CN115667538A - 用于制备龙涎缩醛或龙涎缩醛同系物的酶介导的方法 - Google Patents

用于制备龙涎缩醛或龙涎缩醛同系物的酶介导的方法 Download PDF

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Abstract

一种用于生产龙涎缩醛和龙涎缩醛同系物的酶介导的方法、该方法的产物和所述产物的用途。

Description

用于制备龙涎缩醛或龙涎缩醛同系物的酶介导的方法
技术领域
本发明一般涉及使用角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)或酶变体制备龙涎缩醛(Amberketal)和龙涎缩醛同系物的方法。本发明还涉及通过该方法制备的组合物、所述组合物的不同用途和包含所述组合物的消费品。
背景
龙涎缩醛提供了强烈和持久的琥珀和木香香气，其可单独或与其他木香或琥珀香成分组合用于香料组合物中。龙涎缩醛传统上由泪柏醇通过许多化学转化制备。然而，天然泪柏醇的供应是有限的。因此，期望提供一种新的有效且具有成本效益的合成路线来获得龙涎缩醛和龙涎缩醛同系物。
概述
根据本发明的第一个方面，提供了一种用于制备式(I)的化合物的方法，
Figure BDA0003968589730000011
其中该方法包括使式(II)的化合物与角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)或酶变体接触，
Figure BDA0003968589730000021
其中R为H、甲基或乙基。
在某些实施方案中，该方法包括使其中C-8与C-9之间的双键为E-构型且C-4与C-5之间的双键为Z-构型的式(I)的化合物(式(II)的E,Z-化合物)与角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)(野生型或变体酶)接触。
在某些实施方案中，该方法包括使包含其中两个双键均为E-构型的式(II)的化合物(E,E-化合物)和其中C-8与C-9之间的双键为E-构型且C-4与C-5之间的双键为Z-构型的式(II)的化合物(E,Z-化合物)的混合物与角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)或酶变体接触。
在某些实施方案中，E,Z-化合物与E,E-化合物的重量比在约99:1至约10:90的范围。例如，式(II)的E,Z化合物与式(II)的E,E-化合物的重量比可以在约95:5至约50:50，或约80:20至约50:50，或约80:20至约60:40的范围。
根据本发明的第二个方面，提供了一种组合物，其包含式(I)的化合物和式(III)的化合物、主要由式(I)的化合物和式(III)的化合物组成、或由式(I)的化合物和式(III)的化合物组成，
Figure BDA0003968589730000022
其中R为H、甲基或乙基。
根据本发明的第三个方面，提供了一种组合物，其包含式(I)的化合物、式(IV)的化合物和式(III)的化合物、主要由式(I)的化合物、式(IV)的化合物和式(III)的化合物组成、或由式(I)的化合物、式(IV)的化合物和式(III)的化合物组成，
Figure BDA0003968589730000031
其中R为H、甲基或乙基。
根据本发明的第四个方面，提供了通过或可通过本发明的第一个方面的方法得到的化合物或组合物。该组合物可以例如如本发明的第二个方面中所定义，包括其任一实施方案。
根据本发明的第五个方面，提供了本发明的第二个或第三个方面的组合物作为香料组合物的用途或在香料组合物中的用途。
根据本发明的第六个方面，提供了包含本发明的第二个或第三个方面的组合物的消费品。
在本发明的任一方面的某些实施方案中，R为甲基。当R为甲基时，式(I)的化合物可以称作(+)-龙涎缩醛。
本发明的某些实施方案可以提供如下优点中的一个或多个：
●生产(+)-龙涎缩醛和(+)-龙涎缩醛同系物的生物催化路线；
●更温和的反应条件(例如较低的温度)；
●高选择性；
●使用可替代原料(例如用于化学合成的可替代原料)。
关于本发明的任何一个或多个所述方面提供的细节、实施例和优选方案将在本文中进一步描述，并且同样适用于本发明的所有方面。除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖本文所述的实施方案、实施例和优选方案的所有可能变型的任意组合。
附图简述
图1显示了制备式(II)的化合物的反应方案。对于化合物，R为H、甲基或乙基。
图2显示了用野生型和变体SHC酶将羟基法呢基丙酮转化成(+)-龙涎缩醛的转化率[％]，并给出了测试的SHC酶在如表2所示的其最佳反应条件下的性能的概述。
序列概述
SEQ ID NO:1为野生型酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)AacSHC的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为野生型酸热脂环酸芽孢杆菌AacSHC的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3为具有取代M132R、A224V、I432T、A557T和R613S的SEQ ID NO:1并且本文可以称作SHC酶变体#65。
SEQ ID NO:4为SHC变体#65的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5相应于具有取代M132R、A224V、I432T、Y81H、A557T和R613S的SEQ IDNO:1并且本文可以称作SHC酶变体#66。
SEQ ID NO:6为SHC变体SHC#66的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7相应于具有取代M132R，A224V，I432T，T90A和R613S的SEQ ID NO:1并且本文可以称作SHC酶变体#90C7。
SEQ ID NO:8为SHC变体#90C7的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9相应于具有取代M132R、A224V、I432T、Y81H、H431L和A557T的SEQ IDNO:1并且本文可以称作SHC酶变体#110B8。
SEQ ID NO:10为SHC变体#110B8的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11相应于具有取代M132R、A224V、I432T、A172T和M277K的SEQ ID NO:1并且本文可以称作SHC酶变体#115A7。
SEQ ID NO:12为SHC变体#115A7的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13相应于具有突变M132R、A224V和I432T的SEQ ID NO:1并且本文可以称作SHC酶变体215G2。
SEQ ID NO:14为SHC变体#215G2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15为野生型运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)ZmoSHC1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16为野生型运动发酵单胞菌ZmoSHC2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17为野生型日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)BjaSHC的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18为野生型细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TelSHC的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19为野生型巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)ApaSHC1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20为野生型致病葡糖杆菌(Gluconobacter morbifer)GmoSHC的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21为野生型巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BmeSHC的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22相应于具有取代M132R、A224V、I432T、A557T和H431L的SEQ ID NO:1并且本文可以称作SHC酶变体#49。
详细描述
本发明至少部分地基于以下令人惊奇的发现：角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)和酶变体可以用于由式(II)的多不饱和醇制备(+)-龙涎缩醛和龙涎缩醛同系物。特别令人惊讶的是，其中如本文式(II)所定义的烯基链被羟基甲基取代的底物进行了由内部缩酮化终止的酶促多环化反应。
因此，本文在第一个方面提供了制备式(I)的化合物的方法，
Figure BDA0003968589730000051
其中该方法包括使式(II)的化合物与角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)或酶变体接触，
Figure BDA0003968589730000061
其中R为H、甲基或乙基。
在某些实施方案中，两个双键均为E-构型(式(II)的E,E-化合物)。
在某些实施方案中，C-8与C-9之间的双键为E-构型且C-4与C-5之间的双键为Z-构型(式(II)的E,Z-化合物)。
在具体的实施方案中，R为甲基。
本文提供的方法以酶促方式使用SHC酶或酶变体将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物(生物转化反应)。
式(II)的化合物
式(II)的化合物以四种不同立体异构体的形式存在，例如，作为具有E,E-或E,Z-构型的式(II)的化合物。
在某些实施方案中，该方法包括使式(II)的E,Z-化合物在不存在任何其他式(II)的立体异构体的情况下与角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)或酶变体接触。
在其他实施方案中，式(II)的化合物可以例如为立体异构体的混合物。在某些实施方案中，该混合物包含式(II)的E,E-化合物和式(II)的一种或多种其他立体异构体。在某些实施方案中，该混合物包含式(II)的E,Z-化合物和式(II)的一种或多种其他立体异构体。
在某些实施方案中，该方法包括使包含式(II)的E,E-化合物和式(II)的E,Z-化合物的混合物、主要由式(II)的E,E-化合物和式(II)的E,Z-化合物组成的混合物或由式(II)的E,E-化合物和式(II)的E,Z-化合物组成的混合物与SHC酶或酶变体接触。在某些实施方案中，该组合物不含式(II)的任意其他立体异构体。
式(II)的E,Z-化合物与式(II)的全部其他立体异构体的重量比可以例如等于或大于约10:90。例如，式(II)的E,Z-化合物与式(II)的全部其他立体异构体的重量比可以等于或大于约20:80，或等于或大于约30:70，或等于或大于约40:60，或等于或大于约50:50，或等于或大于约60:40，或等于或大于约70:30，或等于或大于约80:20，或等于或大于约90:10，或等于或大于约95:5，或等于或大于约99:1。
式(II)的E,Z-化合物与式(II)的全部其他立体异构体的重量比可以例如等于或小于约99:1。例如，式(II)的E,Z-化合物与式(II)的其他立体异构体的重量比可以等于或小于约95:5，或等于或小于约90:10，或等于或小于约85:15，或等于或小于约80:20，或等于或小于约60:40。
例如，式(II)的E,Z-化合物与式(II)的全部其他立体异构体的重量比可以在约10:90至约99:1，或约10:90至约90:10，或约20:80至约80:20，或约50:50至约80:20，或约60:40至约80:20的范围。
式(II)的E,Z-化合物与式(II)的E,E-化合物的重量比可以例如等于或大于约10:90。例如，式(II)的E,Z-化合物与式(II)的E,E-化合物的重量比可以等于或大于约20:80，或等于或大于约30:70，或等于或大于约40:60，或等于或大于约50:50，或等于或大于约60:40，或等于或大于约70:30，或等于或大于约80:20，或等于或大于约90:10，或等于或大于约95:5，或等于或大于约99:1。
式(II)的E,Z-化合物与式(II)的E,E-化合物的重量比可以例如等于或小于约99:1。例如，式(II)的E,Z-化合物与式(II)的E,E-化合物的重量比可以等于或小于约95:5，或等于或小于约90:10，或等于或小于约85:15，或等于或小于约80:20，或等于或小于约70:30，或等于或小于60:40。
例如，式(II)的E,Z-化合物与式(II)的E,E-化合物的重量比可以在约10:90至约99:1，或约10:90至约90:10，或约20:80至约80:20，或约50:50至约80:20，或约60:40至约80:20的范围。
立体异构体的混合物中每种立体异构体的量可以例如通过气相色谱法或NMR光谱分析鉴定。
当R为甲基时，式(II)的化合物可以称作羟基法呢基丙酮，包括E,E-羟基法呢基丙酮、E,Z-羟基法呢基丙酮、Z,E-羟基法呢基丙酮和Z,Z-羟基法呢基丙酮及其混合物。
在某些实施方案中，并非所有的式(II)的化合物均转换成式(I)的化合物或反应的副产物。因此，在某些实施方案中，本文所述的组合物，例如通过本文所述的方法得到或可通过本文所述的方法得到的组合物可以包含式(I)的化合物和式(II)的化合物。
在某些实施方案中，通过本文所述的方法制备的混合物中的任何未转化的式(II)的化合物可以与其他反应产物分离，使得该组合物不含任何式(II)的化合物。
在可替代的实施方案中，通过本文所述的方法将所有式(II)的化合物转化成式(I)的化合物或反应的副产物。
存在的式(II)的化合物的立体异构体的数量可以影响反应速率。SHC酶或酶变体能够将式(II)的E,Z-化合物从式(II)的化合物的立体异构体的复杂混合物(该混合物可以仅包含立体异构体的两种，例如，式(II)的E,Z-化合物和E,E-化合物，或它可以包含三种(即式(II)的E,Z-和E,E-和Z,E-或Z,Z-化合物，乃至所有四种立体异构体)转化成式(I)的化合物。然而，可以观察到较低的转化率，这与其他立体异构体可以与式(II)的E,Z-化合物竞争以接近SHC酶或酶变体的观点一致，并因此可以充当用于将式(II)的E,Z-化合物转化成式(I)的化合物的竞争性抑制剂和/或还充当可替代的底物。因此，式(II)的化合物底物可以包含2-4种异构体、优选两种异构体的异构体混合物。优选地，式(II)的化合物底物包含式(II)的E,Z-和E,E-化合物的异构体混合物、主要由式(II)的E,Z-和E,E-化合物的异构体混合物组成或由式(II)的E,Z-和E,E-化合物的异构体混合物组成。
式(II)的化合物可以按照Fujiwara等人(Tetrahedron Letters，1995Vol 36(46)，8435-8438)描述的一般方法合成。或者，式(II)的化合物可以如图1中简要说明的得到，其中R为H、甲基或乙基。
式(I)的化合物
式(I)的化合物包含多个手性碳原子，且由此也可以存在式(I)的化合物的一种或多种立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体。除式(I)的化合物外，通过本文所述的方法制备的产品可以包括式(I)的化合物的立体异构体的一种或多种。得到的立体异构体可以取决于所使用的式(II)的化合物的立体异构体。
例如，除式(I)的化合物外，还可以制备式(IV)的化合物，
Figure BDA0003968589730000091
其中R为H、甲基或乙基。
其中R为甲基的式(IV)的化合物也称作(-)-表-8-龙涎缩醛。
在某些实施方案中，式(I)的化合物的其他立体异构体没有通过该方法制备或不存在于该方法的产物中，例如在某些实施方案中，式(IV)的化合物没有通过该方法制备或不存在于该方法的产物中。
本文所述的方法可以例如制备式(I)的化合物和式(I)的化合物的一种或多种其他立体异构体(例如式(IV)的化合物)。因此，本文所述的组合物，例如通过本文所述的方法得到或可通过本文所述的方法得到的组合物可以包含式(I)的化合物和式(I)的化合物的一种或多种立体异构体(例如式(IV)的化合物)。
式(I)的化合物与式(I)的全部其他立体异构体的重量比可以例如等于或大于约50:50。例如，式(I)的化合物与式(I)的全部其他立体异构体的重量比可以等于或大于约55:45，或等于或大于约60:40，或等于或大于约65:35，或等于或大于约70:30，或等于或大于约75:25，或等于或大于约80:20，或等于或大于约85:15，或等于或大于约90:10，或等于或大于约95:5，或等于或大于约99:1。
例如，式(I)的化合物可以是在组合物中制备或存在的唯一的式(I)的立体异构形式。换句话说，组合物基于式(I)的化合物的所有立体异构形式的总重量可以包含100wt％的式(I)的化合物，或者具有的式(I)的化合物与式(I)的全部其他立体异构体的重量比为100:0。或者，式(I)的化合物与式(I)的全部其他立体异构体的重量比可以小于约100wt％。例如，式(I)的化合物与式(I)的全部其他立体异构体的重量比可以等于或小于约99:1，或等于或小于约98:2，或等于或小于约97:3。
例如，式(I)的化合物与式(I)的全部其他立体异构体的重量比可以为约50:50至约100:0，或约60:40至约99:1，或约70:30至约98:2，或约80:20至约97:3，或约90:10至约97:3。
立体异构体的混合物中式(I)的化合物的每种立体异构体的量可以例如通过手性柱上的气相色谱或在位移试剂存在下的NMR光谱来鉴定。
通过本文所述的方法获得的式(I)的化合物可以例如是无定形形式或结晶形式。
通过本文所述的方法制备的式(I)的化合物可以通过蒸汽提取/蒸馏或使用非水混溶性溶剂的有机溶剂萃取(以将反应产物和未反应的底物与停留在水相中的生物催化剂分离)，随后蒸发溶剂来分离，以便得到如通过气相色谱(GC)分析确定的粗反应产物。蒸汽提取/蒸馏和有机溶剂萃取方法是本领域技术人员已知的。
作为实例，可以使用有机溶剂例如非水混溶性溶剂(例如甲苯)从整个反应混合物中萃取所得的式(I)的化合物。或者，可以使用水混溶性溶剂(例如乙醇)或非水混溶性溶剂(例如甲苯)从反应混合物的固相(通过例如离心或过滤获得)中萃取所得的式(I)的化合物。作为另一个实例，式(I)的化合物可以作为晶体或以无定形形式存在于固相中，并且还可以通过过滤与剩余的固相(细胞材料或其碎片)和液相分离。作为另外的实例，在高于式(I)的化合物的熔点的温度下，式(I)的化合物可以在水相的顶部上形成油层，该油层可以被去除并收集。为了确保在除去油层后完全回收式(I)的化合物，可以将有机溶剂加入到含有生物质的水相中，以提取生物质中或生物质上或生物质周围含有的任何残留的式(I)的化合物(例如(+)-龙涎缩醛)。可以将有机层与油层合并，然后进一步处理整体以分离和纯化式(I)的化合物。可以进一步使式(I)的化合物选择性结晶以从终产物中除去副产物和任何未反应的式(II)的化合物。术语“选择性结晶”是指一种方法步骤，其中使式(I)的化合物从溶剂中结晶，同时副产物保持溶解在结晶溶剂中，其溶解程度使得分离的结晶材料仅含有式(I)的化合物，或者如果其含有任何副产物，则它们仅以嗅觉可接受的量存在。例如，式(I)的化合物不含或基本上不含副产物如式(III)或(IIIa)的化合物。选择性结晶步骤可以使用水混溶性溶剂，例如乙醇等。式(I)的化合物的选择性结晶可能受到未反应的式(II)的化合物的存在以及式(I)的化合物与其他可检测副产物的比例的影响。即使仅10％的式(II)的化合物转化成式(I)的化合物，式(I)的化合物的选择性结晶仍然是可能的。
最终的式(I)的化合物产物的嗅觉纯度可以使用水中的10％乙醇提取物或通过测试结晶材料来确定。相对于市售的式(I)的化合物的参考物，测试最终的式(I)的化合物产物的嗅觉纯度、质量及其感官特征。还由专家在应用研究中测试了式(I)的化合物材料，以确定该材料是否满足关于其感官特征的规格。
适用于萃取和/或选择性结晶式(I)的化合物的适合的水混溶性和非水混溶性有机溶剂的实例包括但不限于脂族烃，优选具有5至8个碳原子的那些，例如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷，卤代脂族烃，优选具有一个或两个碳原子的那些，例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷，芳族烃，例如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯，脂族无环和环状醚或醇，优选具有4至8个碳原子的那些，例如乙醇、异丙醇、乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚、四氢呋喃，或酯，例如乙酸乙酯或乙酸正丁酯，或酮，例如甲基异丁基酮，或二噁烷，或这些的混合物。特别优选使用的溶剂为上述的庚烷、甲基叔丁基醚(也称作MTBE、叔丁基甲基醚、叔丁基甲基醚和tBME)、二异丙基醚、四氢呋喃、乙酸乙酯和/或其混合物。优选地，水混溶性溶剂例如乙醇用于从反应混合物的固相中萃取式(I)的化合物。使用乙醇是有利的，因为它易于处理，它是无毒的并且它对环境是友好的。
如本文所用的术语“分离的”是指生物转化产物，例如式(I)的化合物，其已经从伴随它的组分中分离或纯化。在不同于其天然起源的来源的细胞系统中产生的实体是“分离的”，因为其必然不含天然伴随其的组分。分离程度或纯度可以通过任何适合的方法测量，例如气相色谱(GC)、HPLC或NMR分析。
在一些实施方案中，从获得的粗产物中分离和纯化式(I)的化合物(例如(+)-龙涎缩醛)(例如至至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的纯度)。
理想地，通过本文所述的方法获得的反应液中式(I)的化合物的浓度可以为约1mg/l至约20,000mg/l(20g/l)或更高，例如约20g/l至约200g/l或100-500g/l(包括150g/l、250g/l、300g/l、350g/l、400g/l或450g/l)。
式(III)的化合物
本文所述的方法可以例如制备作为副产物的式(III)的化合物，其中R为H、甲基或乙基：
Figure BDA0003968589730000121
式(III)的化合物可以例如为具有式(IIIa)的相对构型的化合物，其中R为H、甲基或乙基：
Figure BDA0003968589730000122
本文所述的方法可以例如制备式(III)的化合物的一种或多种立体异构体。本文所述的组合物可以包含式(III)的化合物的一种或多种立体异构体。本文所述的方法可以例如制备具有式(IIIa)中所示的相对构型的式(III)的化合物。因此，本文所述的组合物可以包括具有式(IIIa)中所示的相对构型的式(III)的化合物。在某些实施方案中，通过本文所述的方法制备并因此存在于本文所述的组合物中的唯一式(III)的化合物为具有式(IIIa)中所示的相对构型的化合物。
在某些实施方案中，至少约50wt％的全部式(III)的化合物具有式(IIIa)中所示的相对构型。例如，至少约60wt％，或至少约70wt％，或至少约80wt％，或至少约90wt％的全部式(III)的化合物可以具有式(IIIa)中所示的相对构型。
在某些实施方案中，具有式(IIIa)中所示构型的化合物为式(III)的唯一立体异构体。例如，100wt％的全部式(III)的化合物具有式(IIIa)中所示的相对构型。在某些实施方案中，等于或小于约99wt％，或等于或小于约95wt％，或等于或小于约90wt％，或等于或小于约85wt％，或等于或小于约80wt％，或等于或小于约75wt％的全部式(III)的化合物具有式(IIIa)中所示的相对构型。
例如，约50wt％至约100wt％，或约60wt％至约99wt％，或约70wt％至约95wt％的全部式(III)的化合物具有式(IIIa)中所示的相对构型。
立体异构体的混合物中式(III)的化合物的不同异构体的量可以例如通过手性柱上的气相色谱或在位移试剂存在下的NMR光谱来鉴定。
通过本文所述的方法得到的产品
本文还提供了本文所述的方法的产品。因此，本文还提供了通过本文所述的方法(包括其所有实施方案)得到或可通过本文所述的方法得到的组合物。
本文提供了一种组合物，其包含式(I)的化合物和式(III)的化合物、主要由式(I)的化合物和式(III)的化合物组成或由式(I)的化合物和式(III)的化合物组成。该组合物可以例如进一步包含一种或多种其他式(I)的立体异构体，例如式(IV)的化合物。该组合物可以例如包含一种或多种其他式(III)的立体异构体。例如，该组合物可以包含具有式(IIIa)的相对构型的化合物。该组合物可以例如进一步包含任何未反应的式(II)的化合物。在某些实施方案中，R为甲基。
在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物，其包含式(I)的化合物、式(IV)的化合物和式(III)的化合物、主要由式(I)的化合物、式(IV)的化合物和式(III)的化合物组成或由式(I)的化合物、式(IV)的化合物和式(III)的化合物组成。
本文还提供了组合物，其包含式(I)的化合物和式(I)的化合物的一种或多种立体异构体，例如式(IV)的化合物。该组合物可以例如进一步包含式(III)的化合物。该组合物可以进一步包含任何未反应的式(II)的化合物。在某些实施方案中，R为甲基。
本文所述的组合物中式(I)的化合物与式(III)的化合物的重量比可以例如在约60:40至约99:1的范围。例如，式(I)的化合物与式(III)的化合物的重量比可以在约65:35至约99:1，或约70:30至约99:1，或约75:25至约99:1，或约80:20至约99:1，或约85:15至约99:1，或约90:10至约99:1，或约95:5至约99:1的范围。例如，式(I)的化合物与式(III)的化合物的重量比可以在约65:35至约98:2，或约70:30至约97:3，或约75:25至约96:4，或约80:20至约95:5，或约85:15至约90:10的范围。
本文所述的粗反应产物中式(I)的化合物与式(II)的化合物的重量比可以例如在约90:10至约100:0的范围。例如，本文所述的组合物中式(I)的化合物与式(II)的化合物的重量比可以在约92:8至约100:0，或约94:6至约100:0，或约95:5至约100:0，或约96:4至约99.5:0.5，或约97:3至约99.0:1.0，或约98:2至约99.0:1.0的范围。
香料组合物
本文还提供了本文所述的反应产物在香料组合物中或作为香料组合物的用途。
因此，本文还提供了包含一种或多种式(I)的化合物的香料组合物。所谓“香料组合物”是指包含一种或多种式(I)的化合物和基质材料的任意组合物。
如本文所用，“基质材料”包括所有已知的香料成分，其选自广泛的天然产物和目前可获得的合成分子，例如精油、醇类、醛类和酮类、醚类和缩醛类、酯类和内酯类、大环类和杂环类，和/或与一种或多种通常与香料组合物中的增香剂结合使用的成分或赋形剂(例如载体材料、稀释剂和本领域常用的其他助剂)的混合物。
本领域已知的香料成分可容易地从主要的香料制造商商购获得。这类成分的非限制性实例包括：
-精油和提取物，例如海狸香、广木香根油、橡苔净油、香叶油、树苔净油、罗勒油、果油(例如香柠檬油和桔油)、香桃木油、玫瑰草油、广藿香油、橙叶油、茉莉油、玫瑰油、檀香油、苦艾油、薰衣草油和/或依兰-依兰油；
-醇类，例如肉桂醇((E)-3-苯基丙-2-烯-1-醇)；顺式-3-己烯醇((Z)-己-3-烯-1-醇)；香茅醇(3,7-二甲基辛-6-烯-1-醇)；二氢月桂烯醇(2,6-二甲基辛-7-烯-2-醇)；EbanolTM((E)-3-甲基-5-(2,2,3-三甲基环戊-3-烯-1-基)戊-4-烯-2-醇)；丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)；乙基芳樟醇((E)-3,7-二甲基壬-1,6-二烯-3-醇)；法呢醇((2E,6Z)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯-1-醇)；香叶醇((E)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-醇)；Super MuguetTM((E)-6-乙基-3-甲基辛-6-烯-1-醇)；芳樟醇(3,7-二甲基辛-1,6-二烯-3-醇)；薄荷醇(2-异丙基-5-甲基环己醇)；橙花醇(3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇)；苯基乙基醇(2-苯基乙醇)；RhodinolTM(3,7-二甲基辛-6-烯-1-醇)；SandaloreTM(3-甲基-5-(2,2,3-三甲基环戊-3-烯-1-基)戊-2-醇)；松油醇(2-(4-甲基环己-3-烯-1-基)丙-2-醇)；或TimberolTM(1-(2,2,6-三甲基环己基)己-3-醇)；2,4,7-三甲基辛-2,6-二烯-1-醇和/或[1-甲基-2(5-甲基己-4-烯-2-基)环丙基]-甲醇；
-醛类和酮类，例如茴香醛(4-甲氧基苯甲醛)；α戊基肉桂醛(2-亚苄基庚醛)；GeorgywoodTM(1-(1,2,8,8-四甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢萘-2-基)乙酮)；羟基香茅醛(7-羟基-3,7-二甲基辛醛)；Iso E
Figure BDA0003968589730000151
(1-(2,3,8,8-四甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢萘-2-基)乙酮)；
Figure BDA0003968589730000152
((E)-3-甲基-4-(2,6,6-三甲基环己-2-烯-1-基)丁-3-烯-2-酮)；3-(4-异丁基-2-甲基苯基)丙醛；麦芽酚；甲基柏木酮；甲基紫罗兰酮；马鞭草烯酮；和/或香草醛；
-醚类和缩醛类，例如
Figure BDA0003968589730000161
(3a,6,6,9a-四甲基-2,4,5,5a,7,8,9,9b-八氢-1H-苯并[e][1]苯并呋喃)；香叶基甲基醚((2E)-1-甲氧基-3,7-二甲基辛-2,6-二烯)；玫瑰醚(4-甲基-2-(2-甲基丙-1-烯-1-基)四氢-2H-吡喃)；和/或
Figure BDA0003968589730000162
(2',2',3,7,7-五甲基螺[二环[4.1.0]庚烷-2,5'-[1,3]二噁烷])；
-大环类，例如黄葵内酯((Z)-氧杂环十七碳-10-烯-2-酮)；十三烷二酸亚乙基酯(1,4-二氧杂环十七烷-5,17-二酮)；和/或
Figure BDA0003968589730000163
(16-氧杂环十六烷-1-酮)；和
-杂环类，例如异丁基喹啉(2-异丁基喹啉)。
如本文所用，“载体材料”是指从增香剂的角度来看实际上是中性的材料，即不会显著改变增香剂的感官特性的材料。
所谓“稀释剂”是指通常与增香剂结合使用的任何稀释剂，例如邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、一缩二丙二醇(DPG)、肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、柠檬酸三乙酯(TEC)和醇(例如乙醇)。
术语“助剂”是指由于与所述组合物的嗅觉性能不特别相关的原因而可以用于香料组合物中的成分，例如，助剂可以是作为加工香料成分或含有所述成分的组合物的助剂的成分，或者它可以改善香料成分或含有香料成分的组合物的处理或储存，例如抗氧化剂助剂，所述抗氧化剂可以选自，例如
Figure BDA0003968589730000164
TT(BASF)、
Figure BDA0003968589730000165
Q(BASF)、生育酚(包括其异构体，CAS 59-02-9；364-49-8；18920-62-2；121854-78-2)、2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚(BHT，CAS 128-37-0)和相关酚类、氢醌(CAS 121-31-9)。
它也可以是提供额外益处(例如赋予颜色或质地)的成分。它也可以是赋予香料组合物中包含的一种或多种成分耐光性或化学稳定性的成分。
通常用于包含助剂的香料组合物中的助剂的性质和类型的详细描述不能穷尽，但必须提及的是，所述成分是本领域技术人员众所周知的。
式(I)的化合物的各种应用包括但不限于精细香料或消费品，例如织物护理、盥洗用品、美容护理和清洁产品、洗涤剂产品和皂产品，包括基本上所有其中在商业上使用当前可用的(+)-龙涎缩醛成分的产品。
本文还提供了消费品，其包含如本文所述的组合物或香料组合物，包括其任何实施方案。消费品可以为例如化妆品(例如香水(eau de parfum)或淡香水(eau detoilette)、清洁产品、洗涤剂产品或皂产品。
中间体和原料
本文还提供了用于本文所述的方法的中间体和原料。
本文还提供了包含式(II)的化合物、主要由式(II)的化合物组成或由式(II)的化合物组成的混合物。例如，混合物可以包含其中两个双键均为E-构型的式(II)的化合物(E,E-化合物)和其中C-8与C-9之间的双键为E-构型且C-4与C-5之间的双键为Z-构型的式(II)的化合物(E,Z-化合物)、主要由它们组成或由它们其组成。在一个实施方案中，所述混合物可以包含三种式(II)的立体异构体(即式(II)的E,Z-、E,E-和Z,E-或Z,Z-化合物)乃至所有四种式(II)的立体异构体、主要由它们组成或由它们组成。
式(II)的E,Z-化合物与E,E-化合物的重量比可以例如等于或大于约10:90。例如，式(II)的E,Z-化合物与E,E-化合物的重量比可以等于或大于约20:80，或等于或大于约30:70，或等于或大于约40:60，或等于或大于约50:50，或等于或大于约60:40，或等于或大于约70:30，或等于或大于约80:20，或等于或大于约90:10，或等于或大于约95:5，或等于或大于99:1。
式(II)的E,Z-化合物与E,E-化合物的重量比可以例如等于或小于约99:1。例如，式(II)的E,Z-化合物与E,E-化合物的重量比可以等于或小于约95:5，或等于或小于约90:10，或等于或小于约85:15，或等于或小于约80:20，或等于或小于约70:30，或等于或小于60:40。
例如，式(II)的E,Z-化合物与式(II)的E,E-化合物的重量比可以在约10:90至约99:1，或约10:90至约90:10，或约20:80至约80:20，或约50:50至约80:20，或约60:40至约80:20的范围。
SHC酶或酶变体
本文所述的方法使用SHC酶或变体酶以便以酶促方式将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物。
如本文所用，术语“SHC酶”是指天然存在于例如嗜热细菌例如酸热脂环酸芽孢杆菌中的野生型角鲨烯何帕烯环化酶。
如本文所用，术语“变体”应理解为与衍生其的多肽相比通过氨基酸序列中的一个或多个变化而不同的多肽。衍生变体的多肽也称作亲本或参考多肽。通常，变体是人工产生的，优选通过基因技术方式产生。通常，衍生变体的多肽为野生型酶或野生型酶。然而，可用于本公开的变体也可以衍生自亲本多肽的同源物、直系同源物或旁系同源物或衍生自人工构建的变体。氨基酸序列的变化可以为氨基酸交换(取代)、插入、缺失、N-端截短或C-端截短，或这些变化的任意组合，其可以在一个或几个位点处发生。
如本文所用，术语“SHC酶变体”是指衍生自野生型SHC酶但与野生型SHC酶相比具有一个或多个氨基酸改变并且因此不是天然存在的酶。所述一个或多个氨基酸改变可以例如改变(例如增加)底物(例如式(II)的化合物)的酶活性。或者，变体SHC酶可以衍生自已经存在的SHC酶变体。
用于确定和定量SHC酶和/或SHC酶变体活性的测定法在本文中描述并且是本领域已知的。作为实例，SHC酶和/或SHC酶变体活性可以通过将纯化的SHC酶或酶变体或来自已经产生SHC酶或酶变体的宿主细胞或完整重组宿主生物体的提取物与适当的底物在适当的条件下孵育，并进行底物和反应产物的分析(例如通过气相色谱(GC)或HPLC分析)来确定。关于SHC酶和/或SHC酶变体活性测定和反应产物分析的进一步细节在实施例中提供。这些测定可以包括在重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli))中产生SHC酶变体。
如本文所用，术语“活性”是指酶与底物反应以提供目标产物的能力。所述活性可以在所谓的活性测试中通过目标产物的增加、底物(或原料)的减少或通过这些参数的组合作为时间的函数来确定。本公开的SHC酶的特征可以在于它们将式(II)的化合物(例如羟基法呢基丙酮)转化成式(I)的化合物(例如(+)-龙涎缩醛)的能力。
如本文所用，“生物活性”是指多肽可以表现出的任何活性，包括但不限于：酶活性；与另一种化合物的结合活性(例如与另一种多肽结合，特别是与受体结合，或与核酸结合)；抑制活性(例如酶抑制活性)；活化活性(例如酶活化活性)；或毒性作用。不要求变体表现出与亲本或野生型多肽相同程度的这种活性。在其他实施方案中，本文所用的SHC酶变体显示出比参考SHC酶(例如野生型SHC酶或已知的SHC酶变体)更好的底物转化收率。在另外的实施方案中，本文使用的SHC酶变体相对于参考SHC酶(例如215G2 AacSHC相对于野生型AacSHC)可以显示出改变的(例如增加的)生产率。术语“生产率”是指每小时生物转化时间(即加入底物后的时间)每升反应的可回收产物的量(克)。
如本文所用，术语“氨基酸改变”是指相对于参考氨基酸序列的氨基酸序列，在两个氨基酸之间插入一个或多个氨基酸、缺失一个或多个氨基酸或用一个或多个不同的氨基酸取代(其可以是保守的或非保守的)一个或多个氨基酸。取代用变体序列中相同数目的氨基酸替代参考序列的氨基酸。参考氨基酸序列可以例如为野生型(WT)氨基酸序列(例如SEQID NO:1或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21)，或可以例如自身为SHC酶变体序列(例如AacSHC变体215G2-SEQ ID NO:13)。
通过将SHC酶变体的氨基酸序列与参考氨基酸序列(例如野生型或变体SHC氨基酸序列)的氨基酸序列进行比较，可以容易地鉴定氨基酸改变。
SHC酶的适合的来源包括，例如，酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)、运动发酵单胞菌(Zmo)、日本慢生根瘤菌(Bja)、致病葡糖杆菌(Gmo)、双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaambifaria)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、巨大芽孢杆菌(Bme)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)、桤木弗兰克氏菌(Frankia alni)、巴氏醋杆菌(Apa)、细长嗜热聚球藻(Tel)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(Sco)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)(Rpa)、涂氏船蛆杆菌(Teredinibacter urnerae)(Ttu)、甲醇黏土杆菌(Pelobacter carbinolicus)(Pca)和梨形四膜虫(Tetrahymenapyriformis)(参见，例如WO2010/139719、US2012/01345477、WO2012/066059、WO2016/170099；WO2018/157021和JP2009060799，其内容通过引用并入本文)。适合的酶还描述在例如Neumann&Simon 1986,Biol Chem Hoppe-Seyler 367,723-729；Seckler&Poralla 1986,Biochem Biophys Act 356-363；Ochs等人1990,J Bacteriol 174,298-302；Seitz等人2012,J Molecular Catalysis B:Enzymatic 84,72-77；和Seitz2012PhD论文(http://elib.uni-stuttgart.de/handle/1 1682/1400)中，其内容通过引用并入本文。这些SHC酶和变体可以用于本文所述的方法。
特别地，SHC酶(例如SHC酶变体可以从其衍生)可以为酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)SHC酶、运动发酵单胞菌(Zmo)SHC酶、日本慢生根瘤菌(Bja)SHC酶、巨大芽孢杆菌(Bme)SHC酶或致病葡糖杆菌(Gmo)SHC酶。在某一实施方案中，SHC酶(例如SHC酶变体可以从其衍生)可以为酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)SHC酶。在某一实施方案中，SHC酶(例如SHC酶变体可以从其衍生)可以为巨大芽孢杆菌(Bme)SHC酶。
为了便于参考，名称“AacSHC”可以用于指酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)SHC酶，“ZmoSHC”可以用于指运动发酵单胞菌(Zmo)SHC酶，“BmeSHC”可以用于指巨大芽孢杆菌(Bme)SHC酶、，BjaSHC”可以用于指日本慢生根瘤菌(Bja)SHC酶，并且“GmoSHC”可以用于指致病葡糖杆菌(Gmo)SHC酶。
AacSHC、ZmoSHC和BjaSHC酶序列公开在BASF的WO2010/139719、US2012/01345477A1、Seitz等人(如上文所引述的)和Seitz(如上文所引述的2012PhD论文)中。公开了ZmoSHC的两种不同的序列，称作ZmoSHC1和ZmoSHC2。GmoSHC酶序列公开在WO2018/157021中。表1公开了野生型SHC酶的来源和登录号。
表1.野生型SHC酶的来源和登录号。
Figure BDA0003968589730000211
野生型AacSHC、野生型ZmoSHC1、野生型ZmoSHC2、野生型BjaSHC、野生型GmoSHC、野生型TelSHC、野生型ApaSHC1和野生型BmeSHC的氨基酸序列也在本文中公开(分别为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21)。
本文所述并用于本文所述的方法中的SHC酶或酶变体可以例如基于野生型氨基酸序列(SEQ ID NO 1、13、15、16、17、18、19、20、21)之一或其变体、同源物、突变体、衍生物或片段。所述SHC酶或酶变体可以例如具有与本文公开的野生型氨基酸序列之一具有至少30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％,70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。
本文所述并且用于本文所述的方法的SHC酶或酶变体可以例如具有等于或大于约75％的选择性。例如，所述SHC酶或酶变体可以例如具有等于或大于约80％，或等于或大于约85％，或等于或大于约90％，或等于或大于约95％的选择性。例如，所述SHC酶或酶变体可以例如具有至多100％、例如小于100％、例如等于或小于约99.5％，或等于或小于约99.0％，或等于或小于约98.0％，或等于或小于约97.0％的选择性。
关于基因的核苷酸序列的“百分比(％)同一性”定义为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性之后并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分时，候选DNA序列中与DNA序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。出于确定百分比核苷酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且意指任何氨基酸的肽连接链，与长度或翻译后修饰无关。
如本文所用，术语“衍生物”包括但不限于变体。术语“衍生物”和“变体”在本文中可互换使用。
下文进一步描述可用于本文所述的方法中的特异性SHC酶和酶变体。
野生型SHC酶
本文所述的方法可以例如使用与野生型SHC酶具有100％序列同一性的SHC酶。野生型SHC酶不必直接从其天然生物体获得，并且可以在实验室中合成，例如使用重组DNA技术。
野生型SHC酶可以例如来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)、运动发酵单胞菌(Zmo)、日本慢生根瘤菌(Bja)、致病葡糖杆菌(Gmo)、双向伯克霍尔德氏菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bme)、荚膜甲基球菌、桤木弗兰克氏菌、巴氏醋杆菌(Apa)、细长嗜热聚球藻(Tel)、天蓝色链霉菌(Sco)、沼泽红假单胞菌(Rpa)、涂氏船蛆杆菌(Teredinibacter turnerae)(Ttu)、甲醇黏土杆菌(Pca)和梨形四膜虫(参见，例如WO2010/139719、US2012/01345477、WO2012/066059，其内容通过引用并入本文)。
特别地，野生型SHC酶可以为酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)SHC酶、运动发酵单胞菌(Zmo)SHC酶、巨大芽孢杆菌(Bme)SHC酶、日本慢生根瘤菌(Bja)SHC酶或致病葡糖杆菌(Gmo)SHC酶。特别地，野生型SHC可以为酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)SHC酶或巨大芽孢杆菌(Bme)SHC酶或运动发酵单胞菌(Zmo)SHC酶(例如ZmoSHC1)。
为了便于参考，名称“AacSHC”可以用于指酸热脂环酸芽孢杆菌SHC酶、“ZmoSHC”可以用于指运动发酵单胞菌SHC酶ZmoSHC1和ZmoSHC2，“BjaSHC”可以用于指日本慢生根瘤菌SHC酶，“BmeSHC”可以用于指巨大芽孢杆菌SHC酶，“GmoSHC”可以用于指致病葡糖杆菌SHC酶，“TelSHC”可以用于指细长嗜热聚球藻SHC酶，且“ApaSHC1”可以用于指巴氏醋杆菌SHC酶。
野生型SHC酶氨基酸序列可以例如为AacSHC(SEQ ID NO:1)、ZmoSHC1(SEQ ID NO:15)、ZmoSHC2(SEQ ID NO:16)、BjaSHC(SEQ ID NO:17)、GmoSHC(SEQ ID NO:20)、BmeSHC(SEQ ID NO:21)、TelSHC(SEQ ID NO:18)或ApaSHC1(SEQ ID NO:19)。例如，野生型SHC酶可以为BmeSHC(SEQ ID NO:21)、ZmoSHC1(SEQ ID NO:15)或AacSHC(SEQ ID NO:1)。
SHC变体酶
本文所述的方法可以例如使用SHC酶变体(即与野生型SHC酶的序列同一性小于100％的SHC酶)。
本文所述的方法可以例如使用如WO2016/170099或WO2018/157021中所述的SHC酶变体，其内容通过引用并入本文。例如，用于本文所述的方法的SHC酶变体可以为WO2016/170099中所述的SHC酶变体215G2。
SHC酶变体可以例如具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有与野生型SHC酶氨基酸序列至少约70.0％的同一性。例如，SHC酶变体可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有与野生型SHC酶氨基酸序列至少约75.0％，或至少约80.0％，或至少约85.0％，或至少约90.0％，或至少约95.0％，或至少约95.5％，或至少约96.5％，或至少约97.0％，或至少约97.5％，或至少约98.0％，或至少约98.5％，或至少约99.0％的同一性。
SHC酶变体具有的氨基酸序列与野生型SHC酶氨基酸序列的同一性小于100％，例如等于或小于约99.5％，或等于或小于约99.0％。
例如，SHC酶变体可以与野生型SHC酶氨基酸序列具有约70.0％至约99.5％，或约80.0％至约99.0％，或约85.0％至约98.5％，或约90.0％至约98.0％的同一性。
野生型SHC酶可以例如来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Aac)、运动发酵单胞菌(Zmo)、日本慢生根瘤菌(Bja)、致病葡糖杆菌(Gmo)、双向伯克霍尔德氏菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bme)、荚膜甲基球菌、桤木弗兰克氏菌、巴氏醋杆菌(Apa)、细长嗜热聚球藻(Tel)、天蓝色链霉菌(Sco)、沼泽红假单胞菌(Rpa)、涂氏船蛆杆菌(Ttu)、甲醇黏土杆菌(Pca)和梨形四膜虫(参见，例如WO2010/139719、US2012/01345477、WO2012/066059，其内容通过引用并入本文)。
野生型SHC酶氨基酸序列可以例如为AacSHC(SEQ ID NO:1)、ZmoSHC1(SEQ ID NO:15)、ZmoSHC2(SEQ ID NO:16)、BjaSHC(SEQ ID NO:17)、GmoSHC(SEQ ID NO:20)、BmeSHC(SEQ ID NO:21)、TelSHC(SEQ ID NO:18)或ApaSHC1(SEQ ID NO:19)。例如，野生型SHC酶可以为AacSHC(SEQ ID NO:1)。
因此，在某些实施方案中，SHC酶或SHC酶变体可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21至少约70.0％的同一性。例如，SHC酶或SHC酶变体具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21至少约75.0％，或至少约80.0％，或至少约85.0％，或至少约90.0％，或至少约95.0％，或至少约95.5％，或至少约96.5％，或至少约97.0％，或至少约97.5％，或至少约98.0％，或至少约98.5％，或至少约99.0％的同一性。
例如，SHC酶变体可以例如具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有的与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的同一性小于100％，例如等于或小于约99.5％，或等于或小于约99.0％。
例如，SHC酶变体可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21具有约70.0％至约99.5％，或约80.0％至约99.0％，或约85.0％至约98.5％，或约90.0％至约98.0％的同一性。
关于多肽或核苷酸序列的“百分比(％)同一性”分别定义为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性之后并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分时，候选序列中与参考序列中的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的百分比。出于确定百分比序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且意指任何氨基酸的肽连接链，与长度或翻译后修饰无关。
核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以通过序列比对来确定。这样的比对可以使用几种本领域已知的算法进行，优选使用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)、使用hmmalign(HMMER包，http://hmmer.wustl.edu/)、或使用例如在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/上可得到的CLUSTAL算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.&Gibson,T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22,4673-80)、或GAP程序(爱荷华大学(University of Iowa)的数学算法)或Myers和Miller的数学算法(1989-Cabios 4:11-17)。所用的优选参数为默认参数，如它们在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/上所设置的。
可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算百分比序列同一性。在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215，403-410的BLASTN和BLASTP程序中引入了类似的算法。BLAST多核苷酸检索可以用BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与编码相关蛋白质的那些核酸同源的多核苷酸序列。可以用BLASTP程序进行BLAST蛋白质检索，得分＝50，字长＝3，以获得与多肽同源的氨基酸序列。
为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25，3389-3402中所述利用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，使用各自程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源映射(homology mapping)技术如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics 2003b，19Suppl 1:154-162)或马尔可夫(Markov)随机场来补充。当在本申请中涉及序列同一性的百分比时，如果没有另外特别指出，则相对于较长序列的全长计算这些百分比。
在具体实施方案中，使用CLUSTAL O(1.2.4版)确定两个序列之间的％同一性。
与亲本SHC酶相比，SHC酶变体可例如具有增加的将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物的酶活性。增加的酶活性可以指式(II)的化合物向式(I)的化合物的酶促转化的任何方面，包括例如式(II)的化合物向式(I)的化合物的总转化率增加、式(II)的化合物的转化速率增加(例如在反应的前4小时、或前6小时、或前12小时中)、式(I)的化合物的产量增加和/或副产物的产量减少。通常，增加的酶活性可以通过增加的生产率来定义。其可以根据每小时、每克生物催化剂和每升反应产生的式(I)的化合物来定义。
与亲本SHC酶相比，SHC酶变体可以例如提供增加的式(II)的化合物的转化率。因此，与使用亲本SHC酶的方法相比，本文所述的方法可以具有增加的式(II)的化合物转化水平。与亲本SHC酶相比，SHC酶变体可以例如提供增加的式(II)的化合物的转化速率。因此，与亲本SHC酶相比，本文所述的方法可以具有增加的式(II)的化合物的转化速率。与亲本SHC酶相比，SHC酶变体可以例如在反应的前4小时或前2小时、或前4小时、或前6小时、或前8小时或前12小时或前24小时内提供增加的式(II)的化合物的转化速率。因此，与亲本SHC酶相比，本文所述的方法可以在反应的前2小时、或前4小时、或前6小时、或前8小时、或前12小时、或前24小时内具有增加的式(II)的化合物的转化速率。这可以是当与在相同反应条件(例如相同pH和温度)下使用两种酶(即SHC酶变体和亲本SHC酶)相比时，或者当与在已经单独定义为对于其活性最佳的条件(例如优化的pH和温度)下使用每种酶相比时，并且其可以彼此不同。
式(II)的化合物向式(I)的化合物的转化率可以例如使用如上所述的活性测定法来确定，并且可以计算为每克原料的可回收产物的克数(如果期望，其可以计算为百分比摩尔转化率)。
用于制备本文公开的式(I)的化合物的方法可以在所用特定酶的最佳温度范围或最佳温度和/或最佳pH范围或最佳pH和/或SDS最佳浓度范围或最佳SDS浓度下进行，如下文实施例中所述。
核酸和制备核酸的方法
本文所述的SHC酶和酶变体可以由核酸序列编码。包含编码序列的核酸可以为例如分离的核酸。
因此，本文提供了包含编码如本文所述的SHC酶或酶变体的核酸序列的构建体。如本文所用，“构建体”是待转染到靶细胞中的人工产生的核酸区段。构建体可以包含编码SHC酶或酶变体的核酸序列和基因表达控制器(例如启动子)。
本文进一步提供了包含如本文所述的构建体的载体。如本文所用，“载体”是用作媒介物以将外源遗传物质人工携带到其可以在其中复制和/或表达的细胞中的DNA分子。载体可以为例如质粒、病毒载体、粘粒或人工染色体。
术语“构建体”和“载体”可以重叠，例如当构建体为质粒时。
如本文所用的术语“核酸”或“核酸分子”应具体指本公开的多核苷酸，其可以为DNA、cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA，并且可以为双链或单链的、有义链和/或反义链。术语“核酸”或“核酸分子”应特别适用于如本文所用的多核苷酸，例如作为全长核苷酸序列或其片段或部分，其分别编码具有酶活性的多肽(例如代谢途径的酶)或其片段或部分。
该术语还包括单独的分子，例如cDNA，其中相应的基因组DNA具有内含子并因此具有不同的序列；缺少至少一个侧翼基因的基因组片段；通过聚合酶链反应(PCR)产生的并且缺少至少一个侧翼基因的cDNA或基因组DNA片段；缺少至少一个侧翼基因的限制性片段；编码非天然存在的蛋白质例如融合蛋白(例如His标记)、突变蛋白或给定蛋白质的片段的DNA；和作为cDNA的简并变体的核酸或天然存在的核酸。此外，它包括作为杂合基因(即编码非天然存在的融合蛋白的基因)的一部分的重组核苷酸序列。融合蛋白可以向蛋白质添加一个或多个氨基酸(例如但不限于组氨酸(His))，通常在蛋白质的N-末端，但也在C-末端或融合在蛋白质的区域内。这类融合蛋白或编码这类蛋白的融合载体通常用于三个目的：(i)增加重组蛋白的产量；(ii)增加重组蛋白的溶解度；和(iii)通过提供用于亲和纯化的配体来帮助纯化重组蛋白。
术语“核酸序列”还包括适于在特定微生物宿主细胞(例如大肠杆菌宿主细胞)中表达的密码子优化序列。如本文所用，术语“密码子优化的”是指考虑到其特定密码子使用，通过例如用细菌宿主细胞基因(例如大肠杆菌基因)中更频繁使用的密码子取代一个或多个或优选大量密码子，已经适于在特定原核或真核宿主细胞，特别是细菌宿主细胞如大肠杆菌宿主细胞中表达的核酸蛋白质编码序列。
在这方面，编码参考氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13)及其变体/衍生物的核苷酸序列或基因可以是来源中发现的原始核苷酸序列或基因，或者该基因可以针对所选宿主生物体(例如大肠杆菌)进行密码子优化。
在另一个方面，本公开的核酸序列可操作地连接至允许在原核和/或真核宿主细胞中表达的表达控制序列。如本文所用，“可操作地连接”是指掺入到遗传构建体中，使得表达控制序列有效地控制编码序列或关注的基因的表达。上文涉及的转录/翻译调控元件包括但不限于诱导型和非诱导型、组成型、细胞周期调控型、代谢调控型启动子、增强子、操纵子、沉默子、阻遏物和本领域技术人员已知的并且驱动或以其他方式调控基因表达的其他元件。这类调控元件包括但不限于指导组成型表达或允许诱导型表达的调控元件，例如CUP-1启动子、如例如在tet-on或tet-off系统中使用的tet-阻遏物、lac系统、trp系统调控元件。作为实例，异丙基β-D-1-半乳糖硫代吡喃糖苷(IPTG)在例如100μM至1.0mM的浓度范围内是基因表达的有效诱导物。该化合物为异乳糖的分子模拟物，异乳糖是触发lac操纵子转录的乳糖代谢物，因此当基因在lac操纵子的控制下时，它用于诱导基因表达。诱导基因表达的调控元件的另一个实例为乳糖。类似地，本公开的核酸分子可以形成编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分，所述另外的多肽序列例如作为标志物或报道基因起作用的序列。标志物或报道基因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基葡糖苷磷酸转移酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。与本公开的实施相关的许多标准方法一样，本领域技术人员可以想到另外的有用试剂，例如可以起到标记物或报道基因功能的另外的序列。
本文还提供了编码SHC酶或其变体的重组多核苷酸，其可以插入到载体中用于基因表达和任选的酶纯化。一种类型的载体为代表环状双链DNA环的质粒，另外的DNA区段连接到所述环状双链DNA环中。某些载体可以控制与其功能性连接的基因的表达。这些载体称作“表达载体”。通常适用于DNA重组技术的表达载体具有质粒类型。通常，表达载体包含用于产生SHC野生型或变体酶或如本文所述的基因。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒为最常用的载体类型。
这类载体可以包括DNA序列，其包括但不限于非宿主细胞中天然存在的DNA序列、通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序列和期望导入非重组宿主的其他基因或DNA序列。应当理解，通常通过稳定导入一种或多种重组基因来增强本文所述的重组宿主的基因组。然而，自主或复制质粒或载体也可以在本公开的范围内使用。此外，可以使用低拷贝数(例如单拷贝)或高拷贝数(如本文所示例的)质粒或载体来实施本公开。
本公开的载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒、人工细菌和人工酵母染色体、敲除或敲入构建体、合成核酸序列或弹夹盒，并且亚组可以以线性多核苷酸、质粒、巨大质粒、合成或人工染色体(例如植物、细菌、哺乳动物或酵母人工染色体)的形式产生。
优选地，在导入载体时，由导入的多核苷酸编码的蛋白质在细胞内表达。质粒通常是标准克隆载体，例如细菌多拷贝质粒。底物可以掺入相同或不同的质粒中。通常使用具有不同类型的选择标记的至少两种不同类型的质粒来允许选择包含至少两种类型的载体的细胞。
通常，细菌或酵母细胞可以用本领域众所周知的任何一种或多种核苷酸序列转化。对于体内重组，使用标准转化技术将待与染色体或其他基因重组的基因用于转化宿主。在一个适合的实施方案中，构建体中包括提供复制起点的DNA。本领域技术人员可以适当地选择复制起点。根据基因的性质的不同，如果序列已经与作为复制起点本身可操作的基因一起存在，则可能不需要补充的复制起点。
宿主细胞、制备宿主细胞的方法和使用宿主细胞制备式(I)的化合物的方法
重组宿主细胞可以用于本文所述的方法中。
本文进一步提供了一种重组宿主细胞，其包含如本文所述的核酸序列或构建体或载体。本文进一步提供了产生如本文所述的SHC酶或酶变体的重组宿主细胞。
本文所述的用于产生式(I)的化合物的方法可以例如包含培养如本文所述的重组宿主细胞。如本文所用，术语“培养”是指使活细胞增殖以使得它们产生如本文所述的SHC酶或酶变体的过程，所述SHC酶或酶变体可用于产生如本文所述的式(I)的化合物的方法中。
当外源或异源DNA已被导入细胞内时，细菌或酵母细胞可被这类DNA转化。转化DNA可以或可以不整合，即共价连接到细胞的染色体中。例如，在原核生物和酵母中，转化DNA可以维持在附加型元件如质粒上。关于真核细胞，稳定转染的细胞是其中转染的DNA已经整合到染色体中使得其通过染色体复制被子代细胞遗传的细胞。这种稳定性通过真核细胞建立由包含转化DNA的子代细胞群组成的细胞系或克隆的能力来证明。
通常，导入的DNA最初不存在于作为DNA受体的宿主中，但是在本公开范围内从给定宿主分离DNA区段，并且随后将该DNA的一个或多个另外的拷贝导入同一宿主中，例如以增强基因产物的产生或改变基因的表达模式，这在本公开的范围内。在一些情况下，导入的DNA将修饰乃至替换内源基因或DNA序列，例如通过同源重组或定点诱变。适合的重组宿主包括微生物、植物细胞和植物。
本公开的特征还在于重组宿主。术语“重组宿主”(也称作“遗传修饰的宿主细胞”或“转基因细胞”)表示包含异源核酸或其基因组已经通过至少一个掺入的DNA序列扩增的宿主细胞。可以用如上所述的多核苷酸或载体基因工程改造本发明的宿主细胞。
可以用于本公开的目的的宿主细胞包括但不限于原核细胞，例如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，其可以例如用例如包含本公开的多核苷酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA、细菌人工染色体或粘粒DNA表达载体转化；简单的真核细胞如酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia))，其可以例如用例如包含本公开的多核苷酸分子的重组酵母表达载体转化。取决于宿主细胞和用于引入本公开的多核苷酸的相应载体的不同，多核苷酸可以整合到例如染色体或线粒体DNA中，或者可以维持在染色体外，例如以附加型的形式，或者可以仅短暂地包含在细胞中。
本文所用的术语“细胞”，特别是关于基因工程和将一个或多个基因或组装的基因簇引入细胞或生产细胞时，应理解为是指任何原核或真核细胞。关注用于本公开用途的原核和真核宿主细胞，包括细菌宿主细胞如大肠杆菌或芽孢杆菌属(Bacillussp.)、酵母宿主细胞例如啤酒酵母(S.cerevisiae)、昆虫宿主细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptorafrugiperda)或人宿主细胞例如HeLa和Jurkat。
具体地，细胞为真核细胞，优选真菌、哺乳动物或植物细胞，或原核细胞。适合的真核细胞包括例如但不限于哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞(包括Sf9)、两栖动物细胞(包括载黑素细胞)或蠕虫细胞，包括隐杆线虫属(Caenorhabditis)(包括秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))的细胞。适合的哺乳动物细胞包括例如但不限于COS细胞(包括Cos-1和Cos-7)、CHO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293 T-RexTM细胞或其他可转染的真核细胞系。适合的细菌细胞包括但不限于大肠杆菌。
优选地，可以使用原核细胞，例如大肠杆菌，芽孢杆菌属，链霉菌属，或哺乳动物细胞，如HeLa细胞或Jurkat细胞，或植物细胞，如拟南芥属(Arabidopsis)。
细胞可以例如选自原核、酵母、植物和/或昆虫宿主细胞。
优选地，所述细胞为曲霉菌属(Aspergillus sp.)或真菌细胞，优选地，它可以选自酵母属、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属和曲霉菌属。
优选地，所述细胞为细菌细胞，例如选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)的属。例如，所述细菌可以为大肠杆菌。
优选地，大肠杆菌宿主细胞为工业和监管机构认可的大肠杆菌宿主细胞(包括但不限于大肠杆菌K12宿主细胞或大肠杆菌BL21宿主细胞)。
与本公开一起使用的一种优选宿主细胞为大肠杆菌，其可以如本文所述重组制备。因此，重组宿主可以为重组大肠杆菌宿主细胞。存在可用于大肠杆菌的突变体、质粒、代谢的详细计算机模型和其他信息的文库，允许合理设计各种模块以提高产物收率。
在一个实施方案中，重组大肠杆菌微生物包含编码SHC酶或酶变体的核苷酸序列(例如，微生物包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的核苷酸序列)。
优选地，重组大肠杆菌微生物包含如本文所述的载体构建体。在另一个优选的实施方案中，重组大肠杆菌微生物包含编码本文公开的SHC酶和/或酶变体的核苷酸序列。
与本公开一起使用的另一种优选的宿主细胞为啤酒酵母酿。存在可用于啤酒酵母的突变体、质粒和详细的代谢计算机模型和其他信息的文库，允许合理设计各种模块以提高产物收率。制备重组啤酒酵母微生物的方法是已知的。
细胞的培养可以以常规方式进行。培养基可以包含碳源、至少一种氮源和无机盐，并且向其中加入维生素。该培养基的成分可以是常规用于培养所讨论的微生物物种的成分。在本发明方法中使用的碳源包括可被重组宿主细胞代谢以促进关注的SHC酶生长和/或产生的任何分子，所述SHC酶用于将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物。适合的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。
在采用酵母作为宿主的实施方案中，例如，碳源如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是适合的。碳源可以在整个培养期间以分批或补料分批提供给宿主生物体，或者可替代地，可以使用另一种能量源，例如蛋白质或蛋白质水解物。
用于本公开的方法中的重组宿主细胞微生物可以在通常用于微生物增殖的pH、温度和反应条件下在丰富培养基(例如LB培养基、细菌用胰胨酵母提取物培养基、营养培养基等)中增殖。在本公开的一个实施方案中，使用确定的基本培养基例如M9A进行培养。
M9A培养基的组分包含：14g/l KH2PO4、16g/l K2HPO4、1g/lNa3柠檬酸盐.2H2O、7.5g/l(NH4)2SO4、0.25g/l MgSO4.7H2O、0.015g/l CaCl2.2H2O、5g/l葡萄糖和1.25g/l酵母提取物)。
在本公开的另一个实施方案中，使用富含营养物的培养基例如LB。LB培养基的组分包含：10g/l胰胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl。矿物培养基和M9矿物培养基的其他实例公开于例如US6524831B2和US2003/0092143A1中。
基本培养基的另一个实例可以如下制备：对于350ml培养物：向35ml柠檬酸/磷酸盐储备溶液(133g/l KH2PO4，40g/l(NH4)2HPO4，17g/l柠檬酸.H2O，pH调节至6.3)中加入307ml H2O，根据需要用32％NaOH将pH调节至6.8。高压灭菌后，加入0.850ml 50％MgSO4、0.035ml微量元素溶液(参见下文)、0.035ml硫胺素溶液和7ml 20％葡萄糖。
微量元素溶液：50g/l Na2EDTA.2H2O，20g/l FeSO4.7H2O，3g/l H3BO3，0.9g/lMnSO4.2H2O，1.1g/l CoCl2，80g/L CuCl2，240g/l NiSO4.7H2O，100g/l KI，1.4g/l(NH4)6Mo7O24.4H2O，1g/l ZnSO4.7H2O的去离子水溶液。
硫胺素溶液：2.25g/l硫胺素.HCl的去离子水溶液。
MgSO4溶液：50％(w/v)MgSO4.7H2O的去离子水溶液。
重组微生物可以以分批、补料分批或连续过程或其组合的方式生长。通常，使重组微生物在发酵罐中在限定的温度下在适合的营养源(例如碳源)存在下生长期望的时间期限，以产生足够的SHC酶，从而能够将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物并产生期望的量的式(I)的化合物。重组宿主细胞可以以任意适合的方式培养，例如通过分批培养或补料分批培养。
如本文所用，术语“分批培养”是在培养期间既不添加也不取出培养基的培养方法。
如本文所用，术语“补料分批”是指其中在培养期间添加培养基但不取出培养基的培养方法。
本公开的一个实施方案提供了一种在适合的细胞系统中生产式(I)的化合物的方法，所述方法包括在适合的条件下在细胞系统中产生SHC酶或酶变体，将式(II)的化合物进料至细胞系统，使用细胞系统产生的SHC酶或酶变体将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物，从细胞系统收集式(I)的化合物并任选地从该系统中分离式(I)的化合物。其他核苷酸序列的表达可以用于增强用于制备式(I)的化合物的生物转化中使用的细胞系统的活性。
本公开的另一个实施方案是制备式(I)的化合物的生物转化方法，所述方法包括使包含编码SHC酶或酶变体的基因的宿主细胞生长，在宿主细胞中产生SHC酶或酶变体，将式(II)的化合物进料至宿主细胞，在适于促进式(II)的化合物转化成式(I)的化合物的pH、温度和增溶剂的条件下孵育宿主细胞，并收集式(I)的化合物。宿主细胞中SHC酶或酶变体的产生提供了当在适合的反应条件下将式(II)的化合物添加至宿主细胞时制备式(I)的化合物的方法。通过向反应混合物中加入更多的生物催化剂和SDS，可以提高获得的转化率。
可以以多种方式培养重组宿主细胞微生物，以便提供已产生SHC酶或酶变体的适量的细胞用于随后的生物转化步骤。由于适用于生物转化步骤的微生物变化很大(例如酵母、细菌和真菌)，因此培养条件当然根据每个物种的具体要求进行调整，并且这些条件是众所周知的并有文献记载。任何本领域已知的用于培养重组宿主细胞微生物的细胞的方法可用于产生可用于本公开的后续生物转化步骤的细胞。通常，细胞生长至特定密度(可测量为光密度(OD))以产生足够的生物质用于生物转化反应。
所选择的培养条件不仅影响所获得的细胞(生物质)的量，而且培养条件的质量也影响生物质如何成为生物催化剂。表达SHC酶或酶变体基因并产生SHC酶或酶变体的重组宿主细胞微生物称作生物催化剂，其适用于生物转化反应。在一些实施方案中，生物催化剂是产生SHC酶或酶变体的重组全细胞，或者其可以是悬浮液或固定化形式。在其他实施方案中，生物催化剂是由产生SHC酶或酶变体的重组全细胞制备的膜级分或液体级分(如例如在Seitz等人2012中所公开的—如上文所引用)。产生SHC酶或酶变体的重组全细胞包括从发酵罐收集的全细胞(用于生物转化反应)或发酵罐中的细胞(其然后用于单罐反应)。产生SHC酶或酶变体的重组全细胞可以包括完整重组全细胞和/或细胞碎片。无论哪种方式，SHC酶或酶变体以某种方式与膜(诸如细胞膜)缔合，以便接收底物(例如式(II)的化合物)和/或与底物相互作用，该膜(例如细胞膜)可以为全细胞(例如重组全细胞)的一部分。SHC酶或酶变体也可以是固定化形式(例如与酶载体缔合)，其允许SHC酶或酶变体与底物(例如式(II)的化合物)相互作用。SHC酶或酶变体也可以以可溶形式使用。
在一个实施方案中，在生物转化步骤之前，生物催化剂以足够的量产生(以产生足够的生物质)、收获并洗涤(和任选地储存(例如冷冻或冻干))。
在另一个实施方案中，细胞以足够的量产生(以产生足够的生物催化剂)，然后调节反应条件，无需收获和洗涤生物催化剂用于生物转化反应。这种一步(或“单罐”)方法是有利的，因为它简化了过程。用于生长细胞的培养基也适用于生物转化反应，条件是调节反应条件以促进生物转化反应。
使细胞生长的最佳pH在6.0-8.0的范围内。用于生物转化反应的最佳pH值取决于生物转化反应中使用的SHC酶或酶变体的类型。使用本领域技术人员众所周知的技术调节pH。
本公开的生物转化方法在时间、温度、pH和增溶剂的条件下进行，以提供式(II)的化合物向式(I)的化合物的转化。
对于所考虑的SHC野生型酶或SHC酶变体，反应混合物的pH可以在4-8，优选4.5-6.5，更优选4.5-6.5的范围内，并且可以通过向反应混合物中加入缓冲液来维持。用于此目的的示例性缓冲液为柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液。
对于所考虑的SHC野生型酶或SHC酶变体，温度为约15℃至约60℃，例如约15℃至约50℃，或约15℃至约45℃，或约30℃至约60℃，或约35℃至约55℃。在生物转化过程中，温度可以保持恒定或可以改变。
当生物催化剂与式(II)的化合物之比为约2:1时，[SDS]/[细胞]之比可以在约10:1-20:1，优选约15:1-18:1的范围内，优选约16:1。
用于制备本文公开的式(I)的化合物的方法可以在最佳温度、pH和表面活性剂浓度下进行，所述最佳温度、pH和表面活性剂浓度使得所考虑的每种单独SHC酶(野生型或变体)具有最佳活性。
在生物转化反应中包括增溶剂(例如表面活性剂、洗涤剂、溶解度增强剂、水混溶性有机溶剂等)可能是有用的。
如本文所用，术语“表面活性剂”是指降低两种液体之间或液体和固体之间的表面张力(或界面张力)的成分。表面活性剂可用作洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。表面活性剂的实例包括但不限于Triton X-100、Tween 80、牛磺脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)和/或月桂基硫酸钠(SLS)。
虽然Triton X-100可用于部分纯化SHC酶或酶变体(以可溶性或膜级分/悬浮液形式)，但它也可用于生物转化反应(参见例如Seitz(如上文所引用的2012PhD论文)中的公开内容以及Neumann和Simon(1986—如上文所引用)和JP2009060799中的公开内容。SDS可用作增溶剂。
不希望受理论束缚，SDS与重组微生物宿主细胞一起使用可能是有利的，因为SDS可以有利地与宿主细胞膜相互作用，以使SHC酶或酶变体(其为膜结合酶)更容易接近式(II)的化合物底物。此外，在反应混合物中包含适合水平的SDS可以改善乳液的性质(例如，在水中的式(II)的化合物)和/或改善式(II)的化合物底物对宿主内的SHC酶的接近。生物转化反应中使用的增溶剂(例如SDS)的浓度受生物质量和底物浓度的影响。也就是说，增溶剂(例如SDS)浓度、生物质量和底物浓度之间存在一定程度的相互依赖性。作为实例，随着式(II)的化合物底物的浓度增加，需要足量的生物催化剂和增溶剂(例如SDS)来进行有效的生物转化反应。例如，如果增溶剂(例如SDS)浓度太低，则可能观察到式(II)的化合物的次优转化。另一方面，例如，如果增溶剂(例如SDS)浓度过高，则可能存在生物催化剂通过破坏完整微生物细胞和/或SHC酶或酶变体的变性/失活而受到影响的风险。必须仔细研究在生物质量和底物的背景下选择合适浓度的SDS。
在一些实施方案中，使用向其中加入式(II)的化合物底物的生物催化剂生产式(I)的化合物。
能够通过使用已知装置(例如蠕动泵、输注注射器等)进料来添加底物。式(II)的化合物可以是油溶性的并且以油形式提供。鉴于生物催化剂(微生物细胞，例如完整重组全细胞和/或细胞碎片和/或固定化酶)存在于水相中，当将式(II)的化合物加入到生物转化反应混合物中时，生物转化反应可以被认为是三相体系(包含水相、固相和油相)。即使当存在SDS时也是这种情况。
发酵罐可以用于使产生SHC酶或酶变体基因并产生活性SHC酶或酶变体的重组宿主细胞在用于将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物(例如与一种或多种式(III)的副产物混合)的相同发酵罐容器中生长至适合用作生物催化剂的足够生物质浓度。
本领域技术人员将理解，通过实施连续过程，例如产物去除、底物进料和生物质添加或(部分)替换，可以实现更高的累积生产效价(production titers)。优选地，在包含SHC酶或酶变体的重组宿主细胞存在下将式(II)的化合物生物转化成式(I)的化合物产生5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100的式(I)的化合物收率，以摩尔百分比表示并且以所用的式(II)的化合物的摩尔数为基准；特别优选地，收率为5至100、10至100、和100、25至100、30至100、35至100，特别是40至100、45至100、50至100、60至100、70至100mol％。
SHC酶或酶变体的活性通过以百分比计的反应速率((产物的量/(产物的量+剩余原料的量))×100)来定义。优选地，在SHC酶或酶变体存在下将式(II)的化合物生物转化成式(I)的化合物产生5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100的式(I)的化合物收率，以摩尔百分比表示并且以所用的式(II)的化合物的摩尔数为基准；特别优选地，收率为5至100、10至100、20至100、25至100、30至100、35至100，特别是40至100、45至100、50至100、60至100、70至100。
在本发明的一个优选实施方案中，在例如4、6、8、10、12、16、20、24、36、48或72小时的限定时间期限内测定收率和/或反应速率，在该限定时间期限内式(II)的化合物通过包含编码SHC酶或酶变体的核苷酸序列并且已产生SHC酶或酶变体的重组宿主细胞转化成式(I)的化合物。
在另一个实施方案中，反应在例如25℃、30℃、40℃、50℃或60℃的精确确定的条件下进行。特别地，收率和/或反应速率通过在约35℃至约55℃的温度范围内在24-72小时的时间期限内通过本发明的SHC酶或酶变体进行将式(II)的化合物转化成式(I)的化合物的反应来确定。
在本发明的另一个实施方案中，包含编码SHC酶变体的核苷酸序列的重组宿主细胞的特征在于在相同条件下，优选地在已经单独定义为对于所考虑的SHC酶的活性最佳的条件下，与亲本野生型或变体SHC酶相比，其显示在式(II)的化合物的反应中得到式(I)的化合物的收率和/或反应速率为2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-、20-、21-、22-、23-、24-、25-、26-、27-、28-、29-、30-、31-、32-、33-、34-、35-、36-、37-、38-、39-、40-、41-、42-、43-、44-、45-、46-、47-、48-、49-、50-、51-、52-、53-、54-、55-、56-、57-、58-、59-、60-、61-、62-、63-、64-、65-、66-、67-、68-、69-、70-、71-、72-、73-、74-、75-、76-、77-、78-、79-、80-、81-、82-、83-、84-、85-、86-、87-、88-、89-、90-、91-、92-、93-、94-、95-、96-、97-、98-、99-、100-、200-、500-、1000-倍或更高。本文的术语条件涉及但不限于反应条件，例如pH、温度和增溶剂(例如SDS)的浓度。
用于在包含编码野生型/参考SHC或SHC变体的核苷酸序列的重组大肠杆菌菌株中由式(II)的化合物制备式(I)的化合物的生物转化方法的成功开发可以提供用于式(I)的化合物生产的低成本和工业上经济的方法。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”以及例如“包含(comprises)”和“含有(comprising)”的变化形式将被理解为暗示包含所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。术语“包含”还表示“包括”以及“由......组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括另外的成分，例如X+Y。还必须注意，正如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，内容中另有明确规定的除外。作为实例，涉及的“基因”或“酶”是指“一种或多种基因”或“一种或多种酶”。
应当理解，本公开不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本公开的范围，本公开的范围将仅由所附权利要求限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。根据本公开，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。
本公开的应用不限于以下描述中阐述的或附图中示例的构造细节和部件布置。本公开能够具有其他实施方案并且能够以各种方式实施或进行。此外，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应被认为是限制性的。优选地，本文所用的术语如“Amultilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger,H.G.W，Nagel,B.和Kolbl，H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland)中所述定义。
在本说明书的整个文本中引用了若干对比文件。本文引用的每篇对比文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书、GenBank登录号序列提交件等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。
本文描述的实施例是对本公开的示例，而不旨在对其进行限制。已经根据本公开描述了本公开的不同实施方案。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文描述和示例的技术进行许多变型和改变。因此，应当理解，这些实施例仅是示例明性的，并不限制本公开的范围。
实施例
实施例1-SHC酶的生产
SHC质粒制备：
将编码野生型或变体角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)的基因插入质粒pET-28a(+)中，其中其处于IPTG诱导型T7启动子的控制下，用于在大肠杆菌中产生蛋白质。使用标准热激转化方案将质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。
培养基制备：
对于350ml培养物，如下制备默认选择的基本培养基：向35ml柠檬酸/磷酸盐储备溶液(133g/l KH2PO4、40g/l(NH4)2HPO4、17g/l柠檬酸.H2O，pH调节至6.3)中加入307ml H2O，根据需要用32％NaOH将pH调节至6.8。高压灭菌后，加入0.850ml 50％MgSO4、0.035ml微量元素溶液(参见下文)、0.035ml硫胺素溶液和7ml 20％葡萄糖。
微量元素溶液：50g/l Na2EDTA.2H2O，20g/l FeSO4.7H2O，3g/l H3BO3，0.9g/lMnSO4.2H2O，1.1g/l CoCl2，80g/L CuCl2，240g/l NiSO4.7H2O，100g/l KI，1.4g/l(NH4)6Mo7O24.4H2O，1g/l ZnSO4.7H2O的去离子水溶液。
硫胺素溶液：2.25g/l硫胺素.HCl的去离子水溶液。
MgSO4溶液：50％(w/v)MgSO4.7H2O的去离子水溶液。
SHC酶或酶变体生产(生物催化剂生产)。
小规模生物催化剂生产(野生型SHC或SHC变体)
从包含SHC生产质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)的预培养物接种350ml培养物(补充有50μg/ml卡那霉素的培养基)。在恒定搅拌(250rpm)下使细胞生长至在37℃下光密度为约0.5(OD650nm)。
然后通过加入IPTG至300μM的浓度，随后在恒定振荡下再孵育5-6小时来诱导蛋白质产生。最后通过离心收集所得生物质，并用例如50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5洗涤。将细胞作为沉淀储存在4℃或-20℃直至进一步使用。通常，从1升培养物中获得2.5至4克细胞(湿重)，与所用的培养基无关。
发酵罐中的生物催化剂生产
在750ml InforsHT反应器中准备和运行发酵。向发酵容器中加入168ml去离子水。反应容器配备有所有需要的探头(pO2，pH，采样，消泡剂)，C+N进料和氢氧化钠瓶，高压灭菌。高压灭菌后，将如下成分加入到反应器中：
20ml 10x磷酸盐/柠檬酸缓冲液
14ml 50％葡萄糖
0.53ml MgSO4溶液
2ml(NH4)2SO4溶液
0.020ml微量元素溶液
0.400ml硫胺素溶液
0.200ml卡那霉素储备溶液
运行参数设置如下：pH＝6.95，pO2＝40％，T＝30℃，以300rpm搅拌。级联：rpm设定点为300，min 300，max 1000，流速(L/min)设定点0.1，min 0，max 0.6。消泡剂对照：1:9。
将发酵罐从种子培养物接种至OD650nm 0.4-0.5。使该种子培养物在LB培养基(+卡那霉素)中在37℃、220rpm下生长8h。发酵首先以分批模式运行11.5h，之后开始用补料溶液(无菌葡萄糖溶液(143ml H2O+35g葡萄糖)进行C+N补料，灭菌后向其中加入：17.5ml(NH4)2SO4溶液，1.8ml MgSO4溶液，0.018ml微量元素溶液，0.360ml硫胺素溶液，0.180ml卡那霉素储备溶液。进料以约4.2ml/h的恒定流速运行。葡萄糖和NH4 +在外部进行测量以评估培养物中C-源和N-源的可利用性。葡萄糖水平通常极低。
培养物生长总计约25小时，其中它们通常达到OD650nm 40-45。然后通过加入IPTG至在发酵罐中1mM的浓度启动SHC生产(作为IPTG脉冲或使用输注注射器在3-4小时的时间期限内)，将温度设定至40℃和pO2设定至20％。在40℃诱导SHC生产持续16h。在诱导结束时，通过离心收集细胞，用0.1M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液pH 5.4洗涤，并在4℃或-20℃下作为沉淀储存直至进一步使用。
实施例2-GC分析
用适当体积的叔丁基甲基醚(MBTE/tBME)提取样品以定量其在底物和反应产物中的含量。在用气相色谱分析之前，通过离心使溶剂级分与水相分离。将1μL溶剂相注射(分流比10)到30m x 0.32mm x 0.25μm Zebron ZB-Wax柱上。柱在恒定流速(4ml/min H2)与温度梯度下展开：100℃，15℃/min至200℃，120℃/min至240℃，4min，240℃。入口温度：250℃，检测器温度：250℃。这导致底物和产物峰分离。
羟基法呢基丙酮转化率由相应于底物和反应产物的峰的面积用下式计算：
转化率(％)＝100x(面积产物峰/(面积产物峰+面积底物峰))
实施例3-使用SHC酶和酶变体筛选羟基法呢基丙酮环化
如实施例1所述在大肠杆菌中产生用于羟基法呢基丙酮环化反应的SHC酶集合。该反应体系包含1g/l羟基法呢基丙酮和细胞至OD650nm 10。应用如表2中所列的反应条件。在表2中列出的最佳反应条件下测试的SHC酶的性能概述显示在图2中。
表2.SHC酶和反应条件。
Figure BDA0003968589730000441
Figure BDA0003968589730000451
*在柠檬酸/磷酸钠缓冲液中
所有测试的酶都能够将羟基法呢基丙酮环化成(+)-龙涎缩醛。野生型酶的转化率在2％至约90％之间，并且在BmeSHC的情况下最高，如图2所示。如使用在图2中概括的SHC变体215G2 SHC、115A7SHC、110B8 SHC、90C7 SHC、SHC#49、SHC#65、SHC#66中观察到的，当将突变导入野生型AacSHC时，羟基法呢基丙酮环化增加。
实施例4-使用SHC酶的羟基法呢基丙酮环化
分别在包含2和8g/l羟基法呢基丙酮的反应中用产生ZmoSHC1或BmeSHC酶的细胞测试反应中的羟基法呢基丙酮环化。反应包含细胞至OD600nm 80。反应在50mM琥珀酸/NaOH缓冲液pH 5.2中进行，并在35℃下孵育24小时。溶剂萃取反应的GC-FID分析表明，在2g/l底物下运行的反应中，对于ZmoSHC1和BmeSHC，羟基法呢基丙酮转化率分别为52％和90％。在8g/l下，使用ZmoSHC1和BmeSHC的羟基法呢基丙酮转化率分别为17％和79％。
实施例5-使用角鲨烯何帕烯环化酶变体酶的羟基法呢基丙酮的环化
如实施例1所概括的生产酶SHC变体215G2并用于羟基法呢基丙酮的环化反应。
典型的反应(150g总体积)如下在0.75升Infors发酵罐中设置。向反应容器中装入羟基法呢基丙酮(0.75g，2.7mmol)，从在去离子水中制备的31％(w/w)溶液中加入1.95gSDS。通过将细胞悬浮于0.1M琥珀酸/NaOH缓冲液pH 5.1中，由已产生关注的SHC变体的大肠杆菌细胞制备细胞悬浮液。通过在10℃和17210g下离心10min测定该细胞悬浮液的细胞湿重浓度后，将适当体积的细胞加入反应容器中以将37.5g细胞导入反应中。用所需量的反应缓冲液pH 5.1将反应体积补足至150g。反应在35℃和pH 5.4下在恒定搅拌(700rpm)下进行。使用85％H3PO4将pH设定为5.4。根据需要使用85％磷酸手动进行pH调节。将反应随时间取样(1ml)，用5体积的MTBE/tBME(5ml)萃取。在通过离心(台式离心机，13000rpm，2min)澄清溶剂相后，通过GC分析测定反应的底物和产物含量。
大约在72小时的反应之后，通过剧烈振荡用100ml MTBE萃取反应体系5次，然后通过离心(6000g，10min，室温)进行相分离。将粗萃取物经硅胶过滤并将滤液浓缩。将残余物(2.4g)通过硅胶柱色谱法(用在正庚烷中的7-70％乙酸乙酯的梯度洗脱)进行纯化。从其中分离出(+)-龙涎缩醛(式(I)的化合物，173mg，23％，淡黄色固体)和(Z)-5-((5aR,9aR)-6,6,9a-三甲基八氢苯并[b]噁庚因-3(2H)-亚基)戊-2-酮(式(III)的化合物，65mg，9％，灰白色固体)。
(+)-龙涎缩醛的表征。[α]D 23＝+16.4°(c＝0.42，CHCl3)。TLC(硅胶，庚烷/EtOAc3:2):Rf＝0.54。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)4.32(d,J＝6.8Hz,1H),3.37(dd,J＝7.1,1.2Hz,1H),1.90(dt,J＝12.7,3.4Hz,1H),1.82(dd,J＝13.7,4.6Hz,1H),1.49-1.78(m,8H),1.43-1.47(m,1H),1.42(s,3H),1.10-1.24(m,3H),0.99(dd,J＝12.2,2.0Hz,1H),0.90(s,6H),0.83-0.95(m,1H),0.82(s,3H)。13C-NMR(101MHz,CDCl3):106.0(s),82.6(s),73.5(t),55.7(d),53.3(d),41.8(t),38.7(t),37.3(s),36.2(t),35.9(t),33.6(q),33.1(s),24.3(q),21.7(q),20.0(t),18.3(t),17.4(t),14.6(q)。
EI-MS(70eV):278(M+,<1),263(<1),248(2),236(4),218(36),203(19),190(55),175(43),162(11),147(24),137(34),121(42),109(47),95(34),79(38),69(36),55(42),43(100)。
(Z)-5-((5aR,9aR)-6,6,9a-三甲基八氢苯并[b]噁庚因-3(2H)-亚基)戊-2-酮的表征
TLC(硅胶，庚烷/EtOAc3:2):Rf＝0.29。
1H-NMR(600MHz,苯-d6)δppm5.01(br t,J＝7.3Hz,1H),4.44(d,J＝16.6Hz,1H),4.29(br d,J＝16.2Hz,1H),2.47(ddd,J＝12.4,7.9,3.8Hz,1H),2.22(ddd,J＝12.7,8.6,4.3Hz,1H),2.08(q,J＝7.2Hz,2H),),1.94(t,J＝1.0Hz,2H),1.73-1.62(m,3H),1.61(s,3H),1.49-1.22(m,4H),1.21-1.14(m,2H),1.19(s,3H),0.87(s,3H),0.72(s,3H)。13C-NMR(151MHz,苯-d6)δppm 205.59,143.75,120.82,78.59,62.81,55.39,42.97,42.28,41.65,35.76,35.38,33.45,29.42,26.21,21.56,21.56,20.89,19.64。
EI-MS(70eV):278(M+,<1),260(<1),245(<1),220(1),141(16),135(15),123(24),109(32),95(25),81(19),69(12),55(13),43(100)。
实施例5A-使用野生型BmeSHC的羟基法呢基丙酮的环化
如实施例1中所概括的生产野生型BmeSHC，并将其用于羟基法呢基丙酮的环化反应。
反应(4ml体积)包含在0.2M乙酸/乙酸钠缓冲液pH 5.2中的135g/l羟基法呢基丙酮、221g/l细胞(细胞湿重)、0.09％SDS。将该反应体系在45℃下在恒定搅拌(650rpm，Radleys Carousel)下温育。一个反应用作对照，随时间取样，用MTBE萃取样品，通过离心(台式离心机，13000rpm，2min)澄清溶剂相，并通过GC分析其底物和产物含量。开始后50h，羟基法呢基丙酮转化完全或几乎完全(100％)，预期约920mg的(+)-龙涎缩醛。
将合并的反应物离心(4500g，4℃，15min)。回收沉淀并用20ml去离子水洗涤3次(剧烈振荡+离心)，弃去水相。最终将沉淀重悬于15ml去离子水中，并用15-20ml MTBE萃取3次(剧烈振荡+离心)。收集有机相并分析其(+)-龙涎缩醛含量。将合并的有机相过滤(硅胶)，在氮气流下蒸发溶剂，得到约720mg干燥的结晶粉末。将残余物(720mg)通过硅胶柱色谱法纯化，用在正庚烷中的6-50％MTBE的梯度洗脱。合并包含纯(+)-龙涎缩醛的级分，蒸发溶剂。分离出560mg(+)-龙涎缩醛(式(I)的化合物(收率约61％)。
(+)-龙涎缩醛的表征。[α]D 25＝+22.6°(c＝0.94，CHCl3)。TLC(硅胶，正庚烷/MTBE3:1):Rf＝0.55。NMR：光谱数据与实施例5中所示的数据一致。
实施例6-羟基法呢基丙酮(也参见图1)
1a)(E)-6,10-二甲基-1-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十一碳-5,9-二烯-2-酮(4)的制备：在氮气气氛中向在1L高压釜中的4-(苄基氧基)-3-氧代丁酸乙酯(1，60g，0.25mol，1当量)在乙醇(600mL)中的溶液中分部分加入10％披钯碳(6.0g，10％w/w)，并将该混合物在3atm氢气中搅拌12h。通过C盐(celite)床过滤该反应混合物，并用二氯甲烷/乙醇的1:1混合物洗涤。真空蒸发滤液，得到淡黄色残余物，将其溶于二氯甲烷(600mL)。向该溶液中加入3,4-二氢-2H-吡喃(42.7g，0.51mol，2当量)和PPTS(6.3g，0.025mol；0.1当量)，并将该混合物在室温下搅拌16h，然后加入水(500mL)，随后用二氯甲烷(2x 200mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯的石油醚溶液(5-8％)洗脱，得到(E)-5,9-二甲基-2-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙酰基)癸-4,8-二烯酸乙酯(2)，为淡黄色液体(45g，77％)。将该产物(44g，0.19mol，1.0当量)溶于THF(440mL)，并加入碳酸钾(31.6g，0.23mol，1.2当量)。将该悬浮液在室温下搅拌1h，然后在0℃下加入(E)-1-溴-3,7-二甲基辛-2,6-二烯(香叶基溴，37.3g，0.172mol，0.9当量)，并将该混合物在室温下搅拌16h。将该混合物过滤并将滤饼用二氯甲烷洗涤。真空浓缩滤液，得到(E)-5,9-二甲基-2-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙酰基)癸-4,8-二烯酸乙酯(3，70g)，将其溶于乙醇(500mL)。加入KOH(35g)在水(100mL)中的溶液，并将该混合物加热至80℃，历时2h。真空浓缩该溶液，得到残余物，将其溶于二氯甲烷(1L)，并用水(2x 200mL)和盐水洗涤。将有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到粗油状物，将其通过硅胶柱色谱法、使用5-8％的乙酸乙酯的石油醚溶液纯化，得到(E)-6,10-二甲基-1-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十一碳-5,9-二烯-2-酮(4，20g，36％)，为淡黄色液体。
1b)(3-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)丙基)三苯基鏻碘化物(8)的制备：向5-碘戊-2-酮(45g，0.21mol，1当量)在(200mL)甲苯中的溶液中加入三苯基膦(66.8g，0.25mol，1.2当量)。将该混合物在120℃下搅拌16h，然后冷却至室温，此时固体沉淀，将其过滤，用乙醚(100mL)洗涤并真空干燥，得到(4-氧代戊基)三苯基鏻碘化物(90g，90％)，为浅棕色固体。将该产物(40g，0.10mol，1当量)悬浮于甲苯(400mL)中，并加入乙二醇(80mL)和对甲苯磺酸(1g，0.0167mol，0.16当量)，并给装置配备迪安-斯达克冷凝器。将该混合物加热至130℃，历时12h，然后冷却至室温并弃去甲苯层。将剩余的橡胶状残余物溶于二氯甲烷(500mL)，并用水(500mL)和盐水(200mL)洗涤。
将有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到(3-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)丙基)三苯基鏻碘化物(8，43g，80％)，为浅棕色固体。
1c)羟基法呢基丙酮的制备：在-78℃下冷却(3-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)丙基)三苯基鏻碘化物(52.8g，0.10mol，2当量)在THF(150mL)中的悬浮液，然后添加1.6M n-BuLi的己烷溶液(63.8mL，0.10mol，2当量)。将该混合物在室温下搅拌30min，此时形成橙黄色悬浮液，再将其冷却至-78℃。滴加(E)-6,10-二甲基-1-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十一碳-5,9-二烯-2-酮(4，15g，0.05mol，1当量)在THF(20mL)中的溶液。并在室温下持续搅拌2h。在该期限过程中，反应混合物变成黄色悬浮液。将该反应混合物用冰水(100mL)淬灭，并用乙酸乙酯(2x 100mL)萃取。将有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到粗产物，将其与己烷(4x 50mL)一起研磨，并将沉淀的三苯基膦氧化物通过过滤除去。真空除去溶剂后，得到2-(((2Z,5E)-6,10-二甲基-2-(3-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)亚丙基)十一碳-5,9-二烯-1-基)氧基)四氢-2H-吡喃(9，22g)，为淡黄色液体，根据1H-NMR，其仍然包含痕量的三苯基膦氧化物。将产物(22g，0.05mol，1当量)溶于丙酮(200mL)，并在0℃下加入1.5N HCl-水溶液(220mL)。将该溶液在室温下搅拌16h，然后加入水(50mL)，并将混合物用乙醚(2x 100mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到粗油状物，将其通过硅胶柱色谱法纯化，用10-15％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，得到(5Z,9E)-6-(羟基甲基)-10,14-二甲基十五碳-5,9,13-三烯-2-酮(羟基法呢基丙酮，7.5g，GC/MS纯度为81％)，通过在85℃/1mm/Hg下蒸馏从其中除去挥发性杂质。使残余物(5.8g)进行第二次硅胶柱色谱，用10-15％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱，得到羟基法呢基丙酮(2.8g，19％)，为淡黄色液体。
13C-NMR(d6-DMSO,100MHz):208.4(s),140.2(s),134.7(s),131.1(s),125.0(d),124.6(d),124.6(d),58.5(t),43.6(t),39.7(2t),35.0(t),30.1(q),26.7(t),25.9(q),21.9(t),18.0(q),16.2(q)。
序列表
SEQ ID NO:1(野生型酸热脂环酸芽孢杆菌SHC(AacSHC)的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
SEQ ID NO:2(编码野生型AacSHC的核苷酸序列)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
SEQ ID NO:3(AacSHC酶变体#65的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTTWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYSHVFPTLALGRYKQAIERR
SEQ ID NO:4(编码SHC酶变体#65的核苷酸序列)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGACCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACAGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
SEQ ID NO:5(AacSHC酶变体#66的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALHPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTTWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYSHVFPTLALGRYKQAIERR
SEQ ID NO:6(编码SHC酶变体#66的核苷酸序列)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGCACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGACCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACAGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
SEQ ID NO:7(AacSHC酶变体#90C7的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDATIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYSHVFPTLALGRYKQAIERR
SEQ ID NO:8(编码SHC变体#90C7的核苷酸序列)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACGCGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACAGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
SEQ ID NO:9(AacSHC酶变体#110B8的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALHPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNLTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTTWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
SEQ ID NO:10(编码SHC酶变体#110B8的核苷酸序列)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGCACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCTCACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGACCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
SEQ ID NO:11(AacSHC酶变体#115A7的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARTTVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDKTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
SEQ ID NO:12(编码SHC变体#115A7的核苷酸序列)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGACGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACAAGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
SEQ ID NO:13(AacSHC酶变体215G2的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
SEQ ID NO:14(编码Aac 215G2 SHC酶变体的核苷酸序列)
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCTCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGAGGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGTGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACACCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTTCTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
SEQ ID NO:15(野生型ZmoSHC1的氨基酸序列)
MGIDRMNSLSRLLMKKIFGAEKTSYKPASDTIIGTDTLKRPNRRPEPTAKVDKTIFKTMGNSLNNTLVSACDWLIGQQKPDGHWVGAVESNASMEAEWCLALWFLGLEDHPLRPRLGNALLEMQREDGSWGVYFGAGNGDINATVEAYAALRSLGYSADNPVLKKAAAWIAEKGGLKNIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNLPPEIIWFPDNFVFSIYNFAQWARATMVPIAILSARRPSRPLRPQDRLDELFPEGRARFDYELPKKEGIDLWSQFFRTTDRGLHWVQSNLLKRNSLREAAIRHVLEWIIRHQDADGGWGGIQPPWVYGLMALHGEGYQLYHPVMAKALSALDDPGWRHDRGESSWIQATNSPVWDTMLALMALKDAKAEDRFTPEMDKAADWLLARQVKVKGDWSIKLPDVEPGGWAFEYANDRYPDTDDTAVALIALSSYRDKEEWQKKGVEDAITRGVNWLIAMQSECGGWGAFDKDNNRSILSKIPFCDFGESIDPPSVDVTAHVLEAFGTLGLSRDMPVIQKAIDYVRSEQEAEGAWFGRWGVNYIYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYITKACDWLVAHQQEDGGWGESCSSYME
SEQ ID NO:16(野生型ZmoSHC2的氨基酸序列)
MTVSTSSAFHHSPLSDDVEPIIQKATRALLEKQQQDGHWVFELEADATIPAEYILLKHYLGEPEDLEIEAKIGRYLRRIQGEHGGWSLFYGGDLDLSATVKAYFALKMIGDSPDAPHMLRARNEILARGGAMRANVFTRIQLALFGAMSWEHVPQMPVELMLMPEWFPVHINKMAYWARTVLVPLLVLQALKPVARNRRGILVDELFVPDVLPTLQESGDPIWRRFFSALDKVLHKVEPYWPKNMRAKAIHSCVHFVTERLNGEDGLGAIYPAIANSVMMYDALGYPENHPERAIARRAVEKLMVLDGTEDQGDKEVYCQPCLSPIWDTALVAHAMLEVGGDEAEKSAISALSWLKPQQILDVKGDWAWRRPDLRPGGWAFQYRNDYYPDVDDTAVVTMAMDRAAKLSDLHDDFEESKARAMEWTIGMQSDNGGWGAFDANNSYTYLNNIPFADHGALLDPPTVDVSARCVSMMAQAGISITDPKMKAAVDYLLKEQEEDGSWFGRWGVNYIYGTWSALCALNVAALPHDHLAVQKAVAWLKTIQNEDGGWGENCDSYALDYSGYEPMDSTASQTAWALLGLMAVGEANSEAVTKGINWLAQNQDEEGLWKEDYYSGGGFPRVFYLRYHGYSKYFPLWALARYRNLKKANQPIVHYGM
SEQ ID NO:17(野生型BjaSHC的氨基酸序列)
MTVTSSASARATRDPGNYQTALQSTVRAAADWLIANQKPDGHWVGRAESNACMEAQWCLALWFMGLEDHPLRKRLGQSLLDSQRPDGAWQVYFGAPNGDINATVEAYAALRSLGFRDDEPAVRRAREWIEAKGGLRNIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNIPPEVIWFPLWFPFSIYNFAQWARATLMPIAVLSARRPSRPLPPENRLDALFPHGRKAFDYELPVKAGAGGWDRFFRGADKVLHKLQNLGNRLNLGLFRPAATSRVLEWMIRHQDFDGAWGGIQPPWIYGLMALYAEGYPLNHPVLAKGLDALNDPGWRVDVGDATYIQATNSPVWDTILTLLAFDDAGVLGDYPEAVDKAVDWVLQRQVRVPGDWSMKLPHVKPGGWAFEYANNYYPDTDDTAVALIALAPLRHDPKWKAKGIDEAIQLGVDWLIGMQSQGGGWGAFDKDNNQKILTKIPFCDYGEALDPPSVDVTAHIIEAFGKLGISRNHPSMVQALDYIRREQEPSGPWFGRWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYIGRACDWLVAHQQADGGWGESCASYMDVSAVGRGTTTASQTAWALMALLAANRPQDKDAIERGCMWLVERQSAGTWDEPEFTGTGFPGYGVGQTIKLNDPALSQRLMQGPELSRAFMLRYGMYRHYFPLMALGRALRPQSHS
SEQ ID NO:18(野生型TelSHC的氨基酸序列)
MPTSLATAIDPKQLQQAIRASQDFLFSQQYAEGYWWAELESNVTMTAEVILLHKIWGTEQRLPLAKAEQYLRNHQRDHGGWELFYGDGGDLSTSVEAYMGLRLLGVPETDPALVKARQFILARGGISKTRIFTKLHLALIGCYDWRGIPSLPPWIMLLPEGSPFTIYEMSSWARSSTVPLLIVMDRKPVYGMDPPITLDELYSEGRANVVWELPRQGDWRDVFIGLDRVFKLFETLNIHPLREQGLKAAEEWVLERQEASGDWGGIIPAMLNSLLALRALDYAVDDPIVQRGMAAVDRFAIETETEYRVQPCVSPVWDTALVMRAMVDSGVAPDHPALVKAGEWLLSKQILDYGDWHIKNKKGRPGGWAFEFENRFYPDVDDTAVVVMALHAVTLPNENLKRRAIERAVAWIASMQCRPGGWAAFDVDNDQDWLNGIPYGDLKAMIDPNTADVTARVLEMVGRCQLAFDRVALDRALAYLRNEQEPEGCWFGRWGVNYLYGTSGVLTALSLVAPRYDRWRIRRAAEWLMQCQNADGGWGETCWSYHDPSLKGKGDSTASQTAWAIIGLLAAGDATGDYATEAIERGIAYLLETQRPDGTWHEDYFTGTGFPCHFYLKYHYYQQHFPLTALGRYARWRNLLAT
SEQ ID NO:19(野生型ApaSHC1的氨基酸序列
MNMASRFSLKKILRSGSDTQGTNVNTLIQSGTSDIVRQKPAPQEPADLSALKAMGNSLTHTLSSACEWLMKQQKPDGHWVGSVGSNASMEAEWCLALWFLGLEDHPLRPRLGKALLEMQRPDGSWGTYYGAGSGDINATVESYAALRSLGYAEDDPAVSKAAAWIISKGGLKNVRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNLPPEIIWFPDNFVFSIYNFAQWARATMMPLAILSARRPSRPLRPQDRLDALFPGGRANFDYELPTKEGRDVIADFFRLADKGLHWLQSSFLKRAPSREAAIKYVLEWIIWHQDADGGWGGIQPPWVYGLMALHGEGYQFHHPVMAKALDALNDPGWRHDKGDASWIQATNSPVWDTMLSLMALHDANAEERFTPEMDKALDWLLSRQVRVKGDWSVKLPNTEPGGWAFEYANDRYPDTDDTAVALIAIASCRNRPEWQAKGVEEAIGRGVRWLVAMQSSCGGWGAFDKDNNKSILAKIPFCDFGEALDPPSVDVTAHVLEAFGLLGLPRDLPCIQRGLAYIRKEQDPTGPWFGRWGVNYLYGTGAVLPALAALGEDMTQPYISKACDWLINCQQENGGWGESCASYMEVSSIGHGATTPSQTAWALMGLIAANRPQDYEAIAKGCRYLIDLQEEDGSWNEEEFTGTGFPGYGVGQTIKLDDPAISKRLMQGAELSRAFMLRYDLYRQLFPIIALSRASRLIKLGN
SEQ ID NO:20(野生型GmoSHC的氨基酸序列)
MSPADISTKSSSFQRLDNMLPEAVSSACDWLIDQQKPDGHWVGPVESNACMEAQWCLALWFLGQEDHPLRPRLAQALLEMQREDGSWGIYVGADHGDINTTVEAYAALRSMGYAADMPIMAKSAAWIQQKGGLRNVRVFTRYWLALIGEWPWDKTPNLPPEIIWLPDNFIFSIYNFAQWARATMMPLTILSARRPSRPLLPENRLDGLFPEGRENFDYELPVKGEEDLWGRFFRAADKGLHSLQSFPVRRFVPREAAIRHVIEWIIRHQDADGGWGGIQPPWIYGLMALSVEGYPLHHPVLAKAMDALNDPGWRRDKGDASWIQATNSPVWDTMLAVLALHDAGAEDRYSPQMDKAIGWLLDRQVRVKGDWSIKLPDTEPGGWAFEYANDKYPDTDDTAVALIALAGCRHRPEWRERDIEGAISRGVNWLLAMQSSSGGWGAFDKDNNRSILTKIPFCDFGEALDPPSVDVTAHVLEAFGLLGISRNHPSVQKALAYIRSEQERNGAWFGRWGVNYVYGTGAVLPALAAIGEDMTQPYIVRACDWLMSVQQENGGWGESCASYMDINAVGHGVATASQTAWALIGLLAAKRPKDREAIARGCQFLIERQEDGSWTEEEYTGTGFPGYGVGQAIKLDDPSLPDRLLQGAELSRAFMLRYDLYRQYFPVMALSRARRMMKEDASAAA
SEQ ID NO:21(野生型BmeSHC的氨基酸序列)
MIILLKEVQLEIQRRIAYLRPTQKNDGSFRYCFETGVMPDAFLIMLLRTFDLDKEVLIKQLTERIVSLQNEDGLWTLFDDEEHNLSATIQAYTALLYSGYYQKNDRILRKAERYIIDSGGISRAHFLTRWMLSVNGLYEWPKLFYLPLSLLLVPTYVPLNFYELSTYARIHFVPMMVAGNKKFSLTSRHTPSLSHLDVREQKQESEETTQESRASIFLVDHLKQLASLPSYIHKLGYQAAERYMLERIEKDGTLYSYATSTFFMIYGLLALGYKKDSFVIQKAIDGICSLLSTCSGHVHVENSTSTVWDTALLSYALQEAGVPQQDPMIKGTTRYLKKRQHTKLGDWQFHNPNTAPGGWGFSDINTNNPDLDDTSAAIRALSRRAQTDTDYLESWQRGINWLLSMQNKDGGFAAFEKNTDSILFTYLPLENAKDAATDPATADLTGRVLECLGNFAGMNKSHPSIKAAVKWLFDHQLDNGSWYGRWGVCYIYGTWAAITGLRAVGVSASDPRIIKAINWLKSIQQEDGGFGESCYSASLKKYVPLSFSTPSQTAWALDALMTICPLKDQSVEKGIKFLLNPNLTEQQTHYPTGIGLPGQFYIQYHSYNDIFPLLALAHYAKKHSS
SEQ ID NO:22(AacSHC酶变体#49的氨基酸序列)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRRWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRVLHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNLTPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTTWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
序列表
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<120> 酶介导的方法
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<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 631
<212> PRT
<213> 酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)野生型SHC酶
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<211> 631
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<213> 人工序列
<220>
<223> SHC酶变体#66
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Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 14
<211> 1896
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SHC酶变体#215G2
<400> 14
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
tacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac cacaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacggc ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtaccgcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 15
<211> 608
<212> PRT
<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)野生型SHC酶
<400> 15
Met Gly Ile Asp Arg Met Asn Ser Leu Ser Arg Leu Leu Met Lys Lys
1 5 10 15
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100 105 110
Arg Pro Arg Leu Gly Asn Ala Leu Leu Glu Met Gln Arg Glu Asp Gly
115 120 125
Ser Trp Gly Val Tyr Phe Gly Ala Gly Asn Gly Asp Ile Asn Ala Thr
130 135 140
Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Asn
145 150 155 160
Pro Val Leu Lys Lys Ala Ala Ala Trp Ile Ala Glu Lys Gly Gly Leu
165 170 175
Lys Asn Ile Arg Val Phe Thr Arg Tyr Trp Leu Ala Leu Ile Gly Glu
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260 265 270
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275 280 285
Asn Leu Leu Lys Arg Asn Ser Leu Arg Glu Ala Ala Ile Arg His Val
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355 360 365
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370 375 380
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Asp Trp Leu Leu Ala Arg Gln Val Lys Val Lys Gly Asp Trp Ser Ile
405 410 415
Lys Leu Pro Asp Val Glu Pro Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn
420 425 430
Asp Arg Tyr Pro Asp Thr Asp Asp Thr Ala Val Ala Leu Ile Ala Leu
435 440 445
Ser Ser Tyr Arg Asp Lys Glu Glu Trp Gln Lys Lys Gly Val Glu Asp
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Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn Arg Ser Ile Leu Ser
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Gln Gln Glu Asp Gly Gly Trp Gly Glu Ser Cys Ser Ser Tyr Met Glu
595 600 605
<210> 16
<211> 658
<212> PRT
<213> 运动发酵单胞菌野生型SHC酶
<400> 16
Met Thr Val Ser Thr Ser Ser Ala Phe His His Ser Pro Leu Ser Asp
1 5 10 15
Asp Val Glu Pro Ile Ile Gln Lys Ala Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys
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Gln Gln Gln Asp Gly His Trp Val Phe Glu Leu Glu Ala Asp Ala Thr
35 40 45
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Gly Glu His Gly Gly Trp Ser Leu Phe Tyr Gly Gly Asp Leu Asp Leu
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Ala Met Arg Ala Asn Val Phe Thr Arg Ile Gln Leu Ala Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Met Leu Met Pro Glu Trp Phe Pro Val His Ile Asn Lys Met Ala Tyr
165 170 175
Trp Ala Arg Thr Val Leu Val Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Leu Lys
180 185 190
Pro Val Ala Arg Asn Arg Arg Gly Ile Leu Val Asp Glu Leu Phe Val
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Trp Pro Lys Asn Met Arg Ala Lys Ala Ile His Ser Cys Val His Phe
245 250 255
Val Thr Glu Arg Leu Asn Gly Glu Asp Gly Leu Gly Ala Ile Tyr Pro
260 265 270
Ala Ile Ala Asn Ser Val Met Met Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Pro Glu
275 280 285
Asn His Pro Glu Arg Ala Ile Ala Arg Arg Ala Val Glu Lys Leu Met
290 295 300
Val Leu Asp Gly Thr Glu Asp Gln Gly Asp Lys Glu Val Tyr Cys Gln
305 310 315 320
Pro Cys Leu Ser Pro Ile Trp Asp Thr Ala Leu Val Ala His Ala Met
325 330 335
Leu Glu Val Gly Gly Asp Glu Ala Glu Lys Ser Ala Ile Ser Ala Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Lys Pro Gln Gln Ile Leu Asp Val Lys Gly Asp Trp Ala
355 360 365
Trp Arg Arg Pro Asp Leu Arg Pro Gly Gly Trp Ala Phe Gln Tyr Arg
370 375 380
Asn Asp Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Thr Met Ala
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Met Asp Arg Ala Ala Lys Leu Ser Asp Leu His Asp Asp Phe Glu Glu
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Ser Lys Ala Arg Ala Met Glu Trp Thr Ile Gly Met Gln Ser Asp Asn
420 425 430
Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Ala Asn Asn Ser Tyr Thr Tyr Leu Asn
435 440 445
Asn Ile Pro Phe Ala Asp His Gly Ala Leu Leu Asp Pro Pro Thr Val
450 455 460
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465 470 475 480
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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Ala Arg Tyr Arg Asn Leu Lys Lys Ala Asn Gln Pro Ile Val His Tyr
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Gly Met
<210> 17
<211> 684
<212> PRT
<213> 日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)野生型SHC酶
<400> 17
Met Thr Val Thr Ser Ser Ala Ser Ala Arg Ala Thr Arg Asp Pro Gly
1 5 10 15
Asn Tyr Gln Thr Ala Leu Gln Ser Thr Val Arg Ala Ala Ala Asp Trp
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Leu Ile Ala Asn Gln Lys Pro Asp Gly His Trp Val Gly Arg Ala Glu
35 40 45
Ser Asn Ala Cys Met Glu Ala Gln Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Met
50 55 60
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100 105 110
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Ser Ala Arg Arg Pro Ser Arg Pro Leu Pro Pro Glu Asn Arg Leu Asp
195 200 205
Ala Leu Phe Pro His Gly Arg Lys Ala Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Val
210 215 220
Lys Ala Gly Ala Gly Gly Trp Asp Arg Phe Phe Arg Gly Ala Asp Lys
225 230 235 240
Val Leu His Lys Leu Gln Asn Leu Gly Asn Arg Leu Asn Leu Gly Leu
245 250 255
Phe Arg Pro Ala Ala Thr Ser Arg Val Leu Glu Trp Met Ile Arg His
260 265 270
Gln Asp Phe Asp Gly Ala Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Ile Tyr
275 280 285
Gly Leu Met Ala Leu Tyr Ala Glu Gly Tyr Pro Leu Asn His Pro Val
290 295 300
Leu Ala Lys Gly Leu Asp Ala Leu Asn Asp Pro Gly Trp Arg Val Asp
305 310 315 320
Val Gly Asp Ala Thr Tyr Ile Gln Ala Thr Asn Ser Pro Val Trp Asp
325 330 335
Thr Ile Leu Thr Leu Leu Ala Phe Asp Asp Ala Gly Val Leu Gly Asp
340 345 350
Tyr Pro Glu Ala Val Asp Lys Ala Val Asp Trp Val Leu Gln Arg Gln
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Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn Asn Tyr Tyr Pro Asp Thr Asp
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Asp Thr Ala Val Ala Leu Ile Ala Leu Ala Pro Leu Arg His Asp Pro
405 410 415
Lys Trp Lys Ala Lys Gly Ile Asp Glu Ala Ile Gln Leu Gly Val Asp
420 425 430
Trp Leu Ile Gly Met Gln Ser Gln Gly Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp
435 440 445
Lys Asp Asn Asn Gln Lys Ile Leu Thr Lys Ile Pro Phe Cys Asp Tyr
450 455 460
Gly Glu Ala Leu Asp Pro Pro Ser Val Asp Val Thr Ala His Ile Ile
465 470 475 480
Glu Ala Phe Gly Lys Leu Gly Ile Ser Arg Asn His Pro Ser Met Val
485 490 495
Gln Ala Leu Asp Tyr Ile Arg Arg Glu Gln Glu Pro Ser Gly Pro Trp
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Pro Ala Leu Ala Ala Ile Gly Glu Asp Met Thr Gln Pro Tyr Ile Gly
530 535 540
Arg Ala Cys Asp Trp Leu Val Ala His Gln Gln Ala Asp Gly Gly Trp
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Gly Glu Ser Cys Ala Ser Tyr Met Asp Val Ser Ala Val Gly Arg Gly
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Thr Thr Thr Ala Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Met Ala Leu Leu Ala
580 585 590
Ala Asn Arg Pro Gln Asp Lys Asp Ala Ile Glu Arg Gly Cys Met Trp
595 600 605
Leu Val Glu Arg Gln Ser Ala Gly Thr Trp Asp Glu Pro Glu Phe Thr
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645 650 655
Ala Phe Met Leu Arg Tyr Gly Met Tyr Arg His Tyr Phe Pro Leu Met
660 665 670
Ala Leu Gly Arg Ala Leu Arg Pro Gln Ser His Ser
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<210> 18
<211> 642
<212> PRT
<213> 细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)野生型SHC酶
<400> 18
Met Pro Thr Ser Leu Ala Thr Ala Ile Asp Pro Lys Gln Leu Gln Gln
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Gly Tyr Trp Trp Ala Glu Leu Glu Ser Asn Val Thr Met Thr Ala Glu
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65 70 75 80
Trp Glu Leu Phe Tyr Gly Asp Gly Gly Asp Leu Ser Thr Ser Val Glu
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Ala Tyr Met Gly Leu Arg Leu Leu Gly Val Pro Glu Thr Asp Pro Ala
100 105 110
Leu Val Lys Ala Arg Gln Phe Ile Leu Ala Arg Gly Gly Ile Ser Lys
115 120 125
Thr Arg Ile Phe Thr Lys Leu His Leu Ala Leu Ile Gly Cys Tyr Asp
130 135 140
Trp Arg Gly Ile Pro Ser Leu Pro Pro Trp Ile Met Leu Leu Pro Glu
145 150 155 160
Gly Ser Pro Phe Thr Ile Tyr Glu Met Ser Ser Trp Ala Arg Ser Ser
165 170 175
Thr Val Pro Leu Leu Ile Val Met Asp Arg Lys Pro Val Tyr Gly Met
180 185 190
Asp Pro Pro Ile Thr Leu Asp Glu Leu Tyr Ser Glu Gly Arg Ala Asn
195 200 205
Val Val Trp Glu Leu Pro Arg Gln Gly Asp Trp Arg Asp Val Phe Ile
210 215 220
Gly Leu Asp Arg Val Phe Lys Leu Phe Glu Thr Leu Asn Ile His Pro
225 230 235 240
Leu Arg Glu Gln Gly Leu Lys Ala Ala Glu Glu Trp Val Leu Glu Arg
245 250 255
Gln Glu Ala Ser Gly Asp Trp Gly Gly Ile Ile Pro Ala Met Leu Asn
260 265 270
Ser Leu Leu Ala Leu Arg Ala Leu Asp Tyr Ala Val Asp Asp Pro Ile
275 280 285
Val Gln Arg Gly Met Ala Ala Val Asp Arg Phe Ala Ile Glu Thr Glu
290 295 300
Thr Glu Tyr Arg Val Gln Pro Cys Val Ser Pro Val Trp Asp Thr Ala
305 310 315 320
Leu Val Met Arg Ala Met Val Asp Ser Gly Val Ala Pro Asp His Pro
325 330 335
Ala Leu Val Lys Ala Gly Glu Trp Leu Leu Ser Lys Gln Ile Leu Asp
340 345 350
Tyr Gly Asp Trp His Ile Lys Asn Lys Lys Gly Arg Pro Gly Gly Trp
355 360 365
Ala Phe Glu Phe Glu Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala
370 375 380
Val Val Val Met Ala Leu His Ala Val Thr Leu Pro Asn Glu Asn Leu
385 390 395 400
Lys Arg Arg Ala Ile Glu Arg Ala Val Ala Trp Ile Ala Ser Met Gln
405 410 415
Cys Arg Pro Gly Gly Trp Ala Ala Phe Asp Val Asp Asn Asp Gln Asp
420 425 430
Trp Leu Asn Gly Ile Pro Tyr Gly Asp Leu Lys Ala Met Ile Asp Pro
435 440 445
Asn Thr Ala Asp Val Thr Ala Arg Val Leu Glu Met Val Gly Arg Cys
450 455 460
Gln Leu Ala Phe Asp Arg Val Ala Leu Asp Arg Ala Leu Ala Tyr Leu
465 470 475 480
Arg Asn Glu Gln Glu Pro Glu Gly Cys Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val
485 490 495
Asn Tyr Leu Tyr Gly Thr Ser Gly Val Leu Thr Ala Leu Ser Leu Val
500 505 510
Ala Pro Arg Tyr Asp Arg Trp Arg Ile Arg Arg Ala Ala Glu Trp Leu
515 520 525
Met Gln Cys Gln Asn Ala Asp Gly Gly Trp Gly Glu Thr Cys Trp Ser
530 535 540
Tyr His Asp Pro Ser Leu Lys Gly Lys Gly Asp Ser Thr Ala Ser Gln
545 550 555 560
Thr Ala Trp Ala Ile Ile Gly Leu Leu Ala Ala Gly Asp Ala Thr Gly
565 570 575
Asp Tyr Ala Thr Glu Ala Ile Glu Arg Gly Ile Ala Tyr Leu Leu Glu
580 585 590
Thr Gln Arg Pro Asp Gly Thr Trp His Glu Asp Tyr Phe Thr Gly Thr
595 600 605
Gly Phe Pro Cys His Phe Tyr Leu Lys Tyr His Tyr Tyr Gln Gln His
610 615 620
Phe Pro Leu Thr Ala Leu Gly Arg Tyr Ala Arg Trp Arg Asn Leu Leu
625 630 635 640
Ala Thr
<210> 19
<211> 720
<212> PRT
<213> 巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)野生型SHC酶
<400> 19
Met Asn Met Ala Ser Arg Phe Ser Leu Lys Lys Ile Leu Arg Ser Gly
1 5 10 15
Ser Asp Thr Gln Gly Thr Asn Val Asn Thr Leu Ile Gln Ser Gly Thr
20 25 30
Ser Asp Ile Val Arg Gln Lys Pro Ala Pro Gln Glu Pro Ala Asp Leu
35 40 45
Ser Ala Leu Lys Ala Met Gly Asn Ser Leu Thr His Thr Leu Ser Ser
50 55 60
Ala Cys Glu Trp Leu Met Lys Gln Gln Lys Pro Asp Gly His Trp Val
65 70 75 80
Gly Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Met Glu Ala Glu Trp Cys Leu Ala
85 90 95
Leu Trp Phe Leu Gly Leu Glu Asp His Pro Leu Arg Pro Arg Leu Gly
100 105 110
Lys Ala Leu Leu Glu Met Gln Arg Pro Asp Gly Ser Trp Gly Thr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Ala Gly Ser Gly Asp Ile Asn Ala Thr Val Glu Ser Tyr Ala
130 135 140
Ala Leu Arg Ser Leu Gly Tyr Ala Glu Asp Asp Pro Ala Val Ser Lys
145 150 155 160
Ala Ala Ala Trp Ile Ile Ser Lys Gly Gly Leu Lys Asn Val Arg Val
165 170 175
Phe Thr Arg Tyr Trp Leu Ala Leu Ile Gly Glu Trp Pro Trp Glu Lys
180 185 190
Thr Pro Asn Leu Pro Pro Glu Ile Ile Trp Phe Pro Asp Asn Phe Val
195 200 205
Phe Ser Ile Tyr Asn Phe Ala Gln Trp Ala Arg Ala Thr Met Met Pro
210 215 220
Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Arg Pro Ser Arg Pro Leu Arg Pro Gln
225 230 235 240
Asp Arg Leu Asp Ala Leu Phe Pro Gly Gly Arg Ala Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Glu Leu Pro Thr Lys Glu Gly Arg Asp Val Ile Ala Asp Phe Phe Arg
260 265 270
Leu Ala Asp Lys Gly Leu His Trp Leu Gln Ser Ser Phe Leu Lys Arg
275 280 285
Ala Pro Ser Arg Glu Ala Ala Ile Lys Tyr Val Leu Glu Trp Ile Ile
290 295 300
Trp His Gln Asp Ala Asp Gly Gly Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp
305 310 315 320
Val Tyr Gly Leu Met Ala Leu His Gly Glu Gly Tyr Gln Phe His His
325 330 335
Pro Val Met Ala Lys Ala Leu Asp Ala Leu Asn Asp Pro Gly Trp Arg
340 345 350
His Asp Lys Gly Asp Ala Ser Trp Ile Gln Ala Thr Asn Ser Pro Val
355 360 365
Trp Asp Thr Met Leu Ser Leu Met Ala Leu His Asp Ala Asn Ala Glu
370 375 380
Glu Arg Phe Thr Pro Glu Met Asp Lys Ala Leu Asp Trp Leu Leu Ser
385 390 395 400
Arg Gln Val Arg Val Lys Gly Asp Trp Ser Val Lys Leu Pro Asn Thr
405 410 415
Glu Pro Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn Asp Arg Tyr Pro Asp
420 425 430
Thr Asp Asp Thr Ala Val Ala Leu Ile Ala Ile Ala Ser Cys Arg Asn
435 440 445
Arg Pro Glu Trp Gln Ala Lys Gly Val Glu Glu Ala Ile Gly Arg Gly
450 455 460
Val Arg Trp Leu Val Ala Met Gln Ser Ser Cys Gly Gly Trp Gly Ala
465 470 475 480
Phe Asp Lys Asp Asn Asn Lys Ser Ile Leu Ala Lys Ile Pro Phe Cys
485 490 495
Asp Phe Gly Glu Ala Leu Asp Pro Pro Ser Val Asp Val Thr Ala His
500 505 510
Val Leu Glu Ala Phe Gly Leu Leu Gly Leu Pro Arg Asp Leu Pro Cys
515 520 525
Ile Gln Arg Gly Leu Ala Tyr Ile Arg Lys Glu Gln Asp Pro Thr Gly
530 535 540
Pro Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly Thr Gly Ala
545 550 555 560
Val Leu Pro Ala Leu Ala Ala Leu Gly Glu Asp Met Thr Gln Pro Tyr
565 570 575
Ile Ser Lys Ala Cys Asp Trp Leu Ile Asn Cys Gln Gln Glu Asn Gly
580 585 590
Gly Trp Gly Glu Ser Cys Ala Ser Tyr Met Glu Val Ser Ser Ile Gly
595 600 605
His Gly Ala Thr Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Met Gly Leu
610 615 620
Ile Ala Ala Asn Arg Pro Gln Asp Tyr Glu Ala Ile Ala Lys Gly Cys
625 630 635 640
Arg Tyr Leu Ile Asp Leu Gln Glu Glu Asp Gly Ser Trp Asn Glu Glu
645 650 655
Glu Phe Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Tyr Gly Val Gly Gln Thr Ile
660 665 670
Lys Leu Asp Asp Pro Ala Ile Ser Lys Arg Leu Met Gln Gly Ala Glu
675 680 685
Leu Ser Arg Ala Phe Met Leu Arg Tyr Asp Leu Tyr Arg Gln Leu Phe
690 695 700
Pro Ile Ile Ala Leu Ser Arg Ala Ser Arg Leu Ile Lys Leu Gly Asn
705 710 715 720
<210> 20
<211> 685
<212> PRT
<213> 致病葡糖杆菌(Gluconobacter morbifer)野生型SHC酶
<400> 20
Met Ser Pro Ala Asp Ile Ser Thr Lys Ser Ser Ser Phe Gln Arg Leu
1 5 10 15
Asp Asn Met Leu Pro Glu Ala Val Ser Ser Ala Cys Asp Trp Leu Ile
20 25 30
Asp Gln Gln Lys Pro Asp Gly His Trp Val Gly Pro Val Glu Ser Asn
35 40 45
Ala Cys Met Glu Ala Gln Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Leu Gly Gln
50 55 60
Glu Asp His Pro Leu Arg Pro Arg Leu Ala Gln Ala Leu Leu Glu Met
65 70 75 80
Gln Arg Glu Asp Gly Ser Trp Gly Ile Tyr Val Gly Ala Asp His Gly
85 90 95
Asp Ile Asn Thr Thr Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Met Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Met Pro Ile Met Ala Lys Ser Ala Ala Trp Ile Gln
115 120 125
Gln Lys Gly Gly Leu Arg Asn Val Arg Val Phe Thr Arg Tyr Trp Leu
130 135 140
Ala Leu Ile Gly Glu Trp Pro Trp Asp Lys Thr Pro Asn Leu Pro Pro
145 150 155 160
Glu Ile Ile Trp Leu Pro Asp Asn Phe Ile Phe Ser Ile Tyr Asn Phe
165 170 175
Ala Gln Trp Ala Arg Ala Thr Met Met Pro Leu Thr Ile Leu Ser Ala
180 185 190
Arg Arg Pro Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Asn Arg Leu Asp Gly Leu
195 200 205
Phe Pro Glu Gly Arg Glu Asn Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Val Lys Gly
210 215 220
Glu Glu Asp Leu Trp Gly Arg Phe Phe Arg Ala Ala Asp Lys Gly Leu
225 230 235 240
His Ser Leu Gln Ser Phe Pro Val Arg Arg Phe Val Pro Arg Glu Ala
245 250 255
Ala Ile Arg His Val Ile Glu Trp Ile Ile Arg His Gln Asp Ala Asp
260 265 270
Gly Gly Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Ile Tyr Gly Leu Met Ala
275 280 285
Leu Ser Val Glu Gly Tyr Pro Leu His His Pro Val Leu Ala Lys Ala
290 295 300
Met Asp Ala Leu Asn Asp Pro Gly Trp Arg Arg Asp Lys Gly Asp Ala
305 310 315 320
Ser Trp Ile Gln Ala Thr Asn Ser Pro Val Trp Asp Thr Met Leu Ala
325 330 335
Val Leu Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Glu Asp Arg Tyr Ser Pro Gln
340 345 350
Met Asp Lys Ala Ile Gly Trp Leu Leu Asp Arg Gln Val Arg Val Lys
355 360 365
Gly Asp Trp Ser Ile Lys Leu Pro Asp Thr Glu Pro Gly Gly Trp Ala
370 375 380
Phe Glu Tyr Ala Asn Asp Lys Tyr Pro Asp Thr Asp Asp Thr Ala Val
385 390 395 400
Ala Leu Ile Ala Leu Ala Gly Cys Arg His Arg Pro Glu Trp Arg Glu
405 410 415
Arg Asp Ile Glu Gly Ala Ile Ser Arg Gly Val Asn Trp Leu Leu Ala
420 425 430
Met Gln Ser Ser Ser Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn
435 440 445
Arg Ser Ile Leu Thr Lys Ile Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Ala Leu
450 455 460
Asp Pro Pro Ser Val Asp Val Thr Ala His Val Leu Glu Ala Phe Gly
465 470 475 480
Leu Leu Gly Ile Ser Arg Asn His Pro Ser Val Gln Lys Ala Leu Ala
485 490 495
Tyr Ile Arg Ser Glu Gln Glu Arg Asn Gly Ala Trp Phe Gly Arg Trp
500 505 510
Gly Val Asn Tyr Val Tyr Gly Thr Gly Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala
515 520 525
Ala Ile Gly Glu Asp Met Thr Gln Pro Tyr Ile Val Arg Ala Cys Asp
530 535 540
Trp Leu Met Ser Val Gln Gln Glu Asn Gly Gly Trp Gly Glu Ser Cys
545 550 555 560
Ala Ser Tyr Met Asp Ile Asn Ala Val Gly His Gly Val Ala Thr Ala
565 570 575
Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ala Lys Arg Pro
580 585 590
Lys Asp Arg Glu Ala Ile Ala Arg Gly Cys Gln Phe Leu Ile Glu Arg
595 600 605
Gln Glu Asp Gly Ser Trp Thr Glu Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Gly Phe
610 615 620
Pro Gly Tyr Gly Val Gly Gln Ala Ile Lys Leu Asp Asp Pro Ser Leu
625 630 635 640
Pro Asp Arg Leu Leu Gln Gly Ala Glu Leu Ser Arg Ala Phe Met Leu
645 650 655
Arg Tyr Asp Leu Tyr Arg Gln Tyr Phe Pro Val Met Ala Leu Ser Arg
660 665 670
Ala Arg Arg Met Met Lys Glu Asp Ala Ser Ala Ala Ala
675 680 685
<210> 21
<211> 625
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)野生型SHC酶
<400> 21
Met Ile Ile Leu Leu Lys Glu Val Gln Leu Glu Ile Gln Arg Arg Ile
1 5 10 15
Ala Tyr Leu Arg Pro Thr Gln Lys Asn Asp Gly Ser Phe Arg Tyr Cys
20 25 30
Phe Glu Thr Gly Val Met Pro Asp Ala Phe Leu Ile Met Leu Leu Arg
35 40 45
Thr Phe Asp Leu Asp Lys Glu Val Leu Ile Lys Gln Leu Thr Glu Arg
50 55 60
Ile Val Ser Leu Gln Asn Glu Asp Gly Leu Trp Thr Leu Phe Asp Asp
65 70 75 80
Glu Glu His Asn Leu Ser Ala Thr Ile Gln Ala Tyr Thr Ala Leu Leu
85 90 95
Tyr Ser Gly Tyr Tyr Gln Lys Asn Asp Arg Ile Leu Arg Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Tyr Ile Ile Asp Ser Gly Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Leu Thr
115 120 125
Arg Trp Met Leu Ser Val Asn Gly Leu Tyr Glu Trp Pro Lys Leu Phe
130 135 140
Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Leu Leu Val Pro Thr Tyr Val Pro Leu Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Glu Leu Ser Thr Tyr Ala Arg Ile His Phe Val Pro Met Met
165 170 175
Val Ala Gly Asn Lys Lys Phe Ser Leu Thr Ser Arg His Thr Pro Ser
180 185 190
Leu Ser His Leu Asp Val Arg Glu Gln Lys Gln Glu Ser Glu Glu Thr
195 200 205
Thr Gln Glu Ser Arg Ala Ser Ile Phe Leu Val Asp His Leu Lys Gln
210 215 220
Leu Ala Ser Leu Pro Ser Tyr Ile His Lys Leu Gly Tyr Gln Ala Ala
225 230 235 240
Glu Arg Tyr Met Leu Glu Arg Ile Glu Lys Asp Gly Thr Leu Tyr Ser
245 250 255
Tyr Ala Thr Ser Thr Phe Phe Met Ile Tyr Gly Leu Leu Ala Leu Gly
260 265 270
Tyr Lys Lys Asp Ser Phe Val Ile Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Cys
275 280 285
Ser Leu Leu Ser Thr Cys Ser Gly His Val His Val Glu Asn Ser Thr
290 295 300
Ser Thr Val Trp Asp Thr Ala Leu Leu Ser Tyr Ala Leu Gln Glu Ala
305 310 315 320
Gly Val Pro Gln Gln Asp Pro Met Ile Lys Gly Thr Thr Arg Tyr Leu
325 330 335
Lys Lys Arg Gln His Thr Lys Leu Gly Asp Trp Gln Phe His Asn Pro
340 345 350
Asn Thr Ala Pro Gly Gly Trp Gly Phe Ser Asp Ile Asn Thr Asn Asn
355 360 365
Pro Asp Leu Asp Asp Thr Ser Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ser Arg Arg
370 375 380
Ala Gln Thr Asp Thr Asp Tyr Leu Glu Ser Trp Gln Arg Gly Ile Asn
385 390 395 400
Trp Leu Leu Ser Met Gln Asn Lys Asp Gly Gly Phe Ala Ala Phe Glu
405 410 415
Lys Asn Thr Asp Ser Ile Leu Phe Thr Tyr Leu Pro Leu Glu Asn Ala
420 425 430
Lys Asp Ala Ala Thr Asp Pro Ala Thr Ala Asp Leu Thr Gly Arg Val
435 440 445
Leu Glu Cys Leu Gly Asn Phe Ala Gly Met Asn Lys Ser His Pro Ser
450 455 460
Ile Lys Ala Ala Val Lys Trp Leu Phe Asp His Gln Leu Asp Asn Gly
465 470 475 480
Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Gly Val Cys Tyr Ile Tyr Gly Thr Trp Ala
485 490 495
Ala Ile Thr Gly Leu Arg Ala Val Gly Val Ser Ala Ser Asp Pro Arg
500 505 510
Ile Ile Lys Ala Ile Asn Trp Leu Lys Ser Ile Gln Gln Glu Asp Gly
515 520 525
Gly Phe Gly Glu Ser Cys Tyr Ser Ala Ser Leu Lys Lys Tyr Val Pro
530 535 540
Leu Ser Phe Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Asp Ala Leu
545 550 555 560
Met Thr Ile Cys Pro Leu Lys Asp Gln Ser Val Glu Lys Gly Ile Lys
565 570 575
Phe Leu Leu Asn Pro Asn Leu Thr Glu Gln Gln Thr His Tyr Pro Thr
580 585 590
Gly Ile Gly Leu Pro Gly Gln Phe Tyr Ile Gln Tyr His Ser Tyr Asn
595 600 605
Asp Ile Phe Pro Leu Leu Ala Leu Ala His Tyr Ala Lys Lys His Ser
610 615 620
Ser
625
<210> 22
<211> 631
<212> PRT
<213> SHC酶变体#49
<400> 22
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Thr Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630

Claims (11)

1.制备式(I)的化合物的方法，
Figure FDA0003968589720000011
其中该方法包括使式(II)的化合物与角鲨烯-何帕烯环化酶(SHC)或酶变体接触，
Figure FDA0003968589720000012
其中R为H、甲基或乙基。
2.权利要求1的方法，其中该方法包括使其中C-8与C-9之间的双键为E-构型且C-4与C-5之间的双键为Z-构型的式(II)的化合物与SHC酶或酶变体接触。
3.任一前述权利要求的方法，其中式(III)的化合物作为副产物制备，
Figure FDA0003968589720000013
其中R为H、甲基或乙基。
4.权利要求3的方法，其中具有式(IIIa)中所示的相对构型的化合物作为副产物制备，
Figure FDA0003968589720000021
其中R为H、甲基或乙基。
5.任一前述权利要求的方法，其中R为甲基。
6.任一前述权利要求的方法，其中该方法还包括纯化式(I)的化合物。
7.组合物，其包含式(I)的化合物和式(III)的化合物：
Figure FDA0003968589720000022
其中R为H、甲基或乙基。
8.权利要求7的组合物，其中R为甲基。
9.通过或可通过权利要求1至6中任一项的方法得到的组合物，例如其中该组合物为根据权利要求7至8中任一项的组合物。
10.权利要求7至8中任一项的组合物作为香料组合物的用途或在香料组合物中的用途。
11.消费品，其包含权利要求7至8中任一项的组合物。
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