CN116536372B - cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种cylindrocyclophanes类化合物的化学‑酶法合成方法及其应用，通过一种化学‑酶法合成路线，以实现[7.7]对环芳烷类天然产物(–)‑cylindrocyclophane A、(–)‑cylindrocyclophane F的高效合成。本发明基于傅‑克烷基化酶CylK的催化功能，首先通过化学方法对映选择性合成两种关键中间体，随后利用CylK酶及其突变体催化的分子间和分子内傅‑克烷基化反应实现了(–)‑cylindrocyclophane A和F的制备级合成。与现有方法相比，本发明合成路线更加简洁，总产率更高，对其它[7.7]对环芳烷类天然产物的合成提供了借鉴意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药和天然产物的化学-酶法合成领域，尤其涉及一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法及其应用。
背景技术
从蓝藻中分离得到的[7.7]对环芳烷类天然产物具有独特的化学结构和多种生物活性，如抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤活性等。在前期的研究中，Moore课题组从蓝藻Cylindrospermum licheniforme Kützing (ATCC 29204)中分离得到的cylindrocyclophanes类天然产物对KB细胞（人口腔表皮癌细胞）和LoVo细胞（人结肠癌细胞）具有良好的细胞毒性(IC50 = 2-10 µg/mL)。然而，这些天然产物在自然界中含量低，限制了后续的活性研究及应用，因此通过化学手段合成该类天然产物及其结构类似物具有重要的意义。
迄今为止，有机化学家们已经完成了该类天然产物中cylindrocyclophane A (1)和cylindrocyclophane F (2)的化学全合成。其中，构建[7.7]对环芳烷骨架主要通过两种策略实现：Smith课题组、Iwabuchi课题组和Breit课题组利用了交叉复分解/关环复分解(CM/RCM)策略；Hoye课题组和Nicolaou课题组采用了烯烃化反应策略。但是，现有的cylindrocyclophane A和F的合成路线较为冗长，产率低，限制了该类天然产物类似物的制备和构效关系研究。不仅如此，通过天然来源提取的方式分离纯化cylindrocyclophanes类天然产物的步骤繁琐、总收率低、提取成本高，难以可持续。因此，开发简洁高效的合成路线用于实现该类天然产物的高效合成具有重要的意义。
因此，现有技术还有待改进，发展一种高效合成cylindrocyclophanes类天然产物的合成策略具有重要意义。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法及其应用，通过提供一种化学-酶法合成路线，以实现[7.7]对环芳烷类天然产物(–)-cylindrocyclophane A、(–)-cylindrocyclophane F的高效合成，旨在解决目前难以高效合成cylindrocyclophanes类天然产物的问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，所述合成方法包括步骤：
通过化学合成方法得到中间体化合物3或4；
通过CylK酶催化所述中间体化合物3或4发生傅-克烷基化反应，得到所述cylindrocyclophanes类化合物；
其中，所述中间体化合物3或4的结构式为
。
所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，所述cylindrocyclophanes类化合物包括(–)-cylindrocyclophane A和/或(–)-cylindrocyclophane F；所述CylK酶催化所述中间体化合物3反应得到(–)-cylindrocyclophane A，催化所述中间体化合物4反应得到(–)-cylindrocyclophane F，其结构式分别为
。
所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，所述CylK酶包括野生型CylK酶和/或CylK酶突变体。
所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，所述CylK酶突变体包括突变体L411A，所述突变体L411A的氨基酸序列第411位的亮氨酸突变为丙氨酸。
所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，所述化学合成方法具体步骤包括：
以3,5-二羟基苯甲醛5a为原料，合成化合物8a；或者，以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为原料，合成化合物8b；
以化合物8a或化合物8b为原料，依次经过烯烃化反应、硼氢化反应、硼锂交换反应、水解反应、氯化反应，分别生成氯化产物12a或12b；
将氯化产物12a脱除羟基的硅醚保护基以及脱除酚羟基的苄基保护基，得到中间体化合物3；或者，将氯化产物12b脱除酚羟基的苄基保护基，得到中间体化合物4；
其中，所述化合物8a的结构式为
；
所述化合物8b的结构式为
；
所述氯化产物12a或12b的结构式为
。
所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，以3,5-二羟基苯甲醛5a为原料，合成化合物8a的具体步骤为：
以3,5-二羟基苯甲醛5a为起始原料，对其酚羟基进行苄基保护，得到化合物6a；
所述化合物6a与Evans手性辅基发生不对称Aldol反应，生成手性苄醇7a；
对所述手性苄醇7a的羟基进行硅醚保护后，通过NaBH4还原脱除手性辅基，得到化合物8a；
合成路线为
。
所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为原料，合成化合物8b的具体步骤为：
以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为起始原料，对其酚羟基进行苄基保护，得到化合物14b；
所述化合物14b被LiAlH4还原为苄醇后发生Appel反应，生成苄溴化合物6b；
所述苄溴化合物6b与Evans手性辅基发生亲核取代，得到酰胺化合物7b；
所述酰胺化合物7b经LiAlH4还原，脱除手性辅基后得到化合物8b；
合成路线为
。
所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其中，以化合物8a或化合物8b为原料，分别生成氯化产物12a或12b的具体步骤为：
将化合物8a或8b转化生成对应的三氟甲磺酸酯后，与烯丙基溴化镁反应，生成对应的烯烃化合物9a或9b；
所述烯烃化合物9a或9b经一步铑催化的硼氢化反应，生成对应的硼烷化合物10a或10b；
将所述硼烷化合物10a或10b分别与酰胺酯化合物13，在手性鹰爪豆碱的控制下，通过硼锂交换反应生成对应的手性硼烷化合物，之后直接水解后得到对应的手性醇11a或11b；
所述手性醇11a或11b采用TMCE做氯化试剂，发生氯化反应，得到手性翻转的氯化产物12a或12b；
合成路线为
。
一种如上任一所述的合成方法在合成对环芳烷类天然产物中的应用。
所述的应用，其中，所述对环芳烷类天然产物包括(–)-cylindrocyclophane A和/或(–)-cylindrocyclophane F，所述(–)-cylindrocyclophane A、(–)-cylindrocyclophane F的结构式分别为
。
有益效果：本发明提供了一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法及其应用，通过一种化学-酶法合成路线，以实现[7.7]对环芳烷类天然产物(–)-cylindrocyclophane A、(–)-cylindrocyclophane F的高效合成。本发明基于傅-克烷基化酶CylK的催化功能，首先通过化学方法对映选择性合成了两种关键中间体，随后利用CylK酶及其突变体催化的分子间和分子内傅-克烷基化反应实现了(–)-cylindrocyclophane A和F的制备级合成。本发明能够分别以11步10%和11步24%的总产率合成(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophane F。与现有的合成方法相比，本发明的合成路线更加简洁，总产率更高，并且对其它[7.7]对环芳烷类天然产物的合成提供了借鉴意义。
附图说明
图1为本发明中不同温度下CylK酶及其突变体对化合物4的催化活性示意图。
图2为本发明实施例中化合物3的核磁共振氢谱图。
图3为本发明实施例中化合物3的核磁共振碳谱图。
图4为本发明实施例中化合物4的核磁共振氢谱图。
图5为本发明实施例中化合物4的核磁共振碳谱图。
图6为本发明实施例化合物(–)-cylindrocyclophane A核磁共振氢谱图。
图7为本发明实施例化合物(–)-cylindrocyclophane A核磁共振碳谱图。
图8为本发明实施例化合物(–)-cylindrocyclophane F核磁共振氢谱图。
图9为本发明实施例化合物(–)-cylindrocyclophane F核磁共振碳谱图。
具体实施方式
本发明提供一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，所述合成方法包括步骤：
S10、通过化学合成方法得到中间体化合物3或4；
S20、通过CylK酶催化所述中间体化合物3或4发生傅-克烷基化反应，得到所述cylindrocyclophanes类化合物。
在一些实施方式中，所述中间体化合物3或4的结构式为
。化合物3或4的区别仅在于R基的不同，化合物3的R为OH，化合物4的R为H。
在一些实施方式中，所述cylindrocyclophane类化合物包括(–)-cylindrocyclophane A和/或(–)-cylindrocyclophane F。
具体的，(–)-cylindrocyclophane A的结构式为
具体的，(–)-cylindrocyclophane F的结构式为
在一些实施方式中，(–)-cylindrocyclophane A由所述CylK酶催化所述中间体化合物3反应得到，(–)-cylindrocyclophane F由所述CylK酶催化所述中间体化合物4反应得到。
[7.7]对环芳烷类聚酮天然产物具有独特的化学结构，如下所示：
，且该类天然产物具有抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤等生物活性。然而其在自然界中含量低，限制了后续更加深入的活性及应用研究，因此开发该类天然产物及其结构类似物的普适性合成路线具有重要的意义。本发明以简洁高效的路线完成[7.7]对环芳烷类天然产物(–)-cylindrocyclophane A (1)和(–)-cylindrocyclophane F (2)的化学-酶法合成，该合成路线主要包括化学合成与后期生物催化转化两部分。在化学合成部分，通过简洁高效的方法完成了特定构型氯化物单体的对映选择性合成；在后期生物催化部分，通过探索不同条件下CylK酶不同突变体对底物的催化效率以及对各种不同底物催化的可行性，确定了CylK酶催化二聚反应获得目标[7.7]对环芳烷类天然产物(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophane F的最优条件，最终通过CylK酶催化对应氯化物单体的二聚反应获得了目标[7.7]对环芳烷类天然产物(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophaneF。
所述化学合成方法具体步骤包括：
S101、以3,5-二羟基苯甲醛5a为原料，合成化合物8a；或者，以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为原料，合成化合物8b；
S102、以化合物8a或化合物8b为原料，依次经过烯烃化反应、硼氢化反应、硼锂交换反应、水解反应、氯化反应，分别生成氯化产物12a或12b；
S103、将氯化产物12a脱除羟基的硅醚保护基以及脱除酚羟基的苄基保护基，得到中间体化合物3；或者，将氯化产物12b脱除酚羟基的苄基保护基，得到中间体化合物4。
具体的，所述化合物8a的结构式为
；
所述化合物8b的结构式为
；
所述氯化产物12a或12b的结构式为
。
在一些具体的实施方式中，步骤S101中，以3,5-二羟基苯甲醛5a为原料，合成化合物8a具体步骤包括：
（1）以3,5-二羟基苯甲醛5a为起始原料，对其酚羟基进行苄基保护，得到化合物6a；
（2）所述化合物6a与Evans手性辅基发生不对称Aldol反应，生成手性苄醇7a；
（3）对所述手性苄醇7a的羟基进行硅醚保护后，通过NaBH4还原脱除手性辅基，得到化合物8a。
合成路线为
。
在一些具体的实施方式中，步骤S101中，以3,5-二羟基苯甲酸甲酯为原料，合成化合物8b的具体步骤包括：
（1）以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为起始原料，对其酚羟基进行苄基保护，得到化合物14b；
（2）所述化合物14b被LiAlH4还原为苄醇后发生Appel反应，生成苄溴化合物6b；
（3）所述苄溴化合物6b与Evans手性辅基发生亲核取代，得到酰胺化合物7b；
（4）所述酰胺化合物7b经LiAlH4还原，脱除手性辅基后得到化合物8b。
合成路线为
。
在一些具体的实施方式中，步骤S102中，以化合物8a或化合物8b为原料，分别生成氯化产物12a或12b的具体步骤包括：
（1）将化合物8a或8b转化生成对应的三氟甲磺酸酯后，与烯丙基溴化镁反应，生成对应的烯烃化合物9a或9b；
（2）所述烯烃化合物9a或9b经一步铑催化的硼氢化反应，生成对应的硼烷化合物10a或10b；
（3）将所述硼烷化合物10a或10b分别与酰胺酯化合物13，在手性鹰爪豆碱的控制下，通过硼锂交换反应生成对应的手性硼烷化合物，之后直接水解后得到对应的手性醇11a或11b；
（4）所述手性醇11a或11b采用TMCE做氯化试剂，发生氯化反应，得到手性翻转的氯化产物12a或12b。
合成路线为
。
本发明实施例中，通过化学方法分别对(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophane F的中间体化合物3和4进行了合成：
合成(–)-cylindrocyclophane A的中间体化合物3的起始原料3,5-二羟基苯甲醛5a为商业可得的原料，首先对其酚羟基进行苄基保护得到化合物6a，随之与Evans手性辅基发生不对称Aldol反应生成手性苄醇7a，对7a的羟基进行硅醚保护并通过NaBH4还原脱除手性辅基得到化合物8a。随后将化合物8a转化生成其三氟甲磺酸酯后进一步与烯丙基溴化镁反应生成烯烃化合物9a，再经一步铑催化的硼氢化反应可获得硼烷化合物10a，硼烷化合物10a可与酰胺酯化合物13在手性鹰爪豆碱的控制下通过硼锂交换生成碳增长的手性硼烷化合物，直接水解便可得到手性醇11a。接下来采用TMCE做氯化试剂，成功得到手性翻转的氯化产物12a，随后使用四丁基氟化铵脱除羟基的硅醚保护基，以及在Pd/C、HCO2NH4的条件下脱除酚羟基的苄基保护基，最终成功得到酶催化的关键前体3。
与中间体化合物3的合成类似，(–)-cylindrocyclophane F的中间体化合物4的合成可以商业可得的3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为起始原料，对酚羟基进行苄基保护得到化合物14b，14b被LiAlH4还原为苄醇，随后发生Appel反应生成苄溴化合物6b，6b与Evans手性辅基发生亲核取代得到酰胺7b，经LiAlH4还原脱除手性辅基得到手性醇8b。同样地，将8b转化为相应的三氟甲磺酯后，进一步与烯丙基溴化镁反应生成烯烃化合物9b，再经一步Rh催化的硼氢化反应可获得硼烷化合物10b。10b可与酰胺酯化合物13在手性鹰爪豆碱的控制下通过硼锂交换生成碳增长的手性硼烷化合物，直接水解便可得到手性醇11b。随后，手性醇11b再在TMCE做氯化试剂的条件下以高产率得到手性翻转的氯化产物12b。接下来，12b在Pd/C、HCO2NH4的较温和条件下脱除酚羟基的苄基保护基，成功得到二聚化的前体化合物4。
总的合成路线为
。
在无特别标注情况下，本发明中TMCE代表1-氯-N,N,2-三甲基-1-丙烯胺（1-chloro-N,N,2-trimethyl-1-propenylamine），TBS代表叔丁基二甲基硅基（tert-butyldimethylsilyl）。
后期的生物催化部分，本发明实施例利用傅-克烷基化酶CylK分别催化前期化学合成得到的中间体化合物3和4发生傅-克烷基化反应，得到天然产物cylindrocyclophane。
在一些实施方式中，所述CylK酶包括野生型CylK酶和/或CylK酶突变体。
在一些实施方式中，所述CylK酶突变体包括突变体L411A，所述突变体L411A氨基酸序列第411位的亮氨酸突变为丙氨酸。
在另一些实施方式中，所述CylK酶突变体包括突变体L411G，所述突变体L411G氨基酸序列第411位的亮氨酸突变为甘氨酸。
本发明的目的是发展一条简洁高效的路线实现[7.7]对环芳烷类天然产物(–)-cylindrocyclophane A (1)、(–)-cylindrocyclophane F (2)的化学-酶法合成。前期工作中，Balskus课题组研究发现CylK酶可以接受一系列间苯二酚环和仲烷基卤化物作为反应底物；在发明人前期对傅-克烷基化酶CylK的研究中，已经发展了一种可靠的CylK蛋白纯化方法，用这种方法得到的酶非常稳定，在储存几个月后仍能保持其活性。除此之外，基于晶体结构和突变体活性研究，发明人还发现CylK的L411A突变体催化底物的转化比野生型酶更好。
为了进一步验证其催化活性提高的程度，本发明详细的研究了野生型CylK、CylK的L411A和L411G突变体对底物化合物4的催化活性：
200 µL反应体系：反应buffer [25 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mMMgCl2, 10 mM CaCl2]、Cylk酶(100 μM)、底物4 (10 mM)。在相应条件下分别反应0.5 h、1h、4 h、10 h、24 h，HPLC监测分析产物2的生成，包括不同温度下的反应情况。结果如图1所示。结果表明，在37℃下，CylK的L411A突变体对底物具有更好的反应性。在后续的制备级酶催化反应中，0.5 mol%的CylK的L411A突变体酶量仍能稳定高效地催化底物4发生二聚化，该步酶催化反应最终以85%的产率获得了天然产物(–)-cylindrocyclophane F。与之类似，在37℃下，0.5 mol%的CylK的L411A突变体也能高效的催化底物3发生二聚化，以88%的产率获得了天然产物(–)-cylindrocyclophane A。
本发明实施例利用CylK-L411A突变体催化的傅-克烷基化反应实现了目标分子(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophane F的高效合成，分别以11步10%和11步24%的总产率合成(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophane F，合成效率高于已报道的该类分子的其它合成路线。而且，本发明在构建该分子中的手性中心的策略不同，这种策略还可以用于该家族其他天然产物的化学-酶法合成。与现有的合成方法相比，本发明合成路线更加简洁，总产率更高，并且对其它[7.7]对环芳烷类天然产物的合成提供借鉴意义。
在另一些实施方式中，还可以利用CylK的其它突变体，或者其已知(如CabK、MerH)或未知的同源蛋白来实现所示反应。
在另一些实施方式中，还可以通过其它化学合成手段获得中间体化合物3和4，在此不做限制，任何手段合成的化合物3和4都可以用于傅-克烷基化反应生成目标化合物(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophane F。
本发明实施例还提供一种上述合成方法在合成对环芳烷类天然产物中的应用。
在一些实施方式中，所述对环芳烷类天然产物包括(–)-cylindrocyclophane A和/或(–)-cylindrocyclophane F，所述(–)-cylindrocyclophane A、(–)-cylindrocyclophane F的结构式分别为
。/>
下面通过具体实施例对本发明一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法及其应用做进一步的解释说明。
若无特别说明，下述化学合成均采用超干溶剂，反应前均置换氩气三次使反应在氩气环境下进行。
实施例1 化学合成中间体化合物
化合物6a：在0 °C条件下，溴化苄（1.7 mL，14.4 mmol，2.0 equiv.）缓慢滴加到化合物5a（1.0 g，7.2 mmol，1.0 equiv.）、碳酸钾（3.0 g，21.6 mmol，3.0 equiv.）和18-冠醚-6（370 mg，1.4 mmol，0.2 equiv.）的丙酮（15 mL）溶液中，随后在56 °C下反应8小时，TLC监测化合物5a反应完全后向体系中加入1 mL三乙胺，在56 °C下继续反应直至溴化苄消耗完全。随后旋蒸除去反应溶剂，用适量二氯甲烷重新溶解，饱和食盐水洗涤后二氯甲烷萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 40/1）得到1.9 g（6.0 mmol，83%）白色固体。
TLC: Rf= 0.45 (hexane/EtOAc = 10/1), 磷钼酸显色。MP: 73–74 ℃. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 9.90 (s, 1H), 7.47–7.32 (m, 10H), 7.12 (d, J = 2.3 Hz,2H), 6.88 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 5.10 (s, 4H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 191.9,160.5, 138.6, 136.4, 128.8, 128.4, 127.7, 108.8, 108.5, 70.5. HRMS-ESI (m/z):[M+H]+calculated for C21H19O3 +, 319.1334; found, 319.1330.
化合物7a：在0 °C条件下，三氟甲磺酸二丁硼（0.63 mL，0.63 mmol，1.1 equiv.，1M in DCM）和N,N-二异丙基乙胺（120 µL，0.68 mmol，1.2 equiv.）依次缓慢滴加到化合物15a（133 mg，0.57 mmol，1.0 equiv.）的二氯甲烷（1.5 mL）溶液中，随后在0 °C下反应0.5小时。冷却至-78 °C，并于该温度下向体系中加入化合物6a（200 mg，0.63 mmol，1.1equiv.）的二氯甲烷（1.5 mL）溶液，在-78 °C下继续反应0.5小时，再升至室温反应1.5小时。反应结束后用pH = 7.0的磷酸盐溶液淬灭，二氯甲烷萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 10/1到5/1）得到232 mg（0.42 mmol，74%）白色固体。
TLC: Rf= 0.20 (hexane/EtOAc = 5/1), 磷钼酸显色。[α]D 25.0= −16.20 (c 0.5,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.43–7.27 (m, 13H), 7.25–7.21 (m, 2H), 6.66 (d,J = 2.3 Hz, 2H), 6.52 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 5.46 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.02 (s,4H), 4.99 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.61 (p, J = 6.7 Hz, 1H), 4.04 (td, J = 6.9,4.1 Hz, 1H), 3.07 (s, 1H), 1.59 (s, 1H), 1.16 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.84 (d, J= 6.6 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 176.5, 160.0, 152.7, 144.1, 137.0,133.2, 129.0, 128.9, 128.7, 128.1, 127.7, 125.7, 105.4, 101.6, 79.1, 74.1,70.2, 55.1, 44.7, 14.5, 10.9. HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+calculated for C34H33NO6Na+, 574.2206; found, 574.2203.
化合物8a：在室温下，2,6-二甲基吡啶（8.4 mL，72.6 mmol，10.0 equiv.）缓慢滴加到化合物7a（4.0 g，7.3 mmol，1.0 equiv.）的二氯甲烷（15 mL）溶液中，随后在0 °C下向反应体系中逐滴滴加叔丁基二甲基硅烷基三氟甲烷磺酸酯（8.3 mL，36.3 mmol，5.0equiv.），室温反应30分钟，TLC监测化合物7a反应完全后向体系中加入等体积饱和氯化铵溶液洗涤，二氯甲烷萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，简单经硅胶柱（石油醚/乙酸乙酯 = 40/1）得到约3.92 g浅褐色糖稀状固体。取该固体一半并将其重新溶解至四氢呋喃/水(2:1 v/v, 45 mL)，于0 °C下向反应体系中分批加入硼氢化钠（1.3 g，36.3 mmol，10.0 equiv.）。室温反应10小时，TLC监测反应完全后于0 °C下向体系中加入等体积饱和氯化铵溶液淬灭，乙酸乙酯萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 25/1）得到1.32 g（2.7mmol，两步74%）无色油状液体。
TLC: Rf= 0.45 (hexane/EtOAc = 5/1), 磷钼酸显色。[α]D 23.7= +22.30 (c 1.0,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46–7.31 (m, 10H), 6.58–6.55 (m, 3H), 5.10–5.00 (m, 4H), 4.75 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 10.7, 7.8 Hz, 1H), 3.43(dd, J = 10.7, 4.7 Hz, 1H), 2.02–1.95 (m, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.78 (d, J = 7.0Hz, 3H), 0.06 (s, 3H), -0.14 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 159.6, 145.5,137.1, 128.7, 128.1, 127.6, 106.0, 101.2, 77.1, 70.2, 65.6, 43.2, 26.0, 18.3,12.0, -4.5, -5.2. HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+calculated for C30H40O4SiNa+,515.2594; found, 515.2592.
化合物9a：在-78 °C条件下，三氟甲磺酸酐（0.30 mL，1.83 mmol，1.8 equiv.）逐滴滴加到化合物8a（500 mg，1.02 mmol，1.0 equiv.）和吡啶（0.15 mL，1.83 mmol，1.8equiv.）的二氯甲烷（5 mL）溶液中，随后在-78 °C下反应1小时，TLC监测化合物8a反应完全后，将体系转移至0 °C冰浴并加入5 mL水对反应进行淬灭，随后用二氯甲烷对体系萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得粗产物重新溶于3 mL四氢呋喃，在-78 °C条件下向其中依次缓慢滴加四氯合酮酸二锂溶液（1.02 mL，1.02 mmol，1equiv.，0.1 M in THF）和烯丙基溴化镁溶液（8.16 mL，8.16 mmol，8.0 equiv.，1 M inEt2O）。随后，反应体系缓慢升至室温，并于室温反应10小时。TLC监测反应完全后，在0 °C冰浴下向体系中逐滴滴加饱和氯化铵溶液以淬灭反应。随后用乙酸乙酯对体系萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 =100/1）得到441 mg（0.85 mmol，两步84%）淡黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.95 (hexane/EtOAc = 10/1), 磷钼酸显色。[α]D 23.8= +9.40 (c 1.0,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48–7.28 (m, 10H), 6.57–6.46 (m, 3H), 5.76(ddt, J = 16.9, 10.2, 6.6 Hz, 1H), 5.08–4.88 (m, 6H), 4.43 (d, J = 4.6 Hz,1H), 2.10 (tdd, J = 9.8, 7.9, 4.3 Hz, 1H), 2.06–1.92 (m, 1H), 1.71–1.59 (m,1H), 1.52–1.38 (m, 1H), 1.22–1.09 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz,3H), 0.03 (s, 3H), -0.18 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 159.5, 147.3,139.2, 137.2, 128.7, 128.0, 127.7, 114.4, 106.1, 100.8, 78.5, 70.2, 41.1,32.6, 31.7, 26.1, 18.4, 14.2, -4.3, -4.9. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calculatedfor C33H45O3Si+, 517.3138; found, 517.3137.
化合物10a：在0 °C条件下，频那醇硼烷（1.4 mL，9.84 mmol，2.0 equiv.）缓慢滴加到化合物9a（2.54 g，4.92 mmol，1.0 equiv.）和三苯基膦羰基氯化铑（174 mg，0.25mmol，0.05 equiv.）的四氢呋喃（25 mL）溶液中，随后在室温反应36小时。反应结束后在0 ℃下缓慢加入5 mL甲醇和20 mL水，乙酸乙酯萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 100/1到80/1）得到2.54g（3.94 mmol，80%）黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.80 (hexane/EtOAc = 10/1), 磷钼酸显色。[α]D 23.2= +8.80 (c 1.0,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.50–7.27 (m, 10H), 6.59–6.43 (m, 3H), 5.04 (s,4H), 4.41 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 1.62 (s, 1H), 1.41–1.35 (m, 5H), 1.25 (s,12H), 1.13–0.97 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.85–0.70 (m, 5H), 0.03 (d, J = 1.3Hz, 3H), -0.18 (d, J = 1.1 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 159.4, 147.6,137.2, 128.7, 128.0, 127.7, 106.1, 100.7, 83.0, 78.6, 70.1, 41.7, 33.3, 30.4,26.1, 25.0, 24.4, 18.4, 14.3, -4.3, -4.9. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calculatedfor C39H58BO5Si+, 645.4147; found, 645.4147.
化合物13：在室温下，正戊醇（1.83 mL，17.0 mmol，1.0 equiv.）逐滴滴加到二异丙基氨基甲酰氯（3.34 g，20.4 mmol，1.2 equiv.）和三乙胺（2.4 mL，17.3 mmol，1.02equiv.）的二氯甲烷（20 mL）溶液中，随后将该反应体系加热至回流并在该温度下反应24小时。随后将反应体系冷却至室温并加入等体积的水。用二氯甲烷对体系萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得粗产物经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 100/1）得到3.21 g（14.9 mmol，88%）淡黄色水状液体。
TLC: Rf= 0.50 (hexane/EtOAc = 10/1), 高锰酸钾显色。 1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.62 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.38–1.29 (m,4H), 1.18 (d, J = 6.9 Hz, 12H), 0.94–0.83 (m, 3H)13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ156.1, 64.8, 45.8, 28.9, 28.5, 22.4, 21.1, 14.1. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calculated for C12H26NO2 +, 216.1964; found, 216.1959.
化合物11a：在-78 °C条件下，仲丁基锂溶液（1.3 mL，1.71 mmol，2.2 equiv.，1.3M in hex）逐滴滴加到化合物13（336 mg，1.56 mmol，2.0 equiv.）和(+)-鹰爪豆碱（401mg，1.71 mmol，2.2 equiv.）的乙醚（2 mL）溶液中，随后在-78 °C下反应5小时。化合物10a（500 mg，0.78 mmol，1.0 equiv.）溶于2.5 mL乙醚并逐滴滴加至反应体系中，继续在-78 °C下反应40分钟后缓慢升至40 °C回流反应12小时。随后将体系转移至0 ℃并逐滴加入NaOH(2 M)/H2O2 (30%) (2:1 v/v, 36 mL)水溶液，室温反应1小时后于0 °C加入饱和硫代硫酸钠溶液对反应进行淬灭，随后用乙酸乙酯对体系萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得粗产物经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 40/1）得到286mg（0.47 mmol，两步61%）无色油状液体。
TLC: Rf= 0.70 (hexane/EtOAc = 5/1), 磷钼酸显色。[α]D 24.6= +11.10 (c 1.0,MeOH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48–7.27 (m, 10H), 6.58–6.44 (m, 3H), 5.04(d, J = 1.6 Hz, 4H), 4.40 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.57 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 1.60(qd, J = 4.3, 2.2 Hz, 1H), 1.52–1.14 (m, 14H), 1.09 (s, 1H), 0.91 (s, 12H),0.81 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.02 (s, 3H), -0.18 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ 159.5, 147.5, 137.2, 128.7, 128.0, 127.7, 106.1, 100.7, 78.7, 72.1, 70.1,41.7, 37.7, 37.3, 33.4, 28.0, 27.6, 26.1, 26.0, 22.9, 18.4, 14.4, 14.2, -4.3,-4.9. HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+calculated for C38H56O4SiNa+, 627.3846; found,627.3843.
化合物12a：在室温下，1-氯-N,N,2-三甲基丙烯胺（159 µL，1.2 mmol，2.0equiv.）缓慢滴加到化合物11a（363 mg，0.6 mmol，1.0 equiv.）的二氯甲烷（4 mL）溶液中，随后在室温反应10小时，TLC监测化合物11a反应完全后减压浓缩除去二氯甲烷，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 200/1）得到318 mg（0.51 mmol，85%）淡黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.75 (hexane/EtOAc = 20/1), 磷钼酸显色。[α]D 24.0= +9.10 (c 1.0,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.45–7.30 (m, 10H), 6.53–6.50 (m, 3H), 5.06–5.00 (m, 4H), 4.39 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 3.88 (p, J = 6.8, 6.1 Hz, 1H), 1.74–1.63 (m, 4H), 1.63–1.57 (m, 1H), 1.52–1.49 (m, 1H), 1.39–1.25 (m, 8H), 1.09–1.02 (m, 1H), 0.93–0.90 (m, 12H), 0.81 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.02 (s, 3H), -0.19 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 159.5, 147.4, 137.2, 128.7, 128.0,127.7, 106.1, 100.8, 78.8, 70.2, 64.4, 41.6, 38.6, 38.4, 33.2, 28.8, 27.0,26.7, 26.1, 22.4, 18.4, 14.4, 14.1, -4.3, -4.9. HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+calculated for C38H55ClO3SiNa+, 645.3507; found, 645.3505.
化合物3：在室温下，四丁基氟化铵（0.9 mL，0.9 mmol，6.0 equiv.，1 M in THF）缓慢滴加到化合物12a（93 mg，0.15 mmol，1.0 equiv.）的四氢呋喃（2 mL）溶液中，随后加热至60 °C反应4小时，TLC监测化合物12a反应完全后冷却至室温并向体系中加入2 mL饱和氯化铵溶液，乙酸乙酯萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，简单经硅胶柱（石油醚/乙酸乙酯 = 25/1）得到约57 mg淡黄色油状液体。将其全部重新溶解于四氢呋喃（3 mL），于室温下向反应体系中加入钯碳（104 mg, 10%，加约55%水湿润）。升温至40 °C，并于该温度下向体系中加入甲酸铵（141 mg，0.36 mmol，20.0 equiv.）。40 °C下反应3小时，反应完全后过滤除去固体残渣，有机相减压浓缩，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 4/1）得到34 mg（0.10 mmol，两步71%）白色固体。
TLC: Rf= 0.25 (hexane/EtOAc = 2/1), 磷钼酸显色。[α]D 25.0= −7.00 (c 0.5,MeOH).1H NMR (400 MHz, CD3OD) 6.27 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.15 (t, J = 2.2 Hz,1H), 4.25 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 3.87 (tt, J = 8.6, 4.4 Hz, 1H), 1.76–1.56 (m,5H), 1.54–1.42 (m, 2H), 1.39–1.29 (m, 7H), 1.07 (q, J = 10.6, 8.8 Hz, 1H),0.95–0.89 (m, 6H). 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ 159.2, 148.1, 106.2, 102.2,79.1, 65.0, 41.1, 39.5, 39.4, 34.1, 29.8, 27.6, 27.6, 23.3, 15.4, 14.3. HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+calculated for C18H29ClO3Na+, 351.1703; found, 351.1699.
化合物3的核磁共振氢谱图如图2所示，碳谱图如图3所示。
化合物14b、6b、7b、8b、4的制备方法参照文献[Wang, H.-Q.; Mou, S.-B.; Xiao,W.; Zhou, H.; Hou, X.-D.; Wang, S.-J.; Wang, Q.; Gao, J.; Wei, Z.; Liu, L.;Xiang, Z. Structural Basis for the Friedel−Crafts Alkylation inCylindrocyclophane Biosynthesis. ACS Catal. 2022, 12, 2108-2117.]。
化合物9b：在-78 °C条件下，三氟甲磺酸酐（3.4 mL，19.88 mmol，1.5 equiv.）逐滴滴加到化合物8b（4.8 g，13.25 mmol，1.0 equiv.）和吡啶（1.6 mL，19.88 mmol，1.5equiv.）的二氯甲烷（40 mL）溶液中，随后在-78 °C下反应1小时，TLC监测化合物8b反应完全后，将体系转移至0 °C冰浴并加入20 mL水对反应进行淬灭，随后用二氯甲烷对体系萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得粗产物重新溶于25 mL四氢呋喃，在-78 °C条件下向其中依次缓慢滴加四氯合酮酸二锂溶液（13.3 mL，1.33 mmol，0.1equiv.，0.1 M in THF）和烯丙基溴化镁溶液（79.5 mL，79.5 mmol，6.0 equiv.，1 M inEt2O）。随后，反应体系缓慢升至室温，并于室温反应10小时。TLC监测反应完全后，在0 °C冰浴下向体系中逐滴滴加饱和氯化铵溶液以淬灭反应。随后用乙酸乙酯对体系萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 =100/1）得到4.35 g（11.26 mmol，两步85%）黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.85 (hexane/EtOAc = 10/1), 磷钼酸显色。[α]D 24.2= −3.80 (c 1.0,MeOH).1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.48–7.30 (m, 10H), 6.48 (d, J = 2.3 Hz, 1H),6.42 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 5.80 (td, J = 16.9, 6.7 Hz, 1H), 5.04–4.92 (m, 6H),2.60 (dd, J = 13.4, 6.1 Hz, 1H), 2.31 (dd, J = 13.4, 8.2 Hz, 1H), 2.19–2.08(m, 1H), 2.08–2.00 (m, 1H), 1.80–1.69 (m, 1H), 1.51–1.42 (m, 1H), 1.30–1.24(m, 1H), 0.86 (d, J = 6.7 Hz, 3H).13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 159.9, 144.1,139.2, 137.3, 128.7, 128.1, 127.7, 114.4, 108.7, 99.6, 70.2, 44.1, 36.0,34.4, 31.5, 19.5. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calculated for C27H31O2 +, 387.2324;found, 387.2320.
化合物10b：在0 °C条件下，频那醇硼烷（3.4 mL，23.4 mmol，2.0 equiv.）缓慢滴加到化合物9b（4.47 g，11.6 mmol，1.0 equiv.）和三苯基膦羰基氯化铑（403 mg，0.58mmol，0.05 equiv.）的四氢呋喃（45 mL）溶液中，随后在室温反应36小时。反应结束后在0 °C下缓慢加入8 mL甲醇和30 mL水，乙酸乙酯萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 80/1到45/1）得到5.24 g（10.19 mmol，88%）黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.68 (hexane/EtOAc = 10/1), 磷钼酸显色。[α]D 23.3= −3.40 (c 1.0,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49–7.28 (m, 10H), 6.47 (s, 1H), 6.42 (d, J =2.3 Hz, 2H), 5.02 (s, 4H), 2.58 (dd, J = 13.3, 5.9 Hz, 1H), 2.27 (dd, J =13.3, 8.4 Hz, 1H), 1.69 (s, 1H), 1.45–1.26 (m, 5H), 1.25 (s, 12H), 1.20–1.09(m, 1H), 0.84–0.78 (m, 5H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 159.8, 144.3, 137.2,128.7, 128.0, 127.7, 108.6, 99.4, 83.0, 70.1, 44.2, 36.7, 34.9, 30.0, 25.0,24.4, 19.5. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calculated for C33H44BO4 +, 515.3333; found,515.3329.
化合物11b：在-78 °C条件下，仲丁基锂溶液（1.6 mL，2.13 mmol，2.2 equiv.，1.3M in hex）逐滴滴加到化合物13（418 mg，1.94 mmol，2.0 equiv.）和(+)-鹰爪豆碱（500mg，2.13 mmol，2.2 equiv.）的乙醚（2.5 mL）溶液中，随后在-78 °C下反应5小时。化合物10b（500 mg，0.97 mmol，1.0 equiv.）溶于2.5 mL乙醚并逐滴滴加至反应体系中，继续在-78 °C下反应40分钟后缓慢升至40 °C回流反应12小时。随后将体系转移至0 °C并逐滴加入NaOH (2 M)/H2O2 (30%) (2:1 v/v, 36 mL)水溶液，室温反应1小时后于0 °C加入饱和硫代硫酸钠溶液对反应进行淬灭，随后用乙酸乙酯对体系萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得粗产物经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 20/1）得到414 mg（0.87 mmol，两步90%）淡黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.55 (hexane/EtOAc = 5/1), 磷钼酸显色。[α]D 28.6= −3.00 (c 1.0,CHCl3).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.47-7.28 (m, 10H), 6.48 (t, J = 2.3 Hz, 1H),6.42 (d,J = 2.2 Hz, 2H), 5.03 (s, 4H), 3.59 (s, 1H), 2.57 (dd, J = 13.3, 6.1Hz, 1H), 2.30 (dd, J = 13.3, 8.2 Hz, 1H), 1.79-1.65 (m, 1H), 1.48-1.22 (m,14H), 1.22-1.12 (m, 1H), 0.92 (s, 3H), 0.85 (d, J = 6.6 Hz, 3H).13C NMR (101MHz, CDCl3) δ159.8, 144.2, 137.2, 128.7, 128.0, 127.7, 108.6, 99.4, 72.1,70.2, 44.2, 37.6, 37.3, 36.8, 34.9,28.0, 27.3, 26.0, 22.9, 19.6, 14.2. HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+calculated for C32H42O3Na+, 497.3032; found, 497.3028.
化合物12b：在室温下，1-氯-N,N,2-三甲基丙烯胺（24 µL，0.18 mmol，2.0equiv.）缓慢滴加到化合物11b（43 mg，0.09 mmol，1.0 equiv.）的二氯甲烷（2 mL）溶液中，随后在室温反应10小时，TLC监测化合物11b反应完全后减压浓缩除去二氯甲烷，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 200/1）得到40 mg（0.081 mmol，90%）淡黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.70 (hexane/EtOAc = 20/1), 磷钼酸显色。[α]D 24.4= −4.20 (c 1.0,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46–7.32 (m, 10H), 6.50 (s, 1H), 6.43 (s,2H), 5.04 (s, 4H), 3.90 (p, J = 6.1 Hz, 1H), 2.58 (dd, J = 13.3, 6.1 Hz, 1H),2.32 (dd, J = 13.3, 8.1 Hz, 1H), 1.79–1.66 (m, 5H), 1.55–1.49 (m, 2H), 1.43–1.29 (m, 7H), 1.22–1.11 (m, 1H), 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.6Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 159.9, 144.1, 137.2, 128.7, 128.1, 127.7,108.6, 99.5, 70.1, 64.5, 44.2, 38.6, 38.4, 36.6, 34.8, 28.8, 26.8, 26.8,22.4, 19.6, 14.1. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calculated for C32H42ClO2 +, 493.2873;found, 493.2870.
化合物4：在室温下将钯碳（385 mg, 10%，加约55%水湿润）加入到化合物12b（211mg，0.43 mmol，1.0 equiv.）的四氢呋喃（6 mL）溶液中，升温至40 °C，并于该温度下向体系中加入甲酸铵（540 mg，8.57 mmol，20.0 equiv.）。40 °C下反应3小时，反应完全后过滤除去固体残渣，有机相减压浓缩，经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 5/1）得到134 mg（0.43 mmol，99%）淡黄色油状液体。
TLC: Rf= 0.50 (hexane/EtOAc = 2/1), 磷钼酸显色。[α]D 24.1= −8.80 (c 1.0,MeOH).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.22 (s, 2H), 6.19 (s, 1H), 5.51–5.18 (m, 2H),3.95–3.84 (m, 1H), 2.48 (dd, J = 13.3, 6.2 Hz, 1H), 2.29–2.18 (m, 1H), 1.73–1.65 (m, 5H), 1.49 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 1.39–1.24 (m, 7H), 1.20–1.07 (m, 1H),0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.6 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ156.4, 145.0, 109.0, 100.4, 64.7, 43.7, 38.6, 38.4, 36.6, 34.7, 28.8, 26.8,26.7, 22.4, 19.5, 14.1. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+calculated for C18H30ClO2 +,313.1934; found, 313.1929.
化合物4的核磁共振氢谱图如图4所示，碳谱图如图5所示。
实施例2 CylK酶催化中间体化合物的傅-克烷基化反应
（1）CylK酶的表达纯化过程如下：
将pET-28a-CylK质粒（购买自金唯智公司）转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂于含卡那霉素抗性的培养基平板中，37 °C培养至长出单菌落。挑取单菌落接种于10 mL的LB液体培养基中，卡那霉素工作浓度为50 mg/L，37 °C，220 r.p.m.过夜培养。将菌液接种到1 L新鲜的LB液体培养基中，37 °C，220 r.p.m.培养至OD 600在0.6-0.8之间，然后预冷，加入0.5 mM IPTG诱导，25 °C，180 r.p.m.过夜培养。随后收集菌体，保存于−80 °C。将保存于−80 °C的菌体重悬于40 mL细胞裂解液（25 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5mM MgCl2,5% v/v glycerol, 0.5 mg/mL lysozyme, 1 mg/mL PMSF, 25 µg/mL DNAse I, and 0.1%Triton X-100）中。并使用均质机破碎，直至菌液变澄清。在4 °C，18000 r.p.m.条件下离心15分钟，去掉上清，收集白色蛋白沉淀。将蛋白沉淀用40 mL 包涵体清洗液（25 mM Tris,pH 8.0, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2% TritonX-100）重悬并清洗两次，然后将蛋白沉淀重悬于30 mL变性缓冲液（10 mM glycine, 5 mM β-mercaptoethanol）中，加入尿素，使终浓度为6.7 M。待蛋白沉淀溶解后，置于重折叠缓冲液中（50 mM Tris, pH 8.0, 5% v/vglycerol, 5 mM β-cyclodextrin, 1.4 mM β-mercaptoethanol, 1 mM CaCl2）进行复性。最后使用GE Healthcare公司的分子筛凝胶柱（Superdex 200 Increase 10×300 GLcolumn）进一步纯化，最终获得可溶性的目标蛋白CylK。
（2）CylK的体外酶活测试
反应混合物中含有200 µM底物，1.0 µM CylK酶和反应缓冲液（25 mM Tris, pH8.0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2），总体积为100 µL。反应在恒温反应器进行，根据需要设置不同温度，转速为300 r.p.m.。反应过程中定期取样30 µL，加入 60 µL冰甲醇/乙腈（甲醇:乙腈=1:1）淬灭，混匀，冰浴10分钟后，15000 r.p.m.离心10分钟，取上清用于HPLC检测。
（3）CylK突变体的选择
基于发明人前期解析的apo-CylK及其与底物复合物的晶体结构，通过对活性口袋的氨基酸进行分析，本发明发现将Leu411突变为Ala之后，提高了CylK的催化活性。
(–)-cylindrocyclophane A (1)：CylK-L411A酶提前从-80 °C冰箱取出，置于冰盒解冻。将21mg化合物3（0.064 mmol，0.4 mM）溶于4.8 mL DMSO（3%），加入到盛有153 mL反应缓冲液（25 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2）的锥形瓶中，随后加入解冻好的CylK-L411A酶（2.0 µM），轻摇混匀，放入37 °C，180 r.p.m.摇床中反应22小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯对反应体系萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得粗产物经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 2/1）得到16.5mg（0.028 mmol，88%）黄白色粉末状固体。
TLC: Rf= 0.70 (hexane/EtOAc = 1/1), 高锰酸钾显色。[α]D 26.6= −20.0 (c0.125, MeOH).1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 6.24 (s, 2H), 6.06 (s, 2H), 3.74 (d, J= 9.7 Hz, 2H), 3.19–3.10 (m, 2H), 2.09–2.02 (m, 2H), 1.98–1.88 (m, 2H), 1.61–1.52 (m, 2H), 1.50–0.99 (m, 18H), 1.07 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 0.98–0.86 (m,4H), 0.79 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.76–0.67 (m, 4H), 0.67–0.58 (m, 2H). 13C NMR(101 MHz, CD3OD) δ 158.9, 157.0, 143.9, 117.8, 109.0, 105.1, 81.9, 42.1,36.9, 35.5, 35.3, 34.9, 31.7, 30.7, 30.0, 23.9, 17.0, 14.5. HRMS-ESI (m/z):[M+Na]+calculated for C36H56O6Na+, 607.3975; found, 607.3973.
化合物(–)-cylindrocyclophane A的核磁共振氢谱图如图6所示，碳谱图如图7所示。
(–)-cylindrocyclophane F (2): CylK-L411A酶提前从-80 °C冰箱取出，置于冰盒解冻。将20 mg化合物4（0.064 mmol，0.4 mM）溶于4.8 mL DMSO（3%）,加入到盛有153 mL反应缓冲液（25 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2）的锥形瓶中，随后加入解冻好的CylK-L411A酶（2.0 µM），轻摇混匀，放入37 °C，180 r.p.m.摇床中反应17小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯对反应体系萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得粗产物经柱层析分离纯化（石油醚/乙酸乙酯 = 15/1）得到15.4 mg（0.028 mmol，88%）黄白色粉末状固体。
TLC: Rf= 0.50 (hexane/EtOAc = 5/1), 高锰酸钾显色。[α]D 24.0= −20.8 (c0.5, CH2Cl2).1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 6.02 (s, 2H), 5.98 (s, 2H), 3.16–3.06(m, 2H), 2.58 (dd, J = 13.1, 3.9 Hz, 2H), 2.02–1.89 (m, 4H), 1.83 (dd, J =13.1, 11.4 Hz, 2H), 1.61–1.54 (m, 2H), 1.50–1.00 (m, 22H), 0.94 (d, J = 6.5Hz, 6H), 0.82 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.80–0.73 (m, 4H), 0.69–0.58 (m, 2H).13CNMR (101 MHz, CD3OD) δ 158.3, 157.0, 140.9, 116.1, 110.0, 108.1, 45.9, 36.8,36.7, 36.7, 35.6, 34.9, 31.7, 30.7, 30.2, 23.9, 20.8, 14.6. HRMS-ESI (m/z):[M+H]+calculated for C36H57O4 +, 553.4257; found, 553.4255.
化合物(–)-cylindrocyclophane F的核磁共振氢谱图如图8所示，碳谱图如图9所示。
综上所述，本发明提供了一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法及其应用，通过一种化学-酶法合成路线，以实现[7.7]对环芳烷类天然产物(–)-cylindrocyclophane A、(–)-cylindrocyclophane F的高效合成。本发明基于傅-克烷基化酶CylK的催化功能，首先通过化学方法对映选择性合成了两种关键中间体，随后利用CylK酶及其突变体催化的分子间和分子内傅-克烷基化反应实现了(–)-cylindrocyclophane A和F的制备级合成。本发明能够分别以11步10%和11步24%的总产率合成(–)-cylindrocyclophane A和(–)-cylindrocyclophane F，合成效率高于已报道的该类分子的其它合成路线。而且，本发明在构建该分子中的手性中心的策略不同，这种策略还可以用于该家族其他天然产物的化学-酶法合成。与现有的合成方法相比，本发明的合成路线更加简洁，总产率更高，并且对其它[7.7]对环芳烷类天然产物的合成提供了借鉴意义。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其特征在于，所述合成方法包括步骤：
通过化学合成方法得到中间体化合物3或4；
通过CylK酶催化所述中间体化合物3或4发生傅-克烷基化反应，得到所述cylindrocyclophanes类化合物；
其中，所述中间体化合物3或4的结构式为
；
所述CylK酶包括野生型CylK酶和/或CylK酶突变体，所述CylK酶突变体包括突变体L411A，所述突变体L411A的氨基酸序列第411位的亮氨酸突变为丙氨酸；
所述化学合成方法具体步骤包括：
以3,5-二羟基苯甲醛5a为原料，合成化合物8a；或者，以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为原料，合成化合物8b；
以化合物8a或化合物8b为原料，依次经过烯烃化反应、硼氢化反应、硼锂交换反应、水解反应、氯化反应，分别生成氯化产物12a或12b；
将氯化产物12a脱除羟基的硅醚保护基以及脱除酚羟基的苄基保护基，得到中间体化合物3；或者，将氯化产物12b脱除酚羟基的苄基保护基，得到中间体化合物4；
其中，所述化合物8a的结构式为
；
以3,5-二羟基苯甲醛5a为原料，合成化合物8a的具体步骤为：
以3,5-二羟基苯甲醛5a为起始原料，对其酚羟基进行苄基保护，得到化合物6a；
所述化合物6a与Evans手性辅基发生不对称Aldol反应，生成手性苄醇7a；
对所述手性苄醇7a的羟基进行硅醚保护后，通过NaBH4还原脱除手性辅基，得到化合物8a；
合成路线为
；
所述化合物8b的结构式为
；
以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为原料，合成化合物8b的具体步骤为：
以3,5-二羟基苯甲酸甲酯5b为起始原料，对其酚羟基进行苄基保护，得到化合物14b；
所述化合物14b被LiAlH4还原为苄醇后发生Appel反应，生成苄溴化合物6b；
所述苄溴化合物6b与Evans手性辅基发生亲核取代，得到酰胺化合物7b；
所述酰胺化合物7b经LiAlH4还原，脱除手性辅基后得到化合物8b；
合成路线为
；
所述氯化产物12a或12b的结构式为
；
以化合物8a或化合物8b为原料，分别生成氯化产物12a或12b的具体步骤为：
将化合物8a或8b转化生成对应的三氟甲磺酸酯后，与烯丙基溴化镁反应，生成对应的烯烃化合物9a或9b；
所述烯烃化合物9a或9b经一步铑催化的硼氢化反应，生成对应的硼烷化合物10a或10b；
将所述硼烷化合物10a或10b分别与酰胺酯化合物13，在手性鹰爪豆碱的控制下，通过硼锂交换反应生成对应的手性硼烷化合物，之后直接水解后得到对应的手性醇11a或11b；
所述手性醇11a或11b采用TMCE做氯化试剂，发生氯化反应，得到手性翻转的氯化产物12a或12b；
合成路线为
。
2.根据权利要求1所述的cylindrocyclophanes类化合物的化学-酶法合成方法，其特征在于，所述cylindrocyclophanes类化合物包括(–)-cylindrocyclophane A和/或(–)-cylindrocyclophane F，其结构式分别为
；
所述CylK酶催化所述中间体化合物3反应得到(–)-cylindrocyclophane A，催化所述中间体化合物4反应得到(–)-cylindrocyclophane F。
3.一种如权利要求1-2任一所述的合成方法在合成对环芳烷类天然产物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述对环芳烷类天然产物包括(–)-cylindrocyclophane A和/或(–)-cylindrocyclophane F，所述(–)-cylindrocyclophaneA、(–)-cylindrocyclophane F的结构式分别为
。
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