CN110862978B - 一种重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法；步骤为：以Halostella sp.DL‑M4的基因组为模板，pET28a质粒为表达载体构建重组质粒；重组质粒转化大肠杆菌细胞，诱导表达，离心收集菌体进行细胞重悬及破碎，再次离心取上清液，加入β‑巯基乙醇得到混合液过镍柱，酶原与镍介质结合复性，最后经二次除杂蛋白及目标蛋白洗脱、超滤离心浓缩、凝胶过滤层析，得到重组嗜盐古菌蛋白酶；本发明具有良好的通用性，纯化步骤更简单，生产周期更短，获得的蛋白酶纯度高，最终获得比酶活为1159.15U/mg的嗜盐古菌蛋白酶。

Description

一种重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法。

背景技术

蛋白酶是全球工业生产中销售量最高的酶制剂，在洗涤纺织工业、皮革业、食品加工、废弃物处理、生物技术领域均有广泛应用。在高盐食品加工、高盐废水处理等高盐工业生产过程中市售商业蛋白酶易失活，使蛋白酶的使用受到限制，而极端嗜盐古菌分泌的嗜盐古菌蛋白酶，能够在高盐条件保持高水解活性。嗜盐古菌蛋白酶为丝氨酸蛋白酶中类枯草杆菌蛋白酶S8家族成员，多具有耐高盐、耐有机溶剂、耐受多种金属离子和稳定性强等特点，具有广阔的应用前景。与大多数丝氨酸蛋白酶类似，嗜盐古菌蛋白酶基因先转录翻译形成酶原，分泌至胞外，通过顺式或反式的自催化成熟，形成有活性的蛋白酶。

现阶段嗜盐古菌蛋白酶的制备，多采用优化产酶嗜盐古菌菌株培养条件，从发酵液中经多步层析的方法纯化获得。但嗜盐古菌生长较慢、培养基和耐高盐发酵装置成本高、胞外酶表达量低、纯化步骤繁琐等缺点，增加了纯酶的生产成本和生产周期。嗜盐古菌蛋白酶在低盐和无盐条件下多会不可逆的变性失活，纯化过程多依赖高盐环境，使得许多蛋白纯化方法使用受限，如盐析、离子交换层析和疏水层析等。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一；本发明提供一种重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，无需优化产酶条件、大规模培养生长较慢的嗜盐古菌以及摸索繁琐的层析步骤，具有良好的通用性，纯化步骤更简单，生产周期更短，获得的蛋白酶纯度高。

为实现上述目的，本发明采用的具体步骤如下：

一种重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)的制备方法，步骤包括：

(1)含蛋白酶HPDC1基因的重组质粒构建：以嗜盐古菌盐星菌属(Halostella sp.)DL-M4 的基因组为模板，设计特异性引物正向引物F序列、反向引物R序列进行PCR扩增得到目的基因；以pET28a质粒为表达载体；表达载体和目的基因片段通过NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切，然后通过T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒；

所述菌株盐星菌属(Halostella sp.)DL-M4，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC 1.13603，保藏日期为2018年12月06日，菌株分离自大连产盐渍海带(于2017年6月购自镇江凯源超市)；菌株盐星菌属(Halostella sp.)DL-M4的16S rRNA序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)重组质粒转化大肠杆菌细胞，诱导表达，离心收集菌体；将步骤(1)中验证成功的重组质粒转入到大肠杆菌感受态细胞中，将挑选的单克隆菌株在LB培养基中培养一段时间活化后得到培养液，取培养液接种于含有卡那霉素的LB培养基中继续培养，培养至一定OD₆₀₀值时加入诱导剂IPTG，继续培养一段时间，然后，离心收集菌体；

(3)取步骤(2)得到的菌体加入buffer 1溶液进行重悬，重悬后在超声波细胞破碎仪上进行超声破碎，获得细胞破碎液；将细胞破碎液进行离心，然后，取上清液加入β-巯基乙醇，得到混合液；将β-巯基乙醇加入buffer 1溶液中得到平衡液，使用平衡液冲洗镍柱；冲洗后将混合液过镍柱数次，然后将buffer 2溶液加入镍柱洗脱杂蛋白，获得酶原与镍介质结合状态的镍柱；再加入buffer 3溶液冲洗，冲洗后加入buffer 3溶液封存镍柱，在一定温度条件下保存一段时间；保存后将buffer 4溶液加入镍柱洗脱杂蛋白，然后再将buffer5溶液加入镍柱洗脱目标蛋白，洗脱后获得粗纯的嗜盐古菌蛋白酶液；

所述buffer 1溶液为8mol/L尿素、50mmol/L Tris、10mmol/L CaCl₂.、pH 8.0；

所述buffer 2溶液为40mmol/L咪唑、8mol/L尿素、50mmol/L Tris、10mmol/LCaCl₂、 20mmol/L β-巯基乙醇、pH 8.0；

所述buffer 3溶液为4mol/L NaCl、50mmol/L Tris、10mmol/L CaCl₂、pH 8.0；

所述buffer 4溶液为20mmol/L咪唑、4mol/L NaCl、50mmol/L Tris、10mmol/LCaCl₂、 pH 8.0；

所述buffer 5溶液为100～250mmol/L咪唑、4mol/L NaCl、50mmol/L Tris、10mmol/L CaCl₂、 pH 8.0；

(4)将步骤(3)所述的粗纯的嗜盐古菌蛋白酶液超滤离心浓缩，获得浓缩酶液；然后将浓缩酶液通过凝胶过滤层析，得到重组嗜盐古菌蛋白酶，记为HPDC1。

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，步骤(1)中，所述特异性引物正向引物F序列为 5’-ATACCATGGCAAATAATGGCAACCCAT-3’，NcoⅠ酶切位点为CCATGG；反向引物R序列为5’-ATACTCGAGGCCACCGCCGTTGCCGAC-3’，XhoⅠ酶切位点为CTCGAG。

优选的，步骤(2)所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌感受态细胞。

优选的，步骤(2)中所述的单克隆菌株的活化时间为10～12h；所述那霉素在LB培养基中的终浓度为50μg/mL；所述培养液接种的体积为含有卡那霉素的LB培养基体积的1％。

优选的，步骤(2)中所述培养至一定OD₆₀₀值为0.5～0.6；所述诱导剂IPTG加入的终浓度为0.5mM；继续培养温度为37℃；继续培养一段时间为4～6h；所述离心的条件为：温度4℃，转速8000～9000g，时间10～15min。

优选的，步骤(3)中所述混合液过镍柱数次具体为2～3次。

优选的，步骤(3)中所述混合液中β-巯基乙醇的终浓度为15～20mmol/L；所述β-巯基乙醇在平衡液中的终浓度为15～20mmol/L。

优选的，步骤(3)中所述buffer 3溶液冲洗的用量为4～5个柱床体积；所述buffer3溶液封存镍柱的用量为4～5个柱床体积；所述buffer 4溶液洗脱杂蛋白的用量为4～5个柱床体积；所述buffer5溶液洗脱目标蛋白的用量为4～5个柱床体积。

优选的，步骤(3)中所述一定温度为37℃，保存一段时间为22～48h。

优选的，步骤(4)中所述超滤离心浓缩使用截留分子量为10kDa的超滤离心管浓缩。

优选的，步骤(4)中所述凝胶过滤层析使用凝胶柱Superdex 200 10/300 GL进行层析，层析时以buffer 3为流动相。

有益效果：

本发明提出了一种嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，相比于野生型菌株发酵液纯化制备蛋白酶，本发明无需优化产酶条件、大规模培养生长较慢的嗜盐古菌以及摸索繁琐的层析步骤，因此，具有良好的通用性，纯化步骤更简单，生产周期更短，获得的蛋白酶纯度高，最终获得比酶活为1159.15U/mg的嗜盐古菌蛋白酶。

附图说明

图1为本发明制备的重组嗜盐古菌蛋白酶的凝胶过滤层析图。

图2为本发明制备的重组嗜盐古菌蛋白酶的SDS-PAGE电泳图。

图3为本发明制备的重组嗜盐古菌蛋白酶的牛奶平板水解图。

具体实施方式

下面通过实例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不受限于这些实例。

实施例1：

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)的异源表达；

(一)目标基因PCR扩增

用无菌接种环取一环菌株Halostella sp.DL-M4菌体(分离自盐渍海带，保藏于CGMCC 1.13603)于30μL无菌水中，煮沸10min，瞬时离心后取上清为PCR模板；特异性引物正向引物F序列为5’-ATACCATGGCAAATAATGGCAACCCAT-3’，反向引物R序列为 5’-ATACTCGAGGCCACCGCCGTTGCCGAC-3’，下划线序列分别为NcoⅠ酶切位点和XhoⅠ酶切位点。PCR扩增使用酶为KOD-PLUS(购自TOYOBO公司)，扩增体系为50μL。

各成分用量如下：

PCR扩增程序：

(二)电泳验证切胶回收；

以1％琼脂糖凝胶电泳检测产物大小是否正确，使用AxyGEN DNA凝胶回收试剂盒将大小为1.3kb的条带进行胶回收，具体步骤参照产品说明书。

(三)目标基因和载体双酶切和纯化；

将回收后的目标基因和pET28a载体分别于37℃水浴锅使用NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶 (购自Takara公司)双酶切30min。酶切产物再分别使用AxyGEN DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。

(四)连接和转化DH5α；

将纯化后的目标基因和pET28a载体用T4 DNA连接酶(购自Takara公司)16℃连接1h。

连接体系(10μL)：

将上述连接产物以热激的方法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，具体操作参照《分子生物学实验手册》。

(五)PCR验证和质粒提取；

挑取重组子进行PCR验证，引物与目标基因扩增引物相同；用AxyGEN质粒提取试剂盒提取阳性克隆的质粒，测序验证后，保藏正确的菌株。

(六)正确质粒转化到BL21(DE3)；

同样以热激的方法将含有目标基因的质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取重组子进行PCR验证，引物与目标基因扩增引物相同，对阳性克隆进行保藏。

(七)诱导表达；

将单克隆菌株在LB培养基中培养12h活化后得到培养液，按1％接种量接种于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀介于0.5～0.6范围时，加入终浓度为0.5mmol/L 的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，继续培养4h后，于4℃，9000g离心10min收集菌体。

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)的亲和复性层析；

(一)细胞重悬及破碎；

将诱导表达后的菌体重悬于30mL的buffer 1溶液(8mol/L尿素、50mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl₂.、pH 8.0)中；用细胞超声破碎仪破碎细胞；

(二)镍柱与组氨酸标签蛋白亲和层析；

细胞破碎液离心后上清液中加入β-巯基乙醇得到混合液，β-巯基乙醇在混合液中的终浓度为20mmol/L；将β-巯基乙醇加入buffer 1溶液中得到平衡液，使用平衡液冲洗镍柱，待镍柱平衡后，取混合液过镍柱2次，再以10个柱床体积的buffer 2溶液(40mmol/L咪唑、8mol/L 尿素、50mmol/L Tris、10mmol/L CaCl₂.20mmol/L β-巯基乙醇、pH 8.0)加入镍柱洗脱杂蛋白；

(三)酶原与镍介质结合复性；

洗脱杂蛋白后，以5个柱床体积的buffer 3溶液(4mol/L NaCl、50mmol/L Tris、10mmol/L CaCl₂.、pH 8.0)置换镍柱内的溶液，使柱内保留5个柱床体积的buffer 3溶液，在酶原与镍介质结合的状态下，37℃培养箱保温24h，使蛋白酶完全复性；

(四)镍柱上二次除杂蛋白及目标蛋白洗脱；

蛋白酶完全复性后，以5个柱床体积的buffer 4溶液(20mmol/L咪唑、4mol/LNaCl、 50mmol/L Tris、10mmol/L CaCl₂.、pH 8.0)加入镍柱洗脱杂蛋白；然后再以5个柱床体积的buffer 5溶液(100mmol/L咪唑、4mol/L NaCl、50mmol/L Tris、10mmol/L CaCl₂.、pH8.0) 加入镍柱洗脱目标蛋白，洗脱后获得粗纯的嗜盐古菌蛋白酶液；

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)的凝胶过滤层析；

(一)超滤浓缩；

将步骤(4)所述的粗纯的嗜盐古菌蛋白酶液使用截留分子量为10kDa的Millipore超滤管浓缩至600μL，获得浓缩酶液；

(二)凝胶过滤层析

浓缩酶液使用Superdex 200 10/300 GL进行纯化，以buffer 3(4mol/L NaCl、50mmol/L Tris、 10mmol/L CaCl₂.、pH 8.0)为流动相，得到高纯度的重组嗜盐古菌蛋白酶，紫外280吸收峰图；如图1所示，其峰图为单一峰，说明纯化后蛋白分子量大小均一，获得的重组蛋白酶纯度高。

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)的检测；

(一)SDS-PAGE电泳；

利用10％丙烯酰胺分离胶、5％丙烯酰胺浓缩胶，具体操作参照《分子生物学实验手册》。经SDS-PAGE电泳检测纯度及表观分子量，结果如图2所示。1、2、3泳道分别为蛋白酶亲和复性层析后、分子筛上样前、经分子筛分离后的峰收集液，它们均在46kDa附近有明显的单一条带，说明经过亲和复性层析后能够得到纯度较高的蛋白酶，再经凝胶过滤层析进步纯化去除小分子肽和咪唑等成分，最终获得表观分子量为46kDa的嗜盐古菌蛋白酶。

(二)水解实验；

利用含5％脱脂奶粉的高盐平板，滴加10μL酶液，于37℃培养箱放置8h，观察是否产生水解圈，验证酶液的蛋白水解能力。其中标号1、2、3、4分别为蛋白酶亲和复性层析后样品、分子筛上样前样品和2管经分子筛分离后的峰收集液样品，1、2、3、4均能产生明显水解圈，如图3所示，说明经过亲和复性层析后可获得有活性的蛋白酶，并且在进一步的纯化中一直保持蛋白水解活性，最终获得了有活性的高纯度的嗜盐古菌蛋白酶。

(三)酶活测定；

蛋白酶活性测定参照福林酚试剂法，以2％干酪素为底物，在3mol/L NaCl、50mmol/L Tris、 pH 8.0缓冲液中，37℃反应30min，加入10％的三氯乙酸终止反应，室温静置30min后离心。以1：5：1添加上清液、0.4mol/L的Na₂CO₃溶液和33.3％的福林酚试剂，40℃水浴20min 显色后，10,000g离心10min，取上清在680nm的波长下测定吸光值。

酶活定义：在一定条件下每min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。

同时使用上海碧云天生物技术有限公司的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；经过测定，结果显示所制备的嗜盐古菌蛋白酶HPDC1的比酶活为1159.15U/mg。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1

MSNNGNPSWSRRSFIKATGTMGAIGALSGVSSATPGRSPGPREDEILVGVSAASTMDDVQTQVERDIPDDAEVVHRNETLGYMAVRLPDRAGTQARDSVKSAMENRNGVRYAEDNSTHHPLAEPNDPRFNDQYAP QQVNAPAAWDTTLGSESVTVAVVDQGVKYDHPDLADQFGSNKGRDFVDNDGDPYPTDLQNEYHGTHV AGIAAATTNDGTGVAGISNSRLLSARALGDGGGSTADIADAVQWATDQGADVINMSLGGGGYTNTMKNA VSYATNNGALVICAAGNNGSRGVSYPAGYDETVAVSALDQNENLADFSQYGDKIDVAAPGVDVLSAWTT SDYNRISGTSMACPAAAGVAALGKAVDSSLSATELRQHLKQTAVDVGLSSDQQGSGRVDAGNIVGNGGG

重组嗜盐古菌蛋白酶(HPDC1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2

atgtcaaataatggcaacccatcatggtcacgacgatcgtttatcaaagcaaccggtacgatgggggcgataggcgccctcagcggtgt ctcctcggcaaccccggggagatctcccggtccacgggaggacgagatcctcgtcggcgtctccgcagcgtcgacgatggatgacgttcaga cacaggtcgagcgagatattccggacgatgcggaggtcgttcaccggaacgagacgctcggttacatggcggtacgactgccggatcgcgc gggcacgcaggcacgcgattcggtgaaatccgcgatggaaaaccgaaacggcgtccgatacgcggaggacaactcgacccatcacccgct ggccgaaccgaacgacccccggttcaacgaccagtacgcgccccagcaggtcaacgcgcccgcggcctgggacaccacactcggctccg agagcgtcaccgtcgccgtggtcgaccagggagtcaaatacgaccaccccgacctggccgaccagttcgggagcaacaagggacgtgactt cgttgacaacgacggcgatccgtaccccacggacctacaaaacgaatatcacggtactcacgtcgccggcatcgccgcggcgacgacgaac gacggcacgggcgtcgcgggcatcagcaactcgcgcctcctctcggcccgagcgctcggagatggcggcggatccactgcggacatcgcc gacgcggtgcagtgggccaccgaccagggcgcggacgtgatcaacatgtccctgggtggcggcggctacacgaacacgatgaaaaacgcc gtctcctacgcgacgaacaacggtgcgctcgtcatctgtgcggccggtaacaacggctcccgcggcgtctcctaccccgcggggtacgacga gaccgtcgccgtctccgcgctggaccagaacgagaacctcgcggacttctcacagtacggagacaagatcgacgtcgccgcgccgggcgtg gacgtcctctccgcctggaccaccagcgactacaaccggatctccggtacctcgatggcctgtccggccgccgccggcgtcgccgcgctcgg caaagcggtggactcgtcgctgtccgcaacggaactgcgccagcacctcaaacagaccgcggtcgacgtgggactctccagcgaccagcaa gggtccggccgagtcgacgccggaaacatcgtcggcaacggcggtggc

嗜盐古菌盐星菌属(Halostella sp.)DL-M4的16S rRNA序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3

attccggttgatcctgccggaggccattgctatcggggtccgatttagccatgctagtcgcacgagtttagactcgtggcgaatagctccg taacacgtggccaaactaccctctggagcgggataacctcgggaaactgaggctaataccgcatacggctctccgccttgaacggcctgagcc ggaaatgctccggcgccagaggatgtggctgcggccgattaggtagacggtggggtaacggcccaccgtgccgataatcggtacgggttgtg agagcaagaacccggagacggtatctgagacaagataccgggccctacggggcgcagcaggcgcgaaacctttacactgcacgccagtgc gataaggggaccccgagtgcgagggcatatagccctcgcttttgtacaccgtactgaggtgtacgaataaggactgggcaagaccggtgcca gccgccgcggtaataccggcagtccaagtgatggccgctattattgggcctaaagcgtccgtagccggccaggcaagttcgtcgggaaatcca cctgctcaacaggtgggcgtccggcgaaaactgtctggctagggaccggaagacccgaggggtacgtccagggtaggagtgaaatcctataa tcctggacggaccaccggtggcgaaagcgcctcgggaagacggatccgacggtgagggacgaaagcttgggtcacgaaccggattagata cccgggtagtccaagctgtaaacgatgctcgctaggtgtggcacaggctacgagcctgtgctgtgccgcagggaagccgcgaagcgagccg cctgggaagtacgtctgcaaggatgaaacttaaaggaattggcgggggagcactacaaccggaggagcctgcggtttaattggactcaacgcc ggacatctcaccagctccgacagtagcagtgacgatcagtgtgatgagcttatcagagctactgagaggaggtgcatggccgccgtcagctcg taccgtgaggcgtcctgttaagtcaggcaacgagcgagacccgcactcctaattgccagcatgacccttgaggttgatgggtacattaggagga ctgccacagccaatgtggaggaaggaacgggcaacggtaggtcagtatgccccgaatgagctgggcgacacgcgggctacaatggccgag acagtgggatgcaaccccgaaaggggacgctaatctccgaaactcggtcgtagttcggattgagggctgaaactcgccctcatgaagctggatt cggtagtaatcgcgcctcagaagggcgcggtgaatacgtccctgctccttgcacacaccgcccgtcaaagcacccgagtgaggtccggatga aaccgtctctgacggctgaatctgggcttcgcaagggggcttaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaatctgcggctggatcacctcct

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 409

<212> PRT

<213> 嗜盐古菌蛋白酶氨基酸序列(Halophilic archaea )

<400> 1

Met Ser Asn Asn Gly Asn Pro Ser Trp Ser Arg Arg Ser Phe Ile Lys

1 5 10 15

Ala Thr Gly Thr Met Gly Ala Ile Gly Ala Leu Ser Gly Val Ser Ser

20 25 30

Ala Thr Pro Gly Arg Ser Pro Gly Pro Arg Glu Asp Glu Ile Leu Val

35 40 45

Gly Val Ser Ala Ala Ser Thr Met Asp Asp Val Gln Thr Gln Val Glu

50 55 60

Arg Asp Ile Pro Asp Asp Ala Glu Val Val His Arg Asn Glu Thr Leu

65 70 75 80

Gly Tyr Met Ala Val Arg Leu Pro Asp Arg Ala Gly Thr Gln Ala Arg

85 90 95

Asp Ser Val Lys Ser Ala Met Glu Asn Arg Asn Gly Val Arg Tyr Ala

100 105 110

Glu Asp Asn Ser Thr His His Pro Leu Ala Glu Pro Asn Asp Pro Arg

115 120 125

Phe Asn Asp Gln Tyr Ala Pro Gln Gln Val Asn Ala Pro Ala Ala Trp

130 135 140

Asp Thr Thr Leu Gly Ser Glu Ser Val Thr Val Ala Val Val Asp Gln

145 150 155 160

Gly Val Lys Tyr Asp His Pro Asp Leu Ala Asp Gln Phe Gly Ser Asn

165 170 175

Lys Gly Arg Asp Phe Val Asp Asn Asp Gly Asp Pro Tyr Pro Thr Asp

180 185 190

Leu Gln Asn Glu Tyr His Gly Thr His Val Ala Gly Ile Ala Ala Ala

195 200 205

Thr Thr Asn Asp Gly Thr Gly Val Ala Gly Ile Ser Asn Ser Arg Leu

210 215 220

Leu Ser Ala Arg Ala Leu Gly Asp Gly Gly Gly Ser Thr Ala Asp Ile

225 230 235 240

Ala Asp Ala Val Gln Trp Ala Thr Asp Gln Gly Ala Asp Val Ile Asn

245 250 255

Met Ser Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Thr Met Lys Asn Ala Val

260 265 270

Ser Tyr Ala Thr Asn Asn Gly Ala Leu Val Ile Cys Ala Ala Gly Asn

275 280 285

Asn Gly Ser Arg Gly Val Ser Tyr Pro Ala Gly Tyr Asp Glu Thr Val

290 295 300

Ala Val Ser Ala Leu Asp Gln Asn Glu Asn Leu Ala Asp Phe Ser Gln

305 310 315 320

Tyr Gly Asp Lys Ile Asp Val Ala Ala Pro Gly Val Asp Val Leu Ser

325 330 335

Ala Trp Thr Thr Ser Asp Tyr Asn Arg Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala

340 345 350

Cys Pro Ala Ala Ala Gly Val Ala Ala Leu Gly Lys Ala Val Asp Ser

355 360 365

Ser Leu Ser Ala Thr Glu Leu Arg Gln His Leu Lys Gln Thr Ala Val

370 375 380

Asp Val Gly Leu Ser Ser Asp Gln Gln Gly Ser Gly Arg Val Asp Ala

385 390 395 400

Gly Asn Ile Val Gly Asn Gly Gly Gly

405

<210> 2

<211> 1227

<212> DNA

<213> 嗜盐古菌蛋白酶核苷酸序列(Halophilic archaea )

<400> 2

atgtcaaata atggcaaccc atcatggtca cgacgatcgt ttatcaaagc aaccggtacg 60

atgggggcga taggcgccct cagcggtgtc tcctcggcaa ccccggggag atctcccggt 120

ccacgggagg acgagatcct cgtcggcgtc tccgcagcgt cgacgatgga tgacgttcag 180

acacaggtcg agcgagatat tccggacgat gcggaggtcg ttcaccggaa cgagacgctc 240

ggttacatgg cggtacgact gccggatcgc gcgggcacgc aggcacgcga ttcggtgaaa 300

tccgcgatgg aaaaccgaaa cggcgtccga tacgcggagg acaactcgac ccatcacccg 360

ctggccgaac cgaacgaccc ccggttcaac gaccagtacg cgccccagca ggtcaacgcg 420

cccgcggcct gggacaccac actcggctcc gagagcgtca ccgtcgccgt ggtcgaccag 480

ggagtcaaat acgaccaccc cgacctggcc gaccagttcg ggagcaacaa gggacgtgac 540

ttcgttgaca acgacggcga tccgtacccc acggacctac aaaacgaata tcacggtact 600

cacgtcgccg gcatcgccgc ggcgacgacg aacgacggca cgggcgtcgc gggcatcagc 660

aactcgcgcc tcctctcggc ccgagcgctc ggagatggcg gcggatccac tgcggacatc 720

gccgacgcgg tgcagtgggc caccgaccag ggcgcggacg tgatcaacat gtccctgggt 780

ggcggcggct acacgaacac gatgaaaaac gccgtctcct acgcgacgaa caacggtgcg 840

ctcgtcatct gtgcggccgg taacaacggc tcccgcggcg tctcctaccc cgcggggtac 900

gacgagaccg tcgccgtctc cgcgctggac cagaacgaga acctcgcgga cttctcacag 960

tacggagaca agatcgacgt cgccgcgccg ggcgtggacg tcctctccgc ctggaccacc 1020

agcgactaca accggatctc cggtacctcg atggcctgtc cggccgccgc cggcgtcgcc 1080

gcgctcggca aagcggtgga ctcgtcgctg tccgcaacgg aactgcgcca gcacctcaaa 1140

cagaccgcgg tcgacgtggg actctccagc gaccagcaag ggtccggccg agtcgacgcc 1200

ggaaacatcg tcggcaacgg cggtggc 1227

<210> 3

<211> 1471

<212> DNA

<213> 嗜盐古菌盐星菌属DL-M4 序列(Halophilic archaea )

<400> 3

attccggttg atcctgccgg aggccattgc tatcggggtc cgatttagcc atgctagtcg 60

cacgagttta gactcgtggc gaatagctcc gtaacacgtg gccaaactac cctctggagc 120

gggataacct cgggaaactg aggctaatac cgcatacggc tctccgcctt gaacggcctg 180

agccggaaat gctccggcgc cagaggatgt ggctgcggcc gattaggtag acggtggggt 240

aacggcccac cgtgccgata atcggtacgg gttgtgagag caagaacccg gagacggtat 300

ctgagacaag ataccgggcc ctacggggcg cagcaggcgc gaaaccttta cactgcacgc 360

cagtgcgata aggggacccc gagtgcgagg gcatatagcc ctcgcttttg tacaccgtac 420

tgaggtgtac gaataaggac tgggcaagac cggtgccagc cgccgcggta ataccggcag 480

tccaagtgat ggccgctatt attgggccta aagcgtccgt agccggccag gcaagttcgt 540

cgggaaatcc acctgctcaa caggtgggcg tccggcgaaa actgtctggc tagggaccgg 600

aagacccgag gggtacgtcc agggtaggag tgaaatccta taatcctgga cggaccaccg 660

gtggcgaaag cgcctcggga agacggatcc gacggtgagg gacgaaagct tgggtcacga 720

accggattag atacccgggt agtccaagct gtaaacgatg ctcgctaggt gtggcacagg 780

ctacgagcct gtgctgtgcc gcagggaagc cgcgaagcga gccgcctggg aagtacgtct 840

gcaaggatga aacttaaagg aattggcggg ggagcactac aaccggagga gcctgcggtt 900

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atgagcttat cagagctact gagaggaggt gcatggccgc cgtcagctcg taccgtgagg 1020

cgtcctgtta agtcaggcaa cgagcgagac ccgcactcct aattgccagc atgacccttg 1080

aggttgatgg gtacattagg aggactgcca cagccaatgt ggaggaagga acgggcaacg 1140

gtaggtcagt atgccccgaa tgagctgggc gacacgcggg ctacaatggc cgagacagtg 1200

ggatgcaacc ccgaaagggg acgctaatct ccgaaactcg gtcgtagttc ggattgaggg 1260

ctgaaactcg ccctcatgaa gctggattcg gtagtaatcg cgcctcagaa gggcgcggtg 1320

aatacgtccc tgctccttgc acacaccgcc cgtcaaagca cccgagtgag gtccggatga 1380

aaccgtctct gacggctgaa tctgggcttc gcaagggggc ttaagtcgta acaaggtagc 1440

cgtaggggaa tctgcggctg gatcacctcc t 1471

Claims (9)

1.一种重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建重组质粒：以嗜盐古菌盐星菌属（Halostella sp.）DL-M4的基因组为模板，设计特异性引物正向引物F序列、反向引物R序列进行PCR扩增得到目的基因；以pET28a质粒为表达载体；表达载体和目的基因片段通过NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切，然后通过T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒；所述菌株盐星菌属DL-M4的保藏编号为CGMCC 1.13603；

所述特异性引物正向引物F序列为5’-ATACCATGGCAAATAATGGCAACCCAT-3’， NcoⅠ酶切位点为CCATGG；反向引物R序列为5’-ATACTCGAGGCCACCGCCGTTGCCGAC-3’， XhoⅠ酶切位点为CTCGAG；

（2）将步骤（1）中验证成功的重组质粒转入到大肠杆菌感受态细胞中，将挑选的单克隆菌株在LB 培养基中培养一段时间活化后得到培养液，取培养液接种于含有卡那霉素的 LB培养基中继续培养，培养至一定OD₆₀₀值时加入诱导剂IPTG，继续培养一段时间，然后，离心收集菌体；

（3）取步骤（2）得到的菌体加入buffer 1溶液进行重悬，重悬后进行超声破碎，获得细胞破碎液；将细胞破碎液进行离心，然后，取上清液加入β-巯基乙醇，得到混合液；将β-巯基乙醇加入buffer 1溶液中得到平衡液，使用平衡液冲洗镍柱；冲洗后将混合液过镍柱数次，然后将buffer 2溶液加入镍柱洗脱杂蛋白，获得酶原与镍介质结合状态的镍柱；再加入buffer 3溶液冲洗，冲洗后加入buffer 3溶液封存镍柱，在一定温度条件下保存一段时间；保存后将buffer 4溶液加入镍柱洗脱杂蛋白，然后再将buffer 5溶液加入镍柱洗脱目标蛋白，洗脱后获得粗纯的嗜盐古菌蛋白酶液；所述buffer 1溶液为8 mol/L尿素、50 mmol/LTris、10 mmol/L CaCl₂、pH 8.0；所述buffer 2溶液为40 mmol/L咪唑、8 mol/L尿素、50mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl₂、20 mmol/L β-巯基乙醇、pH 8.0；所述buffer 3溶液为4mol/L NaCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl₂、pH 8.0；所述buffer 4溶液为20 mmol/L咪唑、4 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl₂、pH 8.0；所述buffer 5溶液为100~250 mmol/L咪唑、4 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl₂、pH 8.0；

（4）将步骤（3）所述的粗纯的嗜盐古菌蛋白酶液超滤离心浓缩，获得浓缩酶液；然后将浓缩酶液通过凝胶过滤层析，得到重组嗜盐古菌蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌感受态细胞。

3.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的单克隆菌株的活化时间为10~12 h；所述卡 那霉素在 LB培养基中的终浓度为50 μg/mL；所述培养液接种的体积为含有卡那霉素的 LB培养基体积的1%。

4.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述培养至一定OD₆₀₀值为 0.5~0.6；所述诱导剂IPTG加入的终浓度为0.5mM；继续培养温度为37℃；继续培养一段时间为4~6h；所述离心的条件为：温度4℃，转速8000~9000 g，时间10~15min。

5.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述混合液过镍柱数次具体为2~3次；所述混合液中β-巯基乙醇的终浓度为15~20 mmol/L；所述β-巯基乙醇在平衡液中的终浓度为15~20 mmol/L。

6.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述buffer 3溶液冲洗的用量为4~5个柱床体积；所述buffer 3溶液封存镍柱的用量为4~5个柱床体积；所述buffer 4溶液洗脱杂蛋白的用量为4~5个柱床体积；所述buffer5溶液洗脱目标蛋白的用量为4~5个柱床体积。

7.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述一定温度为37℃，保存一段时间为22~48h。

8.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述超滤离心浓缩使用截留分子量为10 kDa的超滤离心管浓缩。

9.根据权利要求1所述的重组嗜盐古菌蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述凝胶过滤层析使用凝胶柱Superdex 200 10/300 GL进行层析，层析时以buffer 3溶液为流动相。

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