BR112019015747A2 - Vetor recombinante, célula hospedeira recombinante, esqualeno hopeno ciclase recombinante, e, método para produção de ambroxano - Google Patents

Abstract

uma esqualeno hopeno ciclase (shc) isolada a partir de gluconobacter morbifer é proporcionada, assim como variantes e um método para uso da shc de g. morbifer para converter biocataliticamente homofarnesol em ambroxano.

Description

VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, ESQUALENO HOPENO CICLASE RECOMBINANTE, E, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE AMBROXANO

Antecedentes [0001] Os compostos com o esqueleto de dodeca-hidronafto[2,l-b] furano têm grande importância econômica como químicos de aroma. Entre estes, (3aR,5aS,9aS,9bR)-dodeca-hidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,l-b] furano, conhecido como ambroxano, tem particular importância para proporcionar notas de base de composições de perfume. Originalmente obtido a partir do âmbar-cinza do cachalote, foram desenvolvidos métodos sintéticos para a produção de ambroxano. Em uma abordagem, o esclareol, um constituinte da sálvia esclareia (Salvia sclarea), é usado como um material de partida. A degradação oxidativa de esclareol com, p.ex., ácido crômico, permanganate, H2O2 ou ozônio proporciona esclareolídeo, que é subsequentemente reduzido, p.ex., usando L1AIH4OU NaBH4para dar ambrox-

1,4-diol. Altemativamente, o esclareolídeo pode ser preparado a partir de esclareol por meio de uma biotransformação usando Hyphozyma roseoniger (EP 0204009). Finalmente, o ambrox-l,4-diol é ciclizado em uma série de processos químicos para dar o composto ambroxano ((-)-2). A preparação do racemato de ambroxano, rac-2, tem sido alcançada, inter alia, através de ácido homofamesílico e 4-(2,6,6-trimetilciclo-hex-l-enil)butan-2-ona.

[0002] Em outra abordagem, o ambroxano é biocataliticamente preparado usando esqualeno hopeno ciclase (SHC; Esquema 1) (Neumann, et al. (1986) Biol. Chem. Hoppe Seyler 367: 723).

Homofsrnesol Ainfaxoxano

ESQUEMA 1

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2/54 [0003] Embora a SHC catalise naturalmente a ciclização de esqualeno em hopano, a catálise de ambroxano é uma reação secundária com uma atividade específica de 0,02 mU/mg de proteína. SHC de Alicyclobacillus acidocaldarius (antigamente Bacillus acidocaldarius), Zymomonas mobilis e Bradyrhizobium japonicum foram purificadas e caracterizadas em termos dos seus substratos naturais (p.ex., esqualeno) e não naturais (p.ex., homofarnesol e citral). Ver, por exemplo, WO 2010/139719, WO 2012/066059, JP 2009060799 e Seitz, et al. (2012) J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 84: 72-77). Adicionalmente, WO 2016/170099 descreve mutantes de SHC com taxas melhoradas de conversão de Ε,Ε-homofarnesol em ambroxano foram descritos.

Sumário da Invenção [0004] Esta invenção proporciona um vetor recombinante abrigando uma molécula de ácido nucleico codificando Esqualeno Hopeno Ciclase (GHC), a sequência de aminoácidos da qual é SEQ ID NO:2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, a SHC tem uma substituição de aminoácido, em relação à SEQ ID NO:2, na posição 45, 46, 54, 86, 139, 142, 178, 184, 194, 239, 278, 326, 335, 386, 455, 460, 603, 623, 624, 656, 658 ou uma sua combinação. Uma célula hospedeira recombinante abrigando o vetor recombinante é também proporcionada como o é um método para produção de ambroxano proporcionando homofarnesol a uma célula hospedeira recombinante que expressa SHC, a sequência de aminoácidos da qual é SEQ ID NO:2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2 e coletar o ambroxano produzido pela SHC. De acordo com algumas modalidades do método, o homofarnesol é proporcionado na presença de um agente solubilizante, p.ex., um tensoativo não iônico. De acordo com outras modalidades do método, o homofarnesol inclui (3E,7E) homofarnesol. Esta invenção proporciona

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3/54 adicionalmente um polipeptídeo de SHC recombinante tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2 e incluindo uma substituição de aminoácido, em relação à SEQ ID NO:2, na posição 45, 46, 54, 86, 139, 142, 178, 184, 194, 239, 278, 326, 335, 386, 455, 460, 603, 623, 624, 656, 658 ou uma sua combinação.

Breve Descrição dos Desenhos [0005] As FIG. IA a FIG. 1C proporcionam uma comparação de sequências de aminoácidos de Esqualeno Hopeno Ciclase de Gluconobacter morbifer (GmSHC) com enzimas SHC de Z. mobilis (ZmSHC), Bradyrhizobium sp. (BspSHC), Rhodopseudomonas palustris (RpSHC), Streptomyces coelicolor (ScSHC), Burkholderia ambifaria (BamSHC), Bacillus anthracis (BanSHC) e A. acidocaldarius (AaSHC). Os resíduos sublinhados representam a sequência nuclear Gln-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Trp (SEQ ID NO:3) e os resíduos a negrito representam o motivo do local ativo Asp-Xaa-Asp-Asp-Thr-Ala (SEQ ID NO:4).

[0006] A FIG. 2 mostra a % de área de pico de ambroxano produzido por enzimas GmSHC mutantes após incubação a 37°C durante 6 e 20 horas com 15 mg/mE de homofamesol. A linha tracejada mostra a produção de ambroxano por SHC de tipo selvagem.

[0007] A FIG. 3 mostra a % de área de pico do produto ambroxano produzido por enzimas GmSHC mutantes após incubação a 37°C durante 6 e 20 horas com 50 mg/mE de homofarnesol a 25% de carga de enzima.

Descrição Detalhada da Invenção [0008] Esta invenção proporciona uma Esqualeno Hopeno Ciclase (SHC) ou, mais preferencialmente, uma homofarnesol-ambroxano ciclase (HAC), isolada a partir de Gluconobacter morbifer e método para uso da SHC de G. morbifer (GmSHC) para converter biocataliticamente homofarnesol em ambroxano. A sequência de nucleotídeos de GmSHC é proporcionada em SEQ ID NO:1. A sequência de aminoácidos de GmSHC (SEQ ID NO:2) está

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4/54 disponível sob os Nos. de Acesso do GENBANK WP_040507485 e EHH69691. Um alinhamento da sequência de aminoácidos de GmSHC com sequências de aminoácidos de SHC de Z. mobilis, Bradyrhizobium sp., R. palustris, S. coelicolor, B. ambifaria, B. anthracis e A. acidocaldarius (FIG. IA a FIG. 1C) indica identidades de sequências de aminoácidos variando entre 37% e 76% (Tabela 1).

TABELA 1

Organismo fonte	No. de Acesso	Identidade com GmSHC
Z. mobilis	Q5NM88	76%
Bradyrhizobium sp.	A5EBP6	72%
B. ambifaria	Q0B5S3	37%
B. anthracis	A0A0E0W268	48%
R. palustris	WP 011665849	66%
S. coelicolor	Q9X7V9	45%
A. acidocaldarius	P33247	44%

[0009] GmSHC contém a sequência nuclear Gln-Xaa-Xaa-Xaa-GlyXaa-Trp (SEQ ID NO:3)(Reipen, et al. (1995) Microbiology 141: 155-161), bem como o motivo Asp-Xaa-Asp-Asp-Thr-Ala (SEQ ID NO:4), que se correlaciona com o local ativo de SHC (Wendt, et al. (1997) Science ΤΊΤ. 1811-5). Ver FIG. IA a FIG. 1C. Os dados apresentados aqui demonstram que a enzima GmSHC, quando expressa em uma célula hospedeira heteróloga, p.ex., E. coli, pode prontamente converter homofamesol em ambroxano. Portanto, a enzima GmSHC, bem como seus derivados, têm uso em um método para preparação de ambroxano usando homofarnesol como uma matéria-prima ou material de partida.

[0010] Como usado aqui, o termo “ambroxano” se refere a (3aR,5aS,9aS,9bR)-dodeca-hidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,l-b]furano, que é conhecido comercialmente como AMBROX (Firmenich), Ambroxano (Henkel) AMBROFIX (Givaudan), AMBERLYN (Quest), CETALOX Laevo (Firmenich), AMBERMOR (Aromor) e/ou Éter de Norambrenolídeo (Pacific). Os benefícios sensoriais desejáveis do ambroxano vêm do estereoisômero (-) ao invés do enantiômero (+). O odor do estereoisômero (-) é descrito como almiscarado, amadeirado, quente ou ambarado ao passo que o

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5/54 enantiômero (+) tem uma nota de odor relativamente fraca. Assim, materiais enriquecidos com (-)-ambroxano são uma característica desta invenção.

[0011] Como descrito aqui, o (-)-ambroxano pode ser sintetizado a partir de homofamesol (Esquema 1). Existem quatro isômeros conhecidos de homofamesol, os isômeros (3Z,7Z, i.e., ZZ), (3E,7Z, i.e., EZ), (3Z,7E, i.e., ZE) e (3E,7E, i.e., EE). De acordo com Neumann, et al. ((1986) Biol. Chem. Hoppe Seyler 367: 723), o (-)-ambroxano é principalmente obtido a partir de EE homofamesol. US 2012/0135477 indica que a enzima SHC de Z. mobilis pode converter o ZE homofamesol em (-)-ambroxano. No entanto, Schaefer ((2011) Chemie Unserer Zeit 45: 374-388) indica que o ZE homofamesol é somente convertido em 9b-epi-ambroxano e não em (-)-ambroxano. Conformemente, a matéria-prima/material de partida homofamesol desta invenção é um isômero único ou é uma mistura de dois ou mais isômeros de homofamesol. Em algumas modalidades, o material de partida homofamesol é uma mistura dos quatro isômeros EE:EZ:ZZ:ZE. Em outras modalidades, o material de partida homofamesol é uma mistura de ZE:EE, ZE:EZ ou EE:EZ. Em modalidades incluindo o uso de uma mistura de EE:EZ, preferencialmente a razão de pesos de EE:EZ está na gama de 99:1 a cerca de 50:50. Mais particularmente, o material de partida de homofamesol tem uma razão de pesos de EE:EZ de 80:20 ou 70:30. Em modalidades particulares, o material de partida homofamesol tem >90 (3E,7E) homofamesol. Uma mistura estereoisomérica EE:EZ exemplificativa de homofamesol tem o número CAS de 35826-67-6.

[0012] Preferencialmente, o material de partida usado na preparação de (-)-ambroxano é (3E,7E) homofamesol (EEH) estereoisomericamente puro. Métodos para preparação de EEH são conhecidos na técnica e descritos, p.ex., por Dodd, et al. (1992) J. Org. Chem. 57: 2794; Barrero, et al. (1996) J. Org. Chem. 61: 2215; Kocienski et al. (1989) J. Org. Chem. 54: 1215; WO 92/06063 e US 9,493,385.

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6/54 [0013] Como usado aqui, “GmSHC” se refere à Esqualeno Hopeno Ciclase isolada a partir de Gluconobacter morbifer. Em particular, quando não modificado por “mutante” ou “derivado”, “GmSHC” se refere a uma proteína de tipo selvagem tendo a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:2. Por comparação, “GmSHC mutante”, “mutante de GmSHC” ou “derivado de GmSHC” se refere a uma sequência de aminoácidos modificada ou variante que é alterada em comparação com a sequência de aminoácidos da sequência de GmSHC de referência (ou tipo selvagem) de acordo com SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, um derivado de GmSHC tem pelo menos uma alteração que modifica (p.ex., aumenta) a atividade da enzima pelo seu substrato (p.ex., homofarnesol, em particular EEH). Em outra modalidade, um derivado de GmSHC tem pelo menos uma alteração que modifica a estabilidade, localização ou expressão da enzima em uma célula hospedeira heteróloga.

[0014] Como usado aqui, o termo “alteração de aminoácido” significa uma inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos, uma deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos ou uma substituição (que pode ser conservativa ou não conservativa) de um ou mais resíduos de aminoácidos por um ou mais aminoácidos diferentes em relação à sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos de referência (tal como, por exemplo, a sequência de aminoácidos de tipo selvagem de SEQ ID NO:2). A alteração de aminoácido pode ser facilmente identificada por uma comparação das sequências de aminoácidos da sequência de aminoácidos do derivado de GmSHC com a sequência de aminoácidos da GmSHC de referência.

[0015] Substituições conservativas de aminoácidos podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade na polaridade, carga, tamanho, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos de aminoácidos envolvidos. Os 20 aminoácidos ocorrendo naturalmente podem ser agrupados nos seguintes seis grupos padrão de

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7/54 aminoácidos: (1) hidrofóbicos - Met, Ala, Vai, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutros - Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácidos - Asp, Glu; (4) básicos - His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia - Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Conformemente, como usado aqui, o termo “substituições conservativas” significa uma troca de um aminoácido por outro aminoácido listado dentro do mesmo grupo dos seis grupos padrão de aminoácidos mostrados acima. Por exemplo, a troca de Asp por Glu retém uma carga negativa no polipeptídeo assim modificado. Adicionalmente, a glicina e a prolina podem ser substituídas uma pela outra com base na sua capacidade de desagregar hélices alfa. Algumas substituições conservativas preferenciais dentro dos seis grupos acima são trocas dentro dos seguintes subgrupos: (i) Ala, Vai, Leu e Ile; (ii) Ser e Thr; (iii) Asn e Gin: (iv) Lys e Arg; e (v) Tyr e Phe. Dado o código genético conhecido, e técnicas de DNA recombinante e sintético, o cientista perito pode construir DNA codificando as variantes conservativas de aminoácidos.

[0016] Como usado aqui, “substituições não conservativas” ou “trocas não conservativas de aminoácidos” são definidas como trocas de um aminoácido por outro aminoácido listado em um grupo diferente dos seis grupos padrão de aminoácidos (1) a (6) como mostrado acima. Tipicamente, os derivados de GmSHC da presente divulgação são preparados usando substituições não conservativas que alteram a função biológica da GmSHC de tipo selvagem.

[0017] Em várias modalidades, a alteração de aminoácido ou combinação de alterações de aminoácidos intensifica a atividade do derivado de GmSHC para conversão de homofarnesol em ambroxano em comparação com GmSHC de tipo selvagem, que não tem a alteração de aminoácidos ou combinação de alterações de aminoácidos. Pode ser usada modelação de proteínas para guiar tais substituições, deleções ou inserções na sequência de referência de GmSHC. Por exemplo, um modelo estrutural da sequência de

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8/54 aminoácidos de GmSHC pode ser criada usando as coordenadas para a SHC de A. acidocaldarius. Um tal modelo de homologia é útil para dirigir melhoria da enzima SHC para conversão de homofamesol em ambroxano, tal como uma produção mais elevada de ambroxano após contato com u substrato de homofamesol do que a enzima de tipo selvagem de referência.

[0018] Alterações de aminoácidos tais como substituições de aminoácidos podem ser introduzidas usando protocolos conhecidos de tecnologia de genes recombinantes incluindo PCR, clonagem de genes, mutagênese sítio-dirigida de cDNA, transfecção de células hospedeiras e transcrição in vitro, que podem ser usadas para introduzir tais mudanças na sequência de GmSHC resultando em uma enzima derivada de GmSHC. Os derivados podem ser depois rastreados quanto à atividade funcional de GmSHC.

[0019] O derivado de GmSHC pode ter de cerca de 1 a cerca de 45 alterações de aminoácidos, cerca de 1 a cerca de 40 alterações de aminoácidos, cerca de 1 a cerca de 35 alterações de aminoácidos, cerca de 1 a cerca de 30 alterações de aminoácidos, cerca de 1 a cerca de 25 alterações de aminoácidos, de cerca de 1 a cerca de 20 alterações de aminoácidos, cerca de 1 a cerca de 15 alterações de aminoácidos, cerca de 1 a cerca de 10 alterações de aminoácidos ou de cerca de 1 a cerca de 5 alterações de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da sequência de GmSHC de referência (ou tipo selvagem) de acordo com SEQ ID NO:2.

[0020] Alternativamente, o derivado de GmSHC pode ter pelo menos 5 ou pelo menos 10 alterações de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da sequência de GmSHC de referência (ou tipo selvagem) de acordo com SEQ ID NO:2, mas não mais do que cerca de 20 ou 30 alterações de aminoácidos. Em várias modalidades, o derivado de GmSHC pode ter cerca de 1 alteração de aminoácido, cerca de 2 alterações de aminoácidos, cerca de 3 alterações de aminoácidos, cerca de 4 alterações de aminoácidos,

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9/54 cerca de 5 alterações de aminoácidos, cerca de 6 alterações de aminoácidos, cerca de 7 alterações de aminoácidos, cerca de 8 alterações de aminoácidos, cerca de 9 alterações de aminoácidos, cerca de 10 alterações de aminoácidos, cerca de 15 alterações de aminoácidos, cerca de 20 alterações de aminoácidos, cerca de 25 alterações de aminoácidos, cerca de 30 alterações de aminoácidos, cerca de 35 alterações de aminoácidos, cerca de 40 alterações de aminoácidos, cerca de 45 alterações de aminoácidos ou cerca de 50 alterações de aminoácidos em relação à GmSHC de referência.

[0021] Em estas ou outras modalidades, o derivado de GmSHC partilha pelo menos cerca de 50% identidade de sequências, pelo menos cerca de 55% identidade de sequências, pelo menos cerca de 60% identidade de sequências, pelo menos cerca de 65% identidade de sequências, pelo menos cerca de 70% identidade de sequências, pelo menos cerca de 75% identidade de sequências, pelo menos cerca de 80% identidade de sequências, pelo menos cerca de 85% identidade de sequências, pelo menos 90% identidade de sequências, pelo menos 91% identidade de sequências, pelo menos 92% identidade de sequências, pelo menos 93% identidade de sequências, pelo menos 94% identidade de sequências, pelo menos 95% identidade de sequências, pelo menos 96% de identidade de sequências, pelo menos 97% de identidade de sequências, pelo menos 98% de identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências com GmSHC de referência (SEQ ID NO:2).

[0022] Em algumas modalidades, um derivado de GmSHC inclui alterações de aminoácidos em uma ou mais das posições 45, 46, 54, 86, 139, 142, 178, 184, 194, 239, 278, 326, 335, 386, 455, 460, 603, 623, 624, 656 ou 658 em relação à SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, um derivado de GmSHC tem uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: V45X, E46X, Q54X, S86X, F139X, Y142X, Q178X, M184X, R194X, G239X, I278X, T326X, L335X, E386X, I455X, F460X, Q603X, G623X, F624X,

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L656X ou Y658X em relação à SEQ ID NO:2, em que:

X em V45X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, Wou Y;

X em E46X é A, C, D, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, Wou Y;

X em Q54X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, R, S, T, V, Wou Y;

X em S86X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, T, V, Wou Y;

X em F139X é A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y;

X em Y142X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V ou W;

X em Q178X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, R, S, T, V, W ou Y;

X em M184X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, N, P, Q, R, S, T,

V, W ou Y;

X em R194X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, S, T, V, W ou Y;

X em G239X é A, C, D, E, F, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T,

V, W ou Y;

X em I278X é A, C, D, E, F, G, Η, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y;

X em T326X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, V, W ou Y;

X em L335X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y;

X em E386X é A, C, D, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T,

V, W ou Y;

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X em I455X é A, C, D, E, F, G, Η, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y;

X em F460X é A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y;

X em Q603X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, R, S, T, V, W ou Y;

X em G623X é A, C, D, E, F, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y;

X em F624X é A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y;

X em L656X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y; e

X em Y658X é A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, ou W.

[0023] Em certas modalidades, o derivado de GmSHC tem uma ou uma combinação das seguintes substituições de aminoácidos V45I, V45Q, V45L, E46H, E46Q, Q54E, S86A, F139L, Y142R, Q178E, M184A, M184L, Ml 841, M184V, R194Q, G239V, I278V, T326S, L335F, E386Q, I455T, F460A, Q603H, G623A, G623V, F624Y, F624A, L656E e Y658F em relação à SEQ ID NO:2. Em outras modalidades, o derivado de GmSHC tem uma combinação de substituições em relação à SEQ ID NO:2 como apresentado na Tabela 2 ou qualquer sua combinação.

TABELA 2

Combinação	Mutações	No. de Mutações
A	Y142R + I455T	2
B	S86A + F139E	2
C	Q603H + F624Y	2
D	V45E + T326S	2
E	F139E + F624Y	2
F	E46Q + M184I	2
G	E46Q + M184A	2
H	E46Q + M184V	2
I	M184I + Q178E	2
J	E46Q + F624Y	2
K	Q54E + M184I	2
L	M184V + Q178E	2

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Combinação	Mutações	No. de Mutações
M	E46Q + G623A	2
N	E46Q + M184L	2
O	Q54E + R194Q	2
P	Q54E + E46Q	2
Q	F139L + Y142R + I455T	3
R	Y142R + I455T + F624Y	3
S	Y142R + I455T + G239V	3
T	E46Q + M184I + G623A	3
u	E46Q + M184I + F624Y	3
V	E46Q + M184I + R194Q	3
w	Q54E + M184I + F624Y	3
x	E46Q + M184I + F624Y + G623A	4
Y	E46Q + M184I + V45E + T326S	4
z	F139E + Y142R + I455T + F624Y	4
AA	E46Q + M184I + F624Y + R194Q	4
BB	Q54E + M184I + V45E + T326S	4
CC	Q54E + M184I + F624Y + T326S	4
DD	Q54E + E46Q + M184I + F624Y	4
EE	Q54E + R194Q + V45E + T326S	4
FF	Q54E + E46Q + M184I + V45E + T326S	5
GG	Q54E + M184I + V45E + T326S + F624Y	5
HH	E46Q + M184I + F624Y + R194Q + V45E + T326S	6
II	E46Q + M184I + F624Y + G623A + V45E + T326S	6
JJ	E46Q + M184I + F624Y + R194Q + V45E + T326S	6
KK	E46Q + M184I + F624Y + R194Q + V45E + T326S + G623A	7

[0024] Foi mostrado que substituições de aminoácidos em SHC de A. acidocaldarius (AacSHC) nas posições de aminoácidos correspondendo a F139L, Y142, 1455, G239 e F624 de GmSHC aumentam a atividade da enzima AacSHC em termos de conversão de EEH em ambroxano. Ver WO 2016/170099. Adicionalmente, F601 de AacSHC foi identificado como um resíduo de aminoácido altamente conservado entre as espécies procarióticas e eucarióticas de SHC. Foi relatado que o derivado de AacSHC F601Y mostra uma Vmáx grandemente aumentada para um substrato de oxidoesqualeno (não esqualeno); no entanto, F601Y mostra uma diminuição na afinidade (z.e., uma Km mais elevada) e uma diminuição na eficiência catalítica/atividade (Kcat/KM) em relação à AacSHC de tipo selvagem quando é usado esqualeno. Ver Hoshino & Sato (2002) Chem. Commun. (4): 291-301. Notavelmente, o derivado de SHC equivalente a F601Y em GmSHC é F624Y.

[0025] Conformemente, em certas modalidades desta invenção, o derivado de GmSHC tem pelo menos a substituição Q54E, F624Y ou Y142R em combinação com pelo menos uma ou mais de V45I, V45Q, V45L, E46H,

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E46Q, S86A, F139L, Q178E, M184A, M184L, Μ1841, M184V, R194Q, G239V, I278V, T326S, L335F, E386Q, Ι455Τ, F460A, Q603H, G623A, G623V, L656E e Y658F em relação à SEQ ID N0:2. Em modalidades particulares, o derivado de GmSHC tem uma combinação de mutações listadas na Tabela 2. Em algumas modalidades, o derivado de GmSHC é um polipeptídeo de GmSHC modificado tendo uma sequência de aminoácidos que tem até 4 mutações em comparação com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem/referência de acordo com SEQ ID NO:2 e inclui pelo menos a substituição Q54E, F624Y ou Y142R em relação à SEQ ID NO:2.

[0026] Ensaios para determinação e quantificação da atividade de SHC são descritos aqui e são conhecidos na técnica. A título de ilustração, a atividade de GmSHC e/ou derivado de GmSHC pode ser determinada por incubação da enzima GmSHC purificada ou extratos de células hospedeiras ou um organismo hospedeiro recombinante completo que produziu a enzima GmSHC com um substrato apropriado sob condições apropriadas e levar a cabo uma análise dos produtos de reação (p.ex., por cromatografia gasosa (GC) ou análise de HPLC). Detalhes adicionais sobre ensaios de atividade da enzima GmSHC e análise dos produtos de reação são proporcionados nos Exemplos. Estes ensaios incluem produção da GmSHC em células hospedeiras recombinantes (p.ex., E. coli).

[0027] Como usado aqui, o termo “atividade” significa a capacidade de uma enzima de reagir com um substrato para proporcionar um produto alvo. A atividade pode ser determinada no que é conhecido como um teste de atividade através do aumento do produto alvo, da diminuição do substrato (ou materiais de partida) ou através de uma combinação destes parâmetros como uma função do tempo. A GmSHC da presente divulgação é caracterizada pela sua capacidade de bioconverter homofarnesol em ambroxano.

[0028] Em modalidades dirigidas ao uso de um derivado de GmSHC, preferencialmente o derivado de GmSHC exibe um melhor rendimento alvo

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14/54 do que a proteína GmSHC de referência. O termo “rendimento alvo” se refere à grama de produto recuperável por grama de matéria-prima (que pode ser calculado como uma percentagem da taxa de conversão molar). Adicionalmente, um derivado de GmSHC pode exibir uma produtividade alvo modificada (p.ex., aumentada) em relação à proteína GmSHC de referência. O termo “produtividade alvo” se refere à quantidade de produto alvo recuperável em gramas por litro de capacidade de fermentação por hora de tempo de bioconversão (i.e., tempo após o substrato ter sido adicionado). Além do mais, um derivado de GmSHC pode exibir um fato de rendimento alvo em comparação com a proteína GmSHC de referência. O termo “fator de rendimento alvo” se refere à razão entre a concentração de produto obtida e a concentração do derivado de GmSHC (por exemplo, enzima GmSHC purificada ou um extrato das células hospedeiras recombinantes expressando a enzima GmSHC) no meio de reação. Em certas modalidades, um derivado de GmSHC exibe um aumento de pelo menos 2-, 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 12-, 14-, 16-, 18-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 55-, 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, ou 100 vezes na atividade enzimática (p.ex., conversão de homofarnesol em ambroxano) em relação à proteína GmSHC de referência (p.ex., SEQ ID NO:2).

[0029] Um homólogo funcional das proteínas GmSHC divulgadas aqui está também incluído dentro do escopo desta invenção. Um “homólogo funcional” é um polipeptídeo que tem similaridade de sequências com um polipeptídeo de referência e que leva a cabo uma ou mais da(s) função(ões) bioquímica(s) ou fisiológica(s) do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeo ocorrendo naturalmente, e a similaridade de sequências pode ser devida a eventos evolutivos convergentes ou divergentes. Como tal, os homólogos funcionais são por vezes designados na literatura como homólogos ou ortólogos ou parálogos. As variantes de um homólogo funcional ocorrendo naturalmente,

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15/54 tais como polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência codificante de tipo selvagem, podem ser elas próprias homólogos funcionais. Os homólogos funcionais podem ser também criados através de mutagênese sítio-dirigida da sequência codificante de um polipeptídeo ou por combinação de domínios das sequências codificantes para diferentes polipeptídeos ocorrendo naturalmente (“troca de domínios”). Técnicas para obtenção de homólogos funcionais da enzima GmSHC descrita aqui são conhecidos e incluem, inter alia, técnicas de evolução dirigida, técnicas de mutagênese sítio-dirigida e técnicas de mutagênese aleatório, que podem ser usadas para aumentar a atividade específica da enzima GmSHC, alterar a especificidade pelo substrato, alterar os níveis de expressão ou alterar a localização subcelular de um modo desejado.

[0030] Desejavelmente, a enzima GmSHC e homólogo funcional partilham pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos. Preferencialmente, o homólogo funcional e o polipeptídeo de referência exibem a identidade de sequências indicada ao longo de um trecho contínuo de 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais resíduos de aminoácidos.

[0031] Para facilitar a expressão de GmSHC e produção e isolamento de ambroxano, a GmSHC ou derivado de GmSHC é expressa em uma célula hospedeira recombinante. O termo “hospedeiro recombinante”, também referido como uma “célula hospedeira geneticamente modificada” ou “célula transgênica”, denota uma célula hospedeira que inclui um ácido nucleico heterólogo ou o genoma da qual foi aumentado em pelo menos uma sequência de DNA incorporada. Uma célula hospedeira da presente divulgação pode ser

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16/54 geneticamente manipulada com uma molécula de ácido nucleico ou vetor contendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma GmSHC ou derivado de GmSHC.

[0032] O termo “molécula de ácido nucleico”, como usado aqui, se refere a polinucleotídeos da divulgação que podem ser DNA, cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou RNA e podem ter fita dupla ou fita simples, a fita senso e/ou antissenso. O termo “molécula de ácido nucleico” deverá se aplicar particularmente ao(s) polinucleotídeo(s) como usado aqui (p.ex., como sequência de nucleotídeos de comprimento total ou seus fragmentos ou partes), que codifica uma GmSHC ou derivado de GmSHC, p.ex., SEQ ID NO:1. O termo inclui também um cDNA; um fragmento genômico que não tem pelo menos um dos genes flanqueantes; um fragmento de cDNA ou DNA genômico produzido por reação em cadeia da polimerase (PCR) e que não tem pelo menos um dos genes flanqueantes; um fragmento de restrição que não tem pelo menos um dos genes flanqueantes; e um DNA codificando uma proteína não ocorrendo naturalmente tal como uma proteína de fusão. As proteínas de fusão podem adicionar um ou mais aminoácidos a uma proteína (p.ex., uma cauda de His), usualmente no terminal N da proteína mas também no terminal C ou fundidos dentro de regiões da proteína. Tais proteínas de fusão ou vetores de fusão codificando tais proteínas proporcionam tipicamente (i) um aumento na produção de proteínas recombinantes; (ii) um aumento na solubilidade da proteína recombinante; e/ou (iii) um auxílio na purificação da proteína recombinante proporcionando um ligando para purificação por afinidade. Em certas modalidades, a GmSHC ou derivado de GmSHC inclui uma sequência líder para apoiar a expressão e/ou atividade da GmSHC ou derivado de GmSHC em uma célula hospedeira recombinante, p.ex., E. coli.

[0033] O termo “molécula de ácido nucleico” inclui também sequências com otimização de códons adequadas para expressão em uma

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17/54 célula hospedeira recombinante particular (p.ex., célula hospedeira de E. coli). O termo “com otimização de códons” significa uma sequência codificante de proteína que foi adaptada para expressão em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, particularmente células hospedeiras bacterianas tais como células hospedeiras de E. coli por substituição de um ou mais ou preferencialmente um número significativo de códons por códons que são mais frequentemente usados em genes de células hospedeiras bacterianas. A este respeito, a sequência de nucleotídeos codificando a sequência de referência SEQ ID NO:1 e todas suas variantes/derivados podem ser a original como encontrada na fonte (p.ex., GmSHC) ou a sequência de nucleotídeos pode ter otimização de códons para os organismos hospedeiros selecionados, tais como, p.ex., E. coli.

[0034] O termo “DNA isolado”, como usado aqui, se refere a ácidos nucleicos ou polinucleotídeos isolados a partir de uma fonte natural (p.ex., Gluconobacter morbifer) ou ácidos nucleicos ou polinucleotídeos produzidos por técnicas de DNA recombinante, p.ex., um constructo de DNA incluindo um polinucleotídeo heterólogo a uma célula hospedeira, que está opcionalmente incorporado na célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeos quimérica pode ser especificamente produzida como uma molécula recombinante. O termo “recombinante”, no que diz respeito a enzimas, se refere a enzimas produzidas por técnicas de DNA recombinante, i.e., produzidas a partir de células transformadas por um constructo de DNA exógeno codificando a enzima desejada. O termo “recombinante” deverá se aplicar especificamente a montagem de polinucleotídeos, união de tais polinucleotídeos ou suas partes, com ou sem recombinação para alcançar um cruzamento ou um mosaico de genes. Por exemplo é realizada para unir segmentos de ácidos nucleicos de funções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções. Uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando um polipeptídeo descrito aqui inclui a sequência

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18/54 codificante para esse polipeptídeo operacionalmente ligada, na orientação senso, a uma ou mais regiões reguladoras adequadas para expressão do polipeptídeo. Como muitos microrganismos são capazes de expressar múltiplos produtos de gene a partir de um mRNA policistrônico, múltiplos polipeptídeos podem ser expressos sob o controle de uma única região reguladora para esses microrganismos, se desejado.

[0035] Uma sequência codificante e uma região reguladora são consideradas como estando operacionalmente ligadas quando a região reguladora e sequência codificante estão posicionadas tal que a região reguladora seja eficaz para regulação da transcrição ou tradução da sequência. Os elementos reguladores transcricionais/translacionais incluem, mas não estão limitados a, promotores, intensificadores, operadores, silenciadores, repressores e outros elementos indutíveis e não indutíveis, constitutivos, regulados pelo ciclo celular, metabolicamente regulados que são conhecidos dos peritos na técnica e que dirigem ou de outro modo regulam a expressão de genes. Tais elementos reguladores incluem, mas não estão limitados a, elementos reguladores tais como o promotor CUP-1; o repressor tet como empregue, por exemplo, nos sistemas tet-on ou tet-off; o sistema lac e os elementos reguladores do sistema trp. A título de exemplo, o β-D-lTiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG) é um indutor eficaz da expressão de genes na gama de concentrações de 100 μΜ a 1,0 mM. Este composto é um mimético molecular da alolactose, um metabolito da lactose que desencadeia a transcrição do operon lac e é, portanto, usado para induzir expressão de genes quando o gene está sob o controle do operador lac. Outro exemplo de um elemento regulador que induz a expressão de genes é lactose.

[0036] A(s) molécula(s) de ácidos nucleico da presente divulgação pode(m) também formar parte de um gene híbrido codificando sequências de polipeptídeo adicionais, por exemplo, uma sequência que funciona como um marcador ou repórter. Exemplos de genes marcadores e repórteres incluem

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19/54 beta-lactamase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), adenosina deaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase, di-hidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina cinase (TK), lacZ (codificando beta-galactosidase) e xantina guanina fosforibosiltransferase (XGPRT). Como com muitos dos procedimentos padrão associados à prática da divulgação, os especialistas peritos estarão cientes de reagentes úteis adicionais, por exemplo, sequências adicionais que podem servir a função de um marcador ou repórter.

[0037] Em algumas modalidades, a presente divulgação proporciona uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando GmSHC de tipo selvagem ou um derivado de GmSHC descrito acima, que pode ser inserida em um vetor para expressão e purificação opcional. Tais vetores são referidos aqui como “vetores de expressão”. Usualmente, os vetores de expressão adequados para técnicas de recombinação de DNA são tipicamente do tipo plasmídeo. Um vetor de expressão inclui uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando GmSHC de tipo selvagem ou um derivado de GmSHC como descrito aqui e as regiões reguladoras necessárias adequadas para expressão do polipeptídeo. Tais vetores incluem moléculas de ácido nucleico que não estão naturalmente presentes na célula hospedeira, moléculas de ácido nucleico que não são normalmente transcritas em RNA ou traduzidas em uma proteína (“expressas”) e outros genes ou moléculas de ácido nucleico que se deseja introduzir na célula hospedeira. Será apreciado que tipicamente o genoma de uma célula hospedeira recombinante descrita aqui é aumentado através da introdução estável de uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinantes. No entanto, plasmídeos ou vetores autônomos ou replicantes podem ser também usados dentro do escopo desta divulgação. Além do mais, a presente divulgação pode ser praticada usando um baixo número de cópias, p.ex., uma única cópia, ou plasmídeo ou vetor com elevado número de cópias. Em certas modalidades, o vetor da presente divulgação é

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20/54 um plasmídeo, fagemídeo, fago, cosmídeo, cromossomo bacteriano artificial ou de levedura artificial, constructo knock-out ou knock-in, molécula de ácido nucleico sintética ou cassete produzido na forma de um polinucleotídeo linear, plasmídeo, megaplasmídeo, cromossomo sintético ou artificial, tal como cromossomo artificial de planta, bacteriano, de mamífero ou de levedura.

[0038] De acordo com a invenção, a GmSHC ou um derivado de GmSHC codificado pela molécula de ácido nucleico recombinante é constitutivamente ou indutivelmente expresso dentro da célula após introdução do vetor. As células microbianas são transformadas com um vetor codificando a GmSHC ou um derivado de GmSHC usando técnicas de transformação padrão. Em uma modalidade adequada, DNA proporcionando uma origem de replicação está incluído no vetor. A origem de replicação pode ser adequadamente selecionada pelo perito. Dependendo da natureza dos genes, uma origem de replicação suplementar pode não ser requerida se sequências já estiverem presentes dentro dos genes ou genoma que sejam operáveis como origens de replicação eles próprios.

[0039] Com o contexto da presente invenção, uma célula microbiana (p.ex., uma célula bacteriana ou de levedura) é transformada, quando um DNA exógeno ou heterólogo foi introduzido dentro da célula. O DNA transformante pode ou não ser integrado, i.e., co valentemente ligado no genoma da célula. Em procariotas, e levedura, por exemplo, o DNA transformante pode ser mantido em um elemento epissomal tal como um plasmídeo. No que diz respeito a células eucarióticas, uma célula estavelmente transfectada é uma na qual o DNA transfectado se tomou integrado em um cromossomo tal que seja herdado por células filhas através de replicação do cromossomo. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica de estabelecer linhas de células ou clones incluindo uma população de células filhas contendo o DNA transformante.

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21/54 [0040] Células hospedeiras que podem ser usadas para propósitos da divulgação incluem, mas não estão limitadas a, células procarióticas tais como bactérias (p.ex., E. coli e B. subtilis), que podem ser transformadas com, por exemplo, vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo, cromossomo artificial bacteriano ou DNA de cosmídeo contendo as moléculas de ácido nucleico de GmSHC da divulgação; células eucarióticas simples como levedura (por exemplo, Saccharomyces e Pichid), que podem ser transformadas com, por exemplo, vetores de expressão de levedura recombinantes contendo a molécula de polinucleotídeo da divulgação; células de inseto (p.ex., um sistema de expressão em células de insetos de baculovírus); células humanas (p.ex., HeLa, CHO e Jurkat) e células de plantas (Arabidopsis e tabaco). Dependendo da célula hospedeira e do respectivo vetor usado para introduzir a molécula de ácido nucleico da divulgação, a molécula de ácido nucleico pode se integrar, por exemplo, no cromossomo ou no DNA mitocondrial ou pode ser mantida extracromossomicamente, por exemplo, episomalmente, ou pode estar somente transientemente abrigada pela célula.

[0041] Em modalidades pertencendo a uma célula eucariótica, preferencialmente a célula é uma célula fúngica, de mamífero ou de planta. Células eucarióticas adequadas incluem, por exemplo, sem limitação, células de mamífero, células de levedura (p.ex., Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Pichia e Aspergillus) ou células de insetos (incluindo Sf9), células de anfíbios (incluindo células de melanóforo) ou células de vermes incluindo células de Caenorhabditis (incluindo Caenorhabditis elegans). Células de mamífero adequadas incluem, por exemplo, sem limitação, células COS (incluindo Cos-1 e Cos-7), células CHO, células HEK293, células HEK293T ou outras linhas de células eucarióticas transfectáveis.

[0042] Em modalidades pertencendo a procariotas, preferencialmente

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22/54 a célula é E. coli, uma Bacillus sp. ou Streptomyces sp. Preferencialmente, a célula hospedeira de E. coli é uma célula hospedeira de E. coli que é reconhecida pela indústria e autoridades reguladoras como adequada para expressão recombinante de proteínas (incluindo mas não se limitando a uma célula hospedeira de E. coli K12 ou célula hospedeira de E. coli BL21). Em certas modalidades, a célula hospedeira recombinante desta invenção é E. coli. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos computadorizados detalhados de metabolismo e outra informação disponível para E. coli, permitindo o desenho racional de vários módulos para intensificar o rendimento do produto. Conformemente, em certas modalidades, uma E. coli recombinante expressando uma molécula de ácido nucleico codificando uma sequência codificante de GmSHC ou derivado de GmSHC é proporcionada para conversão de homofamesol em ambroxano.

[0043] Outra célula hospedeira preferencial para usar com a presente divulgação é S. cerevisiae, que é amplamente usada em biológica sintética. Assim, a célula hospedeira recombinante pode ser S. cerevisiae. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos computadorizados detalhados de metabolismo e outra informação disponível para S. cerevisiae, permitindo o desenho racional de vários módulos para intensificar o rendimento do produto. Adicionalmente são conhecidos métodos para fabricação de microrganismos de S. cerevisiae recombinantes. Conformemente, em certas modalidades, uma S. cerevisiae recombinante expressando uma molécula de ácido nucleico codificando uma sequência codificante de GmSHC ou derivado de GmSHC é proporcionada para conversão de homofamesol em ambroxano.

[0044] A cultura de células é realizada de um modo convencional. O meio de cultura contém uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos, e vitaminas são adicionados a ele. Os constituintes deste meio podem ser aqueles que são convencionalmente

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23/54 usados para cultura da espécie de célula hospedeira em questão. As fontes de carbono de uso nos métodos descritos aqui incluem qualquer molécula que possa ser metabolizada pela célula hospedeira recombinante para facilitar o crescimento e/ou produção de ambroxano. Exemplos de fontes de carbono adequadas incluem, mas não estão limitadas a, sacarose (p.ex., como encontrada em melaços), frutose, xilose, glicerol, glucose, celulose, amido, celobiose ou outro polímero contendo glucose.

[0045] Em modalidades empregando E. coli, um meio mínimo definido tal como M9A pode ser usado para cultura de células. Os componentes do meio M9A incluem: 14 g/L de KH2PO4, 16 g/L de K2HPO4,1 g/L de Na₃Citrato 2H₂0, 7,5 g/L de (NH₄)₂S0₄, 0,25 g/L de MgS0₄7H₂0, 0,015 g/L de CaChGFEO, 5 g/L de glucose e 1,25 g/L de extrato de levedura. Em outra modalidade desta divulgação é usado um meio rico em nutrientes tal como LB. Os componentes de meio LB incluem: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl. Outros exemplos de Meio Mineral e Meio Mineral M9 são divulgados, por exemplo, em US 6,524,831 e US 2003/0092143.

[0046] Em modalidades empregando levedura como um hospedeiro, por exemplo, fontes de carbono tais como sacarose, frutose, xilose, etanol, glicerol e glucose são adequadas. A fonte de carbono pode ser proporcionada ao organismo hospedeiro ao longo do período de cultura ou, altemativamente, o organismo pode ser cultivado durante um período de tempo na presença de outra fonte de energia, p.ex., proteína, e depois proporcionado com uma fonte de carbono somente durante a fase descontínua alimentada.

[0047] A adequabilidade de uma célula hospedeira recombinante para uso nos métodos da presente divulgação pode ser determinada por procedimentos de teste simples usando métodos bem conhecidos. Por exemplo, a célula hospedeira a ser testada pode ser propagada em um meio rico (p.ex., meio LB, meio de extrato de levedura Bacto-triptoma, meio

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24/54 nutriente e similares) a um pH, temperatura e sob condições de arejamento comumente usados para propagação do microrganismo. Logo que uma célula hospedeira recombinante seja identificada como produzindo os produtos desejados de bioconversão, os produtos são tipicamente produzidos por uma linha de células hospedeiras de produção à larga escala por sistemas de expressão e fermentadores adequados, p.ex., por produção microbiana em cultura de células.

[0048] A célula hospedeira recombinante pode ser cultivada em um processo descontínuo, descontínuo alimentado ou contínuo ou suas combinações. Como usado aqui, o termo “cultura descontínua” é um método de cultura no qual o meio de cultura não é nem adicionado bem retirado durante a cultura. Por comparação, o termo “descontínuo alimentado” significa um método de cultura no qual meio de cultura é adicionado durante a cultura mas nenhum meio de cultura é retirado. Tipicamente, a célula hospedeira recombinante é cultivada em um sistema de cultura, em que as células hospedeiras recombinantes são cultivadas em fermentador a uma temperatura(s) definida(s) na presença de uma fonte de nutrientes adequada, p.ex., uma fonte de carbono, durante um período de tempo desejado para produzir enzima suficiente para bioconverter homofamesol em ambroxano e para produzir uma quantidade desejada de ambroxano incluindo (-)ambroxano. As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas de qualquer modo adequado, por exemplo por cultura descontínua ou cultura descontínua alimentada. Frequentemente, no entanto, títulos de produção cumulativos mais elevados podem ser alcançados por implementação de um processo contínuo, tal como remoção de produto, alimentação de substrato e adição ou substituição (parcial) de biomassa.

[0049] Uma modalidade da presente divulgação proporciona um método de produção de ambroxano em células hospedeiras recombinantes proporcionando células hospedeiras recombinantes expressando GmSHC de

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25/54 tipo selvagem ou um derivado de GmSHC em um sistema de cultura, proporcionando homofamesol ao sistema de cultura (p.ex., por alimentação), converter homofamesol em ambroxano usando a GmSHC ou derivado de GmSHC produzido pelas células hospedeiras recombinantes, coletando ambroxano e opcionalmente isolando o ambroxano (em particular, (-)ambroxano). Em algumas modalidades, a célula hospedeira recombinante expressa também outras moléculas de ácido nucleico que servem para intensificar a expressão de GmSHC ou via de bioconversão para fabricação de ambroxano.

[0050] Outra modalidade da presente divulgação proporciona um método de produção de ambroxano em células hospedeiras recombinantes proporcionando células hospedeiras recombinantes expressando GmSHC de tipo selvagem ou um derivado de GmSHC em um sistema de cultura, proporcionando homofamesol ao sistema de cultura, alimentando homofamesol (p.ex., EEH) ao sistema de cultura na presença de um agente solubilizante adequado para promover a conversão de homofamesol em ambroxano, coletando ambroxano e opcionalmente isolando o ambroxano (em particular, (-)-ambroxano). Em algumas modalidades, a conversão é intensificada pela adição de um agente solubilizante, em particular um tensoativo ou detergente tal como TWEEN 80, TRITON X-100 e similares, à mistura reacional.

[0051] As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em um número de modos de modo a proporcionar células em quantidades adequadas expressando a GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC para o passo de bioconversão subsequente. Uma vez que as células hospedeiras aplicáveis para o passo de bioconversão variam amplamente (p.ex., células fúngicas, bacterianas, de insetos, de mamífero e de plantas), as condições de cultura são, obviamente, ajustadas aos requisitos específicos de cada espécie e estas condições são bem conhecidas e documentadas. Qualquer

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26/54 um dos métodos conhecidos na técnica para cultura de células hospedeiras recombinantes pode ser usado para produzir as células usadas no passo de bioconversão subsequente da presente divulgação. Tipicamente, as células são cultivadas até uma densidade particular (mensurável como densidade óptica (OD)) para produzir uma biomassa suficiente para a reação de bioconversão. [0052] As condições de cultura escolhidas podem influenciar a quantidade de células obtidas (a biomassa) bem como como a biomassa se toma um biocatalisador (i.e., uma célula ou fração de célula contendo uma GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC). Em algumas modalidades, o biocatalisador é uma célula inteira recombinante que expressa GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC. Em outras modalidades, o biocatalisador é uma suspensão de células inteiras recombinantes ou célula imobilizada que expressa GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC. Em outras modalidades, o biocatalisador é uma fração de membrana ou uma fração de líquido preparada a partir da célula hospedeira recombinante que expressa uma GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC. A célula inteira recombinante produzindo uma GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC inclui células inteiras coletadas a partir do fermentador (para a reação de bioconversão) ou das células no fermentador (que são depois usadas em uma reação de um vaso). A célula inteira recombinante produzindo uma GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC pode incluir célula inteira recombinante intata e/ou detritos de células. De qualquer dos modos, a GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC está associado a uma membrana (tal como uma membrana de célula) de algum modo de modo a receber e/ou interagir com um substrato (p.ex., homofarnesol), membrana essa (tal como uma membrana de célula) que pode ser parte de ou incluir uma célula inteira (p.ex., uma célula inteira recombinante). A GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC pode estar também em uma forma imobilizada (p.ex., associado a um transportador de enzima) que permite que

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27/54 a GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC interaja com um substrato (p.ex., homofamesol). A GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC pode ser também usado em uma forma solúvel.

[0053] Em uma modalidade, o biocatalisador é produzido em quantidades suficientes (para criar uma biomassa suficiente), coletado e lavado (e opcionalmente armazenado (p.ex., congelado ou liofilizado)) antes do passo de bioconversão. Em uma modalidade adicional, as células são produzidas em quantidades suficientes (para criar um biocatalisador suficiente) e as condições de reação são depois ajustadas sem a necessidade de coletar e lavar o biocatalisador para a reação de bioconversão. Este método de um passo (ou “um vaso”) é vantajoso pois simplifica o processo enquanto reduz custos. O meio de cultura usado para cultivar as células é também adequado para uso na reação de bioconversão contanto que as condições de reação sejam ajustadas para facilitar a reação de bioconversão.

[0054] O pH ótimo para cultura das células está na gama de 6,0-7,0. O pH ótimo para a reação de bioconversão pode ser dependente da enzima SHC usada na reação de bioconversão, p.ex., GmSHC de tipo selvagem ou derivado de GmSHC. O pH é regulado usando técnicas que são bem conhecidas do perito.

[0055] Embora os termos “mistura” ou “mistura reacional” podem ser usados indistintamente com o termo “meio” na presente divulgação (especialmente pois se relaciona com uma reação de “um vaso”) deve ser notado que a cultura das células para criar uma biomassa suficiente requer um meio de cultura/fermentação de células mas um meio não é requerido para o passo de bioconversão pois um tampão de reação será suficiente a um pH adequado.

[0056] Os métodos de bioconversão da presente divulgação são levados a cabo sob condições de tempo, temperatura, pH e agente solubilizante para proporcionar conversão da matéria-prima de homofamesol

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28/54 em ambroxano. O pH da mistura reacional pode estar na gama de 4 a 8, preferencialmente, 5 a 6,5, mais preferencialmente 4,8 a 6,0 para as enzimas derivadas de GmSHC e na gama de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0 para a enzima GmSHC de tipo selvagem e pode ser mantido pela adição de tampões à mistura reacional. O tampão usado pode ser um tampão de citrato, fosfato, TRIS (tris(hidróximetil)aminometano) ou MES (ácido 2-(Nmorfolino)etanossulfônico). Em certas modalidades, o tampão é tampão de Tris-Cl. A temperatura preferencial está entre de cerca de 15°C e cerca de 45°C, preferencialmente cerca de 20°C e cerca de 40°C. A temperatura pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o processo de bioconversão.

[0057] Foi mostrado que o uso de um agente solubilizante, p.ex., um tensoativo, detergente, intensificador da solubilidade, solvente orgânico miscível com água e similares melhora a reação de bioconversão. Como usado aqui, o termo “tensoativo” significa um componente que diminui a tensão superficial (ou tensão interfacial) entre dois líquidos ou entre um líquido e um sólido. Os tensoativos podem atuar como detergentes, agentes molhantes, emulsificantes, agentes espumantes e dispersantes. Em certas modalidades, o tensoativo é um tensoativo não iônico, tensoativo aniônico, tensoativo catiônico ou tensoativo anfotérico ou zwitteriônico. Exemplos de tensoativos não iônicos incluem, mas não estão limitados a, TRITON X-100 (4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol, tOctilfenoxipolietóxietanol, Éter de íerc-octilfenila de polietilenoglicol), TWEEN 80 (Polissorbato 80) e TWEEN 20 (Polissorbato 20). Tensoativos aniônicos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, taurodesóxicolato, taurodesóxicolato de sódio, dodecil sulfato de sódio (SDS) e lauril sulfato de sódio (SLS). Como os resultados apresentados aqui demonstram, TRITON X-100 é um agente solubilizante particularmente útil. Conformemente, TRITON X-100 e outros tensoativos tais como SDS e

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TWEEN 20 podem ser usados para aumentar a velocidade e rendimento para a reação de bioconversão de homofamesol em ambroxano. O agente solubilizante pode estar incluído a uma gama de concentrações de cerca de 0,005% a 0,48% na reação ou, mais preferencialmente, cerca de 0,05 a 5% na mistura reacional.

[0058] De acordo com os métodos desta invenção, o ambroxano é produzido usando um biocatalisador ao qual o substrato de homofamesol é adicionado. E possível adicionar o substrato por alimentação usando meios conhecidos (p.ex., bomba peristáltica, seringa de infusão e similares). O homofamesol é um composto solúvel em óleo e é proporcionado em um formato de óleo. Dado que o biocatalisador (células microbianas tais como célula inteira recombinante intata e/ou detritos de células e/ou enzima imobilizada) está presente em uma fase aquosa, a reação de bioconversão pode ser considerada como um sistema de três fases (incluindo uma fase aquosa, uma fase sólida e uma fase de óleo) quando o homofamesol é adicionado à mistura reacional de bioconversão. Este pode ser também o caso mesmo quando agente solubilizante está presente.

[0059] Embora algumas modalidades incluam o uso de células intatas inteiras ou extratos de células, outras modalidades incluem o uso de enzima GmSHC livre, opcionalmente purificada ou parcialmente purificada ou enzima GmSHC imobilizada para bioconversão de homofamesol em ambroxano. A este respeito, quando uma GmSHC de tipo selvagem ou um derivado de GmSHC é usado como um biocatalisador, este é considerado um sistema de duas fases.

[0060] O número de isômeros de homofamesol presente pode influenciar a velocidade da reação. Foi demonstrado que uma enzima derivada de SHC é capaz de bioconverter o Ε,Ε-homofamesol em (-)ambroxano a partir de uma mistura complexa de isômeros de homofamesol (p.ex., EE:EZ:ZE:ZZ) (ver WO 2016/170099). No entanto é tipicamente

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30/54 observada uma taxa de conversão mais baixa usando a mistura complexa de isômeros de homofamesol, o que é consistente com a vista de que os isômeros de homofamesol sem ser EEH podem competir com EEH quanto ao acesso à enzima derivada de SHC e assim podem atuar como inibidores competitivos para a conversão de EEH em (-)-ambroxano e/ou também atuar como substratos alternativos. Conformemente, o presente método é preferencialmente levado a cabo na presença de um substrato de homofamesol composto por uma mistura estereoisomérica de 2-4 isômeros, preferencialmente dois isômeros. Em algumas modalidades, somente dois isômeros de homofamesol são adicionados à mistura reacional. Em certas modalidades, o substrato de homofamesol é composto por uma mistura estereoisomérica EE:EZ. Em outras modalidades, E,E-homofarnesol estereoisomericamente puro é adicionado à mistura reacional.

[0061] O ambroxano produzido pelo método desta invenção pode ser coletado, p.ex., extração por vapor/destilação ou extração por solvente orgânico usando um solvente não miscível com água (para separar os produtos de reação e substrato não reagido do biocatalisador que permanece na fase aquosa) seguida por evaporação subsequente do solvente para se obter um produto de reação em bruto como determinado por análise cromatográfica gasosa (GC). Métodos de extração por vapor/destilação e extração por solvente orgânico são conhecidos dos peritos na técnica. A título de ilustração, o ambroxano resultante pode ser extraído a partir da mistura reacional inteira usando um solvente orgânico tal como um solvente não miscível com água (p.ex., tolueno). Alternativamente, o ambroxano resultante pode ser extraído a partir da fase sólida da mistura reacional (obtida por, p.ex., centrifugação ou filtração) usando um solvente miscível com água (p.ex., etanol) ou um solvente não miscível com água (p.ex., tolueno). A título de exemplo adicional, o ambroxano está presente na fase sólida como cristais ou em forma amorfa e pode ser separado a partir da fase sólida remanescente

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31/54 (material de células ou seus detritos) e da fase líquida também por meio de filtração. A título de exemplo adicional, a uma temperatura acima do ponto de fusão do ambroxano (aproximadamente 75°C), o ambroxano pode formar uma camada de óleo no topo da fase aquosa, em que a camada de óleo pode ser removida e coletada. De modo a assegurar uma recuperação completa de ambroxano após a camada de óleo ser removida, um solvente orgânico pode ser adicionado à fase aquosa contendo a biomassa de modo a extrair qualquer ambroxano residual contido na ou sobre a ou cerca da biomassa. A camada orgânica pode ser combinada com a camada de óleo, antes do todo ser adicionalmente processado para isolar e purificar o ambroxano. O ambroxano pode ser adicionalmente seletivamente cristalizado para se removerem subprodutos (i.e., isômeros diferentes de (-)-ambroxano) e qualquer substrato de homofamesol não reagido a partir do produto final. O termo “cristalização seletiva” se refere a um passo de processo por meio do que se faz com que o (-)-ambroxano cristalize a partir de um solvente enquanto os isômeros remanescentes permanecem dissolvidos no solvente de cristalização. Em algumas modalidades, o material cristalino isolado contém somente produto de (-)-ambroxano. Em outras modalidades, o material cristalino isolado contém os outros isômeros, em que os referidos isômeros estão presentes somente em quantidades aceitáveis olfativas.

[0062] Exemplos de solventes orgânicos miscíveis com água e não miscíveis com água adequados para uso na extração e/ou cristalização seletiva de (-)-ambroxano incluem, mas não estão limitados a, hidrocarbonetos alifáticos, preferencialmente aqueles tendo 5 a 8 átomos de carbono, tais como pentano, ciclopentano, hexano, ciclo-hexano, heptano, octano ou ciclooctano; hidrocarbonetos alifáticos halogenados, preferencialmente aqueles tendo um ou dois átomos de carbono, tais como diclorometano, clorofórmio, tetracloreto de carbono, dicloroetano ou tetracloroetano; hidrocarbonetos aromáticos, tais como benzeno, tolueno, os xilenos, clorobenzeno ou

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32/54 diclorobenzeno; éteres ou álcoois acíclicos e cíclicos alifáticos, preferencialmente aqueles tendo 4 a 8 átomos de carbono, tais como etanol, isopropanol, éter de dietila, éter de metila e íerc-butila, éter de etila e tercbutila, éter de dipropila, éter de di-isopropila, éter de dibutila, tetrahidrofurano; ou ésteres tais como acetato de etila ou acetato de n-butila ou cetonas tais como cetona de metila e isobutila ou dioxano ou misturas destes. Os solventes que são especialmente preferencialmente usados são os acima mencionados heptano, éter de metila e íerc-butila (também conhecido como MTBE, éter de butila e metila terciário e iBME), éter de di-isopropila, tetrahidrofurano, acetato de etila e/ou suas misturas. Preferencialmente, um solvente miscível com água tal como etanol é usado para a extração de (-)ambroxano a partir da fase sólida da mistura reacional. O uso de etanol é vantajoso porque é fácil de manusear, não é tóxico e é ambientalmente amigável.

[0063] Em certas modalidades, o produto final é (-)-ambroxano isolado. O termo “isolado”, como usado com referência a (-)-ambroxano, se refere a um produto de bioconversão que foi separado ou purificado a partir de componentes que o acompanham. Uma entidade que é produzida em um sistema celular diferente da fonte a partir da qual tem origem natural é “isolada” porque estará necessariamente isenta de componentes que a acompanham naturalmente. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por qualquer método apropriado, p.ex., análise de cromatografia gasosa (GC), HPLC ou RMN. Em algumas modalidades, o produto final ((-)-ambroxano) é isolado e purificado até à homogeneidade, p.ex., pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, ou 89,5% puro ou 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% puro.

[0064] A pureza olfativa do produto final (-)-ambroxano pode ser determinada usando um extrato de etanol a 10% em água ou por teste do material cristalino. O produto final (-)-ambroxano pode ser testado contra

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33/54 uma referência comercialmente disponível de produto (-)-ambroxano quanto à sua pureza olfativa, qualidade e seu perfil sensorial. O material de (-)ambroxano pode ser também testado em estudos de aplicação por especialistas de modo a se determinar se o material cumpre as especificações no que diz respeito ao seu perfil organolético.

[0065] A atividade da enzima GmSHC é definida através da taxa de reação (quantidade de produto/(quantidade de produto + quantidade de material de partida remanescente)) x 100) em percentagem de mol. Preferencialmente, a bioconversão de EEH em (-)-ambroxano na presença de GmSHC de tipo selvagem ou um derivado de GmSHC, ou na presença de uma célula hospedeira recombinante que expressa uma GmSHC de tipo selvagem ou um derivado de GmSHC, proporciona um rendimento de (-)ambroxano de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64,

65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,

86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, dado em percentagem de mol e baseado nas moles de EEH empregues; especialmente preferencialmente, o rendimento é entre 5 e 100, 10 e 100, 20 e 100, 25 e 100, 30 e 100, 35 e 100, em particular entre 40 e 100, 45 e 100, 50 e 100, 60 e 100, 70 e 100.

[0066] Em uma modalidade preferencial da invenção, o rendimento e/ou a taxa de reação são determinados ao longo de um período de tempo definido de, por exemplo, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 36 ou 48 horas, durante o qual o EEH é convertido em (-)-ambroxano por uma célula hospedeira recombinante abrigando uma molécula de ácido nucleico codificando uma GmSHC de tipo selvagem ou uma enzima derivada de GmSHC de acordo com a presente divulgação. Em uma modalidade adicional, a reação é levada a cabo sob condições definidas de, por exemplo, 25°C, 30°C, 40°C, 50°C ou

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60°C.

[0067] O processo de bioconversão para fabricação de (-)-ambroxano a partir de homofarnesol em uma estirpe recombinante de E. coli abrigando uma molécula de ácido nucleico codificando uma GmSHC de tipo selvagem ou uma enzima derivada de GmSHC pode oferecer um processo de baixo custo e industrialmente econômico para a produção de (-)-ambroxano.

[0068] Desejavelmente, a quantidade de (-)-ambroxano produzida está na gama de cerca de 1 mg/L a cerca de 20.000 mg/L (20 g/L) ou mais elevada tal como de cerca de 20 g/L a cerca de 200 g/L ou de cerca de 100 a 200 g/L, preferencialmente cerca de 125 g/L ou 150 g/L.

[0069] Várias aplicações para o (-)-ambroxano incluem, mas não estão limitadas a, uma fragrância fina ou um produto de consumo tal como cuidado de tecidos, produtos de higiene pessoal, produtos de cuidado de beleza e limpeza incluindo essencialmente todos os produtos onde os ingredientes de ambroxano correntemente disponíveis são usados comercialmente, incluindo, mas não se limitando a, produtos AMBROX (Firmenich), Ambroxano (Henkel) AMBROFIX (Givaudan), AMBERLYN (Quest), CETALOX Laevo (Firmenich), AMBERMOR (Aromor) e/ou Éter de Norambrenolídeo (Pacific). A cristalização seletiva de (-)-ambroxano pode ser influenciada pela presença de substrato de homofarnesol não reagido e também pela razão entre (-)-ambroxano e os outros isômeros detectáveis. Mesmo se somente for obtida 10% de conversão do substrato de homofarnesol em (-)-ambroxano, a cristalização seletiva de (-)-ambroxano é ainda possível.

[0070] Os seguintes exemplos não limitantes são proporcionados para ilustrar adicionalmente a presente invenção.

Exemplo 1: Inserção de uma Sequência Líder PelB [0071] Como uma abordagem ao aumento da atividade de enzima de GmSHC, uma sequência líder pelB foi inserida no vetor pET28b(+) contendo

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35/54 ácidos nucleicos codificando GmSHC. Um oligonucleotídeo codificando a sequência líder pelB foi preparado com extremidades compatíveis com Ncol e Ndel para inserção no vetor pET28b(+). O vetor pET28b(+) foi digerido com Ncol e Ndel e usado em uma reação de ligação durante a noite com o oligonucleotídeo de sequência líder pelB. A reação de ligação foi purificada e usada na transformação de E. coli eletrocompetente. Uma amostra aleatória de E. coli transformante resultante foi avaliada por PCR de colônias com iniciadores de oligonucleotídeos complementares “pelB-SHC-Fw” e “pETXhol-Rev” para se determinar se as reações de ligação foram bem-sucedidas. Um clone foi identificado como contendo uma inserção do tamanho correto. A análise da sequência de DNA subsequente confirmou a inserção de uma sequência líder pelB no vetor pET28b(+).

Exemplo 2: Análise da Expressão da Proteína de Fusão PelB-GmSHC [0072] O plasmídeo contendo o clone pelB-GmSHC foi usado para transformar E. coli BL21(DE3) para expressão da proteína de fusão. Após transformação, um clone de colônia única foi isolado e usado para inocular 10 mL de meio LB + canamicina. A cultura de 10 mL foi incubada a 37°C, com agitação a 200 rpm durante a noite. A cultura durante a noite foi usada para inocular um frasco contendo 1 L de meio LB + canamicina, que foi incubado a 37°C, com agitação a 200 rpm durante 6 horas antes da indução. A indução da expressão de proteína foi iniciada pela adição de 1 mL de IPTG a 1 M. Após indução, a temperatura do incubador foi diminuída até 25°C e a cultura foi deixada durante a noite com agitação a 200 rpm. Uma alíquota (1,5 mL) da cultura durante a noite a 25°C foi removida para análise da expressão por SDS-PAGE, a cultura remanescente foi coletada por centrifugação para trabalho adicional. A partir da análise de SDS-PAGE foi observado que uma proteína de fusão pelB-GmSHC do tamanho correto foi expressa.

Exemplo 3: Ensaios de Rastreamento de Célula Inteira [0073] A sequência líder pelB foi incluída para facilitar o transporte

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36/54 da enzima GmSHC para o espaço permiplasmático de E. coli tornando deste modo a enzima GmSHC mais disponível a substratos no ambiente rodeando as células. Conformemente, ensaios de rastreamento foram levados a cabo para analisar a conversão de homofarnesol em ambroxano por suspensões de célula inteira contendo pelB-GmSHC em comparação com GmSHC. As reações incluíram células inteiras, 100 pL de Citrato de Sódio a 1 M, pH 4,9, 100 pL de homofarnesol a 100 mM em Tampão de Solubilização (Tris-Cl a 0,05 M, pH 8,0, MgCl₂ a 0,01 M, TRITON X-100 a 1% v/v) e 800 gL de Tampão de Solubilização. As reações foram incubadas a 37°C, 200 rpm e amostras foram removidas após 16 e 80 horas. As amostras foram extraídas com 2 volumes de n-heptano antes da análise de GC. A % de área de conversão média por mg de célula inteira foi calculada. Os resultados indicaram que, ao passo que as suspensões de células com GmSHC de tipo selvagem proporciona uma área de 0,033% média por mg célula inteira por hora, as suspensões de células com pelB-GmSHC não resultaram em qualquer conversão de homofarnesol em ambroxano. Conformemente, a sequência líder pelB pareceu afetar adversamente a atividade de SHC.

[0074] Como as enzimas SHC são independentes de cofator foi postulado que a GmSHC pode reter a atividade pós-reação. Para se determinar se qualquer atividade foi retida, as células do ponto temporal de 16 horas descritas acima foram removidas e ressuspensas em 0,5 mL de mistura reacional fresca. Estas reações de “2^a passagem” foram depois incubadas a 37°C, 200 rpm durante aproximadamente 64 horas. Após 64 horas, as reações foram extraídas com 2 volumes de n-heptano para análise de GC. A comparação da “I^a passagem” e “2^a passagem” indicou degradação mínima da atividade após exposição repetida a mistura reacional fresca (0,033% na I^a passagem versus 0,037% na 2^a passagem). Conformemente, estes dados indicam que as células inteiras podem ser reusadas/recicladas para realizar conversões repetidas, o que pode provar ser vantajoso para minimizar o custo

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37/54 global do processo.

Exemplo 4: Conversão de Homofarnesol em Ambroxano na Fermentação [0075] Como demonstrado acima, células inteiras expressando GmSHC bioconverteram homofamesol em ambroxano. Conformemente foi determinado se a conversão na fermentação podería ser alcançada. Células expressando GmSHC de tipo selvagem ou SHC de R. palustris (RpSHC; WO 2010/139719) foram cultivadas e expressas do seguinte modo. Culturas iniciadoras de 10 mL (meio B + canamicina, 37°C, 200 RPM) durante a noite das células abrigando ácidos nucleicos codificando GmSHC e RpSHC foram usadas para inocular 1 L de meio LB + canamicina. As culturas de 1 L foram incubadas a 37°C, 200 rpm durante aproximadamente 4 horas. Subsequentemente, 1 mL de IPTG a 1 M foi adicionado às culturas para induzir expressão de proteína SHC e a temperatura de incubação da cultura foi reduzida para 25°C para a incubação durante a noite.

[0076] Para confirmar a expressão de GmSHC e RpSHC, análise por SDS-PAGE foi realizada na cultura de células. Alíquotas (1,5 mL) da cultura durante a noite foram removidas e centrifugadas a 14.500 rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e os péletes de células foram ressuspensos em 200 μΕ de tampão de carga de SDS. As células ressuspensas foram depois aquecidas até 95°C durante 5 minutos. Após uma breve centrifugação, 14.500 rpm durante 10 segundos, amostras das SHC em tampão de carga foram colocadas nos poços de um gel de SDS-PAGE a 420% pré-moldado. Os resultados desta análise indicaram que ambas GmSHC e RpSHC foram expressas.

Após confirmação da expressão de GmSHC e RpSHC, reações em duplicado foram preparadas como proporcionado na Tabela 3.

TABELA 3

Conteúdos da Reação	Conjunto A	Conjunto B
Cultura de Células*	850 pL	850 pL
Citrato de Na a 1 M, pH 4,9	100 pL	100 pL
Homofamesol a 100 mM em Tris-Cl a 0,05 M, pH 8,0, MgClj a 0,01 M, TRITON X-100 a 1% v/v	50 pL	-

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Conteúdos da Reação	Conjunto A	Conjunto B
*Homofarnesol a 100 mM em Citrato de Na a 0,1 M, pH 6,5, Taurodesóxicolato a 2%	-	50 pL

* Emulsão descrita em WO 2010/139719.

[0077] As reações foram preparadas e incubadas a 37°C, 200 rpm. As amostras foram removidas após incubação durante 16 horas e extraídas com 2 volumes de n-heptano para análise de GC. Após 40 horas, a mistura reacional remanescente foi centrifugada para peletizar as células e o sobrenadante foi extraído com 2 volumes de n-heptano para análise GC. As médias da % de área de conversão por hora são apresentadas na Tabela 4.

TABELA 4

Cultura de SHC	Conjunto A	Conjunto B
GmSHC	0,46	0,00
RpSHC	0,10	0,00

[0078] Os resultados apresentados na Tabela 4 demonstram conversão de homofarnesol em ambroxano pelas SHC em meio de cultura de células. Os resultados demonstram também que homofarnesol em TRITON X-100 foi mais prontamente convertido em ambroxano do que uma emulsão em taurodesóxicolato.

Exemplo 5: Desenho Racional de Derivados de GmSHC [0079] Modelação por Homologia. A estrutura tridimensional de GmSHC foi construída usando modelação por homologia. ísep]Os moldes usados foram os cristais 1GSZ (Lenhart, et al. (2002) Chem. Biol. 9: 639-45) e 3SQC (Wendt, et al. (1999) J. Mol. Biol. 286: 175-87), que partilham 44% e 43% de identidade de sequências com 95% da sequência de GmSHC.

[0080] Ancoragem Molecular As representações do estado fundamental de homofarnesol foram depois ancoradas ao centro ativo da estrutura de GmSHC. Isto foi alcançado por definição de uma caixa em grelha 3D centrada no átomo de oxigênio protonado do primeiro dador de prótons. Esta caixa em grelha identifica a área de bolso de centro ativo onde as conformações de substrato serão amostradas durante a operação de ancoragem molecular. Depois, a ancoragem molecular foi realizada usando o

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39/54 algoritmo genético larmackiano (LGA; Morris, et al. (1998) J. Comput. Chem. 19: 1639-62; Morris, et al. (2009) J. Comput. Chem. 30: 2785-91). Um total de 1000 operações de LGA foi levado a cabo por sistema. A população foi 300, o elitismo de GA = 1, o número máximo de gerações foi 27000 e o número máximo de avaliações de energia foi 2500000. Conformemente, para cada operação de LGA, a primeira geração começou com uma população de 300 conformações de substrato aleatórias. A melhor conformação de substrato na corrente população sobrevive automaticamente para a próxima geração (elitismo de GA = 1). Como tal, a população da geração seguinte começa com a conformação de substrato mais ajustada a partir da geração prévia mais outras 299 conformações. A operação de LGA para quando o número de gerações máximas ou avaliações de energia é alcançado. Para cada operação de LGA foi obtida uma conformação de substrato. As conformações de substrato foram depois separadas de acordo com energia e desvio de raiz média quadrada. A estrutura classificada no topo correspondeu à estrutura com energia de ligação mais baixa do agrupamento mais populoso com a energia de ligação média mais baixa.

[0081] Análise Estrutural de SHC e Mecanismo Catalítico. As SHC são proteínas membranares monotópicas integrais que adotam uma disposição 3D dimérica. Cada monômero é caracterizado por oito motivos QW (Sato, et al. (1998) Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 407-11) que conectam estreitamente numerosas hélices α construindo dois domínios de barris α/α altamente estáveis (Wendt, et al. (1999) J. Mol. Biol. 286: 175-87). A cavidade do centro ativo está enterrada dentro dos dois domínios de barris α/α e seu acesso é possível através de um canal hidrofóbico interno. Para AaSHC, o canal e a cavidade do centro ativo estão separados por uma constrição estreita constituída pelos resíduos F166, V174, F434 e C435, que é responsável pelo reconhecimento do substrato (Lenhart, et al. (2002) Chem. Biol. 9: 639-45). Para GmSHC, esses resíduos correspondem a F176, M184,

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F457 e C458. A não ser que indicado de outro modo, a posição dos resíduos de aminoácidos proporcionados no que diz respeito a GmSHC é com referência a SEQ ID NO:2. No topo da cavidade do centro de atividade, os resíduos que constituem o motivo XDD conservado (Wendt, et al. (1999) J. Mol. Biol. 286: 175-87) são observados. Um desses resíduos é D396, o primeiro dador de prótons, que inicia a ciclização por doação de um próton à ligação dupla 2 e 3 (Esquema 2). Em GmSHC, o átomo de oxigênio de D396 está 4,6 Ã a partir do carbono 3 da ligação dupla 2,3.

Hôwlwwol Intermediário Catíônico Ambraxarro

ESQUEMA 2 [0082] O motivo DXDD é seguido por resíduos de triptofano e fenilalanina que são responsáveis por estabilização dos intermediários catiônicos por fortes interações cátion-π (Dougherty (1996) Science 271: 163168). No fundo da cavidade está um resíduo de Glutamato, o último aceitador de prótons, que pode receber um próton do grupo hidroxila e levar ao fecho do terceiro anel e formação do produto, Ambrox. A análise estrutural de GmSHC indica que esta enzima possui dois últimos aceitadores de prótons possíveis. No entanto, de acordo com os resultados da ancoragem, E386 de GmSHC é o mais provavelmente o último aceitador de prótons. A distância entre o oxigênio de hidroxila de homofarnesol e E386 é apenas 3,5 Ã. Claramente, esta disposição do último aceitador de prótons desempenha um papel importante na eficácia catalítica desta enzima.

[0083] Usando o modelo particular foram determinados os resíduos de GmSHC que estabelecem as interações cátion-pi responsáveis pela estabilização do intermediário catiônico e os outros principais resíduos

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41/54 catalíticos. Notavelmente, os resíduos catalíticos importantes são conservados com outras enzimas SHC. As principais diferenças incluem: a) o centro ativo de GmSHC é o resíduo 45; b) o resíduo 184 de GmSHC, em conjunto com os resíduos 176, 457 e 458, é responsável pela constrição estreita entre o canal hidrofóbico e a cavidade do centro ativo, que está associada à seletividade do substrato; e c) o padrão de motivos QW é algo diferente.

[0084] Pontos críticos Estruturais. Com base nos resultados da modelação molecular e ancoragem molecular, os seguintes pontos críticos estruturais foram identificados: resíduos V45, E46, Q54, F176, M184, F457, C458, W179,1278, Q279, T326, F385, E386, D397, F443, F460, F624, F654 e L656.

[0085] Posições Determinadoras da Especificidade e Resíduos Conservados. As posições determinadoras da especificidade indicam que resíduos evoluíram coordenadamente dentro de um subgrupo de proteínas de uma família que partilha uma dada especificidade catalítica. Assim permite seguir o processo evolutivo associado à aquisição de uma diversidade de funções biológicas dentro da mesma família de proteínas. As posições determinadoras da especificidade foram calculadas a partir de um alinhamento de múltiplas sequências contendo 1000 sequências homólogas usando os algoritmos de Xdet. As sequências determinadoras da especificidade de GmSHC são: Y113, V138, R141, F171, E225, E226, D227, Q324, G381,1455, H474, L476, S559, A568, L656 e E679.

[0086] Evolução de GmSHC. Para melhorar a conversão catalítica de homofamesol em ambrox, a GmSHC foi modificada para (1) melhorar o complexo de Michaelis-Menten; (2) introduzir mutações que podem aumentar a estabilização cátion-π do intermediário de carbocátion, com base nos pontos críticos estruturais e de coevolução; (3) abrir a cavidade catalítica por mutação dos resíduos que são somente essenciais para a catálise do substrato nativo com 5 anéis, esqualeno; (4) mutar os resíduos que auxiliam o último

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42/54 aceitador de prótons de modo a facilitar a formação de produto; (5) alterar o centro ativo; (6) mutar resíduos responsáveis pela constrição estreita entre o canal hidrofóbico e a cavidade do centro ativo; (7) e aumentar os motivos QW.

[0087] Variantes de GmSHC desenhadas para melhorar o complexo de Michaelis-Menten e aumenta a estabilização cátion-π do intermediário de carbocátion foram testados silico usando ancoragem molecular. Os resultados desta análise são apresentados na Tabela 5.

TABELA 5

Mutante de SHC	Afinidade Calculada (Kcal/mol)	Comentários
WT	-6,01	—
I278F	-6,30	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons.
V45I	-6,05	Similar a WT.
V45F	-6,38	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons.
L656W	-6,14	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons; Ultimo aceitador de prótons diferente.
L656F	-6,22	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons; Ultimo aceitador de prótons diferente.
W179A	-6,45	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons; Ultimo aceitador de prótons diferente.
I278A	-6,26	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons.
F654Y		Desenhado para aumentar interações cátion-π. Pose de substrato similar a WT.
I278N	-6,43	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons; Mesmo último aceitador de prótons mas a hidroxila do substrato também interage com I278N.
T326N	-6,15	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons; Mesmo último aceitador de prótons agora T326N melhora a polaridade rodeando o último aceitador de prótons.
L656E	-6,06	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons; último aceitador de prótons L656E.
G623A	-6,41	O substrato está mais próximo do primeiro dador de prótons e do último aceitador de prótons.
F460A	-6,13	Abre a parte inferior da cavidade do centro ativo. A pose de substrato é similar a WT.
F443Y	-5,94	Desenhado para aumentar interações cátion-π.
E386H	-6,11	Ultimo aceitador de prótons diferente.

[0088] Mutações adicionais visando cada uma das modificações indicadas acima estão listadas na Tabela 6.

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TABELA 6

Mudança Funcional	Mutação de GmSHC
(1) melhoram o complexo de Michaelis-Menten	V45I
V45L
V45Q
V45A
E46Q
E46A
E46H
Q54E
Q54H
G623A
G623V
F385Y
E386D
E386Q
E386H
E386N
F443I
F443L
F443A
F443V
F443H
F443Y
F624W
F624A
F624Y
L656F
L656Y
L656I
L656W
L656E
L656N
V45Q + L656E
V45L + T326S
T326D + E386T
F385Y + F654Y
(2) introduzem mutações que podem aumentar a estabilização cátion-π do intermediário de carbocátion, com base nos pontos críticos estruturais e de coevolução	F654W
F654A
F654L
F654Y
(1) melhoram o complexo de Michaelis-Menten; e (2) introduzem mutações que podem aumentar a estabilização cátion-π do intermediário de carbocátion, com base nos pontos críticos estruturais e de coevolução	W179A
W179V
(1) melhoram o complexo de Michaelis-Menten; e (4) mutam os resíduos que auxiliam o último aceitador de prótons de modo a facilitar a formação de produto	T326E
T326D
T326S
T326N
T326C
T326N + I278N
(2) introduzem mutações que podem aumentar a estabilização cátion-π do intermediário de carbocátion, com base nos pontos críticos estruturais e de coevolução; (3) abrem a cavidade catalítica por mutação dos resíduos que são somente essenciais para a catálise do substrato nativo com 5 anéis, esqualeno; e (4) mutam os resíduos que auxiliam o último aceitador de prótons de modo a facilitar a formação de produto	I278A
I278V
I278F
I278Y
I278N

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Mudança Funcional	Mutação de GmSHC
(5) alteram o centro ativo	Q178H
Q178E
Q178D
D397C
D397C + D394V + V471C
(6) mutam resíduos responsáveis pela constrição estreita entre o canal hidrofóbico e a cavidade do centro ativo	M184E
M184V
Ml 841
M184C
M184A
(7) e aumentam os motivos QW	R194Q
M305W
S321W
S321F
P412Q
M345W
Outra	W87E
W87V*
E335F
F460A
F460H
F460E
Y658F
W556A
W556V*
Q279V + Q54V
D397C + D394V
F385H + E386A
F385E + E386A
F385Y + F654Y + F443Y

*A partir da literatura.

[0089] Expressão de Enzima Mutante de SHC. Tipo selvagem e os mutantes de GmSHC da Tabela 6 foram individualmente clonados em pET28a(+). Estes constructos de DNA foram transformados em E. coli BL21(DE3) e plaqueados em placas de ágar contendo Canamicina. Estas foram incubadas durante a noite a 37°C. Uma única colônia bacteriana foi escolhida e usada para inocular 500 pL de LB + Canamicina em uma placa de 96 poços. Esta placa foi incubada durante a noite a 37°C com agitação. Estas culturas primárias (10 pL) foram usadas para inocular 10 mL de LB + Canamicina em um tubo falcon de 50 mL, que foi subsequentemente incubado a 37°C a 180 rpm durante cerca de 7 horas. A expressão de proteína foi depois induzida com a adição de IPTG a 1 mM. A temperatura do incubador foi diminuída até 25°C e as culturas adicionalmente incubadas a 180 rpm durante a noite. No dia seguinte, as culturas foram centrifugadas a

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4000 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante descartado. Péletes de células foram expostos a 2 rondas de congelação/descongelação antes do uso no ensaio de reação.

[0090] Pélete de células (1 μΕ) foi manchado em uma membrana de nitrocelulose e foi permitido que secasse ao ar durante 30 minutos. A membrana foi colocada em leite em pó a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação gentil. A membrana foi depois enxaguada com solução salina tamponada com fosfato (PBS), 3x5 minutos. Solução de anticorpo anti-histidina (diluição de 1 em 10.000) foi adicionada e incubada à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação. A transferência foi subsequentemente lavada com PBS, 3x5 minutos. Solução de desenvolvimento (6 mg de diaminobenzidina (DAB) e 5 pL H2O2 a 30% em 10 mL PBS) foi adicionada à transferência. Uma vez desenvolvida, a solução de desenvolvimento foi imediatamente removida e a transferência enxaguada com água.

[0091] Os resultados desta análise indicaram que todos os constructos foram expressos em E. coli BL21 (DE3) a 25°C após a adição de IPTG a 1 mM. Após expressão e processamento das enzimas, uma transferência de ponto foi realizada para avaliar se a introdução de mutações específicas havia alterado a expressão de proteína. Notavelmente, a maioria dos mutantes de GmSHC mostrou níveis similares de expressão em relação ao constructo de GmSHC de tipo selvagem.

[0092] Reações de Rastreamento de Mutantes de SHC. Tampão de citrato de sódio pH 5,3 (volumes iguais de citrato de sódio a 1 M, pH 4,9 e citrato de sódio a 0,1 M, pH 6,5) foi preparado. Taurodesóxicolato (2% p/p no que diz respeito ao substrato de homofamesol) foi depois adicionado ao tampão de citrato de sódio. Subsequentemente, homofamesol (3, 10 ou 15 mg/mL) foi adicionado ao tampão. A emulsão resultante foi transferida para duas placas de 96 poços e incubada a 37°C com agitação durante vários

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46/54 períodos de tempo dependendo da concentração de homofamesol adicionada, i.e., 3 mg/mL de homofarnesol, incubação durante 16 horas; 10 mg/mL de homofamesol, incubações durante 6 e 24 horas; 15 mg/mL de homofamesol, incubações durante 4 e 20 horas. A concentração de Homofamesol foi aumentada e o período de incubação diminuído à medida que o estudo progrediu permitindo diferenças mais aparentes na atividade de SHC entre os mutantes investigados. Para parar a reação e extrair os produtos, um 2X volume de heptano foi adicionado a cada poço. A placa foi depois incubada a 37°C durante 30 minutos com agitação para misturar completamente. A placa foi centrifugada durante 10 minutos a 4000 rpm para peletizar qualquer material celular. A camada orgânica superior foi depois removida e colocada em um frasco limpo de cromatografia gasosa (GC).

[0093] Método de Análise de GC. Um método analítico de GC foi usado para detectar cada um dos materiais de partida e produtos usados nas reações de rastreamento. Devido ao volume de amostras geradas foi desenvolvido um método rápido com um tempo de operação de somente 4,5 minutos. As condições de análise de GC são apresentadas na Tabela 7.

TABELA 7

Componente	Condição
Sistema GC	Autosystem XL da PerkinElmer
Coluna	HP-5 da Agilent (30 m, 0,25 mm x 0,25 pm)
Gás transportador	Hélio
Pressão transportadora	30 psi
Programa de forno	Taxa/°C min-1	T ernperatnra/°C	Manter/min
0	200	1,5
45	225	0,5
Temperatura de injeção	270°C
Detector	FID
Temperatura do detector	270°C
Volume de injeção	1 pL
Volume de seringa	10 pL
Tempo de aquisição de dados	4,5 minutos

[0094] A análise das amostras de reação de mutantes de SHC após a adição de tanto 3 como 10 mg/mL de homofamesol indicou que um número de mutantes/derivados de SHC exibiu atividade melhorada em comparação com a enzima de tipo selvagem. Os mutantes de interesse particular estão

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47/54 listados na Tabela 8.

TABELA 8

Mutação	Aumento médio na produção de ambroxano vs. SHC WT (% de área de pico)
M184A	+21
F624Y	+21
V45L + T326S	+ 18,5
M184L	+ 18,5
E46H	+18
Q54E	+18
R194Q	+ 14,5
F624A	+14
Y658F	+14
G623A	+14
M184I	+13
Q178E	+ 12,5
E46Q	+ 12,5
M184V	+11
F460A	+6

[0095] Os resultados demonstraram que muitas das enzimas alcançaram consumo total do isômero de homofarnesol usado para gerar o ambroxano. Conformemente, análise adicional foi conduzida para identificar uma ou mais enzimas SHC ótimas. Em particular, a carga de substrato foi aumentada para 15 mg/mL e foi permitido que a incubação progredisse durante um período de tempo limitado (z.e., 4 horas e 20 horas). Como mostrado na Tabela 9 existiram múltiplas enzimas mutantes que exibiram atividade mais elevada do que a enzima SHC de tipo selvagem. Em particular, o mutante de SHC F624Y mostrou a atividade mais elevada após 4 horas, ao passo que o mutante de SHC E46Q mostrou a atividade mais elevada após 20 horas. Notavelmente, cada uma das enzimas com mutações na posição 184 (M184L, M184V, Ml841 e Ml84A), que foram desenhadas para afetarem a especificidade de enzima por mudança do canal hidrofóbico que dá acesso ao centro ativo, exibiu um aumento na atividade após um período de incubação mais longo.

TABELA 9

Mutação	4 horas a 37°C	20 horas a 37°C
% de Área de Pico média de ambroxano	Diferença média (% de área de pico)*	% de Área de Pico média de ambroxano	Diferença média (% de área de pico)*
V45L + T326S	48,5	+ 11	68	+20,5
G623A	36	-1,5	74,5	+27
F624Y	55	+17,5	68,5	+21
F624A	33,5	-4	54,5	+7

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Mutação	4 horas a 37°C	20 horas a 37°C
% de Área de Pico média de ambroxano	Diferença média (% de área de pico)*	% de Área de Pico média de ambroxano	Diferença média (% de área de pico)*
F460A	26,5	-11	60,5	+ 13
E46Q	45,5	+8	82,5	+35
M184L	40	+2,5	68	+20,5
M184V	40,5	+3	69	+21,5
M184I	47,5	+ 10	80,5	+33
M184A	34	-3,5	66	+18,5
R194Q	33,5	-4	59	+11,5
Y658F	29	-8,5	51	+3,5
Q178E	48	+10,5	67,5	+20
E46H	32,5	-5	55,5	+8
Q54E	27,5	-10	66	+18,5
Tipo selvagem	37,5	0	47,5	0

* Diferença média na produção de ambroxano vs. SHC de tipo selvagem.

[0096] Adicionalmente ao ambroxano, os mutantes foram também testados quanto à produção de esclareolídeo a partir do ácido homofarsênico. Esta análise indicou que os mutantes G623V, I278V, L335F e Q54E exibiram um aumento na produção de esclareolídeo em comparação com GmSHC de tipo selvagem (Tabela 10).

TABELA 10

Mutação	Aumento médio na produção de esclareolídeo vs. SHC WT (% de área de pico)
L656E	+0,2
V45I	+0,3
V45Q	+0,2
G623A	+0,2
G623V	+ 1,6
I278V	+ 1,7
E386Q	+0,2
L335F	+ 1,6
Q178E	+1
E46H	+1
Q54E	+ 1,4

[0097] A FIG. 2 mostra que após a incubação durante 4 horas somente sete mutantes demonstraram produção mais elevada de ambroxano do que a SHC de tipo selvagem (barras acima da linha tracejada), ao passo que 15 mutantes exibiram atividade mais elevada após a incubação durante 20 horas (FIG. 2). Em particular, os mutantes V45L + T326S, F624Y, E46Q, M184L, M184V, Ml841 e Q178E demonstraram atividade aumentada em ambos os pontos temporais. Adicionalmente a estes sete mutantes, as análises in silico e in vitro indicaram que os mutantes G623A, Q54E, R194Q e M184A tinham também interesse. Conformemente, são proporcionados

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49/54 mutantes de combinação, que exibem efeitos aditivos ou sinérgicos para aumentar a atividade da enzima GmSHC (Tabela 11).

TABELA 11

Mutantes Conjugados
E46Q + M184I	E46Q + M184A	E46Q + M184V
E46Q + M184I + G623A	E46Q + M184I + F624Y + G623A + V45L + T326S	E46Q + M184I + F624Y + G623A
M184I + Q178E	E46Q + F624Y	Q54E + M184I
M184V + Q178E	E46Q + G623A	E46Q + M184I + F624Y
E46Q + M184I + F624Y + R194Q + V45L + T326S + G623A	E46Q + M184I + R194Q	E46Q + M184I + V45L + T326S
E46Q + M184I + F624Y + R194Q	E46Q + M184I + F624Y + R194Q + V45L + T326S	E46Q + M184L
Q54E + R194Q	Q54E + E46Q	Q54E + M184I + F624Y
Q54E + M184I + V45L + T326S	Q54E + M184I + F624Y + T326S	Q54E + E46Q + M184I + F624Y
Q54E + R194Q + V45L + T326S	Q54E + E46Q + M184I + V45L + T326S	Q54E + M184I + V45L + T326S + F624Y

[0098] Quando mutantes de combinação selecionados foram incubados com 50 mg/mL de homofarnesol durante 20 horas foi descoberto que cada um dos mutantes exibiu um aumento na atividade em comparação com GmSHC de tipo selvagem (Tabela 12). Foram observados similares quando os mutantes de combinação foram incubados com 50 mg/mL de homofarnesol durante 6 ou 20 horas à carga de enzima de 25% (FIG. 3).

TABELA 12

Mutação	% de Área de Pico de Ambroxano
Tipo selvagem	18,25
E46Q + M184I + V45L + T326S	21,20
Q54E + M184I	21,86
Q54E + R194Q	21,39
Q54E + E46Q	20,02
Q54E + M184I + F624Y	35,10
Q54E + M184I + V45L + T326S	28,96
Q54E + M184I + F624Y + T326S	21,57

Exemplo 6: Sumário de Derivados de GmSHC [0099] As SHC são proteínas membranares monotópicas integrais que adotam uma disposição 3D dimérica. Cada monômero é caracterizado por motivos QW que conectam estreitamente numerosas hélices α construindo dois domínios de barris α/α altamente estáveis (Wendt et al. (1999) J. Mol. Biol. 286: 175-87). A cavidade do centro ativo está enterrada dentro dos dois domínios de barris α/α e seu acesso é possível através de um canal

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50/54 hidrofóbico interno, que se sugere como sendo a região imersa na membrana da enzima (Lenhart, et al. (2002) Chem. Biol. 9: 639-45). O canal e a cavidade do centro ativo estão separados por uma constrição estreita que é responsável pelo reconhecimento do substrato (Lenhart, et al. (2002) Chem. Biol. 9: 639-45). Para GmSHC, esses resíduos correspondem a Phel76, Metí. 84, Phe457 e Cys458. Os resíduos que constituem o motivo XDD conservado (Wendt et al. (1999) J. Mol. Biol. 286: 175-87) são encontrados no topo da cavidade do centro de atividade. Um desses resíduos é Asp396, o primeiro dador de prótons, que inicia a ciclização de homofarnesol doação de um próton à ligação dupla C2=C3. O motivo DXDD é seguido por resíduos de triptofano, tirosina e fenilalanina que são responsáveis por estabilização dos intermediários catiônicos por fortes interações cátion-π (Dougherty (1996) Science 271: 163-8). No fundo da cavidade está um resíduo negativamente carregado, o último aceitador de prótons, que recebe um próton do grupo hidroxila resultando deste modo no fecho do terceiro anel e formação de ambroxano.

[00100] Para melhorar a conversão de homofarnesol em ambroxano, a GmSHC foi mutada em um ou mais dos resíduos na posição 45, 46, 54, 178, 184, 194, 247, 278, posição 326, 386, 335, 460, 623 e 624 de SEQ ID NO:2. [00101] Posições 45 e 326. De acordo com os cálculos do modelo de homologia de GmSHC e ancoragem molecular, os resíduos V45 e T326 estão colocados próximos do grupo hidroxila do substrato. A posição 45 de GmSHC está mutada em glutamina, leucina ou isoleucina e a posição 326 em serina de modo a aumentar as interações intermoleculares com o substrato. A combinação de ambas estas mutações (V45L + T326S) mostrou um aumento de 1,4 vezes na produção de ambroxano após uma incubação durante 20 horas com 15 g/L de homofarnesol.

[00102] Posições 46, 54 e 386. De acordo com os cálculos do modelo de homologia de GmSHC e ancoragem molecular, os resíduos E46 ou E386

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51/54 funcionam como um último aceitador de prótons, recebendo um próton do grupo hidroxila do substrato. Um alinhamento estrutura entre AaSHC (Reinhert, et al. (2004) Chem. Biol. 11: 121-6) e o modelo de homologia de GmSHC indica que Q54 de GmSHC está sobreposto com o resíduo E45 de AaSHC, que é o último aceitador de prótons desta enzima (Dang & Prestwich (2000) Chem. Biol. 7: 643-9). Portanto, o resíduo 54 de GmSHC foi mutado para glutamato para incorporar um último aceitador de prótons em esta posição, sem ter um efeito negativo na rede de carga associada ao motivo DXDD conservado. O resíduo 46 foi mutado para glutamina, alanina ou histidina, enquanto o resíduo 386 foi mutado para glutamina para mudar a posição do último aceitador de prótons. Quando comparados com a enzima de tipo selvagem, os mutantes com mutações na posição E386 não tiveram nenhum efeito na atividade de enzima. No entanto, as mutações nas posições E46 e Q54 mostraram ambas um aumento na conversão de homofamesol em ambroxano. Após uma incubação durante 20 horas de 15 g/L de homofamesol, os mutantes E46Q e E46H exibiram respectivamente uma melhoria de 1,8 vezes e 1,2 vezes na atividade, ao passo que o mutante Q54E exibiu uma melhoria de 1,4 vezes na atividade em comparação com a enzima de tipo selvagem.

[00103] Posição 178. Um alinhamento estmtural entre o modelo de homologia de GmSHC e a lanosterol sintase humana homóloga (Thoma, et al. (2004) Nature 432: 118-22) indica que Q178 de GmSHC está sobreposto com o resíduo H232 da lanosterol sintase humana, que é o último aceitador de prótons desta enzima. Portanto, o resíduo 178 de GmSHC foi mutado para glutamato para incorporar um último aceitador de prótons em esta posição. A introdução desta mutação aumentou a conversão de homofamesol em ambroxano em 1,4 vezes em comparação com a enzima de tipo selvagem.

[00104] Posição 184. O resíduo Ml84 está colocado em constrição estreita, que é responsável pelo reconhecimento do substrato (Lenhart, et al.

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52/54 (2002) Chem. Biol. 9: 639-45). Assim, para alterar o reconhecimento do substrato, Ml 84 de GmSHC foi mutado para aminoácidos não polares, i.e., Leucina, Isoleucina, Valina e Alanina. Por mutação esta posição, qualquer fenômeno de oxidação de metionina é também prevenido, o que podería afetar negativamente o reconhecimento do substrato. Foi observado que a mutação de Ml84 em qualquer uma de Leu, Ile, Vai ou Ala resultou em um aumento na atividade. Notavelmente, o mutante Ml841 exibiu o maior aumento, com uma melhoria de 1,7 vezes na conversão de homofamesol em ambroxano.

[00105] Posição 194. Os motivos QW conectam firmemente as hélices α contribuindo para a construção de dois barris α/α. Estes barris α/α altamente estáveis protegem a enzima contra a liberação de energia associada à reação catalisada altamente exergônica. De acordo com o modelo de homologia de GmSHC, o resíduo R194 está colocado próximo do resíduo W152. Portanto, o resíduo 194 foi mutado para glutamina de modo a introduzir um novo motivo QW com W152, aumentando deste modo a estabilidade estrutural da enzima. Experimentalmente, esta mutação mostrou melhorias na conversão com uma melhoria de 1,3 vezes na conversão de homofamesol em ambroxano.

[00106] Posição 247. De acordo com o modelo de homologia de GmSHC, o resíduo P247 está colocado em uma alça à entrada do canal, que se sugere como sendo a região imersa na membrana da enzima. O resíduo P247 foi mutado para um resíduo diferente de prolina para mudar a dinâmica do canal em esta região. Quando testado no mutante de combinação, V45L + T326S + M184I + R194Q, foi observada uma melhoria de 2,7 vezes na conversão quando incubado com 50 g/L de homofamesol à carga de enzima de 40%.

[00107] Posição 278. De acordo com os cálculos do modelo de homologia de GmSHC e ancoragem molecular, o resíduo 1278 está colocado imediatamente por baixo do grupo hidroxila do substrato. Quando o resíduo 1278 é mutado para valina, os cálculos de ancoragem molecular indicam que o

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53/54 arranjo do substrato dentro do centro ativo melhora por colocação da ligação dupla C2=C3 do substrato mais próxima de D396, o primeiro dador de prótons. A mutação do resíduo 1278 não mostrou quaisquer melhorias na conversão de homofamesol; no entanto, quando a enzima foi incubada com ácido homofarnêsico, a conversão de ácido em esclareolídeo mostrou uma melhoria de 2 vezes quando comparada com a enzima de tipo selvagem quando testada à carga de substrato de 10 g/L e carga de enzima de 100%.

[00108] Posição 335. De acordo com os cálculos do modelo de homologia de GmSHC e ancoragem molecular, o resíduo L335 está colocado próximo do resíduo D396, o primeiro dador de prótons e, quando mutado para fenilalanina, pode introduzir uma forte interação cátion-π com o intermediário catiônico do substrato. As mutações em esta posição proporcionaram uma melhoria de 1,8 vezes no que diz respeito à conversão de ácido homofarnêsico em esclareolídeo.

[00109] Posição 460. De acordo com o modelo de homologia de GmSHC, o resíduo F460 de GmSHC é um resíduo na cavidade do centro ativo próximo da constrição estreita que é responsável pelo reconhecimento do substrato (Lenhart, et al. (2002) Chem. Biol. 9: 639-45). O resíduo F460 foi mutado para alanina para aumentar o acesso do substrato à cavidade do centro ativo. Como resultado, esta mutação mostrou uma melhoria de 1,3 vezes quando reagida com homofamesol à carga de substrato de 15 g/L.

[00110] Posição 623. De acordo com os cálculos do modelo de homologia de GmSHC e ancoragem molecular, o resíduo G623 está posicionado próximo do grupo hidroxila do substrato. Conformemente, o resíduo G623 foi mutado para alanina ou valina para aumentar as interações intermoleculares com o substrato. Enquanto o mutante G623A mostrou uma melhoria de 1,6 vezes na produção de ambroxano na presença de 15 g/L de homofamesol, o mutante G623V exibiu uma melhoria de 1,9 vezes na conversão de ácido homofarnêsico em esclareolídeo.

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54/54 [00111] Posição 624. De acordo com os cálculos do modelo de homologia de GmSHC e ancoragem molecular, o resíduo F624 estabiliza uma forte interação cátion-π, estabilizando o intermediário catiônico. Portanto, o resíduo F624 foi mutado para tirosina ou triptofano para introduzir uma interação cátion-π ainda mais forte com o intermediário catiônico do substrato. Quando esta posição foi alterada para triptofano foi obtida uma melhoria de 1,45 vezes na produção de ambroxano a partir de homofarnesol.

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico codificando Esqualeno Hopeno Ciclase (SHC), a sequência de aminoácidos da qual é SEQ ID NO:2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2.
2. 2. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a SHC compreende uma substituição de aminoácido, em relação à SEQ ID NO:2, na posição 45, 46, 54, 86, 139, 142, 178, 184, 194, 239, 278, 326, 335, 386, 455, 460, 603, 623, 624, 656, 658 ou uma sua combinação.
3. 3. Célula hospedeira recombinante, caracterizado pelo fato de compreende o vetor recombinante como definido na reivindicação 1.
4. 4. Esqualeno Hopeno Ciclase (SHC) recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2 e compreende uma substituição de aminoácido, em relação à SEQ ID NO:2, na posição 45, 46, 54, 86, 139, 142, 178, 184, 194, 239, 278, 326, 335, 386, 455, 460, 603, 623, 624, 656, 658 ou uma sua combinação.
5. 5. Método para produção de ambroxano, caracterizado pelo fato de que compreende (a) proporcionar homofamesol a uma célula hospedeira recombinante que expressa Esqualeno Hopeno Ciclase (SHC), a sequência de aminoácidos da qual é SEQ ID NO:2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2, e (b) coletar ambroxano produzido pela SHC.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o homofamesol é proporcionado na presença de um agente solubilizante.

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7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente solubilizante compreende um tensoativo não iônico.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o homofamesol compreende (3E,7E) homofamesol.