CN109402100B - 一种新型角鲨烯何帕烯环化酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种新型环化酶，该环化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的环化酶可催化角鲨烯转化生成hopene，在催化水解36h后，使大部分的角鲨烯得以转化，体现了该环化酶在hopene制备上的潜能。

Description

一种新型角鲨烯何帕烯环化酶及其应用

技术领域

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种新型角鲨烯何帕烯环化酶 及其应用。

背景技术

角鲨烯何帕烯环化酶(squalene-hopene cyclase，EC 5.4.99.17)在何帕烷类 生物合成过程中起着十分重要的作用。它进行相当复杂的异构化反应或合成酶 反应,最后使角鲨烯转化成为何帕烯,数年来它一直是有机化学家所致力研究的 对象。同甾醇类物质生物合成的环化反应及其它相似的三萜系化合物环化反应 相比,何帕烷生物合成的环化反应是生物化学中最为复杂的反应,它涉及到5个 环的形成,13个共价键的变化和9个立体结构中心体的形成等。

何帕烷类化合物种类繁多，其中很多已被报道出具有抗炎、抗菌等生理活 性，而何帕烯为何帕烷类化合物生物合成过程中的共同前提物质。目前由于何 帕烯结构复杂还无法实现化学法的合成。从原生菌株或植物中直接提取何帕烷 类化合物存在提取量低，药品消耗大的难题。所以使用酶法转化角鲨烯生成何 帕烯是一种高效、绿色的合成方法。但是目前所发现的角鲨烯何帕烯环化酶 (SHC)均为膜附着蛋白，在制备角鲨烯何帕烯环化酶过程中复杂的分离纯化 方式十分限制其大规模的应用。因此寻找新型SHC，将其应用于何帕烯的制备 中，显得至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型非膜结合的角鲨烯何帕烯环化酶，以及利 用该酶高效的转化效率来制备天然何帕烯的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种环化酶，该环化酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)在1)中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的，具有 1)中环化酶功能的酶；

编码上述环化酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明再一个方面提供一种重组表达载体，该重组表达载体携带有编码上 述环化酶的基因；

本发明还提供重组宿主，用于重组表达上述的环化酶；

本发明的环化酶通过环化反应，转化角鲨烯来制备何帕烯。

进一步的，所述环化反应的最适pH为7.0,温度为30℃,乳化剂为Tween 80。

进一步的，所述环化反应中角鲨烯浓度为20mM,反应时间为36h,加酶 量为0.12-0.16mg/mL。

本发明的环化酶为非膜结合的蛋白，可以直接使用镍柱纯化，避免了膜蛋 白纯化过程中复杂的程序。除此之外，可转化角鲨烯生成何帕烯，在催化36h 后，使大部分的角鲨烯得以转化，从简单的制备方法和较高的转化效率体现了 该环化酶在何帕烯制备上的潜能。

附图说明

图1:本发明的SaSHC催化角鲨烯转化何帕烯的GC/GC-MS结果图；其中a 为反应产物GC检测图，b为hopene裂解示意图，c为GC-MS检测反应产物离 子碎片分布图；

图2：本发明的SaSHC进化树分析图(a)及多重序列比对示意图(b)；

图3：本发明的SaSHC的SDS-PAGE电泳图。泳道M是蛋白Marker，泳道 1是表达后菌体破碎液上清，泳道2是表达后菌体破碎液沉淀，泳道3是纯化 后的SaSHC；

图4：SaSHC最适反应条件优化；其中图a是SaSHC最适温度，图b是SaSHC 的最适pH，图c是表面活性剂对SaSHC活力的影响；

图5：SaSHC异源表达后不结合在膜上验证实验的SDS-PAGE电泳图(a) 和环化验证的GC图(b)。

图6：体现SaSHC的最适反应时间为36h的图。

图7：体现SaSHC的最适底物浓度为20mM的图。

图8：体现SaSHC的最适加酶量为0.14mg/mL图。

图9：GC法检测何帕烯合成图。

具体实施方式

本发明用到了分子生物学和酶催化领域使用的常规技术和方法，下面将结 合实施例和附图对该发明进行详细的描述，但保护范围并不仅限于此。

实施例1：新型角鲨烯何帕烯环化酶的来源及异源表达

对Streptomyces albolongus ATCC 27414进行全基因组测序后，通过cluster 分析出具有产生何帕烯的基因簇同时基因测序后也标注出了在合成何帕烷途径 中的关键基因shc，其蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；编码基因的核苷酸序 列为SEQ ID NO:2。之后对这个基因进行异源表达进一步确认其功能，载体使 用pET-his(+)，宿主采用Escherichia coli BL21(DE3)plySs。

对上述工程菌进行诱导发酵，发酵结束后，50mL发酵液离心去除上清， 菌体先利用0.9％NaCl溶液进行冲洗，后使用10mL Tris-HCl缓冲液(100mM， pH 8.0)进行复溶，并于冰浴下进行超声破碎。破碎液上清用于环化角鲨烯功 能的验证，水解反应体系如下：20mM角鲨烯，破碎冻干的酶粉，2mL pH 7.0 100mM磷酸盐缓冲液。将反应混合液置于30℃摇床中震荡孵育36h后，使 用萃取液(正己烷)进行反复抽提，并进行GC/GC-MS检测产物何帕烯是否生 成。结果(图1)显示，SaSHC具有环化squalene生成hopene的能力

实施例2：环化酶SaSHC基因序列分析

环化酶SaSHC的家族分类，使用文献已报道的方法来进行，使用MEGA 6.0 软件构建环化酶SaSHC与其他家族环化酶的进化树，Clustal X软件用于对环化 酶进行多序列比对，ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)用于比对 序列的输出。如图2a所示，SaSHC属于ISOPREN_C2_家族，并具有典型的环 化酶保守序列和催化活性位点DXDDTA和QW序列。在蛋白质水平上，本发 明的环化酶与已报道蛋白的同源性仅为70％。

实施例3：SaSHC的纯化

重新对SaSHC进行诱导发酵，发酵结束后，通过离心收集菌体，并使用灭 菌生理盐水清洗菌体一次。清洗结束后，使用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0) 复溶菌体，并置于超声波细胞粉碎机上进行超声破碎，破碎液上清用于SaSHC 的纯化。该纯化过程采用镍柱(1mL，Qiagen，Hilden，Germany)来进行，蛋 白的梯度洗脱使用含有不同浓度咪唑(20mM-500mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，100mM)。洗脱后的溶液分别进行收集，并使用超滤浓缩管(～30kDa) 进行浓缩脱盐，并进行蛋白电泳分析及squalene-hopene cyclase酶活检测。

上述环化酶SaSHC的蛋白凝胶电泳结果如图3所示，条带M是蛋白 marker，条带1是菌体破碎液上清，条带2是菌体破碎液沉淀，条带3是纯化 后的SaSHC。

由于SaSHC非膜结合的特点，异源表达后使用一步镍柱纯化即可得到高纯 度的蛋白，避免了膜蛋白复杂的纯化过程，从而可以大大降低成本。

实施例4：环化酶SaSHC酶学性质研究

经实施例3纯化后的SaSHC，用作酶学性质研究。

(1)SaSHC最适温度

SaSHC的最适温度，通过在不同温度(20，30,40,50,60℃)下孵育反应， 并检测何帕烯产量来确定。最适温度下的活性定义为100％，其他温度下的活 性以对最高活性的百分比表示。由结果(图4a)可以看出，温度<30℃时， 随着温度的升高，环化酶活性逐渐升高，温度>30℃后，随着温度升高，环 化酶活性逐渐降低，SaSHC的最适温度为30℃。

(3)SaSHC最适pH

pH对SaSHC活性的影响，使用不同pH的不同缓冲液来检测。该过程使 用的缓冲液包括：100mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0-6.0)，100mM磷酸钠缓冲液 (pH 6.0-8.0)，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)和100mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.0-10.0)。最适pH下的活性定义为100％，其他pH下的活性以百 分比来表示。结果(图4b)显示，SaSHC在pH为7的磷酸盐缓冲液中显示出 最高的活性。

(4)表面活性剂对SaSHC活性的影响

为了检测表面活性剂对SaSHC的影响，我们通过向反应液中添加不同的表 面活性剂(终浓度0.5％)来测定，其中使用的试剂包括：Triton X-100，Tween 20，Tween 60和Tween 80。反应液中未添加表面活性剂时测得的活性定义为 100％，添加了表面活性剂的以百分比表示。结果如图4c所示，通过与未添加 表面活性剂的样品对比，发现Triton X-100、Tween 20和Tween 80都对SaSHC 酶活的提高具有促进作用，其中Tween 80对SaSHC环化活性的提高最大，提 高了23.5％，Tween 60则对SaSHC的活性具有显著的抑制效果。

(5)金属离子对酶活的影响

金属离子对SaSHC活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为1mM和10mM的金属离子(CoCl₂，KCl，NaCl，FeSO₄，CuSO₄，MnCl₂，CaCl₂，MgCl₂， ZnCl₂和NiCl₂)以及Na₂-EDTA来测定。未添加金属离子和Na₂-EDTA的作为 对照，其活性定义为100％，结果如下表1所示。

表1：金属离子对酶活的影响表

实施例5：SaSHC异源表达后不结合在膜上

重新发酵SaSHC，离心收集大肠杆菌，使用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)复溶菌体，并置于超声破碎机下进行破碎处理。破碎后的液体10000rpm 在4℃条件下离心20min,之后的上清100000×g在4℃条件下离心1h,之 后获得的各个组分进行SDS-PAGE和冷冻干燥。冷冻干燥之后再进行环化验证， 验证结果进行GC分析，结果如图5所示。S1，P1分别为超声破碎后，低速离 心后的上清与沉淀，S2,P2分别为S1进行超速离心后上清与沉淀。在各个组分 反应后的GC结果中显示，SaSHC异源表达后不结合在膜上。

与之前报道的SHC相比，本发明的SaSHC表现出了非膜结合的特性，使 SHC被更深入的了解。除此之外，传统的膜结合蛋白纯化方式复杂，对工艺要 求较高，并且在纯化后活性大概减弱为原来的1/10。与之相比，非膜结合的蛋 白纯化方式更为简便，活性损失小，使大规模工业化应用成为可能。对于大规 模生成hopene突破何帕烷类化合物获取瓶颈具有重要的意义。

实施例6：SaSHC最适反应时间。

制备大量的SaSHC用于环化条件的研究，分别使用0.02-0.1mg/mL浓度 的酶粉在30mM底物浓度的条件下进行环化反应，分别在0h,2h,6h,8h,12h, 24h,36h,48h分别取样使用GC检测何帕烯产量。由于产物不稳定，时间成为 生成高质量何帕烯的重要因素。结果如图6所示，综合考虑产量和反应时间， 36h被选为最适反应时间进行接下来的实验

实施例7：SaSHC底物浓度。

制备大量的SaSHC用于环化条件的研究，分别使用0.5-50mM浓度的角 鲨烯作为底物进行环化反应,36h后取样使用GC检测何帕烯产量。结果如图7 所示，综合比较角鲨烯的转化率以及何帕烯的产量。我们选择20mM浓度的底 物进行接下来的反应。

实施例8：SaSHC加酶量。

为了继续提升角鲨烯的转化率，0.08-0.16mg/mL不同浓度的加酶量被用于环化实验，36h后取样使用GC检测何帕烯产量。结果如图8所示，实验发现0.14 mg/mL浓度的酶可以使20mM的角鲨烯转化率达到99％以上。

实施例9：扩大反应体系验证。

为鉴定SaSHC工业化应用潜力，将实验体系放大50倍检验环化效果，通 过离心去掉破碎液沉淀后，破碎液上清进行冷冻干燥，制得的SaSHC酶粉用于 环化角鲨烯的研究。反应体系如下：20mM角鲨烯，0.5％Tween 80，2mL磷 酸盐缓冲液，0.14mg/mL酶粉(100mL反应体系)。将反应混合液置于30℃ 水浴摇床中震荡反应，分别于6h、12、24、30、36、48、54、60、72h下取 样使用GC法检测何帕烯合成情况，结果如图9所示，反应体系扩大后最适的 反应时间依旧为36h,何帕烯产量为8.07mg/mL。

扩大规模实验结果表明，SaSHC在大规模应用时性质稳定，并且由于体系 变大接触更加充分，转化效果较小试相比也有所提升。这是首次报道利用SHC 环化角鲨烯生产hopene达到了克级水平。进一步证明了非膜结合的SaSHC在 工业化大规模应用的潜质。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言， 可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变 化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种新型角鲨烯何帕烯环化酶及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 691

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Thr Ala Thr Ala Asp Gly Arg Leu Asp Pro Glu Tyr Asp Pro Glu

1 5 10 15

Pro Ala Ala Val Gly Glu Arg Pro Pro Val Thr Asp Arg Leu Thr Gly

20 25 30

Arg Gln Thr Thr Val Ala Thr Ala Pro Ala Pro Gly Ala Gly Arg Arg

35 40 45

Gln Ala Glu Gly Pro Glu Arg Ser Gly Pro Leu Asp Pro Ala Gln Ala

50 55 60

Leu Ala Arg Ala Thr Ala Glu Leu Leu Ser Arg Gln Ser Pro Asp Gly

65 70 75 80

Trp Trp Lys Gly Asp Leu Glu Thr Asn Val Thr Met Asp Ala Glu Asp

85 90 95

Leu Leu Leu Arg Gln Phe Leu Gly Ile Arg Glu Pro Glu Gln Thr Ala

100 105 110

Ala Thr Ala Ala Trp Ile Arg Ser Gln Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp

115 120 125

Ser Thr Phe Tyr Gly Gly Pro Pro Glu Leu Ser Thr Thr Val Glu Ala

130 135 140

Tyr Val Ala Leu Lys Leu Ala Gly Asp Asp Pro Gly Ala Pro His Met

145 150 155 160

Ala Ala Ala Ala Arg Tyr Val Arg Glu Arg Gly Gly Ile Ala Ala Ser

165 170 175

Arg Val Phe Thr Arg Ile Trp Leu Ala Leu Phe Gly Trp Trp Pro Trp

180 185 190

Glu Arg Leu Pro Glu Met Pro Pro Glu Ile Ile Phe Leu Pro Arg Trp

195 200 205

Leu Pro Leu Asn Ile Tyr Ala Phe Gly Cys Trp Ala Arg Gln Thr Ile

210 215 220

Val Pro Leu Thr Val Val Ser Ala His Arg Pro Val Arg Pro Ala Pro

225 230 235 240

Phe Asp Leu Thr Glu Leu His Thr Asp Pro Ala Asp Pro Tyr Pro Leu

245 250 255

Arg Pro Leu Ala Pro Pro Thr Gly Trp Asp Gly Val Phe Glu Arg Leu

260 265 270

Asp Leu Val Leu His Ala Tyr His Lys Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg

275 280 285

Arg Ala Ala Leu Ala Gln Ala Gly Arg Trp Ile Val Glu Arg Gln Glu

290 295 300

Ala Asp Gly Cys Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Ala Val Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Ile Ala Leu His Leu Leu Gly Tyr Asp Leu Glu His Pro Val Met Arg

325 330 335

Ala Gly Leu Ala Ala Phe Asp Arg Phe Thr Val His Thr Glu Asp Gly

340 345 350

Arg Arg Trp Leu Glu Ala Cys Gln Ser Pro Val Trp Asp Thr Cys Leu

355 360 365

Ala Thr Ile Ala Leu Arg Asp Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Pro Ala

370 375 380

Leu Val Ser Ala Ala Asp Trp Met Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Pro

385 390 395 400

Gly Asp Trp Ser Val Gln Arg Pro Arg Leu Ala Pro Gly Gly Trp Ala

405 410 415

Phe Glu Phe Glu Asn Asp Asn Tyr Pro Asp Ile Asp Asp Thr Ala Glu

420 425 430

Val Val Leu Ala Leu Lys Arg Val Ala His Pro Asp Arg Ala Arg Ile

435 440 445

Asp Gly Ala Val Arg Arg Gly Val Glu Trp Asn Leu Gly Met Gln Ser

450 455 460

Arg Asn Gly Ala Trp Gly Ala Phe Asp Val Asp Asn Thr Ser Thr Leu

465 470 475 480

Pro Asn Lys Leu Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Val Asp Pro Pro

485 490 495

Ser Ala Asp Val Thr Ala His Val Val Glu Met Leu Ala Glu Thr Gly

500 505 510

Leu Ala Gly Asp Arg Arg Thr Arg Arg Gly Ile Asp Trp Leu Leu Lys

515 520 525

Asn Gln Glu Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Thr Asn Tyr

530 535 540

Ile Tyr Gly Thr Gly Ser Val Leu Pro Ala Leu Val Ala Ala Gly Ile

545 550 555 560

Pro Gly Ser His Pro Ala Val Arg Arg Ala Val Asp Trp Leu Ala Asp

565 570 575

Arg Gln Asn Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Met Arg Ser Tyr Glu

580 585 590

Asp Pro Val Arg Trp Ser Gly Arg Gly Asp Ser Thr Ala Ser Gln Thr

595 600 605

Ala Trp Ala Leu Met Ala Leu Leu Ala Ala Gly Glu Gly Pro Asp Gly

610 615 620

Ala Arg Ser Glu Val Val Glu Arg Gly Val Gln Trp Leu Cys Arg Thr

625 630 635 640

Gln Leu Pro Ser Gly Ser Trp Asp Glu Pro Gln Phe Thr Gly Thr Gly

645 650 655

Phe Pro Trp Asp Phe Ser Ile Asn Tyr His Leu Tyr Arg Leu Val Phe

660 665 670

Pro Val Thr Ala Leu Gly Arg Tyr Leu His Gly Ser Pro Leu Thr Gly

675 680 685

Gly Gly Ala

690

<210> 2

<211> 2076

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgacagcaa ccgcggacgg ccggctcgac cctgagtacg atcccgagcc ggccgcggtg 60

ggcgaacgcc cgccggtcac ggaccggttg accggccgtc agacgacggt cgcgacggcc 120

cccgcaccgg gggccgggag gcggcaggcc gaggggccgg agcggagcgg tccgctcgat 180

ccggcccagg ccctggcccg ggccaccgcc gagctgttgt cacgccagag cccggacggc 240

tggtggaagg gcgatctgga gaccaacgtc accatggacg ccgaggacct gttactgcgt 300

cagttcctcg gcatccgcga gccggagcag accgcggcca ccgcggcctg gatccgctcc 360

cagcagcgcg aggacggcac ctggtccacc ttctacggcg gcccgcccga actgtccacc 420

accgtcgagg cctacgtcgc gctcaagctc gccggcgacg accccggcgc accgcacatg 480

gccgccgcag cccggtacgt gcgggagcgc ggcggcatcg cggccagccg ggtgttcacc 540

cggatctggc tcgcgctgtt cggctggtgg ccgtgggagc gcctgcccga gatgccgccg 600

gagatcatct tcctgccccg ctggctgccg ctgaacatct acgccttcgg ctgctgggcc 660

cggcagacca tcgtcccgct caccgtggtc tcggcccacc gcccggtccg ccccgccccg 720

ttcgacctca ccgaactgca caccgacccg gccgacccgt acccgctgcg cccgctggcc 780

ccgcccaccg gctgggacgg cgtcttcgag cgcctcgacc tggtcctgca cgcgtaccac 840

aagcgcgccc tgcgcccgct gcgccgggcc gccctggccc aggccggccg ctggatcgtc 900

gaacgccagg aggcggacgg ctgctggggc ggcatccagc cgcccgccgt gtactccctg 960

atcgccctcc acctgctcgg ctacgacctc gaacaccccg tcatgcgggc cgggctggcc 1020

gccttcgacc gcttcaccgt gcacaccgag gacggccgcc gctggctgga ggcctgccag 1080

tccccggtct gggacacctg cctggccacc atcgcgctgc gggacgcggg cctgcccgcc 1140

gaccaccccg cgctggtctc ggccgccgac tggatgctcg ccgaggagat ccgccgcccc 1200

ggcgactggt ccgtccagcg cccgcggctg gcgcccggcg gctgggcctt cgagttcgag 1260

aacgacaact accccgacat cgacgacacc gccgaggtgg tgctcgccct caagcgggtc 1320

gcccacccgg accgggcgcg gatcgacggt gcggtgcggc ggggcgtcga gtggaacctc 1380

ggcatgcagt cgcgcaacgg cgcctggggc gccttcgacg tcgacaacac cagcaccctc 1440

cccaacaaac tgccgttctg cgacttcggc gaggtggtcg acccgccctc ggcggacgtc 1500

accgcgcacg tggtcgagat gctcgccgag accggcctgg ccggggaccg gcggaccagg 1560

cgcggcatcg actggctgct caagaaccag gagccggacg gctcctggtt cggccgctgg 1620

ggcaccaact acatctacgg caccggctcc gtcctgcccg ccctggtggc cgccgggatc 1680

cccggctcgc accccgccgt ccgccgcgcg gtcgactggc tggcggaccg tcagaacccg 1740

gacggcggct ggggcgagga catgcgctcc tacgaggacc cggtccgctg gtccgggcgc 1800

ggcgactcca ccgcctcgca gaccgcctgg gcgctgatgg ccctgctggc ggcgggcgag 1860

gggccggacg gggcgcgcag cgaggtggtc gagcggggcg tccagtggct ctgccgcacc 1920

caactgccca gcggcagctg ggacgagccg cagttcaccg ggacgggctt cccctgggac 1980

ttctcgatca actaccacct gtaccgcctg gtcttccccg tgacggccct cggacggtac 2040

ctgcacggca gtccgctgac gggaggcgga gcatga 2076

Claims (10)

1.一种角鲨烯何帕烯环化酶，其特征在于，所述的环化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的环化酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求2所述的基因。

5.一种重组宿主微生物，其特征在于，所述的重组宿主微生物转化/转染有权利要求4所述的重组表达载体。

6.权利要求5所述的重组宿主微生物在重组表达权利要求1所述的环化酶中的应用。

7.权利要求1所述的环化酶在催化转化角鲨烯制备何帕烯中的应用。

8.一种制备何帕烯的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的环化酶通过环化反应转化角鲨烯来制备何帕烯。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的环化反应的最适pH为7.0,温度为30℃,乳化剂为Tween 80。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的环化反应中角鲨烯浓度为20mM,反应时间为36h,加酶量为0.12-0.16mg/mL。

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