法３
表２３において同定されているSHCバリアント誘導体の反応条件を、温度、ｐＨ、およびＳＤＳ濃度に関して個々に最適化した。この目的のために、大腸菌細胞を個々のバリアントの産生のためのプラスミドによって形質転換し、それらをエルレンマイヤーフラスコ中で培養し、上に記載されているようにSHC産生を誘導した。このやり方で、全ての培養物が同じかまたは非常に類似のSHC量を含有するということを確実にした。細胞を遠心によって集め、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によって洗浄し、さらに用いられるまで－２０℃で保存した。
結果３
この最適化研究の結果は下の表にまとめられている。最適化ラウンドはまた野生型SHCについても行った。
下記表２４は、野生型と、それぞれのSHC／HAC誘導体酵素の特徴が考慮されたバリアントのそれぞれとについて至適反応条件を示す。
Figure 2023015116000031
考察３
例３は、WT SHCと比較して、SHC誘導体の反応条件の着目された違いを示している。至適温度、ｐＨ、およびＳＤＳ濃度について、野生型SHCからのかなりの偏差がSHCバリアントで観察された。少数の変異のみが、至適な生物変換反応条件に対する顕著な効果を有する。選択されたSHCバリアントの個々の反応条件の決定のために、反応を、ＥＥＨの４ｇ／ｌの基質の投入および１０．０の光学密度ＯＤ６５０ｎｍの野生型またはSHC誘導体を産生した細胞で実施した。
温度
表２４のデータは、WT SHC酵素が５５℃において（４５～６０℃の範囲内において）至適活性を有する一方で、いくつものSHC誘導体が３５℃（３４～５０℃）において至適活性を有するという驚くべき発見を示している。より低い反応温度においてＥ，Ｅ－ホモファルネソールから（－）－アンブロックスを調製するための方法への本開示のSHC誘導体の適用は、産業スケールでの（－）－アンブロックスの産生にとってかなりのコスト利点を有する。
可溶化剤
生物変換反応において有用でなかった潜在的可溶化剤の長いリストから、ＳＤＳを選択および同定した（より多くの情報は例１４参照）。ＳＤＳは、反応速度および収率の観点から、（ＥＥＨ ４ｇ／ｌでの試験において、および例７において提供されているようにＥＥＨ １２５ｇ／ｌが用いられるときに両方とも）例えばTriton X-100よりも良い。
例４
標準的条件下におけるWT SHC酵素と比較したSHCバリアント活性試験
方法４
生体触媒の相対的活性を比較するために、バリアント（表２４に記されている）の産生を下記のように記載する。SHCバリアントの１種の産生のためのプラスミドによって大腸菌細胞を形質転換し、それから大腸菌細胞をＬＢ培地によって３７℃および２８０ｒｐｍで培養し、０．５０のＯＤ６５０ｎｍまで増殖させ、酵素産生をＩＰＴＧの添加によって誘導した。誘導は３７℃、２８０ｒｐｍで５．５時間続けた。細胞を遠心によって集め、０．１Ｍクエン酸ｐＨ６．０によって洗浄し、さらなる使用まで－２０℃で保存した。SHCバリアントの活性を比較するときには（図６参照）、反応混合物のサンプルを、反応のSHC含量を分析するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードする。この分析によって、全ての反応は同一量のSHC酵素を含有することが確認された。
結果４ａ
図６は、標準的な条件下における野生型およびSHCバリアントの相対的活性を示す（ｐＨ６．０、５５℃、０．０５０％ＳＤＳ、ＯＤ６５０ｎｍ１０の細胞）。野生型SHCおよび少なくとも本開示の例に従って試験されたSHCバリアントが溶媒に耐容性であることもまた着目された。これは、選択された水非混和性溶媒（最大でほぼ１００％）を生物変換反応に加え得るということを意味する。
結果４ｂ
215G2 SHCバリアントを用いると、ＮａＣｌが反応に添加されるときに（試験された濃度は５から１００ｍＭ（のみ））、このバリアントの活性に及ぼす着目すべき効果は観察されなかった。加えて、最大で１００ｍＭまたは最大で１５４ｍＭ（０．９％ＮａＣｌ）のＮａＣｌ添加は、バリアント215G2のSHC活性に対してネガティブな効果を示さなかった。これらの発見は、生物変換反応が生理的ＮａＣｌ溶液（０．９％）等の中で行われ、かつｐＨが適切な値（例えば約５．４（５．２～５．６））に維持される場合には、生物変換反応が緩衝液の非存在下において、生理的ＮａＣｌ溶液等の存在下において行われ得ることを示唆している。
考察４
図６は、（－）－アンブロックスへのＥＥＨ変換の観点から、選択されたバリアントおよび野生型SHC酵素の活性のランキングを図示する。
例５
WT SHCおよびSHC誘導体の活性プロファイル
方法５
活性試験を、０．１Ｍクエン酸緩衝液中において５ｍｌ体積で一定の振盪下において９００ｒｐｍでHeidolph Synthesis １装置にて実施した。用いた緩衝液のｐＨ、反応が実施された温度、および反応中のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）濃度は、用いられたSHCバリアント（野生型またはバリアント）に応じた。試験されたバリアントのそれぞれの至適条件は上の表２４にまとめられている。
純度９６％のホモファルネソール出発材料および８７：１３のＥＥＨ：ＥＺＨ比を有するホモファルネソール基質を用いた。
疑義の回避のために、ＥＥ：ＥＺ混合物は（（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｚ，７Ｅ）異性体の混合物である。
結果５
用いたホモファルネソール：ＥＥＨ：ＥＺＨ８７：１３、純度（ＮＭＲ）：９６％。
最適化した条件下において実施した標準的な試験の結果を、図７Ｂ（WT SHCに対するSHC誘導体の活性プロファイル）、およびWT SHCに対するSHC誘導体の相対的な活性の改善を示す図７Ａに示す（４ｈ（初期速度）および２２ｈでの収率）。
用いたホモファルネソール：ＥＥＨ：ＥＺＨ９２：０８、純度（ＮＭＲ）：１００％
最適化した条件下において実施した標準的な試験の結果を、図８Ｂ（WT AacSHCに対するAacSHC誘導体の活性プロファイル）、およびWT SHCに対するAacSHC誘導体の相対的な改善を示す図８Ａに示す（４ｈ（初期速度）および２２ｈでの収率）。
用いたホモファルネソール：ＥＥＨ：ＥＺＨ６６：３３、純度（ＮＭＲ）：７６％
最適化した条件下において実施した標準的な試験の結果を、図９Ｂ（WT AacSHCに対しする、表２４に記されているAacSHC誘導体の活性プロファイル）およびWT SHCに対するAacSHC誘導体の相対的な改善を示す図９Ａに示す（４ｈ（初期速度）および２２ｈでの収率）。
考察５
主な結論は、用いられたホモファルネソール基質の質からは独立して、４つの最良のSHC誘導体酵素が下記の順、215G SHC、SHC26、SHC32、およびSHC3でランク付けされたということであった。
例６
溶媒によって完全に抽出された反応から物質収支を決定する
方法６
全ての条件は不変で、それぞれのバリアントについて２つの反応を実施した。ホモファルネソールを基質として用いた。４時間および２２時間のインキュベーション後に、反応生成物および未反応の基質を、ｔｅｒｔ－ブチル－メチルエーテル（ＭＴＢＥ／ｔＢＭＥ）の等しい体積による合計６回の洗浄によって、バリアントのそれぞれについて完全に抽出した。洗浄のそれぞれのホモファルネソールおよびアンブロックスの含量をＧＣ分析によって決定した。形成されたアンブロックスおよび残りのホモファルネソールの合計量は、基準のアンブロックスおよびホモファルネソールから作られた溶液を用いて作成された較正曲線（calibration curve）から計算した。
結果６
図１０の結果は、用いた基質では、３つの最良のバリアントが野生型SHC酵素よりおよそ１０倍（215G2）、７倍（SHC26）、および６倍（SHC32）の改善を示すことが確認され、観察されたということを示した。
例７
１２５ｇ／ｌのＥ，Ｅ－ホモファルネソール（ＥＥＨ）におけるバイオトランスフォーメーションの性能
方法７
215G2 SHCバリアントを用いて、体積当たりの生産性を増大させるという目標に取り組んだ。一連の実験（ＤＯＥ）検討の設計を行い、パラメータのｐＨ、細胞濃度、およびＳＤＳ濃度を包含する試験反応条件を最適化した。反応条件は、ＥＥＨの１２５ｇ／ｌ（ＥＥ：ＥＺ８６：１４のホモファルネソールから）、細胞の２５０ｇ／ｌ、１．５５％ＳＤＳであり、反応は３５℃で０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．４中において実施された。
典型的な反応（１５０ｇの合計体積）を次のように０．７５リットルInfors発酵槽内にセットアップする。反応容器に、１８．７５ｇのＥＥＨに対応するホモファルネソールの適切な量を投入する。２．３３ｇのＳＤＳを、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．４中に調製された１５．５％（ｗ／ｗ）溶液から添加した。細胞を０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５．４中に懸濁することによって、215G2 SHCバリアントを産生した大腸菌細胞から細胞懸濁液を調製する。１０℃および１７２１０ｇでの１０分間の遠心によるこの懸濁液の細胞湿重量の決定の後に、３７．５ｇの細胞を反応に導入するために、細胞の適切な体積を反応容器に加える。反応の体積は、反応緩衝液の必要量によって１５０ｇに合わせる。反応を３７℃で一定の撹拌下において９００ｒｐｍで実施する。ｐＨ制御は水中の４０％クエン酸を用いて行う。反応を経時的にサンプリングし（１ｍｌ）、５倍体積のＭＴＢＥ／ｔＢＭＥ（５ｍｌ）によって抽出する。遠心による溶媒相の清澄化（卓上遠心機、１３０００ｒｐｍ、２分）、ＭＴＢＥ／ｔＢＭＥによる１０倍希釈の後に、反応のホモファルネソールおよびアンブロックス含量をＧＣ分析によって決定した。
同じ反応を、野生型SHC酵素を産生した大腸菌細胞により行った。このケースにおいては、反応は５５℃で０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中において実施された。この例の反応条件の概要は下の表２４ａの２行目に提供されている。下の表２４ａの１行目に示されている反応条件は以前の例（例えば例３～５）から取っている。
Figure 2023015116000032
結果７
図１１は、２つの酵素によるアンブロックスへの観察されたＥＥＨ変換を示している。７時間の反応において（初期反応速度の概算）、バリアント215G2 SHCによる変換は野生型SHCによって達成されたものよりも１３倍高かった。反応の４８時間において、バリアントによる変換は野生型酵素のものの約８倍であった。
一般的なコメント７
細胞濃度
この例に記載されている反応中の細胞の全ての濃度（ｇ／ｌ）は細胞の湿重量で示されている。細胞懸濁液の細胞の湿重量（ｇ／ｌ）としての濃度は、この細胞懸濁液のサンプルを１７２１０ｇかつ４℃で１０分間遠心した後に決定する。
細胞ｇ／ｌおよびＯＤ６５０ｎｍの間の相関
215G2 SHCまたはWT SHCによるＥＥＨ１２５ｇ／ｌの生物変換を用いると、この反応における２５０ｇ／ｌの細胞は、その反応における約１７２のＯＤ６５０ｎｍに対応する。異なる生体触媒調製物を試験したときには、ＯＤ６５０ｎｍ対生体触媒量の比の変動が観察された。生体触媒は、ＥＥＨ ４ｇ／ｌで標準的な試験に用いるが１０．０のＯＤ６５０ｎｍの細胞を適用したときには、ＯＤ６５０ｎｍ１０．０が細胞１．４５ｇ／ｌと同等であると概算された。
考察７
データは、当分野の開示と比較して比較的高いＥＥＨ基質濃度（１２５ｇ／ｌ）を用いた、最適化した効率的なHAC生物変換プロセスが開発されたということを示しており、ここで、大体０．２ｇ／ｌ（JP2009060799参照）から約２．３６ｇ／ｌ（１０ｍＭ）のホモファルネソール基質濃度が当分野においては開示されているのみである（WO2010/139719A2、US2012/0135477A1参照）およびSeitz et al (2012)同上）。
例８
ＧＣ解析
方法８
それらのＥＥＨおよびアンブロックスの含量の定量のために、サンプルを適切な体積のｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（ＭＢＴＥ／ｔＢＭＥ）によって抽出した。溶媒画分を、ガスクロマトグラフィーによる分析に先立って遠心によって水相から分離した。１μｌの溶媒相を３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍのZebron ZB-5カラムに注入した（スプリット比３）。カラムは、一定のフロー（４ｍｌ／分 Ｈ２）で、温度勾配１００℃、２００℃までは１５℃／分、２４０℃までは１２０℃／分、２４０℃で４分によって展開し、これはアンブロックス、ＥＥＨ、およびＥＺＨの分離をもたらした。流入（inlet）温度は２００℃であり、検出器温度：３００℃。
ＥＥＨ変換は、アンブロックスおよびＥＥＨに対応するピーク面積から下記式：
変換（％）＝１００×（面積アンブロックス＿ピーク／（面積アンブロックス＿ピーク＋面積Ｅ，Ｅ－ホモファルネソールピーク））
によって計算した。
反応生成物アンブロックスの同一性はＧＣ－ＭＳによって確認した（記録値および強度：m/z 221 (100％), m/z 97 (40％), m/z 137 (3.3％), m/z 43 (2.6％), m/z 41 (2.5％), m/z 55 (2.4％), m/z 95 (1.9％), m/z 67 (1.8％), m/z 81 (138％), m/z 222 (1.7％)）。
考察８
生成物回収は溶媒抽出または蒸気抽出／どちらかによって行った。用いた溶媒は例えばＭＴＢＥまたはヘキサン：イソプロパノール（３：２）であった。基質または生成物がもはや検出されなくなるまで、反応を溶媒の等しい体積によって繰り返し抽出し、溶媒画分をＧＣ分析した。一般的に、５から６回の洗浄が十分であった。代替的には、反応生成物の抽出は蒸気抽出／によってなされた。
例９
ワンポット反応
方法９
２００ｍｌの発酵を、上に記載されている標準的な増殖および誘導プロトコールを用いて、Ｎ－末HisTagを有する215G2 SHCの産生のためのpET28a(+) 215G2 SHCプラスミドによって形質転換された大腸菌BL21(DE3)によって実施した。誘導相の終了時に、通気をオフにし、温度を３５℃に、ｐＨをクエン酸によって５．５に、撹拌機の速度を５００ｒｐｍに設定した。培養物の体積は、培養増殖の間になされた全ての添加（フィードおよび基礎消費）から概算した。この体積および培養物のＯＤに従って、ＳＤＳの適切な量を発酵槽に加えた。ＥＥＨは４ｇ／ｌまで追加した。反応を経時的にサンプリングし、サンプル（１５０～３００μｌ）をＧＣ分析のために７００μｌのＭＴＢＥによって抽出した。ＥＥＨは直接的に培養ブロス中でアンブロックスに変換された。反応は合計２２．５日間実施し、その間にはＥＥＨを繰り返し添加した。
結果９
完了に達したときには、１０．６ｇのＥＥＨがアンブロックスに環化されていた。反応生成物(下で提供されている構造）を蒸気抽出／によって抽出し、反応混合物から定量的に回収した。
Figure 2023015116000033
 反応生成物についての注意書き
ホモファルネソールＥＥ：ＥＺ８７：１３がSHCによって変換されるときには、図１２に記されているように反応生成物アンブロックス、（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）が産生され、出発材料のＥＥ：ＥＺ比を反映する。
ＥＥＨが出発材料として用いられるときには、（－）－アンブロックス（Ｉ）および生成物（ＩＶ）のみが生じる。
ＥＺＨ（３Ｚ，７Ｅ）が出発材料として用いられるときには、生成物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のみが生じる。
しかしながら、ＥＥＨおよびＥＺＨの混合物が用いられるときには、アンブロックス（Ｉ）ならびに生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）が生じる。
ＥＥ：ＥＺ６６：３４の１００％の変換が起こる場合には、これは６６％：３４％の（（アンブロックス＋（ＩＶ））：（（ＩＩ）＋（ＩＩＩ））を提供するであろう。
水蒸気抽出が行われるときには、これは全ての４生成物、アンブロックスならびに生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）を抽出し、結晶化ステップにより純度９９％（ＧＣ）のアンブロックスを少なくとも７０％の収率で生じる。
考察９
データは、（－）－アンブロックスの産生が生物変換反応または「ワンポット」反応システムによって可能であるということと、アンブロックスの選択的な濃縮が蒸気抽出／および結晶化の後に達成されるということとを示している。
ホモファルネソール出発材料がＥＥおよびＥＺ（例えば８６：１４）異性体の混合物である場合には、２種の生成物がそれらの異性体（合計で４種）のそれぞれから生まれ、（－）－アンブロックスは粗生成物中の圧倒的に主要である構成成分、結晶化した材料（純度９９．１％）中の主要構成成分である。（＋）－アンブロックスは検出されなかった。
例１０
ＥＥ：ＥＺホモファルネソール混合物の変換
疑義の回避のために、ＥＥは（３Ｅ，７Ｅ）に対応し、ＥＺ混合物は（３Ｚ，７Ｅ）に対応し、ＺＥは（７Ｚ，３Ｅ）に対応し、ＺＺは（７Ｚ，３Ｚ）に対応し、ＥＥＨは（３Ｅ，７Ｅ）に対応し、ＥＺＨは（３Ｚ，７Ｅ）に対応する。
方法１０
ＥＥ：ＥＺ混合物を、下記反応条件下：下記ホモファルネソール基質（ＥＥ：ＥＺホモファルネソール混合物）を用い、合計ホモファルネソール１４６ｇ／ｌ、細胞２５０ｇ／ｌおよびＳＤＳ１．５５％において生物変換した。
ＥＥ：ＥＺ ８６：１４（この例では最も高いＥＥＨ含量）、
ＥＥ：ＥＺ ６９：３１（この例では最も低いＥＥＨ含量）、
ＥＥ：ＥＺ ８０：２０
ＥＥＨ：ＥＺＨ ７０：３０
７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚホモファルネソール混合物の生物変換
下記反応条件を用いて生物変換を始めた：
反応（１５０．１ｇの合計体積）はInforsHTの７５０ｍｌ発酵槽内において０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４中で実施し、合計ホモファルネソール１４６ｇ／ｌを含有し、８６：１４の７Ｅ，３Ｅ：７Ｅ，３Ｚの混合物であるホモファルネソール基質、細胞２５０ｇ／ｌ（例１の方法に従って産生された）、およびＳＤＳ１．５５％を用いた。反応は３５℃で一定の撹拌（８００ｒｐｍ）をしながら実施し、ｐＨコントロールは水中の１０から４０％クエン酸を用いて行った。反応混合物を経時的にサンプリングし、サンプルをＧＣ分析のために溶媒抽出した。ホモファルネソール変換がホモファルネソールの２種（ＥＥ：ＥＺ８６：１４およびＥＥ：ＥＺ６９：３１）で等しく速やかに起こったということが着目された。
結果１０
WT SHCおよび１つの特定のSHC誘導体（215G2 SHC）を用いるＥＥＨ：ＥＺＨ８６：１４材料からの１２５ｇ／ｌのＥ，Ｅ－ホモファルネソールの生物変換を行ったときに、Ｅ，Ｅ－およびＥ，Ｚ－ホモファルネソール両方の変換が観察された。すなわち、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス由来の野生型SHC酵素は、表２３からのSHCバリアントがＥＥＨ：ＥＺＨ混合物から産生するものと同じ反応生成物（すなわち、アンブロックス、生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ））をＥＥＨ：ＥＺＨ８６：１４材料から産生した。図１３および１４は反応生成物のＧＣ分析をアンブロックスならびに生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）について提供している。
考察１０
本開示に従うホモファルネソールからアンブロックスの生物変換は主要化合物として（－）－アンブロックスを産生するが、上で同定されているように（－）－アンブロックス以外の化合物（例えば化合物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ））をもまた産生することがあり、これは（－）－アンブロックス生成物に快い嗅覚的なノートを付与することもありまたはしないこともある。上で示されているように、選択的結晶化条件下において、アンブロックスは他の副生成物（（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ））から分離可能である。従って、生成物がネガティブな事でアンブロックス最終生成物の知覚特性に寄与する場合には、（－）－アンブロックス最終生成物からの生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および（ＩＩＩ）の選択的分離は、フレグランスまたはフレーバーまたは化粧品または消費者ケア製品としてのその価値を増大させる。知覚分析が、熟練の香水業者によって利用される良く確立された知覚試験を用いて行われる。（－）－アンブロックス最終生成物の純度は、生成物が単体で所望の知覚プロファイルの主な要因である場合には、生成物の嗅覚的質の指標であり得る。
例１１
ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ：ＺＺ－ホモファルネソール混合物からのＥＥＨ変換
方法１１
ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ：ＺＺ－ホモファルネソール４０：２６：２０：１４を、215G2 SHCを用いたＥＥＨ変換に基質として用いた。比較目的のために、ＥＥ：ＥＺ２：１または９３：０７の他のホモファルネソールをもまた用いた。
ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ：ＺＺ－ホモファルネソール混合物の変換を215G2 SHCバリアントで検討したが、最適化した条件下においてではない。反応条件は、１００ｍＭクエン酸緩衝液中のｐＨ５．８、０．１０％ＳＤＳ、４０℃であった。下記ＥＥＨ変換が観察され、全ての反応は一定の２ｇ／ｌのＥＥＨ（従って、様々な合計ホモファルネソール濃度）で実施した。
結果１１
次のホモファルネソール異性体混合物変換率が観察された。
ＥＥ：ＥＺ ２：１ ５０～５５％
ＥＥ：ＥＺ ９３：７ ７８％
ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ：ＺＺ ４０：２６：２０：１４ ６％
考察１１
観察された収率に加えて、データは、215G2 SHCバリアントが複雑なＥＥ：ＥＺ：ＺＥ：ＺＺホモファルネソール混合物からＥＥＨをアンブロックスに変換することが可能であるということを示している。予期されたように、より低い変換率がより低いアンブロックス収率からもたらされることが観察された。この結果は、ＥＥＨ以外のホモファルネソール異性体がSHC／HAC誘導体酵素へのアクセスについてＥＥＨと競合することがあり、それゆえに、ＥＥＨから（－）－アンブロックスへの変換については競合阻害剤および／または代替的な基質として作用し得るという見解と一致している。
例１２
Triton X-100およびＳＤＳを用いる全細胞生物変換の比較データ
方法１２
大腸菌ホスト細胞を、例４の方法４のプロトコールに従って増殖させた。215G2 SHCバリアントを用いる生物変換反応を例４の標準的な試験に従って行った。クエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ５．４中のＯＤ６５０ｎｍ１０．０の細胞と４ｇ／ｌのホモファルネソール基質、３５℃、および０．０７％のＳＤＳが、215G2 SHCバリアントにとって最も好適な反応条件として選ばれた。
結果１２
図１５は、０．００５％から０．４８％の濃度範囲のTriton X-100および０．０７％の濃度のＳＤＳを用いたときの全細胞生物変換アッセイにおける215G2 SHCバリアントの活性の比較を提供する。
考察１２
データは、Triton X-100での最高の活性がＳＤＳによって得られた活性の大体２０％にしか過ぎないことを示している。
例１３
ＳＤＳ／細胞比
方法１３
ＥＥＨ基質４ｇ／ｌ、215G2 SHC誘導体酵素を産生したＯＤ６５０ｎｍ５．０の細胞を用いて、例４の方法４に従って生物変換反応をセットアップした。
結果１３
結果は図１６に記されており、これは、異なるＳＤＳ／細胞比について変換されたＥＥＨパーセントを示している。
図１６は、異なるＳＤＳ／細胞比の値を用いて、（－）－アンブロックスへのＥＥＨ変換パーセントがＳＤＳ／細胞比に依存するということを示している。この比は、最大の変換を達成するために慎重に設定されなければならない。
例えばＳＤＳ濃度が低すぎる場合には、準至適なホモファルネソール変換が観察され得る。他方で、例えばＳＤＳ濃度が高すぎる場合には、生体触媒が、無傷の微生物細胞の破破壊および／またはSHC／HAC酵素の変性／不活性化どちらかによって影響されるというリスクがあり得る。１２５ｇ／ｌのＥＥＨおよび２５０ｇ／ｌの生体触媒を用いて例７の方法７に従って生物変換反応を行ったときには、最良の生物変換プロトコールは１６：１の［ＳＤＳ］／［細胞］比を示す。
考察１３
結果は、可溶化剤（ＳＤＳ）濃度、バイオマス量、および基質（ＥＥＨ）濃度の間にある程度の相互依存性があるということを示している。例として、ホモファルネソール基質の濃度が増大すると、効率的な生物変換反応が起こるために十分な量の生体触媒および可溶化剤（ＳＤＳ）が要求される。
例１４
生物変換反応への使用のための可能な可溶化剤の試験
方法１４
種々の可溶化剤（下の表２６に概説されている）を、標準的な試験と同じ条件を用いる215G2 SHCのＥＥＨ環化反応によって（４ｇ／ｌのＥＥＨ、１０．０のＯＤ６５０ｎｍの細胞）、ＳＤＳの可能な代用物として試験した。ＳＤＳをその至適濃度において（０．０６０～０．０７０％）、用いた他の可溶化剤（それらの化合物によってなされたスクリーニングから個々に至適であると決定された濃度において（下の表２６参照））と組み合わせることによって、活性（累積効果）を増強する可能性をもまた、標準的な試験を用いて試験した。加えて、水不溶性化合物を可溶化することを助けることが公知であるいくつかの「深共晶溶媒（deep eutectic solvent）」およびイオン性液体をもまた試験した。
結果１４
下記表２６は、どの可溶化剤（例えば、界面活性剤、洗剤、可溶性増強剤等）がこれまでのところ215G2 SHCのＥＥＨ環化反応によって試験されたかをまとめている。いかなるケースにおいても、０．０６０～０．０７０％の範囲内の濃度のＳＤＳを用いて行われたコントロール反応と比較して改善された活性はなかった。至適として定義された濃度において単独で用いられたそれらの化合物によって観察された活性は、ＳＤＳによるコントロール反応において得られたものの約２０％にしか過ぎなかった。可溶化剤が全く添加されなかったときには、２０％のＥＥＨ変換が達成されたということが着目された。ＳＤＳを用いかつさらなる可溶化剤を（試験において至適と定義された濃度で）加えたときには、相乗効果は観察されなかった。むしろ、ＥＥＨ変換パーセントの減少が観察された。試験した条件下においては、化合物がＥＥＨ変換を全く改善せず、むしろ環化に対して悪影響がみられるということと、ＳＤＳが研究された可溶化剤のなかで最も有用であるということとが研究から結論付けられ得る。加えて、水不溶性化合物を可溶化することを助けることが公知である「深共晶溶媒」およびイオン性液体を用いる試験からはポジティブな結果は得られなかった。
Figure 2023015116000034
考察１４
出願人は、本開示のホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの生物変換反応に有用ではないと示されていた他の可溶化剤の長いリストから、有用な可溶化剤としてＳＤＳを選択および同定した。
例１５
生物変換反応におけるＳＤＳ濃度に対する感受性
方法１５
適用される条件は、１２５ｇ／ｌでの２５０ｇ／ｌの生体触媒および１．５５％ＳＤＳによる標準的な生物変換の条件（例７に記載されている）である。２つの他のＳＤＳ濃度（１．４０％および１．７０％ＳＤＳもまた試験した）。全てのＳＤＳ濃度は重量／重量％である。
１２５ｇ／ｌでの２５０ｇ／ｌの生体触媒および１．５５％ＳＤＳによる標準的な生物変換反応条件（例７に記載されている）は、異なるｐＨ値を試験するためにもまた用いた。コントロールは０．１Ｍクエン酸緩衝液中でｐＨ５．４において実施した。より低いｐＨで実施した反応は０．１Ｍ酢酸緩衝液によって実施した。
結果１５
図１７のデータは、生物変換反応が、ＥＥＨ ４ｇ／ｌおよびＯＤ６５０ｎｍ１０．０で適用された細胞での標準的な試験によってHAC活性が試験されたときよりもＳＤＳ濃度の変化に対して感受性でないようであるということを示している。
図１８のデータは、生物変換反応が適用されるときに、システムが、HAC活性がＥＥＨ４ｇ／ｌのおよびＯＤ６５０ｎｍ１０．０で適用された細胞での標準的な試験によって試験されるときよりもｐＨ変動に対して感受性でないように見えるということを示している。
考察１５
データは、試験したＳＤＳ濃度範囲およびｐＨ範囲に関して、ＥＥＨ １２５ｇ／ｌおよび細胞２５０ｇ／ｌでの生物変換反応の確実性を示している。
例１６
結晶構造上の同定されたSHC／HAC変異の位置
AacSHC／HACバリアント中の同定された変異の位置を図１９において下記のようにマークしている。バリアント215G2は赤色、バリアント101A10は紫色（ワインレッド）、バリアント111C8は緑色である。増大した活性の要因であると同定されたアミノ酸については、側鎖を共結晶化した基質アナログにおいて黄色で強調している。改善された活性を有さない同定されたバリアントの他の変異は青色でマークされている。青色の変異は酵素の２つのドメイン上に約半々（すなわち５０：５０）で散在しており、その一方で、同定された有益なAacSHC変異は大部分が（１つを別にして）ドメイン２内に位置するということが着目される。唯一の例外は変異Ｆ６０１Ｙであり、これは活性部位の近傍にある。SHC／HAC誘導体酵素215G2および111C8の両方のみを考える場合には、変異体の全てはドメイン２内に位置する。図２０は同じ情報を白黒で提供している。
結果１６
215G2、111C8、および101A10に対応する有益な変異体（赤色／緑色／紫色）の全ては大部分は（１つの変異体Ｆ６０１Ｙを別にして）、SHC結晶構造（図１９に提供されている）のドメイン２内に位置する（Wendt et al (1997) Science 277: 1811）。SHCの有益な変異の組み合わせは野生型AacSHC（配列番号１）に従って付番される。
考察１６
結晶構造は、特にホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換に関係して、望ましい構造／活性関係性を有するSHC／HAC誘導体を同定するために有用である。有用な予備選択ステップにより、SHC／HAC結晶構造（図１９および２０参照）のドメイン２内に位置するアミノ酸残基に対する選択を限定することであるかもしれない。
例１７
ホモファルネソールの調製
方法１７
一般的な分析条件
非極性ＧＣ／ＭＳ：５０℃／２分、２０℃／分２００℃、３５℃／分２７０℃。HP 7890AシリーズＧＣシステムを有するＧＣ／ＭＳアジレント5975C MSD。非極性カラム：SGEからのBPX5、５％フェニル９５％ジメチルポリシロキサン０．２２ｍｍ×０．２５ｍｍ×１２ｍ。キャリアガス：ヘリウム。インジェクター温度：２３０℃。スプリット１：５０。フロー：１．０ｍｌ／分。トランスファーライン：２５０℃。ＭＳ－四重極型：１０６℃。ＭＳソース：２３０℃。
Ａ）ＴＨＦ中のＭＮＵの調製
水中の尿素（１７５ｇ、２．９ｍｏｌ）およびメチルアミン塩酸塩（１９８ｇ、２．９ｍｏｌ）の溶液（４００ｍｌ）を撹拌下において３．５時間、加熱還流（１０５℃）した。４０℃で、水（２００ｍｌ）中に溶解したＮａＮＯ２（１０１ｇ、１．４５ｍｏｌ）を加える。１５分後に、ＴＨＦ（１０００ｍｌ）を加え、これは透明な２相混合物をもたらす。濃Ｈ２ＳＯ４（１１０ｇ、１．１ｍｏｌ）を０～５℃で加え、１．５ｈ以内で撹拌する。０～５℃でのさらなる０．５時間後に、２つの透明な相が２５℃において分離する。有機相（Ａ）（１０６５ｍｌ、理論上は１．３５Ｍ）は０～５℃で数日間保存するか、または直ちにシクロプロパン化反応装置に進む。
相分離の後に、水相をＴＨＦによって２回抽出する（２×１：１）。これにより相Ｂ１１００ｍｌおよび相Ｃ１０７５が得られる。相Ａは、引き続くシクロプロパン化反応において末端アルケンからシクロプロパンへの５１％の変換を生じる一方で、相Ｂは＜０．５％のシクロプロパンを生じ、相Ｃは検出可能な変換を生じない。我々は、＞９９％のＭＮＵが最初の相分離の後に抽出されると結論づける。それゆえに、通常は、水相は、（有機相Ａから）最初の相分離の後に、濃ＫＯＨ水溶液および酢酸による処置後に捨てる。
Ｂ）ＴＨＦ中のＭＮＵを用いるＥ－Δファルネセンの調製
Figure 2023015116000035
 ＴＨＦ（１３６ｍｌ、１８４ｍｍｏｌ）中のＮ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア１．３５Ｍを、０℃において、０～５℃のＥ－ベータ－ファルネセン（ＣＡＳ１８７９４－８４－８）（２５ｇ、１２２ｍｍｏｌ）およびＫＯＨ水溶液（５０ｍｌ、４０％）の激しく撹拌した混合物に滴下添加する。ＭＮＵ溶液の４ｍｌの添加後に、０．５ｍｌジクロロメタン中に予め溶解したＰｄ（ａｃａｃ）２（７．４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、０．０２％）を加える。
残りのＭＮＵ溶液を０～５℃で４ｈかけて加える。この段階におけるＧＣは２８％の未変換Ｅ－β－ファルネセン、６５％の所望のモノシクロプロパン（上に示されている）、および３％のビスシクロプロパン化された化合物５を示した。２５℃での１６時間後に、酢酸（１００ｍｌ）を０～５℃で、次いでｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（２５０ｍｌ）を加える。相分離の後に、有機相を２ＭのＨＣｌ（２５０ｍｌ）によって洗浄し、水相をｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（２５０ｍｌ）によって抽出する。組み合わせた有機層を水（２×１００ｍｌ）、１０％ＮａＯＨ水溶液（２×１００ｍｌ）、および水（２×１００ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥し、濾過し、濃縮してやや黄色の液体２６．９ｇを得る。これは９％のＥ－β－ファルネセン、８２％の所望のモノシクロプロパン化合物、および６％のビスシクロプロパン化された副生成物を含有する。
所望の化合物は蒸留精製によってさらに単離され得る。１ｇのＫ２ＣＯ３（１ｇ）の添加および４０～６０ｍｂａｒでの３０ｃｍスチールコイルカラムによる蒸留により、１４７ｇのモノシクロプロパン化合物（６８％ｃｏｒｒ）を１３５～１４５℃で得る。画分をプールして、純度１００％の９２ｇモノシクロプロパン化合物を得る。
Ｅ－Δファルネセンの分析データ：
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 5.1 (2 m, 2 H), 4.6 (2 H), 2.2 (2 H), 2.1 (4 H), 2.0 (2 H), 1.7 (s, 3 H), 1.6 (2 s, 6 H), 1.3 (1 H), 0.6 (2 H), 0.45 (2 H) ppm. 13C-NMR (CDCl3, 400 MHz): 150.9 (s), 135.1 (s), 131.2 (s), 124.4 (d), 124.1 (d), 106.0 (t), 39.7 (t), 35.9 (t), 26.7 (t), 25.7 (q), 17.7 (q), 16.0 (d), 6.0 (t) ppm. GC/MS: 218 (2％, M+), 203 (5％, [M - 15]+), 175 (11％), 147 (31％), 134 (15％), 133 (20％), 121 (12％), 107 (55％), 95 (16％), 93 (30％), 91 (20％), 82 (11％), 81 (33％), 79 (42％), 69 (100％), 67 (22％), 55 (20％), 53 (21％), 41 (75％). IR (film): 3081 (w), 2967 (m), 2915 (m), 2854 (m), 1642 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1107 (w), 1047 (w), 1018 (m), 875 (s), 819 (m), 629 (w). Anal, calcd. for C16H26: C, 88.00; H, 12.00. Found: C, 87.80; H, 12.01.
Ｃ）（７Ｅ）－４，８，１２－トリメチルトリデカ－３，７，１１－トリエン－１－オール（（７Ｅ）－ホモファルネソール）の調製
圧力管内の（Ｅ）－（６，１０－ジメチルウンデカ－１，５，９－トリエン－２－イル）シクロプロパン（Ｅ－Δファルネセン）（１ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、ドデカン（０．２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、内部標準）、およびＬ－（＋）－酒石酸（１ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌下において１５０℃で加熱する。１８時間および完全な変換（ＧＣに従う）の後に、混合物を水（５０ｍｌ）およびトルエン（５０ｍｌ）に注ぐ。
相同士を分離し、水相をトルエン（５０ｍｌ）によって抽出する。組み合わせた有機層を濃Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）および濃ＮａＣｌ（２×５０ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させることにより、茶色がかった樹脂（１．３５ｇ）を得る。これを３０％ＫＯＨ水溶液（４．３ｍｌ）と混合し、２５℃で２時間撹拌する。ＧＣ分析から、内部標準に従って９６％の（７Ｅ）－４，８，１２－トリメチルトリデカ－３，７，１１－トリエン－１－オールの形成が判明する。Ｅ／Ｚ比６８：２２。Ｅ異性体の分析データは文献からのものと一致している。例えばP. Kocienski, S. Wadman J. Org. Chem. 54, 1215 (1989)参照。
結果１７
データは、（－）－アンブロックスへの生物変換にとって好適であるホモファルネソールの調製を示している。
考察１７
ホモファルネソールを調製するためのこのプロセスは２つの同時係属特許出願PCT/EP2014/072882（WO2015/059290）およびPCT/EP2014/072891（WO2015/059293）にもまた記載されており、その全体的な内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
例１８
ワンポット反応
この実験においては、（ｉ）215G2 SHCバリアントを産生する大腸菌株による発酵（例えば例１に記載されている）、次に（ｉｉ）直接的に発酵ブロス中でのＥＥＨ変換を行った。３つのパラメータ［細胞］、［ＥＥＨ］、および［ＳＤＳ］（ｇ／ｌ）は関連しているので、発酵の終了時に得られる細胞の濃度（ｇ／ｌ）に応じて、発酵ブロスの利用可能な体積中のパラメータ［ＥＥＨ］および［ＳＤＳ］を調整することが必要であった。目標は、１．５５％のＳＤＳ濃度において１２５ｇ／ｌのＥＥＨを、細胞２５０ｇ／ｌによって変換することであった。妥当な生物変換を可能にするためには、細胞は休止状態、グルコース枯渇の状態になければならない。通気をオフにした。
方法１８
発酵：
発酵の終了時の反応容器内の発酵ブロスの体積の極めて正確な決定を可能にするために、取り出されたサンプルの体積および発酵槽になされた全ての添加体積（フィード、塩基、酸．．．）を記録した。
発酵ブロス中の細胞濃度の決定：
細胞の湿重量（ｇ／ｌ）決定のために発酵ブロスのサンプル（５～１０ｍｌ）を一定の撹拌下において抜き取り、遠心管に入れた。サンプルの質量を記録した。サンプルを１７２１０ｇおよび４℃で１０分間遠心する（例えば１２０００ｒｐｍ、SS-34ローター、Sorvall RC3B遠心機）。上清を慎重なピペッティングによって取り出し、ペレットの質量を記録した。細胞の湿重量濃度をｇ細胞／ｌブロスまたはｇ細胞／ｇブロスとして決定する。
発酵槽内の発酵ブロスの体積は全ての添加および取り出しに従って決定した。発酵槽が秤上にある場合には、発酵ブロスの質量は秤量によって決定し、そうでない場合には１ｍｌ＝１ｇと仮定した。
必要とされるホモファルネソールおよびＳＤＳの量の決定：
発酵ブロスの決定された細胞濃度および体積に従って、例９に記載されている生物変換に記されているように、３つの間の同じ比、ＥＥＨ１２５ｇ／ｌ、細胞２５０ｇ／ｌ、１．５５％ＳＤＳを保つために反応容器に添加されるべきＥ，Ｅ－ホモファルネソールおよびＳＤＳの量を決定した。
生物変換をセットアップする：
１． 温度は３５℃に設定した。通気をオフにする。
２． 発酵ブロスに、計算された量のホモファルネソールを加えた。
３． ＳＤＳの必要とされる量を１５．５％ＳＤＳ水溶液のストック溶液から慎重に加えた。
４． 反応を８００ｒｐｍでおよそ１５分間、よく混合した。
５． 反応のｐＨを記録した（内部ｐＨ電極）。
６． サンプル（およそ１ｍｌ）を１５ｍｌファルコンチューブに抜き取った。およそ５ｍｌの脱イオン水を加え、徹底した混合の後に、外部校正した電極でｐＨを記録した。
７． 反応容器内のｐＨは８５％Ｈ３ＰＯ４を用いて段階的に５．４に設定した（外部校正した電極で測定される値）。一方で、外部電極でｐＨを定期的にコントロールすることは上に記載した（６．）。
８． ｐＨは、生物変換の間に例えば１０～２５％Ｈ３ＰＯ４および３２％ＮａＯＨを用いて制御した。
９． 反応のサンプリング：およそ１ｍｌの反応混合物を１５ｍｌファルコンチューブに入れた。およそ５ｍｌのＭＴＢＥを加える。サンプルを激しい振盪によって抽出した。
１０． 分注したものを卓上遠心機によって最大スピードで１分間遠心した（エッペンドルフチューブ）。溶媒相の１００μｌを９００μｌのＭＴＢＥを含有するＧＣバイアルに追加した。生物変換の第１日の間は、サンプルを１～１．５時間毎に取った。次の日からは、１日に３つのサンプルのみが取られた。
１１． 溶媒相の１μｌを、例８に記載されているようにそのアンブロックスおよびＥＥＨ含量について分析した。
１２． ＥＥＨ変換（％）を１００×（アンブロックス面積／（アンブロックス面積＋ＥＥＨ面積））として計算する。
結果１８
結果は、ワンポットの発酵＋ＥＥＨ変換がKLF2000反応容器（Bioengineering）内において１．９リットルのスケールで行われたということを示している。細胞２５１ｇ／ｌは、４７時間で≧９３％までの２３８ｇのＥＥＨ（２５１ｇ／ｌ細胞）の変換を可能にした。開始の９３ｈ後に測定したときに、変換は９９％であった。
類似のワンポット実験をInfors HT 0.751反応容器内で実施した。標準的なプロトコールを踏襲した発酵（例１）の後に、平行して同じプロトコールで実施した他の発酵から集められたリアクターの細胞を加えた。得られたブロス体積は４７９ｇであった。細胞濃度は３１３．７ｇ／ｌと決定され、これは１．２５×標準の生物変換の細胞濃度（２５０ｇ／ｌ細胞）であった。従って、ＥＥＨおよびＳＤＳを反応容器に追加した。７５．１ｇのＥＥＨ（この例においては１５７ｇ／ｌのＥＥＨと同等）が９０時間未満で９８％まで変換された。この結果は、実施される発酵が、215G2 SHCバリアントを十分に高い細胞密度で産生した細胞を提供する限り、ワンポット発酵＋ＥＥＨ変換を≧１２５ｇ／ｌのＥＥＨにおいて実施することが可能であるということを示している。
考察１８
有利には、基質の９９％変換が得られた。これは、高価な出発材料（例えばＥＥＨ）が用いられるときに商業的に非常に有用である。
例１９
体積当たりの生産性を増大させる．
方法１９
体積当たりの生産性をさらに増大させるために、細胞３７５ｇ／ｌ、ＥＥＨ １８８ｇ／ｌ、ＳＤＳ２．３３％を含有する１．５×濃縮した生物変換を実施した。標準の生物変換を平行してＥＥＨ １２５ｇ／ｌ、細胞２５０ｇ／ｌ、ＳＤＳ１．５５％（例７）で実施した。
２つの反応を、全ての他のパラメータは不変でInfors HT 0.7501反応容器内で実施した。
結果１９
図２２の結果は、開始７５時間後の変換パーセントが、１．５×生物変換において８８％ｖｓ．標準の生物変換において９５％であったということを示している。開始９６時間後のパーセントの変換は１．５×生物変換において９３％のＥＥＨ変換（convert）ｖｓ．標準の生物変換において９７％であった。１．５×生物変換によるパーセントの変換は、標準の生物変換によって得られたものの９６％であった。１．５×生物変換における撹拌は、油状のホモファルネソールが消え、固体反応生成物によって取りかわられるに連れて経時的により困難になるということが着目された。これは１．５×生物変換のやや低い変換レベルを説明し得る。より良い混合装置を備え付けた反応容器を用いることは、１．５×生物変換によるＥＥＨ変換を改善し得る。結果は、効率的な混合が達成される場合には、ＥＥＨ １８８ｇ／ｌ以上において生物変換を実施することが可能であるということを示している。撹拌効率はシステムの唯一の限定であるように見える。
（－）－アンブロックス生産性
「（－）－アンブロックス生産性」は、生物変換時間（すなわち、基質を加えた後の時間）の時間当たり、生体内変換のリットル当たりのグラムによる、回収可能な（－）－アンブロックスの量を言う。この点で、図２２を参照して、（－）－アンブロックス生産性は次のように計算される。
１２５ｇ／ｌのＥＥＨの生物変換（細胞 ２５０ｇ／ｌ）
１．２５ｈの生産性：時間当たりリットル当たり１０．３グラム
８．２５ｈの生産性：時間当たりリットル当たり６．３グラム
２１．２５ｈの生産性：時間当たりリットル当たり４．１グラム
１８７．５ｇ／ｌのＥＥＨの生物変換（３７５ｇ／ｌ細胞）
１．２５ｈの生産性：時間当たりリットル当たり１２．２グラム
８．２５ｈの生産性：時間当たりリットル当たり８．２グラム
２１．２５ｈの生産性：時間当たりリットル当たり５．５グラム
開始後大体６～８時間に計算された生産性が反応の初期速度に相当すると考えることができ、これはシステムの最高の変換率を最もよく表現する。
細胞２５０ｇ／ｌに１２５ｇ／ｌのＥＥＨを用いる典型的な生物変換は、大体６～８時間後に、時間当たり、リットル当たり６．３および８．５グラムの間のアンブロックス生産性を示す（反応の初期速度に相当する）。
例２０
ＮａＣｌ溶液による反応緩衝液の置き換え
方法２０
標準の生物変換（ＥＥＨ １２５ｇ／ｌ、細胞２５０ｇ／ｌ、ＳＤＳ１．５５％）を例７に記載されているように実施したが、クエン酸緩衝液ｐＨ５．４は０．５％または０．９％ＮａＣｌどちらかに置き換え、全ての他の反応パラメータは不変であった。クエン酸緩衝液中での生物変換を平行してコントロールとして実施した。
結果２０
図２３の結果は、ＥＥＨ変換率が緩衝液および０．９％ＮａＣｌで実施された反応と同じであったということを示している。変換率は０．５％ＮａＣｌのみで実施された反応のときにより低かった。結果は、正確なｐＨ制御および十分なイオン強度が保証される場合に、緩衝液の非存在下において生物変換を実施する可能性を示している。
例２１
反応ブロスの固相の抽出
（－）－アンブロックスが水に可溶性ではなくかつおよそ７５℃よりも低い温度で液体ではないということに鑑みて、それらの特性は、水混和性（例えばエタノール）および水非混和性（例えばトルエン）溶媒どちらかを用いて生体内変換の固相から生成物を抽出するための潜在的利点とされた。
方法２１
２００ｍｌの反応ブロスを遠心して液体（水）相から固体を分離した（Sorvall GS3、５０００ｒｐｍ、１０分、１０℃）。これはおよそ８０ｍｌの固体ペレットをおよそ１２０ｍｌの液相から分離した。ＭＴＢＥ抽出の後の水相の分析（ガスクロマトグラフィー、例８）は、それが初期に２００ｍｌ反応ブロス中に存在する（－）－アンブロックスのおよそ０．３％以下を含有するということを示した。トルエンおよびエタノール９９％を固相からAmbrofixを抽出するために用いた。
結果２１
トルエン抽出：
固相８０ｍｌを、４５ｍｌトルエン（固相体積のおよそ１／２、３０秒の激しい振盪、遠心（Sorvall GS3、５０００ｒｐｍ、１０分、１０℃）によって６×抽出した。溶媒相をその（－）－アンブロックス含量についてＧＣによって分析した。反応ブロス中に初期に存在する（－）－アンブロックスの９９．５％超が、１．３５×初期全反応ブロス体積（２００ｍｌ）または３．４×固相体積という合計トルエン体積に相当する６回の抽出によって抽出された。図２４のグラフは、トルエン洗浄による抽出の経過を、２００ｍｌの全反応ブロス中に初期に存在した（－）－アンブロックス量の％として示している（体積比ブロス／トルエンのため、最初の抽出物における％は１００％を超える）。
エタノール抽出：
固相８０ｍｌをおよそ１６０ｍｌ（２倍体積）の９９％エタノールによって抽出し（Infors Multifors HT、３５℃、１０００ｒｐｍ、３０分）、次に遠心をした。アンブロックスは抽出手順の間に結晶化しなかった。図２５のグラフは、４回の洗浄（合計６４０ｍｌのＥｔＯＨ、すなわち３．２×全初期反応ブロス体積または８×固相の体積）の後に、反応ブロス中に初期に存在したアンブロックスの約９９％が回収されたということを示している。最初の抽出ステップにおいてアンブロックス結晶化を防ぐために十分なエタノールが必要とされる（エタノールに可溶性）。固相の１または１／２倍体積のみを最初の抽出ステップに用いたときには、べたついたペーストが得られ、これは取り扱うことが困難であり、（－）－アンブロックスは遠心の間にペレット上の針状体として結晶化した。温度は、この結晶化の要因の因子ではないようであった（抽出および遠心は室温およびおよそ３５℃～４０℃で試験した）。
ＥｔＯＨ相中の（－）－アンブロックス濃度および液相のＥｔＯＨ／水比（固相の残留水分）は、結晶形成の要因であるように見えた。しかしながら、エタノールの体積を固相の１倍体積まで減ずることが可能であるということが着目された。
コメント２１
（－）－アンブロックスは室温では液相に存在しないので、これはバイオマスと共に分離し、有機溶媒（例えば、水混和性溶媒（例えばエタノール）または非水混和性溶媒（例えばトルエン）によって抽出され得る。（－）－アンブロックスを反応混合物の固相に分離する遠心ステップは、それが（－）－アンブロックスを抽出するために必要とされる溶媒の量を減ずるので有利である。
例２２
知覚分析
目的：「粗」抽出物中および「結晶化された」抽出物中の形成された（－）－アンブロックスおよび副生成物（化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）の知覚分析を行うこと。
結果２２（ａ）
ＥＥＨの変換は（－）－アンブロックス（化合物Ｉ）および（－）－アンブロックス異性体（化合物ＩＶ）をもたらす。
結果２２（ｂ）
ＥＺＨの生体内変換はマクロ環エーテル（化合物ＩＩ）および９ｂ－エピ－アンブロックス（化合物ＩＩＩ）をもたらす。
結果２２（ｃ）
（－）－アンブロックスの粗組成物は化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含み、それぞれの％の化合物はそれぞれ８７．１、２．８、２．５、および７．６％の量で存在する。
結果２２（ｄ）
選択的に結晶化された材料の組成物（実験室規模）は、それぞれ９９．１、０．１、０．１、および０．７％の量で存在する同じ構成成分を有する。
知覚分析結果は下記の通りであった。
（－）－アンブロックス：ＯＴＨ ０．２ｎｇ／ｌ（ＯＴＨは匂い閾値である）。
ＥＥＨからの化合物ＩＶ：弱い、IsoE、ウッディー、ＧＣ－ＴＨ ５～１０ｎｇ。
ＥＺＨからの化合物ＩＩ：「無臭」（ＧＣ－ＴＨ ＞５００ｎｇ）（ＧＣ－ＴＨは検出閾値である）。
ＥＺＨからの化合物ＩＩＩ：アンブロックスよりも約１０×高いＧＣ－ＴＨ（およそ２ｎｇ）。
結論
「粗」抽出物中の３つの副生成物（化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）のそれぞれの合計のパーセントは約３％である。
「結晶化した」抽出物中の３つの副生成物（化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）のそれぞれの合計のパーセントは約１％である（実験室規模）。
３つの副生成物（化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）の知覚分析は、（－）－アンブロックスからのものよりも弱い匂いを示す。
事実、９ｂ－エピ－アンブロックス（化合物ＩＩＩ）の匂いは（－）－アンブロックスよりも約１０倍弱く、それが本質的に無臭であるということを示唆している。
知覚分析は、（－）－アンブロックスからの１種以上の副生成物化合物の取り除きが、取り除かれた化合物それ自体が実際には無臭の化合物である場合でさえも、残りの化合物（すなわち（－）－アンブロックス）の匂いを改善し得るということを示した。すなわち、アンブロックスの匂い増強が化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの非存在下において観察された。
例２３
蒸気抽出／によるアンブロックス回収
方法２３
（蒸気抽出した）粗（－）－アンブロックスおよび結晶化した（－）－アンブロックスについて得られた純度
ＥＥ：ＥＺ８６：１４の生体内変換反応混合物を水蒸気抽出し、反応生成物を下記のように結晶化した：水蒸気蒸留物を二相混合物として集めた。有機相を保持し、水相を捨てた。有機相の組成をＧＣによって分析し、結果を下の表２５に示した（「粗」参照）。次いで、有機相を乾燥状態まで濃縮した。
次に、乾燥した粗生成物にエタノールを加え、混合物を、生成物が溶解するまで温めた。室温において、水をゆっくり加え、（－）－アンブロックスが時々の撹拌および氷浴による冷却下において結晶化する。
結果２３
下の表２５は、蒸気抽出／蒸留ステップの後に得られた（「粗」）生成物および結晶化した生成物（（－）－アンブロックス）のＧＣ解析結果をもまた示している。表２５における「ＥＺＨ」および「ＥＥＨ」への言及は、それぞれ（３Ｚ，７Ｅ）ホモファルネソールおよび７Ｅ，３Ｅホモファルネソールを言う。
表２５は、特定の出発材料（ＥＥＨ：ＥＺＨ８６：１４）が、WT SHCまたはSHC誘導体を用いて所望の最終生成物（－）－アンブロックスおよび副生成物の極めて特異的な混合物（ＩＩ、ＩＶ、およびＩＩＩ）を産生するということを示している。選択的結晶化のデータは（－）アンブロックス（Ｉ）の強い濃縮を示しており、事実上、副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、または（ＩＩＩ）が結晶化したサンプル中には見いだされない。従って、このＥＥ：ＥＺ混合物は、比較的単純明解で費用対効果の高いやり方で選択的に結晶化される嗅覚的に純粋な（－）－アンブロックス生成物を提供する。
Figure 2023015116000036
考察２３
蒸気抽出／濾過はアンブロックスを単離するための環境親和性の方法である。なぜなら、これは、アンブロックスの便利な溶媒を含まない単離を提供し、生体触媒の副次的な不活性化を伴うからである。
概要２３
生物変換反応を用いて産生された（－）－アンブロックスは、溶媒を用いて全反応混合物から（例えば、非水混和性溶媒を用いて、または蒸気抽出／蒸留によって、または濾過によって）または固相から（例えば水混和性溶媒を用いて）、当業者に公知である方法を用いて抽出され得る。

Claims (54)

  1. （３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物に酵素的に変換され、
    酵素的な変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下においてSHC／HAC酵素を用いて行われ、
    ＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、それぞれ［ＥＥ：ＥＺ］、［ＥＥ：ＺＥ］、ならびに［ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ］ともまた呼称される［（３Ｅ，７Ｅ）および［（３Ｚ，７Ｅ）］ならびに／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］ならびに／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］からなる群の１種以上から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になる、
    （－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセス。
  2. （３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物が酵素的に変換されて、（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を与え、
    SHC／HAC酵素を用いる酵素的変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下において行われ、
    反応が可溶化剤の存在下において行われる場合には、Triton X-100またはタウロデオキシコール酸が野生型SHC／HAC酵素との組み合わせで用いられない、
    （－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセス。
  3. （３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、（－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物に酵素的に変換され、
    酵素的変換が、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下においてSHC／HAC酵素を用いて行われ、
    ＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、それぞれ［ＥＥ：ＥＺ］、［ＥＥ：ＺＥ］、ならびに［ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ］ともまた呼称される［（３Ｅ，７Ｅ）および［（３Ｚ，７Ｅ）］ならびに／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］ならびに／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］からなる群の１種以上から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になり、
    反応が、水相、固相、および油相を含む３相システムにおいて起こる、
    （－）－アンブロックスまたは（－）－アンブロックスを含む混合物を調製するためのプロセス。
  4. プロセスが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４からなる群から選択されるSHC／HAC酵素ポリペプチド配列、あるいは表１、表５、表２、表６、表３、表７、表４、表８、もしくは表１３、もしくは表１４から選択されるかまたは配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、１７１、１７３、１７５、１７７、および／もしくは１７８から選択されるSHC／HAC誘導体、あるいは配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４と少なくとも（a least）３０％、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を用いて行われる、
    請求項１または２または３に記載のプロセス。
  5. プロセスが、SHC／HAC酵素を産生する組み換えホスト細胞を用いる、
    請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
  6. SHC／HAC酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、または配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、および／もしくは１７０、１７２、１７４、および／または１７６からなる群から選択される、
    請求項４または５に記載のプロセス。
  7. ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が３０℃から６０℃の範囲内の温度で約４～８の範囲内のｐＨにおいて起こる、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のプロセス。
  8. ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されている野生型SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１種以上を用いて、好ましくは５．０から６．２のｐＨ範囲において、好ましくは３５℃の温度で起こる、
    請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。
  9. 生体触媒対ＥＥＨの比が約２：１であるときに、ＳＤＳ／細胞比が１０：１から２０：１の範囲内に、好ましくは１６：１にある、
    請求項３～８のいずれか一項に記載のプロセス。
  10. 生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５～２：１の範囲内に、好ましくは約１：１または０．５：１である、
    請求項３～９のいずれか一項に記載のプロセス。
  11. 細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる、
    請求項３～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
  12. ホモファルネソール基質が１種以上のホモファルネソール立体異性体を含む、
    請求項２に記載のプロセス。
  13. ホモファルネソール基質が２つのホモファルネソール立体異性体を含むかまたは本質的にそれらからなる、
    請求項１２に記載のプロセス。
  14. ホモファルネソール基質がＥＥ：ＥＺ立体異性体を含むかまたは本質的にそれらからなる、
    請求項１３に記載のプロセス。
  15. ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、および／または６０：４０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる、
    請求項１４のいずれか一項に記載のプロセス。
  16. ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９２：０８、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、および／またはＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる、
    請求項１５に記載のプロセス。
  17. ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる、
    請求項１５または１６に記載のプロセス。
  18. （－）－アンブロックスが、副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の少なくとも１種以上との混合物として産生される、
    請求項１～１７のいずれか一項に記載のプロセス。
  19. （－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される、
    請求項１～１８のいずれか一項に記載のプロセス。
  20. （－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物の固相から単離される、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載のプロセス。
  21. （－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される、
    請求項１９または２０に記載のプロセス。
  22. （－）－アンブロックスがエタノールまたはトルエンを用いて反応混合物から単離される、
    請求項２１に記載のプロセス。
  23. （－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される、
    請求項１９～２２のいずれか一項に記載のプロセス。
  24. （－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない、
    請求項２３に記載のプロセス。
  25. 約１２５～２００ｇ／ｌの濃度範囲内の（－）－アンブロックスが産生される、
    請求項１～２４のいずれか一項に記載のプロセス。
  26. （－）－アンブロックスが約０．１から約０．５ｎｇ／ｌの匂い閾値を有する、
    請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る（－）－アンブロックス。
  27. 固体形態の、好ましくは非晶質または結晶形態の請求項２６に記載の（－）－アンブロックス。
  28. 請求項２６または２７のいずれか一項に記載の（－）－アンブロックスを製品に組み込むことを含む、
    （－）－アンブロックスを含有する製品を作るためのプロセス。
  29. 製品がフレグランス製品、化粧品製品、清掃製品、洗剤製品、または石鹸製品である、
    請求項２８に記載のプロセス。
  30. 請求項２６または２７のいずれか一項に記載の（－）－アンブロックスを含む、フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア製品。
  31. 請求項２６または２７に記載の（－）－アンブロックスと１種以上の追加の構成成分とを含む、フレグランスもしくは化粧品または消費者ケア組成物。
  32. フレグランスまたは化粧品または消費者製品、例えばファブリックケア、トイレタリー、美容、および／または清掃製品の一部としての、請求項２６または２７に記載の（－）－アンブロックスの使用。
  33. （ａ）副生成物化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の１種以上との混合物として（－）－アンブロックスを含む反応混合物を調製するステップと、
    Figure 2023015116000037
     （ｂ）副生成物化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の１種以上との混合物としての（－）－アンブロックスを抽出するステップと、
    （ｃ）抽出混合物から（－）－アンブロックスを選択的に結晶化するステップと、
    を含むプロセスに従って産生される芳香拡張または増強生成物をフレグランス組成物と混合するステップを含み、
    （－）－アンブロックスが、（－）－アンブロックスの産生にとって好適な反応条件下においてSHC／HAC酵素を用いて、（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール（ＥＥＨ）またはＥＥＨを含む立体異性体の混合物の酵素的変換によって調製され、
    ＥＥＨを含む立体異性体の混合物が、それぞれ［ＥＥ：ＥＺ］、［ＥＥ：ＺＥ］、ならびに［ＥＥ：ＥＺ：ＺＥ］ともまた呼称される［（３Ｅ，７Ｅ）および［（３Ｚ，７Ｅ）］ならびに／または［（３Ｅ，７Ｅ）および（３Ｅ，７Ｚ）］ならびに／または［（３Ｚ，７Ｅ）、（３Ｅ，７Ｅ）、および（３Ｅ，７Ｚ）］からなる群の１種以上から選択されるホモファルネソール異性体から本質的になる、
    フレグランス組成物の芳香を拡張、増強、または付与するためのプロセス。
  34. 反応が、水相、固相、および油相を含む３相システムにおいて起こる、
    請求項３３に記載のプロセス。
  35. プロセスが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４からなる群から選択されるSHC／HAC酵素ポリペプチド配列、あるいは表１、表５、表２、表６、表３、表７、表４、表８、もしくは表１４から選択されるかまたは配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、１７１、１７３、１７５、１７７、および／もしくは１７８から選択されるSHC／HAC誘導体、あるいは配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４と少なくとも３０％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも５０％の同一性、または少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を用いて行われる、
    請求項３３または３４に記載のプロセス。
  36. プロセスが、SHC／HAC酵素を産生する組み換えホスト細胞を用いる、
    請求項３３～３５のいずれか一項に記載のプロセス。
  37. SHC／HAC酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、または配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、および／もしくは１７０、１７２、１７４、および／もしくは１７６からなる群から選択される、
    請求項３５または３６に記載のプロセス。
  38. ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が３０℃から６０℃の範囲内の温度で約４～８の範囲内のｐＨにおいて起こる、
    請求項３３～３７のいずれか一項に記載のプロセス。
  39. ホモファルネソールから（－）－アンブロックスへの変換が、表２４または表２４ａに記されている野生型SHC／HACまたはSHC／HAC誘導体酵素のための反応条件の１つ以上を用いて、好ましくは５．０から６．２のｐＨ範囲において、好ましくは３５℃の温度で起こる、
    請求項３３～３８のいずれか一項に記載のプロセス。
  40. 生体触媒対ＥＥＨの比が約２：１であるときに、ＳＤＳ／細胞比が１０：１から２０：１の範囲内に、好ましくは１６：１にある、
    請求項３４～３９のいずれか一項に記載のプロセス。
  41. 生体触媒対ホモファルネソールの重量比が約０．５～２：１の範囲内に、好ましくは約１：１または０．５：１である、
    請求項３４～４０のいずれか一項に記載のプロセス。
  42. 細胞増殖および生物変換反応ステップが同じ反応容器内で行われる、
    請求項３４～４１のいずれか一項に記載のプロセス。
  43. ホモファルネソールが、１００：００、９９：０１、９８：０２、９７：０３、９６：０４、９５：０５、９４：０６、９３：０７、９２：０８、９１：０９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、および／または６０：４０からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる、
    請求項３３～４２のいずれか一項に記載のプロセス。
  44. ホモファルネソールが、ＥＥ：ＥＺ９２：０８、ＥＥ：ＥＺ９０：１０、ＥＥ：ＥＺ８０：２０、ＥＥ：ＥＺ８６：１４、ＥＥ：ＥＺ７０：３０、ＥＥ：ＥＺ６９：３１、および／またはＥＥ：ＥＺ６６：３４からなる群から選択される重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる、
    請求項４３に記載のプロセス。
  45. ホモファルネソールが８０：２０の重量比でＥＥ：ＥＺ立体異性体混合物を含むかまたは本質的にそれからなる、
    請求項４３または４４に記載のプロセス。
  46. （－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）の少なくとも１種以上との混合物として産生される、
    請求項３３～４５のいずれか一項に記載のプロセス。
  47. （－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップまたは濾過を用いて生物変換反応混合物から単離される、
    請求項３３～４６のいずれか一項に記載のプロセス。
  48. （－）－アンブロックスが有機溶媒もしくは水蒸気抽出／蒸留ステップを用いて生物変換反応混合物の固相から単離される、
    請求項３３～４７のいずれか一項に記載のプロセス。
  49. （－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて反応混合物から単離される、
    請求項４７または４８に記載のプロセス。
  50. （－）－アンブロックスがエタノールまたはトルエンを用いて反応混合物から単離される、
    請求項４９に記載のプロセス。
  51. （－）－アンブロックスが有機溶媒を用いて選択的に結晶化される、
    請求項４７～４９のいずれか一項に記載のプロセス。
  52. （－）－アンブロックスが副生成物（ＩＩ）、（ＩＶ）、および／または（ＩＩＩ）を実質的に含まない、
    請求項５１に記載のプロセス。
  53. 約１２５～２００ｇ／リットルの濃度範囲の（－）－アンブロックスが産生される、
    請求項３３～５２のいずれか一項に記載のプロセス。
  54. （－）－アンブロックスが約０．１から約０．５ｎｇ／ｌの匂い閾値を有する、
    請求項３３～５３のいずれか一項に記載のプロセス。

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