CN103266137B - 一种角鲨烯的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种角鲨烯的生产方法，即一种将角鲨烯合成酶基因进行克隆并在大肠杆菌中共表达，从而构建了能合成角鲨烯的重组菌株的方法。本发明提供的角鲨烯的生产方法简单、高效，构建得到的大肠杆菌工程菌能高产角鲨烯，可广泛应用于角鲨烯的发酵生产，提高角鲨烯产量，从而有利于角鲨烯的大规模应用。

Description

一种角鲨烯的生产方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种角鲨烯的生产方法，即一种角鲨烯的生物合成方法，以及构建的重组菌株。

技术背景

角鲨烯是一种脂质不皂化物，最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Sqμalene，其化学名称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜，具有提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质。

作为角鲨烯主要来源的深海鲨鱼鱼肝油，需要捕杀大量深海鲨鱼才能获得，由此便引来一系列问题，如成本高，大量无节制地捕杀鲨鱼使得鲨鱼数量减少，鲨鱼病原体感染导致病原体感染人类，没有一个严格的生产标准等。随着科技的发展，从橄榄油等植物中提取角鲨烯也是目前获得角鲨烯的另一工艺方法。但是单位高成本的问题并没有解决，使得角鲨烯的价格居高不下，导致角鲨烯和角鲨烷(角鲨烯的全氢化衍生物)目前只是小规模市场应用，如手表润滑剂、药品/营养品、化妆品、香水和高价产品的化学中间体。因此，寻求一种生物合成角鲨烯的方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种角鲨烯的生产方法，即一种将角鲨烯合成酶基因进行克隆并在大肠杆菌中共表达，从而构建了能合成角鲨烯的重组菌株，弥补现有技术的不足。

本发明一方面提供了一种角鲨烯的生物合成方法，包括下列步骤：

1）构建携带有角鲨烯合成酶基因的表达载体；

2）以大肠杆菌为宿主菌株，转化步骤1）得到的表达载体，获得重组表达角鲨烯合成酶的大肠杆菌工程菌；

3）发酵培养上述步骤2）得到的大肠杆菌工程菌，生产角鲨烯。

其中的角鲨烯合成酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；核苷酸序列为SEQ IDNO:2。

本发明另一方面提供了一种生产角鲨烯的大肠杆菌工程菌，为大肠杆菌BL21-SQS（Escherichia coli BL21-SQS），已于2013年6月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013246。

本发明提供的角鲨烯的生产方法简单、高效，构建得到的大肠杆菌工程菌能高产角鲨烯，可广泛应用于角鲨烯的发酵生产，提高角鲨烯产量，从而有利于角鲨烯的大规模应用。

附图说明

图1：本发明使用的SQS-pET28a(+)质粒的遗传图谱。

图2：BL21-SQS菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图。

其中：泳道1为BL21-pET28a(+)（阴性对照）菌体胞内蛋白；泳道2为BL21-SQS菌体胞内蛋白；箭头所指条带为角鲨烯合成酶。

图3：BL21-SQS菌体胞内代谢产物HPLC分析图谱。

其中：A为角鲨烯标准品分析图谱；B为BL21-SQS菌体胞内代谢产物分析图谱；箭头所指的峰表明菌体胞内代谢产物中含有角鲨烯。

图4：BL21-SQS菌体胞内代谢产物MS质谱分析图谱。

其中：A为角鲨烯标准品分析图谱；B为BL21-SQS菌体胞内目标产物分析图谱；箭头所指的峰表明目标产物为角鲨烯。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1角鲨烯合成酶表达载体的构建

为了使角鲨烯合成酶基因能够更高效的在大肠杆菌中进行转录，首先对印度人参基因组中角鲨烯合成酶基因GenBank Accession NO.GΜ732820的密码子进行了优化，经过长期的研究后获得了核苷酸序列为SEQ ID NO:2的角鲨烯合成酶基因，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1。序列为SEQ ID NO:2的基因核苷酸片段由上海英潍捷基生物科技有限公司合成作为扩增的模板。

设计基因片段两边酶切位点BamHI和EcoRI。分别利用引物F：

5′-CGCGGATCCATGGGCACCCTGCGTGCAAT-3′和引物R:

5′-CCGGAATTCTTAATTCGGCTCGCTGCGAATCA-3′进行PCR扩增，PCR扩增条件：95℃，10min；95℃，30S；55℃，30S，30个循环；72℃，1.5min；72℃，10min。

将PCR扩增产物与大肠杆菌表达质粒pET28a(+)，经BamHI和EcoRI双酶切，37℃酶切过夜后，酶切产物琼脂糖胶回收纯化。以酶切PCR产物与酶切质粒pET28a(+)摩尔浓度6:1的设计连接体系，加入1μl T4连接酶，20℃连接4h，将连接产物加入50μl大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s转化。加入1ml LB培养基，37℃复壮1h，收集菌体涂布于卡那霉素抗性筛选LB平板中，37℃培养过夜。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，序列分析正确后，新质粒命名为SQS-pET28a(+)，质粒图谱如图1所示。

实施例2角鲨烯合成酶重组表达工程菌的构建

将阳性转化子于LB培养基中37℃，200rpm培养8h，收集菌体，提质粒SQS-pET28a(+)，4℃保存待用。

制备大肠杆菌E.coli BL21转化感受态细胞，加入SQS-pET28a(+)质粒，混匀，冰浴放置30min，42℃热击90s进行转化；加入1ml LB培养基，37℃复壮1h，收集菌体涂于卡那霉素浓度为50μg/ml的抗性筛选LB平板中，37℃培养过夜。菌落PCR验证目的基因SQS，构建得到大肠杆菌重组菌株。

将重组菌株在LB发酵培养基中37℃、220rpm发酵培养过夜；隔日转接新鲜LB培养基，37℃培养2h；加终浓度为1mM IPTG，28℃诱导6h；离心收集菌体，溶于400μl超纯水中，超声破碎，SDS-PAGE分析检测重组菌胞内蛋白表达情况，实验结果如图2所示。已知角鲨烯合成酶蛋白分子量为45kDa，图3中重组菌胞内蛋白所在泳道2与阴性对照泳道1相比，在45kDa左右多出一条蛋白条带，即箭头所指位置，说明角鲨烯合成酶在重组大肠杆菌胞内得到了有效表达。

取发酵液1L，离心收集重组菌体；加入200ml20%KOH乙醇溶液（乙醇与水的体积比为70：30），50℃、200rpm裂解4h；加入等体积正己烷，25℃、200rpm混匀1h；室温静置20min，取上清浓缩。HPLC检测条件：流动相甲醇：乙腈体积比为60：40，柱温30℃，流速1.0ml/min。实验结果如图3所示，A为角鲨烯标准品，在13.5min出现一HPLC吸收峰，B为重组菌体胞内代谢产物，在相同的时间也出现了一吸收峰（即箭头所指位置），说明重组菌体胞内代谢产物中可能存在角鲨烯。进一步将上述两个HPLC吸收峰分别进行MS质谱分析，结果如图4所示，重组菌体胞内目标产物（B图）的分子量与角鲨烯标准品（A图）的分子量相同，说明该目标产物就是角鲨烯，从而也说明本发明构建的大肠杆菌工程菌株可以在体内合成天然产物角鲨烯。多个重组菌的表达产物分析结果也证明了本发明方法的可靠性。

从重组菌中筛选出角鲨烯产量最高的重组菌株命名为大肠杆菌BL21-SQS(Escherichia coli BL21-SQS)，并于2013年6月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013246。大肠杆菌BL21-SQS经传代培养，传代后的菌株还能保持原始菌株的角鲨烯产量。

Claims (3)

1.一种角鲨烯的生物合成方法，其特征在于，所述的合成方法是在大肠杆菌中表达外源的角鲨烯合成酶，再用构建的重组菌株发酵制备角鲨烯；其包括如下的步骤：

1)构建携带有角鲨烯合成酶基因的表达载体；

2)以大肠杆菌为宿主菌株，转化步骤1)得到的表达载体，获得重组表达角鲨烯合成酶的大肠杆菌工程菌；

3)发酵培养上述步骤2)得到的大肠杆菌工程菌，生产角鲨烯；

其中角鲨烯合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的角鲨烯的生物合成方法，其特征在于，所述的角鲨烯合成酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种生产角鲨烯的大肠杆菌工程菌，其保藏编号为CCTCC NO:M2013246。