CN115851863B - 一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用,所述方法为通过对来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶进行改造,利用酶催化方法选择性合成了ent‑isocopalane型海绵烷骨架化合物1和2,所述应用为将化合物1和2用于两种海绵烷天然产物和一种杂萜化合物的化学酶法合成中。本发明合成了光学纯的ent‑isocopalane型化合物,为发现新型萜类化合物、丰富萜类天然产物化合物库提供了重要的先导化合物资源。本发明将酶催化的萜类环化反应与选择性化学转化相结合的两阶段合成策略还可应用于具有相似结构的大量二萜、杂萜类天然产物及其类似物的发散式合成,为这些天然产物的构效关系研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程和天然产物的化学-酶法合成领域,尤其涉及一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用。
背景技术
海绵烷类二萜化合物是从dictyoceratida海绵目和dendroceratida海绵目中分离出来的一类天然产物。该家族成员以6-6-6-5四环体系为特征,或是其重排衍生物。海绵烷二萜具有广泛的生物活性,包括抗肿瘤、抗病毒、抗真菌和抗炎活性。(+)-isoagatholactone是首个被分离鉴定的海绵烷二萜天然产物,可以抑制HeLa细胞的生长(IC50=10μg/mL)。(+)-Spongia-16-one是从澳大利亚海绵Dictyodendrilla cavernosa和新西兰海绵Chelonaplysilla violacea等生物体中分离出来的一种海绵烷二萜天然产物,它是各种ent-isocopalane型海绵烷二萜化合物的重要前体,具有中等的抗肿瘤活性(对L1210和KB细胞系的IC50分别为5.0和9.2μg/mL)。
由于海绵烷类二萜化合物独特的分子结构和重要的生物活性,目前已经开发了几种化学方法以合成海绵烷类二萜化合物。这些合成策略多为化学半合成,例如,1981年,从天然产物迈诺醇出发,Rúveda课题组通过8步化学转化合成了(+)-isoagatholactone(Imamura,P.M,et.al);1983年,Nakano课题组以消旋的黄脂酸为起始化合物,以8.1%的总产率、通过5步化学转化合成了消旋产物(±)-isoagatholactone(Nakano,T.,et.al);1984年,Ungur课题组通过酸催化的二环乙酸酯的环化反应、以3步转化合成了(+)-isoagatholactone(Vlad,P.F.,et.al);1996年,Zaragoza课题组从松香酸出发,以20步化学转化完成了(+)-isoagatholactone的合成(Abad,A.,et.al);2016年,Zeng课题组通过8步化学转化完成了(+)-isoagatholactone对映异构体的合成(Ren,J.,et.al);1996年,Roberts课题组以自由基串联环化反应为关键步骤、通过15步化学转化完成了消旋产物(±)spongia-16-one的全合成(Pattenden,G.,et.al);2001年,Demuth课题组发展了一条以光催化的自由基串联环化反应为关键步骤的(±)spongia-16-one的仿生合成策略,其总产率为11%(Goeller,F.,et.al)。这些策略的主要缺点是合成路线长、立体选择性适中、氧化还原经济性较差。基于此,海绵烷二萜的构效关系研究非常有限。
除海绵烷二萜化合物外,自然界还存在一类包含ent-isocopalane型萜类结构和α-吡喃酮结构的杂萜天然产物。这类天然产物普遍具有生物活性,包括抗胆碱酯酶活性、抑制乙酰辅酶A/胆固醇酰基转移酶的活性、抗分枝杆菌、杀虫和细胞毒性等。这些杂萜天然产物的化学合成策略主要有三种:第一种为仿生合成策略,首先立体选择性构建含有环氧结构的多烯底物,然后利用路易斯酸催化的多烯串联环化反应构建C3-OH萜类骨架;第二种合成策略是利用Wieland-Miescher酮等衍生化后通过C-C键形成反应进行模块化组装,由于这种方法需要在十氢萘环骨架上进行多步化学转化,因此合成效率较低;第三种合成策略是手性元策略,香紫苏内酯和香紫苏醇由于具有与真菌杂萜类天然产物相同的反式十氢萘环结构和手性中心,是合成这类天然产物合适的起始原料,但是需要对C3位进行羟基化。已知的化学方法对香紫苏内酯的碳-氢键官能团化以C2位官能团化产物为主;而利用生物转化的方法虽然可以实现香紫苏内酯的C3位羟基化,但仍存在区域选择性差、过度氧化等问题。
2020年,Renata课题组以香紫苏醇为底物,利用生物催化的C-H键氧化和基于自由基的交叉偶联反应相结合的策略,通过11步转化首次完成了chavone A的合成。
海绵烷二萜天然产物与α-吡喃酮杂萜化合物的化学合成策略具有一定的相似之处:(1)两类化合物都可以采取手性元策略,从其他具有相似骨架的萜类化合物出发,通过官能团的转换、碳碳键的形成以及环化反应,实现复杂环系的构建和新的手性中心的引入;(2)两类化合物也可以采用仿生合成策略,由多烯底物经由碳正离子或自由基串联环化反应实现多环体系的构建,产物手性中心的立体化学由底物的手性中心和反应过渡态的构象决定;(3)两类化合物也可以通过逆合成分析切断为结构更为简单的二环单元,通过碳碳键形成反应进行汇聚式连接。
但是,这些合成策略具有一些缺点:(1)手性元策略中所采用的其他萜类化合物往往需要经过多步官能团转换才能得到关键反应前体,使合成路线变得冗长;(2)利用多烯串联环化的仿生合成策略需要引入手性环氧等官能团,并在环化后还原所产生的羟基,增加了不必要的合成步骤,违背了步骤经济性和氧化还原经济性原则;(3)碳正离子或自由基介导的多烯串联环化反应虽然能够获得目标化合物,但是非对映选择性往往不够理想;(4)无论何种策略都难以避免苛刻的反应条件、较低的产率和选择性等化学合成中常见的问题。此外,通过天然来源提取的方式分离纯化海绵烷二萜天然产物与α-吡喃酮杂萜化合物步骤繁琐、总收率低、提取成本高且极易造成环境的破环,难以可持续。这些因素限制了海绵烷二萜天然产物与α-吡喃酮杂萜化合物的结构类似物的合成与生物活性的研究。
因此,现有技术还有待改进,发展更为高效、高选择性的发散性合成策略具有重要意义。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用,通过提供一类海绵烷骨架化合物的酶催化合成方法,以及萜类天然产物的化学-酶法合成方法,旨在解决目前难以高效、高选择性合成海绵烷二萜天然产物与α-吡喃酮杂萜化合物的问题。
本发明采用的技术方案如下:
一种海绵烷骨架化合物的制备方法,其中,所述海绵烷骨架化合物由野生型角鲨烯环化酶或其突变体催化底物香叶基香叶醇生成;所述突变体发生突变的氨基酸位点为角鲨烯环化酶第261位的异亮氨酸,所述异亮氨酸突变为甘氨酸、苏氨酸或天门冬酰胺中的其中一种。
所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其中,所述海绵烷骨架化合物为ent-isocopalane型骨架化合物1和2,所述ent-isocopalane型骨架化合物结构式如1或2所示:
所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其中,所述野生型角鲨烯环化酶的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示,氨基酸序列如SEQ.ID NO 2所示。
所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其中,所述制备方法包括步骤:
构建AacSHC模板质粒;
对所述AacSHC模板质粒进行定点突变,构建AacSHC突变体重组质粒;
将所述AacSHC模板质粒以及AacSHC突变体重组质粒分别转入大肠杆菌中,表达并纯化AacSHC蛋白,分别得到野生型AacSHC蛋白以及突变体AacSHC蛋白;
通过体外酶催化实验筛选所述突变体AacSHC蛋白,筛选得到突变体AacSHC-I261G/T/N;
利用野生型AacSHC蛋白或者突变体AacSHC-I261G/T/N催化底物香叶基香叶醇,进行海绵烷骨架化合物的体外酶催化合成,获得所述海绵烷骨架化合物。
所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其中,将来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶基因AacSHC克隆至质粒pET28a上,构建得到所述AacSHC模板质粒;对所述AacSHC模板质粒进行定点突变,选择角鲨烯环化酶活性中心的氨基酸残基I261进行突变,构建AacSHC突变体重组质粒。
所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其中,通过体外酶催化实验筛选所述AacSHC蛋白的具体步骤为:将野生型AacSHC蛋白或突变体AacSHC蛋白加入到含有香叶基香叶醇的反应缓冲液中,置于50℃,120rpm摇床中进行酶催化反应;通过GC-MS分析AacSHC蛋白催化香叶基香叶醇的产物分布情况并进行筛选。
一种海绵烷骨架化合物,其中,所述海绵烷骨架化合物如上任一所述的制备方法制备得到,所述海绵烷骨架化合物为ent-isocopalane型骨架化合物,所述ent-isocopalane型骨架化合物结构式如1或2所示:
一种如上所述的海绵烷骨架化合物在合成海绵烷二萜天然产物以及α-吡喃酮杂萜化合物中的应用。
所述的应用,其中,所述海绵烷二萜天然产物包括(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one,所述α-吡喃酮杂萜化合物为3-deoxychevalone A,其结构式如下所示:
所述的应用,其中,所述海绵烷二萜天然产物(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one的合成方法为:以ent-isocopalane型骨架化合物1为底物,通过烯丙位氧化反应、氧化环化反应合成所述(+)-isoagatholactone,所述(+)-isoagatholactone经氢化反应转化为所述(+)-spongian-16-one;
所述α-吡喃酮杂萜化合物3-deoxychevalone A的合成方法为:以ent-isocopalane型骨架化合物2为底物,通过Swern氧化反应、[3+3]环加成反应和基于氢原子转移氢化反应合成所述3-deoxychevalone A。
有益效果:本发明提供了一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用,通过对来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶活性口袋中261位异亮氨酸的改造,获得了能催化香叶基香叶醇选择性合成ent-isocopalane型化合物1和2的突变体;通过体外酶催化反应,实现了由线性底物香叶基香叶醇到光学纯的ent-isocopalane型骨架化合物的制备;进一步利用2-3步化学转化,获得了两种海绵烷天然产物及一种杂萜化合物。与现有技术相比,本发明合成了光学纯的ent-isocopalane型化合物,为发现新型萜类化合物、丰富萜类天然产物化合物库提供了重要的先导化合物资源。本发明将酶催化的萜类环化反应与选择性化学转化相结合的两阶段合成策略还可应用于具有相似结构的大量二萜、杂萜类天然产物及其类似物的发散式合成,为这些天然产物的构效关系研究奠定了基础,同时这种策略也为合成具有药用价值天然产物提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例提供的海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用示意图。
图2为本发明实施例提供的AacSHC突变体催化GGOH的反应活性和产物分布示意图。
图3为本发明实施例提供的野生型AacSHC和纯化后ent-isocopalane型海绵烷骨架化合物的GC-MS图。
图4为本发明实施例中化合物1的核磁共振氢谱图。
图5为本发明实施例中化合物1的核磁共振碳谱图。
图6为本发明实施例中化合物2的核磁共振氢谱图。
图7为本发明实施例中化合物2的核磁共振碳谱图。
图8为本发明实施例中化合物3的核磁共振氢谱图。
图9为本发明实施例中化合物3的核磁共振碳谱图。
图10为本发明实施例中化合物4的X射线晶体结构图。
图11为本发明实施例中化合物4的核磁共振氢谱图。
图12为本发明实施例中化合物4的核磁共振碳谱图。
图13为本发明实施例中化合物5的核磁共振氢谱图。
图14为本发明实施例中化合物5的核磁共振碳谱图。
图15为本发明实施例中化合物6的核磁共振氢谱图。
图16为本发明实施例中化合物6的核磁共振碳谱图。
图17为本发明实施例中化合物7的核磁共振氢谱图。
图18为本发明实施例中化合物7的核磁共振碳谱图。
图19为本发明实施例中(+)-isoagatholactone的核磁共振氢谱图。
图20为本发明实施例中(+)-isoagatholactone的核磁共振碳谱图。
图21为本发明实施例中(+)-spongian-16-one的核磁共振氢谱图。
图22为本发明实施例中(+)-spongian-16-one的核磁共振碳谱图。
图23为本发明实施例中化合物8的核磁共振氢谱图。
图24为本发明实施例中化合物8的核磁共振碳谱图。
图25为本发明实施例中化合物11的核磁共振氢谱图。
图26为本发明实施例中化合物11的核磁共振碳谱图。
图27为本发明实施例中3-deoxychevalone A的核磁共振氢谱图。
图28为本发明实施例中3-deoxychevalone A的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
本发明提供一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种海绵烷骨架化合物的制备方法,所述海绵烷骨架化合物由野生型角鲨烯环化酶或其突变体催化非天然底物香叶基香叶醇(GGOH)生成;所述突变体发生突变的氨基酸位点为第261位的异亮氨酸(Ile)突变为甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)或天门冬酰胺(Asn)等。
在一些实施方式中,所述野生型角鲨烯环化酶的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示,氨基酸序列如SEQ.ID NO 2所示。
本发明实施例通过对来源于酸热脂环杆菌(Alicyclobacillu acidocaldarius)的角鲨烯环化酶(AacSHC)活性口袋中第261位氨基酸的突变,找到一种或多种能选择性地催化非天然底物香叶基香叶醇生产海绵烷骨架化合物的突变体。通过体外酶催化反应,野生型AacSHC可以催化GGOH主要生成ent-isocopalane型骨架化合物1、2和3。针对选择性合成ent-isocopalane型海绵烷骨架化合物的需求,通过对野生型角鲨烯环化酶的I261位的不同氨基酸突变的筛选,本发明实施例提供了一种选择性制备ent-isocopalane型骨架化合物的方法,其中两种ent-isocopalane型骨架化合物还被应用于两种海绵烷天然产物(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one)以及一种α-吡喃酮类杂萜化合物3-deoxychevalone A的化学-酶法合成中,如图1所示,经过3-4步的常规反应,即可从ent-isocopalane型骨架化合物合成海绵烷天然产物及α-吡喃酮类杂萜化合物物。突变体AacSHC-I261X是在野生型AacSHC的基础上,选择角鲨烯环化酶活性口袋的氨基酸残基I261进行突变,突变氨基酸为本发明所涉及氨基酸。
在一些实施方式中,所述海绵烷骨架化合物为ent-isocopalane型骨架化合物1和2,其结构式如下所示:
在一些实施方式中,所述的海绵烷骨架化合物的制备方法包括步骤:
S10、构建AacSHC模板质粒;
S20、对所述AacSHC模板质粒进行定点突变,构建AacSHC突变体重组质粒;
S30、将所述AacSHC模板质粒以及AacSHC突变体重组质粒分别转入大肠杆菌中,表达并纯化AacSHC蛋白,分别得到野生型AacSHC蛋白以及突变体AacSHC蛋白;
S40、通过体外酶催化实验筛选所述突变体AacSHC蛋白,筛选得到突变体AacSHC-I261G/T/N;
S50、利用野生型AacSHC蛋白或者突变体AacSHC-I261G/T/N催化底物香叶基香叶醇,进行海绵烷骨架化合物的体外酶催化合成;
S60、对合成产物进行结构鉴定,获得目的化合物。
在一些实施方式中,步骤S10的具体步骤为:将来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶基因AacSHC克隆至质粒pET28a(+)上,构建得到所述AacSHC模板质粒。
在一些实施方式中,步骤S20中,选择角鲨烯环化酶活性中心的氨基酸残基I261进行突变,构建AacSHC突变体重组质粒。
在一些实施方式中,步骤S30中,表达并纯化AacSHC蛋白的具体步骤为:将野生型AacSHC或其突变体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过含卡那霉素的平板筛选,得到蛋白表达菌株,利用该菌株进行AacSHC蛋白的表达。在37℃进行蛋白表达后,将细菌沉淀裂解后离心,收集离心后沉淀,并利用增溶缓冲液溶出AacSHC蛋白,粗蛋白经亲和层析柱纯化并用Bradford法测定纯蛋白浓度。
在一些实施方式中,步骤S40中,通过体外酶催化实验筛选所述AacSHC蛋白的具体步骤为:采用新鲜的纯酶通过小量体外酶催化实验筛选AacSHC蛋白,将野生型AacSHC蛋白或突变体AacSHC蛋白加入到含有香叶基香叶醇的反应缓冲液中,置于50℃,120rpm摇床中进行酶催化反应;通过GC-MS分析AacSHC蛋白催化香叶基香叶醇的产物分布情况并进行筛选,结果如图2所示。结果表明,突变体I261G、I261T催化GGOH生成的主产物为化合物1,I261A、I261N催化GGOH生成的主产物为化合物为2,四个突变体催化活性略低于野生型AacSHC。
在一些实施方式中,步骤S50中,采用增溶、离心后所得到的野生型AacSHC蛋白及其突变体的粗酶进行大量ent-isocopalane型骨架化合物的体外酶催化反应。野生型AacSHC催化香叶基香叶醇生产ent-isocopalane型骨架化合物1、2和3的收率分别是19%、53%、5.8%;突变体I261G催化生成1、2和3的收率分别是37%、23.8%、4.9%;突变体I261N催化生成1、2和3的收率分别是15%、32%、6%;突变体I261T催化生成1、2和3的收率分别是24.3%、19.8%、4%。
具体的,ent-isocopalane型骨架化合物1、2和3的结构式为:
在一些实施方式中,步骤S60中,经柱层析纯化后得到ent-isocopalane型骨架化合物并进行结构鉴定。在产物结构鉴定之前,产物3还需要进行衍生化反应转化为化合物4,反应式如下:
本发明实施例还提供另外一种ent-isocopalane型骨架化合物,所述骨架化合物采用上述的方法制备而来,或由如上所述角鲨烯环化酶的I261位突变体催化香叶基香叶醇得到;所述ent-isocopalane型骨架化合物结构式如下所示:
不仅如此,本发明实施例还提供了一种如上所述的海绵烷骨架化合物在合成海绵烷二萜天然产物以及α-吡喃酮杂萜化合物中的应用。
在一些实施方式中,所述海绵烷二萜天然产物包括(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one,所述α-吡喃酮杂萜化合物为3-deoxychevalone A,其结构式如下所示:
本发明实施例提供的ent-isocopalane型海绵烷骨架化合物的应用,所述应用为在萜类天然产物合成中的应用,包括以下步骤:
S70、海绵烷天然产物(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one的合成应用;
S80、α-吡喃酮类杂萜化合物3-deoxychevalone A的合成应用。
在一些实施方式中,步骤S70中,以化合物1为底物,通过烯丙位氧化反应、氧化环化反应合成海绵烷天然产物(+)-isoagatholactone,(+)-isoagatholactone经氢化反应转化为(+)-spongian-16-one。
在一些实施方式中,步骤S80中,以化合物2为底物,通过Swern氧化反应、形式[3+3]环加成反应和基于氢原子转移氢化反应合成α-吡喃酮类杂萜化合物3-deoxychevalone。
本发明实施例公开了来源于酸热脂环杆菌的野生型角鲨烯环化酶或其I261位突变体催化香叶基香叶醇的串联环化反应,用以合成ent-isocopalane型骨架化合物,并用于两种海绵烷天然产物(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one以及一种α-吡喃酮类杂萜化合物3-deoxychevalone A的化学-酶法合成。本发明实施例为角鲨烯环化酶的进一步改造提供了新的信息,对其他萜类环化酶的改造具有一定的借鉴作用。特别注意的是,本发明提供的酶催化的萜类环化反应与选择性化学转化相结合的两阶段合成策略还可应用于具有相似结构的很多二萜、杂萜类天然产物及其类似物的发散式合成,为这些天然产物的构效关系研究奠定了基础,这种策略为合成具有药用价值天然产物提供了新思路。
下面通过具体实施例对本发明一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用做进一步的解释说明。
实施例1:AacSHC突变模板质粒的构建
针对来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶基因(AacSHC),在不改变原有基因所编码的氨基酸序列(Uniprot号为P33247)基础上,根据E.coli的偏好性对密码子进行优化并调整G+C含量,优化的基因序列交由商业公司合成,克隆至pET28a载体上,即获得突变模板质粒pET28a-AacSHC。
实施例2:AacSHC-I261X突变体质粒的构建
以野生型pET28a-AacSHC质粒为模板,选取AacSHC活性口袋中位于底物香叶基香叶醇末端羟基的I261位,利用PCR技术进行定点突变。扩增完成后,利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离纯化,通过同源重组、转化到DH5α感受态细胞、提取质粒等步骤得到突变质粒,经商业公司测序正确的质粒置于-20℃冰箱备用。
实施例3:AacSHC蛋白的表达与纯化
pET28a-AacSHC(野生型或突变体)转化到感受态细胞BL21(DE3)中,于37℃过夜培养,筛选得到用于表达AacSHC蛋白的单克隆菌株。
将重组菌株接种至含50mg/L卡那霉素的10mL LB液体培养基中置于37℃,220rpm的摇床中培养过夜。次日分别接种到含卡那霉素的1L TB培养基中,置于37℃,220rpm的摇床中培养至OD600至0.7左右,加入IPIG(工作浓度0.5mM),置于18℃,180rpm摇床中诱导培养18h。培养结束后,离心收集菌体,菌体用磷酸钾缓冲液洗涤两次,细菌沉淀用高压均质机破碎后,离心除去可溶性杂蛋白,收集沉淀。
沉淀用洗涤缓冲液(60mM柠檬酸盐缓冲液,pH 6.0,3mL buffer/g pellet)洗涤,离心后收集沉淀,沉淀用增溶缓冲液(含1%(w/v)CHAPS的60mM柠檬酸盐缓冲液,pH 6.0,1mL buffer/g pellet)重悬,置于4℃冰箱中轻轻搅拌过夜,离心后收集上清即得到含目的蛋白的溶液。将蛋白溶液置于50℃水浴中孵育15min以去除大肠杆菌中的内源性蛋白,离心得到较纯的上清蛋白,并采用Bradford法测定粗蛋白浓度,随后采用亲和层析法纯化目的蛋白。
根据SDS-PAGE凝胶电泳结果,收集纯的目的蛋白样品,透析过夜后离心,将上清液转移至超滤管中离心浓缩,并用反应缓冲液置换蛋白缓冲液,当蛋白浓缩至较小的体积后,采用Bradford法测定蛋白浓度。
实施例4:筛选AacSHC突变体
本实施例采用新鲜的纯酶通过小量体外酶催化实验筛选AacSHC蛋白,反应体系为500μL。
具体过程如下:将野生型AacSHC或突变体(工作浓度0.1mM)加入到含有2mM GGOH的反应缓冲液中(E/S=5%),GGOH预先溶解在DMSO中,配制成200mM母液。反应体系置于50℃,120rpm摇床中反应153h。反应结束后,反应液用0.5mL乙酸乙酯萃取三次,合并有机相,氮吹仪吹干后,用40μL乙酸乙酯重新溶解,然后通过GC-MS检测反应结果。该实验至少重复三次,结果以平均值±标准偏差的形式表示。结果如图2所示,结果显示突变体I261G、I261T催化GGOH生成的主产物为化合物1,I261A、I261N催化GGOH生成的主产物为化合物为2,四个突变体催化活性略低于野生型AacSHC。
实施例5:利用野生型AacSHC及其突变体进行ent-isocopalane型骨架化合物的体外酶催化合成
本实施例通过以下步骤进行AacSHC蛋白的大量表达:过夜培养的200mL菌种接种到含卡那霉素(工作浓度为50mg/L)和4L ZYP-5052自诱导培养基(2g/L乳糖,5g/L甘油,0.5g/L葡萄糖,3.3g/L(NH4)2SO4,6.8g/L KH2PO4,7.1g/L Na2HPO4,0.24g/LMgSO4,10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物)的发酵罐中,调节搅拌速度和空气流量,在37℃诱导培养16h后,离心并收集细菌沉淀。随后采用增溶后所得的粗酶进行大量酶催化反应用于鉴定及选择性制备ent-isocopalane型骨架化合物,Bradford法测定粗酶浓度后,直接用于催化反应。
对于野生型AacSHC催化GGOH的反应,本实施例通过发酵获得80g野生型AacSHC的菌体,按照实施例3所述的增溶方法处理获得粗酶后,搭建以下反应体系:将23.3mL野生型AacSHC(~50.4mg/mL,2mol%)加入到含237mg GGOH(0.82mmol,4.1mL,200mM stocksolution in DMSO)的反应缓冲液(60mM citrate,pH 6.0,CHAPS终浓度为0.2%)中,然后将反应体系置于50℃,120rpm的摇床中,每隔一段时间取0.1mL反应液处理(乙酸乙酯萃取、氮吹仪吹干有机相、乙酸乙酯重新溶解)后,用GC-MS检测GGOH是否完全反应,待反应完全(15天),反应液用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥。经柱层析分离得到化合物1(45mg,0.15mmol,19%)、2(125.6mg,4.07mmol,53%)、3(14.6mg,0.047mmol,5.8%)以及少量化合物1和5的混合物(15mg)。图3所示即为野生型AacSHC和纯化后ent-isocopalane型化合物的GC-MS图。
对于突变体AacSHC-I261G催化GGOH的反应,通过发酵得到240g细菌沉淀,按照实施例3所述的增溶方法处理获得粗酶后,将400mL I261G突变体(~14.2mg/mL)和906.3mgGGOH(3.12mmol,7.8mL,400mM stock solution in DMSO)中加入592.9mL 60mM柠檬酸盐缓冲液中(pH 6.0),在50℃,120rpm条件下,待反应完全(10天),反应液用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥。经柱层析分离得到化合物1(340mg,1.17mmol,37%)、2(228.6mg,0.74mmol,23.8%)、3(46.8mg,0.15mmol,4.9%)。
对于突变体AacSHC-I261N催化GGOH的反应,通过发酵得到70g细菌沉淀,按照实施例3所述的增溶方法处理获得粗酶后,将84mL I261G蛋白溶液(~15.35mg/mL)和288.3mgGGOH(0.99mmol,2.48mL,400mM stock solution in DMSO)中加入93mL60mM柠檬酸盐缓冲液中(pH 6.0),在50℃,120rpm条件下,待反应完全(11天),反应液用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥。经柱层析分离得到化合物1(41.9mg,0.14mmol,15%)、2(98mg,0.32mmol,32%)、3(18.6mg,0.06mmol,6%)。
对于突变体AacSHC-I261T催化GGOH的反应,通过发酵得到105g细菌沉淀,按照实施例3所述的增溶方法处理获得粗酶后,将105.5mL I261T蛋白溶液(~19.95mg/mL)和495mg GGOH(1.7mmol,4.26mL,400mM stock solution in DMSO)中加入185.5mL 60mM柠檬酸盐缓冲液中(pH 6.0),在50℃,120rpm条件下,待反应完全(11天),反应液用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥。经柱层析分离得到化合物1(120.1mg,0.41mmol,24.3%)、2(104mg,0.34mmol,19.8%)、3(21mg,0.068mmol,4%)。
实施例6:ent-Isocopalane型骨架化合物的结构鉴定
1、化合物1的结构鉴定
本实施例将经柱层析分离纯化得到的化合物1的核磁等数据与文献比对后(文献参见Basabe,P.,2005;Fan,W.-Y.,2011),确定化合物1的结构式如下:
化合物1:白色固体。TLC:Rf=0.45(hexane/EtOAc=9/1),PMA stain.[α]D 22.6=-4.32(c=0.37,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.51(s,1H),3.85(dd,J=11.2,3.3Hz,1H),3.73(dd,J=11.2,5.1Hz,1H),2.06(dt,J=12.8,3.2Hz,1H),1.94–1.83(m,3H),1.78(s,3H),1.63(d,J=12.4Hz,2H),1.54(d,J=3.7Hz,1H),1.43–1.32(m,3H),1.27–1.08(m,4H),0.89(s,3H),0.86(s,3H),0.83(s,3H),0.82(s,3H),0.78(dd,J=12.7,3.7Hz,1H).13CNMR(126MHz,CDCl3)δ132.81,124.09,61.05,58.08,56.42,55.03,42.08,41.72,40.10,37.41,36.41,33.56,33.30,22.72,21.95,21.83,18.92,18.68,15.99,15.97.IR(KBr,cm–1)3361,2921,1041,959,839.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calculated for C20H35O+,291.2682;found,291.2683.
其中,化合物1的核磁共振氢谱图如图4,碳谱图如图5所示。
2、化合物2的结构鉴定
本实施例将经柱层析分离纯化得到的化合物2的核磁等数据与文献比对后(文献参见Nishizawa,M.,1986),确定化合物2的结构式如下:
化合物2:白色固体。TLC:Rf=0.51(hexane/EtOAc=1/1),PMA stain.[α]D 24.7=-3.55(c=0.76,CHCl3)(literature[29]for the enantiomer:[α]D=+5.12,c=1.11,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.90(d,J=6.4Hz,2H),2.27(s,2H),1.84(dd,J=16.9,12.8Hz,2H),1.69–1.50(m,6H),1.46–1.36(m,3H),1.33(s,3H),1.27–1.11(m,4H),0.92(d,J=11.8Hz,1H),0.84(s,3H),0.81(d,J=2.1Hz,1H),0.79(s,9H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ75.13,61.18,61.05,60.69,56.52,44.63,42.17,41.89,40.17,38.06,37.74,33.41,24.33,21.47,19.19,18.73,18.50,17.39,16.54.IR(KBr,cm–1)3340,2937,1384,1139,1028.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated for C20H36ONa+,331.2608;found,331.2607.
其中,化合物2的核磁共振氢谱图如图6,碳谱图如图7所示。
3、化合物3的结构鉴定
由于经柱层析分离纯化的化合物3的核磁等数据无法与已报道文献中化合物匹配。因此化合物3的结构是通过进一步衍生化得以鉴定的。化合物3转化为4后,11(9mg)溶解于体积比为1/1/1的丙酮、乙醇和乙腈的混合溶剂中,样品瓶置于室温下,待溶剂慢慢蒸发直至有单晶析出,最后经X射线衍射实验和晶体数据解析,成功鉴定化合物4的结构(CCDC2159566),进而确定化合物3的结构式如下:
化合物3:白色固体。TLC:Rf=0.63(hexane/EtOAc=1/1),PMA stain.[α]D 24.2=-27.21(c=0.61,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.07(dt,J=11.6,7.8Hz,2H),2.55(s,2H),1.99(dt,J=12.5,3.3Hz,1H),1.76–1.70(m,2H),1.63(d,J=3.5Hz,2H),1.55–1.37(m,6H),1.33(s,3H),1.23(s,3H),1.13(dd,J=13.5,4.1Hz,1H),0.94(dd,J=18.0,3.8Hz,2H),0.86(s,3H),0.84(s,3H),0.81(s,3H),0.77(dd,J=16.1,6.3Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ74.05,60.80,60.20,59.05,56.78,43.13,42.33,42.07,40.31,38.85,37.78,33.48,33.45,31.00,21.53,18.81,18.40,17.44,16.52.IR(KBr,cm–1)3324,3298,1383,1254,1027.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated for C20H36ONa+,331.2608;found,331.2608.
化合物3的衍生化方法如下:
将4-二甲氨基吡啶(9.5mg,0.078mmol,3.00equiv.)和3,5-二硝基苯甲酰氯(15.0mg,0.065mmol,2.50equiv.)分别加入到化合物3(8mg,0.026mmol,1.0equiv.)的二氯甲烷(1mL)溶液中,在室温下反应24h后,加入饱和碳酸钠溶液,用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相,并用无水硫酸钠干燥,过滤之后,滤液经减压浓缩、柱层析分离(hexane/EtOA=30/1)得到白色固体4(11.3mg,0.023mmol,87%)。TLC:Rf=0.54(hexane/EtOAc=9/1),PMAstain.[α]D 24.5=-20.37(c=0.43,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.22(t,J=2.1Hz,1H),9.13(d,J=2.1Hz,2H),4.69(d,J=4.6Hz,2H),2.01(dt,J=12.7,3.2Hz,1H),1.80–1.71(m,2H),1.64–1.57(m,4H),1.45–1.37(m,4H),1.29(s,3H),1.26(d,J=2.9Hz,1H),1.24–1.08(m,4H),1.04(s,3H),0.92–0.88(m,1H),0.87(s,3H),0.85(s,3H),0.82(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.54,148.89,134.43,129.44,122.42,72.02,64.94,60.31,58.34,56.64,42.88,42.21,41.55,40.18,38.57,37.80,33.46,33.44,31.26,21.52,18.76,18.20,17.44,17.19,16.49.IR(film)3560,3094,2938,2842,1720,1748,1343,1298,1268,1167,914,728.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated for C27H38N2O7Na+,525.2571;found,525.2572.
其中,化合物3的核磁共振氢谱图如图8,碳谱图如图9所示;化合物4的X射线晶体结构图如图10,核磁共振氢谱图如图11,碳谱图如图12所示。
4、化合物5的结构鉴定
为了鉴定催化产物5的结构,对1和5的混合物,首先按照如下所述实验条件搭建化学反应:在0℃下,将t-BuOOH(18.5μL,0.102mmol,2equiv.,5.5M in decane)加入到含SeO2(4.5mg,0.041mmol,0.8equiv.)的二氯甲烷(2mL)溶液中,在0℃条件下搅拌30min后,加入1和5的混合物(15mg,0.051mmol,1equiv.)的二氯甲烷(4mL)溶液,在0℃条件下反应24h后,将反应体系移至室温并反应5h。然后加入硫代硫酸钠溶液淬灭反应,用乙酸乙酯萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤之后,使用旋转蒸发仪减压浓缩。化合物1由于发生烯丙位氧化反应而使极性增加,而化合物5不参与反应,因此柱层析分离得到了纯的化合物5(3.1mg,0.0107mmol)。本实施例将化合物5与已报道文献中的核磁等数据比对后(文献参见Furuichi,N.,2001),确定化合物5的结构式如下:
化合物5:白色固体。TLC:Rf=0.45(hexane/EtOAc=9/1),PMA stain.[α]D 22.7=-21.50(c=1.44,CHCl3).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.18(d,J=11.5Hz,1H),4.03(d,J=11.5Hz,1H),2.05–2.00(m,2H),1.70(s,3H),1.63(dd,J=11.1,6.5Hz,4H),1.39(ddd,J=16.1,6.0,3.6Hz,6H),1.13(dd,J=13.7,4.5Hz,2H),1.10–1.05(m,2H),0.95(s,3H),0.84(s,6H),0.81(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ141.16,132.44,76.84,58.30,56.60,56.53,42.28,39.84,38.52,38.46,37.53,34.18,33.41,21.90,21.48,19.32,18.80,18.75,17.87,16.52.IR(KBr,cm-1)3445,3383,2925,2868,1461,1386,1363,1266,1194,995,748.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated for C20H34ONa+,313.2502;found,313.2488.
其中,化合物5的核磁共振氢谱图如图13,碳谱图如图14所示。
综上,本实施例成功鉴定了角鲨烯环化酶催化香叶基香叶醇生成的4种ent-isocopalane型海绵烷骨架化合物的结构。
实施例7:海绵烷天然产物(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one的合成
1、化合物6的合成:
合成的反应式如下:
在0℃下,将t-BuOOH(153μL,0.84mmol,2equiv.,5.5M in decane)加入到含SeO2(37.3mg,0.34mmol,0.8equiv.)的二氯甲烷(2mL)溶液中,搅拌30min后,加入化合物1(122mg,0.42mmol,1equiv.)的二氯甲烷(10mL)溶液。在0℃条件下反应24h后,将反应体系移至室温并反应5h后,硫代硫酸钠溶液淬灭反应,乙酸乙酯萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤之后,使用旋转蒸发仪减压浓缩,经柱层析分离纯化(hexane/EtOAc=8/1)后,得到白色固体6(65.1mg,0.21mmol,51%)和7(37.7mg,0.12mmol,29%)。化合物6:TLC:Rf=0.24(hexane/EtOAc=5/2),PMA stain.[α]D 23.0=-7.71(c=1.46,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.81–5.73(m,1H),4.34(d,J=12.1Hz,1H),3.98(d,J=12.1Hz,1H),3.90(dd,J=10.8,2.1Hz,1H),3.68(dd,J=10.8,8.4Hz,1H),2.14(s,1H),2.07–2.01(m,2H),1.91(dd,J=14.1,2.1Hz,1H),1.61–1.56(m,2H),1.41–1.10(m,8H),0.87(s,3H),0.87(s,3H),0.82(s,3H),0.73(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ136.85,127.65,67.55,61.55,56.26,55.18,54.44,41.99,41.14,39.97,37.40,35.90,33.53,33.26,22.75,21.81,18.96,18.61,15.79,15.60.IR(KBr,cm-1)3318,2994,2926,2847,1673,1384,1266,990,741.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated for C20H34O2Na+,329.2451;found,329.2452.副产物7:TLC:Rf=0.51(hexane/EtOAc=5/2),PMA stain.[α]D 23.5=-17.14(c=2.45,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.55(s,1H),3.76(d,J=11.1Hz,1H),3.59(d,J=11.1Hz,1H),1.94–1.89(m,1H),1.80(s,3H),1.62–1.52(m,7H),1.37(dd,J=15.5,6.9Hz,5H),1.17–1.13(m,1H),0.93(s,3H),0.87(s,3H),0.82(s,3H),0.81(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ135.23,127.54,75.77,62.42,55.54,47.99,41.99,40.95,40.30,37.36,33.46,33.23,33.06,23.16,21.84,20.34,18.67,16.44,16.00.IR(KBr,cm-1)3478,2924,2867,2846,1730,1458,1388,1369,1044,743.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated forC20H34O2Na+,329.2451;found,329.2453.
其中,化合物6的核磁共振氢谱图如图15,碳谱图如图16所示;化合物7的核磁共振氢谱图如图17,碳谱图如图18所示。
2、(+)-Isoagatholactone的合成:
合成的反应式如下:
将碳酸银-硅藻土试剂(0.88g,1.17mmol,20equiv.)加入到化合物6(18mg,0.059mmol,1equiv.)的甲苯溶液中,反应体系在110℃下回流24h,过滤并收集滤液,减压浓缩后,经柱层析进行分离(hexane/EtOAc=7/1)得到白色鳞片状固体(+)-isoagatholactone(12.5mg,0.041mmol,70%),经与文献中报道的1H NMR以及13C NMR比对后(文献参见Ren,J.,2016;Abad,A.,1996),可知其结构式如下所示:
TLC:Rf=0.67(hexane/EtOAc=3/1),KMnO4stain.[α]D 24.0=1.71(c=
0.2,CHCl3).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.86(q,J=3.4Hz,1H),4.37(t,J=9.2Hz,1H),4.04(t,J=9.1Hz,1H),2.86–2.74(m,1H),2.34(ddd,J=20.3,9.3,3.9Hz,1H),2.16–2.04(m,1H),1.69(dd,J=9.6,2.9Hz,1H),1.67–1.50(m,4H),1.46–1.36(m,3H),1.35–1.25(m,3H),1.20–1.11(m,1H),0.92(s,3H),0.87(s,3H),0.83(s,3H),0.77(s,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ170.38,136.61,127.10,67.40,56.85,54.59,51.35,41.87,40.92,39.92,37.44,34.63,33.54,33.35,24.34,21.76,18.44,15.45,14.27.IR(KBr,cm-1)1731,1670,1462,1251,1158,1102,969,738.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated for C20H30ONa+,325.2138;found,325.2139.其中,(+)-isoagatholactone的核磁共振氢谱图如图19,碳谱图如图20所示。
3、(+)-Spongian-16-one的合成:
合成的反应式如下:
小心地将约0.2mL兰尼镍水溶液加入到(+)-isoagatholactone(10mg,0.033mmol)的乙醇(1mL)溶液中,用氢气置换气体后,在78℃下回流5h。TLC监测反应,待(+)-isoagatholactone完全反应后,小心加入少量2mol/L盐酸溶液,搅拌15min后,过滤除去不溶物,向滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液,二氯甲烷萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤后,将滤液减压浓缩,经柱层析分离(hexane/EtOAc=9/1)后,得到白色固体(+)-spongian-16-one(8.8mg,0.029mmol,87%)。经与文献中报道的1H NMR以及13C NMR比对后(文献参见Kernan,M.R.,1990),可知其结构式如下所示:
TLC:Rf=0.56(hexane/EtOAc=5/1),PMA stain.[α]D 24.6=13.75(c=0.4,CHCl3).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.21(d,J=9.7Hz,1H),4.10(dd,J=9.7,5.3Hz,1H),2.53(t,J=7.8Hz,1H),2.34–2.26(m,1H),2.08(dd,J=7.9,5.4Hz,1H),1.82(dt,J=12.7,3.1Hz,1H),1.73(d,J=12.3Hz,1H),1.62(d,J=5.4Hz,2H),1.52(d,J=3.5Hz,1H),1.51–1.47(m,1H),1.46–1.39(m,1H),1.38(dd,J=6.1,3.1Hz,1H),1.36–1.32(m,1H),1.30(d,J=8.9Hz,1H),1.18–1.08(m,1H),1.03(td,J=13.0,4.0Hz,1H),0.86(s,3H),0.85(s,3H),0.82(s,3H),0.80(s,3H),0.79(s,1H),0.78–0.75(m,1H),0.74(t,J=3.9Hz,1H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ179.25,67.78,56.85,56.56,50.69,42.33,42.12,40.18,37.59,37.51,35.87,33.50,22.54,21.68,18.66,18.08,17.42,16.51,15.64.IR(KBr,cm-1)1769,1696,1449,1195,1141,961.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated for C20H32ONa+,327.2295;found,327.2295.其中,(+)-spongia-16-one的核磁共振氢谱图如图21,碳谱图如图22所示。
实施例8:α-吡喃酮类杂萜化合物3-deoxychevalone A的合成
1、化合物8的合成
合成的反应式如下:
在氩气保护下,将二甲基亚砜(44.7μL,0.63mmol,4.5equiv.)加入到含有1mL二氯甲烷的圆底烧瓶中,将圆底烧瓶冷却到-78℃,随后将草酰氯(24μL,0.28mmol,2.0equiv.)滴加到反应体系中,在-78℃搅拌20min。随后将化合物2(43mg,0.14mmol,1.0equiv.)的二氯甲烷(5mL)溶液缓慢滴加到反应体系中。反应继续在-78℃下反应45min后,将三乙胺(97μL,0.7mmol,5.0equiv.)加入到反应体系中,随后将反应体系移至室温并继续反应10h。待反应结束,在室温下加入水淬灭反应,随后反应液用二氯甲烷萃取三次,合并有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤之后,将滤液减压浓缩,经柱层析分离(hexane/EtOAc=8/1)得到白色固体8(35mg,0.114mol,81%)。TLC:Rf=0.55(hexane/EtOAc=5/2),PMA stain.[α]D 25.3=-14.59(c=0.61,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.02(d,J=1.1Hz,1H),2.10–2.08(m,1H),1.80(dt,J=12.6,3.3Hz,1H),1.69–1.61(m,4H),1.50–1.40(m,4H),1.37(s,3H),1.34–1.25(m,3H),1.21–1.15(m,1H),1.11(s,3H),0.94(dd,J=12.0,2.2Hz,1H),0.90(d,J=2.4Hz,1H),0.87(s,3H),0.84(s,3H),0.82(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ208.22,72.64,71.82,59.65,56.55,48.35,42.70,42.05,41.50,39.87,37.92,37.76,33.38,25.22,21.45,19.01,18.82,18.58,18.00,16.24.IR(KBr,cm-1)3320,2995,2937,2922,2848,1715,1707,1457,1385,1191,1127,745.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated forC20H34O2Na+,329.2451;found,329.2450.其中,化合物8的核磁共振氢谱图如图23,碳谱图如图24所示。
2、化合物11的合成
在手套箱中,将化合物8(6mg,0.02mmol,1equiv.)加到Schlenk反应管中,并用甲苯(0.2mL)溶解,然后将化合物9(3.7mg,0.03mmol,1.5equiv.)和磷酸10(2mg,0.006mmol,0.3equiv.)加入到Schlenk反应管中。将Schlenk管的盖子旋紧,从手套箱移出,将反应体系置于150℃油浴中反应24h后,将反应液转移到圆底烧瓶中,减压浓缩后,使用制备TLC板分离纯化得到白色固体11(4.1mg,0.122mmol,61%)。TLC:Rf=0.63(hexane/EtOAc=3/1),UV&PMA stain.[α]D 26.5=-25.85(c=0.53,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.18(s,1H),5.77(s,1H),2.20(d,J=0.6Hz,3H),2.18–2.13(m,1H),2.08–2.04(m,1H),1.86(dt,J=13.5,6.8Hz,1H),1.74(d,J=20.0Hz,2H),1.71–1.64(m,2H),1.61(dd,J=17.3,3.6Hz,2H),1.46(s,2H),1.45(s,3H),1.41(dd,J=8.6,3.9Hz,4H),1.13(s,3H),1.03–0.98(m,1H),0.86(s,3H),0.85(s,3H),0.82(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.07,162.57,161.65,147.11,108.73,100.27,99.87,82.08,56.71,56.29,42.12,41.33,40.10,39.92,39.85,37.99,33.45,33.41,26.93,25.12,21.54,20.30,18.72,18.23,16.51.IR(KBr,cm-1)1719,1668,1570,1457,1387,1239,987,810,742.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+calculated forC26H36O3Na+,419.2557;found,419.2557.
其中,化合物11的核磁共振氢谱图如图25,碳谱图如图26所示。
3、3-Deoxychevalone A的合成:
将化合物11(4.7mg,0.011mmol,1equiv.)溶解在干燥的正己烷(1mL)、异丙醇(0.5mL)和二氯甲烷(0.1mL)的混合溶剂中,将苯硅烷(4μL,0.033mmol,3equiv.)和叔丁基过氧化氢(6μL,0.033mmol,3equiv.,5.5M in decane)分别加入到反应体系。将长针伸入液面以下,用氩气鼓泡10min后,将Mn(dpm)3(2.2mg,0.0036mmol,0.3equiv.)加入到反应体系,立即塞紧瓶塞,将长针在液面以上并用氩气置换气体30s。反应体系在室温下反应3h后,取出搅拌子,用旋转蒸发仪减压浓缩,经制备TLC板分离纯化后得到白色固体3-deoxychevalone A(2.7mg,0.0068mmol,62%)。TLC:Rf=0.46(hexane/EtOAc=3/1),UV&PMA stain.[α]D 25.8=-12.22(c=0.27,CHCl3).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.68(s,1H),2.43(dd,J=16.5,4.7Hz,1H),2.17(s,3H),2.14–2.07(m,1H),2.07–2.01(m,1H),1.85–1.79(m,1H),1.76–1.59(m,4H),1.52–1.43(m,2H),1.43–1.38(m,2H),1.35(dd,J=12.6,3.7Hz,2H),1.30(s,2H),1.19(s,3H),1.08(dd,J=33.6,11.1Hz,2H),1.02–0.92(m,2H),0.88(s,3H),0.85(s,3H),0.83(s,3H),0.81(s,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ163.07,162.57,161.65,147.11,108.73,100.27,99.87,82.08,56.71,56.29,42.12,41.33,40.10,39.92,39.85,37.99,33.45,33.41,26.93,25.12,21.54,20.30,18.72,18.23,16.51.IR(KBr,cm-1)2994,2925,2870,2855,1719,1654,1570,1457,1387,1239,987,742.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calculated for C26H39O3 +,399.2894;found,399.2894.其中,3-deoxychevalone A的核磁共振氢谱图如图27,碳谱图如图28所示。
综上所述,本发明提供了一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用,通过对来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶活性口袋中261位异亮氨酸的改造,获得了能催化香叶基香叶醇选择性合成ent-isocopalane型海绵烷骨架化合物1和2的突变体;通过体外酶催化反应,制备了光学纯的ent-isocopalane型骨架化合物;进一步利用2-3步化学转化,获得了两种海绵烷天然产物及一种杂萜化合物。与现有技术相比,本发明可选择性合成光学纯的ent-isocopalane型化合物,为发现新型萜类化合物、丰富萜类天然产物化合物库提供了重要的先导化合物资源。本发明将酶催化的萜类环化反应与选择性化学转化相结合的两阶段合成策略还可应用于具有相似结构的大量二萜、杂萜类天然产物及其类似物的发散式合成,为这些天然产物的构效关系研究奠定了基础,同时这种策略为合成具有药用价值天然产物提供了新思路。此外,本发明也为角鲨烯环化酶的进一步改造提供了新的信息,对其他萜类环化酶的改造具有借鉴意义。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种海绵烷骨架化合物的制备方法,其特征在于,所述海绵烷骨架化合物由野生型角鲨烯环化酶AacSHC或其突变体催化底物香叶基香叶醇生成;所述野生型角鲨烯环化酶AacSHC的氨基酸序列如SEQ.ID NO 2所示;所述突变体发生突变的氨基酸位点为角鲨烯环化酶AacSHC第261位的异亮氨酸,所述异亮氨酸突变为甘氨酸、苏氨酸或天门冬酰胺中的其中一种;所述海绵烷骨架化合物为ent-isocopalane型骨架化合物,所述ent-isocopalane型骨架化合物结构式如1或2所示:
2.根据权利要求1所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其特征在于,所述野生型角鲨烯环化酶的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示。
3.根据权利要求1所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其特征在于,所述海绵烷骨架化合物的制备方法包括步骤:
构建AacSHC模板质粒;
对所述AacSHC模板质粒进行定点突变,构建AacSHC突变体重组质粒;
将所述AacSHC模板质粒以及AacSHC突变体重组质粒分别转入大肠杆菌中,表达并纯化AacSHC蛋白,分别得到野生型AacSHC蛋白以及突变体AacSHC蛋白;
通过体外酶催化实验筛选所述突变体AacSHC蛋白,筛选得到突变体AacSHC-I261G/T/N;
利用野生型AacSHC蛋白或者突变体AacSHC-I261G/T/N催化底物香叶基香叶醇,进行海绵烷骨架化合物的体外酶催化合成,获得所述海绵烷骨架化合物。
4.根据权利要求3所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其特征在于,将来源于酸热脂环杆菌的角鲨烯环化酶基因AacSHC克隆至质粒pET28a上,构建得到所述AacSHC模板质粒;对所述AacSHC模板质粒进行定点突变,选择角鲨烯环化酶活性中心的氨基酸残基I261进行突变,构建AacSHC突变体重组质粒。
5.根据权利要求3所述的海绵烷骨架化合物的制备方法,其特征在于,通过体外酶催化实验筛选所述AacSHC蛋白的具体步骤为:将野生型AacSHC蛋白或突变体AacSHC蛋白加入到含有香叶基香叶醇的反应缓冲液中,置于50℃,120rpm摇床中进行酶催化反应;通过GC-MS分析AacSHC蛋白催化香叶基香叶醇的产物分布情况并进行筛选。
6.一种如权利要求1-5任一所述的海绵烷骨架化合物的制备方法在合成海绵烷二萜天然产物以及α-吡喃酮杂萜化合物中的应用,其特征在于,所述海绵烷二萜天然产物包括(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one,所述α-吡喃酮杂萜化合物为3-deoxychevalone A,其结构式如下所示:
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述海绵烷二萜天然产物(+)-isoagatholactone和(+)-spongian-16-one的合成方法为:以ent-isocopalane型骨架化合物1为底物,通过烯丙位氧化反应、氧化环化反应合成所述(+)-isoagatholactone,所述(+)-isoagatholactone经氢化反应转化为所述(+)-spongian-16-one;
所述α-吡喃酮杂萜化合物3-deoxychevalone A的合成方法为:以ent-isocopalane型骨架化合物2为底物,通过Swern氧化反应、[3+3]环加成反应和基于氢原子转移氢化反应合成所述3-deoxychevalone A。
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