CN113774033B - 一种将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种将脂肪酸转化为β‑羟基脂肪酸的人工生物催化剂，属于蛋白质工程领域。本发明脂肪酸β‑羟基化酶P450BSβ突变体是由野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ的氨基酸序列在第78位、85位、170位和290位突变得到的。本发明构建的生物催化剂能够以高度区域选择性和对映体选择性的方式氧化脂肪酸的β位C‑H基团。该生物催化剂具有高反应活性，以廉价的过氧化氢作为氧化剂，将底物C11‑C18链长的直链饱和脂肪酸以及油酸和亚油酸不饱和脂肪酸转化为相应的(R)‑β‑羟基脂肪酸。

Description

一种将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂
技术领域
本发明涉及一种利用过氧化氢作为氧化剂将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂，属于蛋白质工程领域。
背景技术
天然产生的β-羟基脂肪酸是一类重要的化合物，具有良好的生物活性。β-羟基脂肪酸与氨基酸或碳水化合物结合后，可产生更多具有复杂结构和生物学意义的天然产物。β-羟基脂肪酸还可以用作合成β-氨基、β-内脂、β-内酰胺等多种生物活性的脂肪酸衍生物的前体。此外β-羟基脂肪酸的聚合可以提供聚羟基链烷酸酯，可以作为可降解的生物塑料。因此β-羟基脂肪酸在天然产物合成、药物的研发和生物材料中扮演者重要的角色。
目前β-羟基脂肪酸合成主要的化学方法包括线性醛的不对称醛醇缩合反应和β-酮酯的不对称氢化，但这些方法需要过度金属和复杂的催化配体或化学计量的手型助剂。利用可再生的脂肪酸资源一步氧化生成β-羟基脂肪酸是一种理想、直接且经济的制备方法。但如何在含有多个同样C-H基团的脂肪酸中进行特定位点和特定空间方向性的实施氧化无论在化学还是生物领域都极具挑战性，且至今尚未实现。
虽然枯草芽孢杆菌的P450BSβ是首个被发现的能羟基脂肪酸的酶，但野生型P450BSβ的区域选择性差，生成的1.5：1的β-和α-羟基脂肪酸。丙酮丁醇梭菌的P450CLA也可以进行羟基化，但是区域选择性更倾向于Cα位。甲基芽孢杆菌的P450MP表现出对Cβ位的偏爱，但羟基化还会在Cα位，Cγ位，Cδ位和Cε位发生，且同时产生1-烯烃。因此，脂肪酸的高区域选择性Cβ羟基化仍未解决，更不要说更具有挑战性的空间选择性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的技术缺陷，提供一种利用过氧化氢作为氧化剂将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂，制备的脂肪酸β-羟基酶P450BSβ突变体催化产生β-羟基脂肪酸，具有反应活性高、高区域和对映体选择性、体系简单、合成效率高和成本低廉等优势。
本发明通过对P450BSβ羟基化酶的定向进化实现了对脂肪酸的未活化β位C-H键的高度区域和对映选择性地氧化。获得的P450BSβ羟基化酶突变体能够直接使用廉价的过氧化氢作为氧化剂，以C11-C18饱和脂肪酸和天然衍生的不饱和脂肪酸油酸和亚油酸为底物生成R型手性的β-羟基脂肪酸。该酶合成方法所获得的R型β-羟基脂肪酸产物能够作为原料通过简单的化学方法进一步转化为一系列的脂肪酸衍生物文库。这些(R)-β-羟基化脂酸以及它们的衍生物在天然产物合成、药物合成、可降解塑料、生物材料等方面有着重要的意义。为解决上述技术问题，本发明提供一种脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体，含有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
本发明还提供编码上述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供包含上述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的核苷酸的载体。
本发明还提供表达上述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的基因工程菌。
本发明还提供一种获得脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的方法，野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ，将第290位的甘氨酸突变成异亮氨酸，将第170位的缬氨酸突变成异亮氨酸，将第85位的谷氨酰胺突变丙氨酸，将第78位的亮氨酸突变成丙氨酸。
本发明还提供一种脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建表达野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ的质粒，并将该质粒转化到大肠杆菌中；
通过四轮定点饱和突变，构建饱和突变库，筛选到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化脂肪酸β位C-H基团的P450BSβ突变体的突变质粒；
脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的表达及纯化。
进一步的，脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的表达及纯化包括如下步骤：
将筛选到的突变质粒在LB液体培养基中过夜培养，加入TB液体培养基扩培，于对数生长期内加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；
用缓冲液将得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
将上清液加入镍离子亲和柱内，使带有His标签的目的蛋白与镍离子结合，除去杂蛋白，洗脱目的蛋白，得到脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体。
一种脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的获得及制备方法，包括以下步骤：
(1)构建表达野生型脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ的质粒：将SEQ ID NO:3核苷酸序列经酶切重组到表达载体上，并将该质粒转化到大肠杆菌中；
(2)通过四轮定点饱和突变，构建饱和突变库，筛选到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化(羟基化)脂肪酸β位C-H基团的P450BSβ突变体的突变质粒；
(3)脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的表达：将步骤(2)得到的菌种在LB液体培养基(Kan/Cam)中过夜培养，加入TB液体培养基(Kan/Cam)扩培，于对数生长期内加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；
(4)含有脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤(3)中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
(5)脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的纯化：将步骤(4)的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱内，使带有His标签的目的蛋白与镍离子结合，然后用较低浓度的咪唑除去杂蛋白，最后用高浓度咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，将洗脱下来的目的蛋白透析除去咪唑，测定目的蛋白浓度后，-80℃保存。
脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，具体步骤为：
(1)脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ基因表达载体的构建：将全基因合成的P450BSβ片段(序列如SEQ ID NO：3所示，由苏州金唯智生物有限公司合成)，经限制性内切酶NcoI和XhoI依据说明书进行酶切操作后，用T4连接酶连接到被相同酶切过的表达载体pET28a上；将连接产物转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞内；从含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有相同浓度的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，摇床转速为220rpm/min的条件下培养过夜。将培养过夜的菌液用质粒小提试剂盒提取重组质粒，将提取的质粒送测序鉴定；
(2)脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体质粒的筛选：将上述测序成功的质粒作为PCR的模板，通过Quickchange方法构建定点饱和突变质粒库，通过四轮饱和突变库筛选，得到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化(羟基化)脂肪酸β位C-H基团的P450BSβ突变体的突变质粒，并送测序鉴定；
(3)脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备：挑取-80℃超低温冰箱保存的甘油菌，接种到40ml LB液体培养基(Kan/Cam)37℃过夜培养。将过夜培养的菌液5ml接种到500ml TB培养基(Kan/Cam)，在37℃，摇床转速220rpm/min下进行扩大培养；待OD600值约为0.6时，加入250ul终浓度为0.5mM的前体ALA(δ-氨基乙酰丙酸)和500ul 1mM的IPTG诱导表达。在25℃，摇床转速220rpm/min下培养16h。5000rpm/min离心l0 min收菌，并用75ml含10％mM咪唑的buffer A(0.1M KPi，0.3M KCl，20％glycerol,pH 7.4)将菌体重悬，用超声破碎仪破碎。4℃，10000rpm/min，离心40min，获得上清液。将含目的蛋白的上清液装入事先装好的镍离子亲和柱内，使携带His标签的目的蛋白与镍离子结合。分别用含10％mM，35％mM的咪唑的buffer A除去杂蛋白，然后用buffer B(0.1M KPi，0.3M KCl，20％glycerol,250mM咪唑，pH 7.0)洗脱目的蛋白。SDS-PAGE鉴定目的蛋白纯度。将洗脱下来的目的蛋白用buffer A透析，4℃过夜，除去咪唑。蛋白分装，-80℃保存。
本发明还提供一种生产β-羟基脂肪酸的方法，以C11-C18链长的直链脂肪酸或天然存在的不饱的油酸和亚油酸作为底物，加入过氧化氢作为氧化剂，再加入反应缓冲液，用上述的脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体为催化剂进行催化反应。
进一步的，所述β-羟基脂肪酸为R型β-羟基脂肪酸。
进一步的，催化反应以5％乙醇作为助溶剂。
β-羟基化酶P450BSβ突变体催化制备β-羟基脂肪酸的方法，具体步骤为：
脂肪酸β-羟基化反应包含bufferA(0.1M KPi，0.3M KCl，pH 7.4)，纯化的β-羟基化酶P450BSβ突变体(4μM)，底物(4mM)，Triton X-100(0.5％)，5％乙醇作为助溶剂和过氧化氢(5mM×2次，间隔时间5min加入第二次)。在室温下以100mL的最终体积，反应45min。在相同条件下进行十二烷酸和十四烷酸羟基化的大规模反应，不同的是底物浓度为5mM，酶为3uM，Triton X-100(0.625％)。HCl淬灭后，取出1mL反应混合物，萃取，用TMSCHN2处理，并通过GC和GC-MS进行分析。剩余的反应溶液用乙酸乙酯萃取，用无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并通过硅胶柱色谱法纯化(己烷：乙酸乙酯：乙酸＝80∶20∶1)，得到β-羟基脂肪酸，为白色固体。
本发明还提供上述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体在合成R型β-羟基脂肪酸及衍生物的应用。
进一步的，β-羟基脂肪酸及衍生物为R型1,3-脂肪二醇、S型β-氨基脂肪酸、R型β-脂肪内酯、S型β-羟基脂肪酸、S型β-脂肪内酰胺。
进一步的，所述β-羟基脂肪酸及衍生物为(R)-十四烷-1,3-二醇、(S)-3-氨基十四烷酸甲酯、(S)-4-十一烷基氮杂环丁烷-2-酮、(R)-4-壬基氧杂环丁烷-2-酮或(S)-3-羟基十二烷酸甲酯。
本发明还提供上述β-羟基化酶P450BSβ突变体在制备其他脂肪酸衍生物的应用。
本发明脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体是由野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ的氨基酸序列在第290位、170位、85位和78位突变得到的。P450BSβ羟化酶突变体反应活性高，直接使用廉价的过氧化氢作为氧化剂将C11-C18饱和脂肪酸和天然衍生的不饱和脂肪酸油酸和亚油酸为底物直接转化为相应的β-羟基脂肪酸。P450BSβ羟化酶的定向进化实现了对脂肪酸的未活化β位C-H键高度区域和对映选择性的氧化，而这是化学及生物合成方法至今尚未实现的。所得到的手性β-羟基脂肪酸运用简单的化学反应进一步可以得到一系列的脂肪酸衍生物文库，该文库具有生物活性分子中普遍存在的结构多样的β-官能团。通过P450BSβ羟基化酶催化脂肪酸和进一步的化学反应的结合可以获得廉价且多样化的产品。因反应活性高、高选择性、成本低廉，在合成β-羟基脂肪酸及后续衍生物方面具有良好的工业生产前景。
本发明所达到的有益效果：
(1)本发明构建的生物催化剂直接利用廉价过氧化氢作为氧化剂、C11-C18链长的直链饱和脂肪酸以及油酸和亚油酸不饱和脂肪酸为底物，直接合成β-羟基脂肪酸，具有反应活性高、高度区域选择性和对映体选择性、价格低廉。
(2)该新型酶脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体将脂肪酸催化合成β-羟基脂肪酸，无需伴侣和辅助因子，反应体系简单。
(3)该新型酶脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体将脂肪酸催化合成β-羟基脂肪酸，通过进一步的化学反应可以获得手性的1,3-二醇、β-氨基、β-内酯和β-内酰胺对映体等有价值的脂肪酸衍生物。
附图说明
图1为β-羟基脂肪酸衍生物流程图。
具体实施方式
下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
除非特定说明，以下所有的化合物和试剂都是从生工生物工程(上海)有限公司，Sigma-Aldrich,Tokyo Chemical Industry,EMD Millipore，New England Biolabs购买。
实施例1P450BSβ基因表达载体的构建
将全基因合成的P450BSβ片段(序列如SEQ ID NO：3所示，由苏州金唯智生物有限公司合成)，经限制性内切酶NcoI和XhoI(New England Biolabs公司)依据说明书进行双酶切操作，用T4连接酶(New England Biolabs公司)连接到被NcoI和XhoI双酶切过的表达载体pET28a上。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)。从含有50μg/ml卡那霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，摇床转速为220rpm/min的条件下培养过夜。从培养过夜的菌液中用质粒小抽试剂盒(天根生化科技有限公司)，依据说明书提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定(苏州金唯智生物有限公司)。
实施例2P450BSβ突变体蛋白的大量表达纯化
挑取-80℃超低温冰箱保存的甘油菌，接种到40ml TB液体培养基
(Kan/Cam)37℃过夜培养。将过夜培养的菌液接种到500ml TB培养基(Kan/Cam)，在37℃，摇床转速220rpm/min下进行扩大培养；待OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的前体ALA(δ-氨基乙酰丙酸)和1mM的IPTG诱导表达，在25℃，摇床转速为220rpm/min下培养16h。5000rpm/min离心l0 min，收菌，并用75ml的buffer A(0.1M KPi，0.3M KCl，20％glycerol,pH 7.4)将菌体重悬，之后利用超声进行破碎。4℃，10000rpm/min，离心40min，获得上清液。将含有目的蛋白的上清装入事先装好的镍离子亲和柱内，使携带His标签的目的蛋白与镍离子结合。分别用含10mM，35mM的咪唑的buffer A除去杂蛋白，然后用buffer B(0.1M KPi，0.3M KCl，20％glycerol,250mM咪唑，pH 7.4)将目的蛋白洗脱下来。SDS-PAGE鉴定目的蛋白纯度。将洗脱下来的目的蛋白用buffer A透析，除去咪唑，4℃过夜。蛋白分装，-80℃保存。蛋白的浓度通过P450-CO法测定。
实施例3β-羟基化酶P450BSβ突变体催化生成β-羟基脂肪酸
脂肪酸β-羟基化反应包含bufferA，纯化的β-羟基化酶P450BSβ突变体(4μM)，底物(4mM)，Triton X-100(0.5％)，5％乙醇作为助溶剂，过氧化氢(5mM×2，间隔时间＝5min)。在室温下以100mL的最终体积进行反应45min。在相同条件下进行十二烷酸(200mg，1.0mmol)和十四烷酸(570mg，2.50mmol)羟化反应的大规模反应，不同的是底物浓度为5mM，酶为3uM，Triton X-100(0.625％)。HCl淬灭后，取出1mL反应混合物，萃取，用TMSCHN2处理，并通过GC和GC-MS进行分析。剩余的反应溶液用乙酸乙酯萃取，用无水MgSO4干燥并过滤。将滤液真空浓缩，并通过硅胶柱色谱法纯化(己烷：乙酸乙酯：乙酸＝80∶20∶1)，得到β-羟基脂肪酸，为白色固体。实验结果详见表1。
表1不同底物下β-羟基化酶P450BSβ突变体催化β-羟基脂肪酸体系
[a]反应条件：β-羟基化P450BSβ突变体(4μM)，底物(4mM)，过氧化氢(5mM×2)，0.1MKPi(pH 7.4)，0.3M KCl，0.5％TritonX-100，5％乙醇(助溶剂)，100ml，室温，45min。[c]通过手性HPLC测定。[d]通过粗产物1H-NMR测定。[e]由GC确定。[f]1mmol(200mg级别)。[g]2.5mmol(570mg级别)。
实施例4β-羟基化P450BSβ突变体产物鉴定分析
取出500μl萃取后的乙酸乙酯萃取液加入200μl的甲醇，混匀后加入75μl10％的三甲基硅重氮甲烷的正己烷溶液进行酯化。取样，通过气相色谱进行检测和定量。色谱柱：DB-WAX。程序：40℃保持1min，10℃min-1到250℃保持15min，总时间40min。1-十四烯的出峰位置为12.0min，α-羟基化产物的出峰位置为23.3min，β-羟基化产物的出峰位置为24.0min。在以C11-C18脂肪酸以及油酸亚油酸为底物的反应过程中，反应结束后，用5N的HCl终止反应并用等体积的乙酸乙酯进行萃取。取样，通过气相色谱对相应的β-羟基脂肪酸定量。色谱柱：TG-5MS。程序：60℃保持1min，20℃min-1到320℃，总时间14min。手性高效液相色谱在Agilent 1260Infinity仪器上使用CHIRALPAK IA色谱柱(Daicel，4.6×250mm，5μm色谱柱)在己烷和异丙醇(异丙醇：己烷：＝1:99/1.5:98.5)下进行，作为流动相(流速：1.0mL min-1，检测：210nm)。为了进行紫外线检测，按照公开的程序，将由酶促反应制备的纯化的β-羟基脂肪酸及其消旋标准物转化为相应的苄基酯。将经硅胶柱纯化得到的β-羟基脂肪酸用CDCl3溶解并转移至核磁管内在Agilent DD2 400MHz核磁共振谱仪上记录1H-和13C-NMR谱。
实施例5β-羟基脂肪酸衍生物的合成
(R)-十四烷-1,3-二醇的合成
在干燥的10mL圆底烧瓶中装入硼烷二甲基硫醚(320μL，2M的THF，0.64mmol，3.20eq)，硼酸三甲酯(68μL，0.60mmol，3.00eq)，和THF(1mL)，然后冷却至0℃。将(R)-3-羟基十四烷酸(49mg，0.20mmol，1.00eq)的THF(1mL)溶液滴加到反应混合物中。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜。用甲醇(0.1mL)淬灭反应，真空浓缩。通过硅胶柱(EtOAc：己烷＝40:60)纯化粗混合物，得到(R)-十四烷-1,3-二醇，为无色油状物(44mg，0.19mmol，95％)。
(S)-3-氨基十四烷酸甲酯
在室温下将TMSCL(64μL，0.5mmol，5.0eq)加入(S)-4-十一烷基氮杂环丁烷-2-酮(22mg，0.10mmol，1.0eq)的无水MeOH(2ml)溶液中，将混合物搅拌16h。然后真空除去挥发性组分，并加入CH2Cl2。溶液用饱和NaHCO3萃取，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，并通过硅胶柱色谱法纯化(EtOAc∶己烷＝90∶10)，得到(S)-3-氨基十四烷酸甲酯，结晶油状(23mg，0.09mmol，90％)。
(S)-4-十一烷基氮杂环丁烷-2-酮
在干燥的烧瓶中，将(R)-3-羟基十四酸(49mg，0.20mmol，1.0eq)，O-苄基羟胺盐酸盐(35mg，0.22mmol，1.1eq)和LiOH(5mg，0.20mmol，1.0eq)溶解在THF(0.12mL)和水(0.34mL)中，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，50mg，0.26mmol，1.3eq)加入。通过TLC监测反应直至羟基酸完全转化。浓缩反应溶液，与甲苯共沸3次，直接用于下一步。在另一容器中，将偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，43μL，0.22mmol，1.1eq)在0℃下缓慢加入PPh3(58mg，0.22mmol，1.1eq)的溶液中，在添加过程中形成白色固体。然后缓慢加入异羟肟酸酯中间体的THF溶液。添加完成后，将反应恢复室温。18h后，将溶液用EtOAc和水萃取，并将有机层用柠檬酸(1N，10mL)，饱和NaHCO3和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩。产物通过硅胶柱纯化(EtOAc∶己烷＝25∶75)，得到N-苄氧基β-内酰胺，为无色油状。在0℃下，向N-苄氧基β-内酰胺THF(2mL)和脱氧水(66μL)的溶液中添加SmI2(0.1M，7.0mL，0.7mmol，5.0eq)的THF溶液蓝色持续存在。1h后，将溶液在EtOAc和饱和NaHCO3萃取。有机层用饱和Na2S2O3和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，并通过硅胶柱色谱法纯化(EtOAc∶己烷＝25∶75)，得到(S)-4-十一烷基氮杂环丁烷-2-酮，为白色固体(32mg，0.14mmol，70％，2steps)
(R)-4-壬基氧杂环丁烷-2-酮
在干燥的烧瓶中，将2,2'-二硫二吡啶(66mg，0.30mmol，1.5eq)和三苯基膦(PPh3，84mg，0.32mmol，1.6eq)在环境温度下于无水氯仿(2mL)中溶解。N2下缓慢加入(R)-3-羟基十二烷酸(43mg，0.20mmol，1.0eq)。30min后，将得到的黄色溶液在50℃N2下滴加到剧烈搅拌的甲基磺酸汞(II)(156mg，0.400mmol，2.0eq)在无水乙腈(4.8mL)中的悬浮液中。在50℃下20min后，将反应混合物过滤并将白色沉淀物用氯仿洗涤几次。溶剂蒸发后，将粗混合物通过硅胶柱色谱纯化(EtOAc：己烷＝5:95)，得到(R)-4-壬基氧杂环丁烷-2-酮，为黄色油状物(32mg，0.16mmol，80％)。
(S)-3-羟基十二烷酸甲酯
将(R)-3-羟基十二烷酸(43mg，0.20mmol，1.0eq)溶解在甲醇(1mL)中，并加入TMSCHN2(0.5mL，2M的己烷溶液，1.0mmol，5.0eq)。将反应混合物在室温搅拌4h。反应完成后，真空除去溶剂。将获得的粗产物浓缩并直接用于下一步。向所得残余物(0.2mmol，1.0eq)的搅拌溶液中，加入PPh 3(79mg，0.3mmol，1.5eq)和对硝基苯甲酸(50mg，0.3mmol，1.5eq)的THF(1mL)溶液。在0℃下偶氮二甲酸二异丙酯(55μL，0.3mmol，1.5eq)。16h后，将反应用饱和NaHCO3淬灭，并将混合物用EtOAc萃取。萃取液依次用水和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，并通过使用硅胶柱纯化(EtOAc∶己烷＝5∶95)，得到产物，为白色固体。然后将白色固体溶于MeOH/THF(5:1，1.2mL)。在0℃下将K2CO3(6mg，0.04mmol)加入溶液中，并将所得混合物在室温搅拌4h。将混合物通过硅藻土垫过滤，并将滤饼用EtOAc洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(EtOAc∶己烷＝15∶85)，得到无色油状的(S)3-羟基十二烷酸甲酯(23mg，0.1mmol，50％，3steps)。
以上显示出了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本发明构建的生物催化剂可以利用C11-C18链长的直链饱和脂肪酸以及油酸和亚油酸不饱和脂肪酸为底物、以过氧化氢作氧化剂，一步合成β-羟基脂肪酸的方法具有的优点有：1)具有反应活性高、高度区域选择性和对映体选择性、价格低廉。2)该新型酶脂肪酸羟基化酶P450BSβ突变体将脂肪酸催化合成β-羟基脂肪酸，无需伴侣蛋白和辅助因子，反应体系简单。3)该新型酶脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体将脂肪酸催化合成β-羟基脂肪酸，通过进一步的化学催化可以获得1,3-二醇、β-氨基、β-内酯和β-内酰胺对映体等有价值的脂肪酸衍生物。其在天然产物合成、药物合成、可降解塑料、生物材料等方面有着重要的意义。
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
ATGAATGAGCAGATTCCACATGACAAAAGTCTCGATAACAGTCTGACACTGCTGAAGGA
AGGGTATTTATTTATTAAAAACAGAACAGAGCGCTACAATTCAGATCTGTTTCAGGCCCG
TTTGTTGGGAAAAAACTTTATTTGCATGACTGGCGCTGAGGCGGCGAAGGTGTTTTATGA
TACGGATCGATTCCAGCGGCAGAACGCTTTGCCTAAGCGGGTGCAGAAATCGGCATTTG
GTGTTAATGCGATTGCAGGAATGGATGGCAGCGCGCATATCCATCGGAAGATGCTTTTTC
TGTCATTGATGACACCGCCGCATCAAAAACGTTTGGCTGAGTTGATGACAGAGGAGTGG
AAAGCAGCAGTCACAAGATGGGAGAAGGCAGATGAGGTTGTGTTATTTGAAGAAGCAA
AAGAAATCCTGTGCCGGGTAGCGTGCTATTGGGCAGGTGTTCCGTTGAAGGAAACGGA
AGTCAAAGAGAGAGCGGATGACTTCATTGACATGATAGACGCGTTCGGTGCTGTGGGAC
CGCGGCATTGGAAAGGAAGAAGAGCAAGGCCGCGTGCGGAAGAGTGGATTGAAGTCA
TGATTGAAGATGCTCGTGCCGGCTTGCTGAAAACGACTTCCGGAACAGCGCTGCATGAA
ATGGCTTTTCACACACAAGAAGATGGAAGCCAGCTGGATTCCCGCATGGCAGCCATTGA
GCTGATTAATGTACTGCGGCCTATTGTCGCCATTTCTTACTTTCTGGTGTTTTCAGCTTTG
GCGCTTCATGAGCATCCGAAGTATAAGGAATGGCTGCGGTCTGGAAACAGCCGGGAAA
GAGAAATGTTTGTGCAGGAGGTCCGCAGATATTATCCGTTCATTCCGTTTTTAGGGGCGC
TTGTCAAAAAAGATTTTGTATGGAATAACTGTGAGTTTAAGAAGGGCACATCGGTGCTG
CTTGATTTATATGGAACGAACCACGACCCTCGTCTATGGGATCATCCCGATGAATTCCGG
CCGGAACGATTTGCGGAGCGGGAAGAAAATCTGTTTGATATGATTCCTCAAGGCGGGGG
GCACGCCGAGAAAGGCCACCGCTGTCCAGGGGAAGGCATTACAATTGAAGTCATGAAA
GCGAGCCTGGATTTCCTCGTCCATCAGATTGAATACGATGTTCCGGAACAATCACTGCAT
TACAGTCTCGCCAGAATGCCATCATTGCCTGAAAGCGGCTTCGTAATGAGCGGAATCAGACGAAAAAGTTAA。
SEQ ID NO:3
ATGAATGAGCAGATTCCACATGACAAAAGTCTCGATAACAGTCTGACACTGCTGAAGGA
AGGGTATTTATTTATTAAAAACAGAACAGAGCGCTACAATTCAGATCTGTTTCAGGCCCG
TTTGTTGGGAAAAAACTTTATTTGCATGACTGGCGCTGAGGCGGCGAAGGTGTTTTATGA
TACGGATCGATTCCAGCGGCAGAACGCTTTGCCTAAGCGGGTGCAGAAATCGCTGTTTG
GTGTTAATGCGATTCAGGGAATGGATGGCAGCGCGCATATCCATCGGAAGATGCTTTTTC
TGTCATTGATGACACCGCCGCATCAAAAACGTTTGGCTGAGTTGATGACAGAGGAGTGG
AAAGCAGCAGTCACAAGATGGGAGAAGGCAGATGAGGTTGTGTTATTTGAAGAAGCAA
AAGAAATCCTGTGCCGGGTAGCGTGCTATTGGGCAGGTGTTCCGTTGAAGGAAACGGA
AGTCAAAGAGAGAGCGGATGACTTCATTGACATGGTCGACGCGTTCGGTGCTGTGGGA
CCGCGGCATTGGAAAGGAAGAAGAGCAAGGCCGCGTGCGGAAGAGTGGATTGAAGTC
ATGATTGAAGATGCTCGTGCCGGCTTGCTGAAAACGACTTCCGGAACAGCGCTGCATGA
AATGGCTTTTCACACACAAGAAGATGGAAGCCAGCTGGATTCCCGCATGGCAGCCATTG
AGCTGATTAATGTACTGCGGCCTATTGTCGCCATTTCTTACTTTCTGGTGTTTTCAGCTTT
GGCGCTTCATGAGCATCCGAAGTATAAGGAATGGCTGCGGTCTGGAAACAGCCGGGAA
AGAGAAATGTTTGTGCAGGAGGTCCGCAGATATTATCCGTTCGGCCCGTTTTTAGGGGCG
CTTGTCAAAAAAGATTTTGTATGGAATAACTGTGAGTTTAAGAAGGGCACATCGGTGCT
GCTTGATTTATATGGAACGAACCACGACCCTCGTCTATGGGATCATCCCGATGAATTCCG
GCCGGAACGATTTGCGGAGCGGGAAGAAAATCTGTTTGATATGATTCCTCAAGGCGGGG
GGCACGCCGAGAAAGGCCACCGCTGTCCAGGGGAAGGCATTACAATTGAAGTCATGAA
AGCGAGCCTGGATTTCCTCGTCCATCAGATTGAATACGATGTTCCGGAACAATCACTGCA
TTACAGTCTCGCCAGAATGCCATCATTGCCTGAAAGCGGCTTCGTAATGAGCGGAATCAGACGAAAAAGTTAA。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 合肥生融生物科技有限公司
<120> 一种将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asn Glu Gln Ile Pro His Asp Lys Ser Leu Asp Asn Ser Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Phe Ile Lys Asn Arg Thr Glu Arg Tyr
20 25 30
Asn Ser Asp Leu Phe Gln Ala Arg Leu Leu Gly Lys Asn Phe Ile Cys
35 40 45
Met Thr Gly Ala Glu Ala Ala Lys Val Phe Tyr Asp Thr Asp Arg Phe
50 55 60
Gln Arg Gln Asn Ala Leu Pro Lys Arg Val Gln Lys Ser Ala Phe Gly
65 70 75 80
Val Asn Ala Ile Ala Gly Met Asp Gly Ser Ala His Ile His Arg Lys
85 90 95
Met Leu Phe Leu Ser Leu Met Thr Pro Pro His Gln Lys Arg Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Met Thr Glu Glu Trp Lys Ala Ala Val Thr Arg Trp Glu Lys
115 120 125
Ala Asp Glu Val Val Leu Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Leu Cys Arg
130 135 140
Val Ala Cys Tyr Trp Ala Gly Val Pro Leu Lys Glu Thr Glu Val Lys
145 150 155 160
Glu Arg Ala Asp Asp Phe Ile Asp Met Ile Asp Ala Phe Gly Ala Val
165 170 175
Gly Pro Arg His Trp Lys Gly Arg Arg Ala Arg Pro Arg Ala Glu Glu
180 185 190
Trp Ile Glu Val Met Ile Glu Asp Ala Arg Ala Gly Leu Leu Lys Thr
195 200 205
Thr Ser Gly Thr Ala Leu His Glu Met Ala Phe His Thr Gln Glu Asp
210 215 220
Gly Ser Gln Leu Asp Ser Arg Met Ala Ala Ile Glu Leu Ile Asn Val
225 230 235 240
Leu Arg Pro Ile Val Ala Ile Ser Tyr Phe Leu Val Phe Ser Ala Leu
245 250 255
Ala Leu His Glu His Pro Lys Tyr Lys Glu Trp Leu Arg Ser Gly Asn
260 265 270
Ser Arg Glu Arg Glu Met Phe Val Gln Glu Val Arg Arg Tyr Tyr Pro
275 280 285
Phe Ile Pro Phe Leu Gly Ala Leu Val Lys Lys Asp Phe Val Trp Asn
290 295 300
Asn Cys Glu Phe Lys Lys Gly Thr Ser Val Leu Leu Asp Leu Tyr Gly
305 310 315 320
Thr Asn His Asp Pro Arg Leu Trp Asp His Pro Asp Glu Phe Arg Pro
325 330 335
Glu Arg Phe Ala Glu Arg Glu Glu Asn Leu Phe Asp Met Ile Pro Gln
340 345 350
Gly Gly Gly His Ala Glu Lys Gly His Arg Cys Pro Gly Glu Gly Ile
355 360 365
Thr Ile Glu Val Met Lys Ala Ser Leu Asp Phe Leu Val His Gln Ile
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Pro Glu Gln Ser Leu His Tyr Ser Leu Ala Arg Met
385 390 395 400
Pro Ser Leu Pro Glu Ser Gly Phe Val Met Ser Gly Ile Arg Arg Lys
405 410 415
Ser
<210> 2
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaatgagc agattccaca tgacaaaagt ctcgataaca gtctgacact gctgaaggaa 60
gggtatttat ttattaaaaa cagaacagag cgctacaatt cagatctgtt tcaggcccgt 120
ttgttgggaa aaaactttat ttgcatgact ggcgctgagg cggcgaaggt gttttatgat 180
acggatcgat tccagcggca gaacgctttg cctaagcggg tgcagaaatc ggcatttggt 240
gttaatgcga ttgcaggaat ggatggcagc gcgcatatcc atcggaagat gctttttctg 300
tcattgatga caccgccgca tcaaaaacgt ttggctgagt tgatgacaga ggagtggaaa 360
gcagcagtca caagatggga gaaggcagat gaggttgtgt tatttgaaga agcaaaagaa 420
atcctgtgcc gggtagcgtg ctattgggca ggtgttccgt tgaaggaaac ggaagtcaaa 480
gagagagcgg atgacttcat tgacatgata gacgcgttcg gtgctgtggg accgcggcat 540
tggaaaggaa gaagagcaag gccgcgtgcg gaagagtgga ttgaagtcat gattgaagat 600
gctcgtgccg gcttgctgaa aacgacttcc ggaacagcgc tgcatgaaat ggcttttcac 660
acacaagaag atggaagcca gctggattcc cgcatggcag ccattgagct gattaatgta 720
ctgcggccta ttgtcgccat ttcttacttt ctggtgtttt cagctttggc gcttcatgag 780
catccgaagt ataaggaatg gctgcggtct ggaaacagcc gggaaagaga aatgtttgtg 840
caggaggtcc gcagatatta tccgttcatt ccgtttttag gggcgcttgt caaaaaagat 900
tttgtatgga ataactgtga gtttaagaag ggcacatcgg tgctgcttga tttatatgga 960
acgaaccacg accctcgtct atgggatcat cccgatgaat tccggccgga acgatttgcg 1020
gagcgggaag aaaatctgtt tgatatgatt cctcaaggcg gggggcacgc cgagaaaggc 1080
caccgctgtc caggggaagg cattacaatt gaagtcatga aagcgagcct ggatttcctc 1140
gtccatcaga ttgaatacga tgttccggaa caatcactgc attacagtct cgccagaatg 1200
ccatcattgc ctgaaagcgg cttcgtaatg agcggaatca gacgaaaaag ttaa 1254
<210> 3
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaatgagc agattccaca tgacaaaagt ctcgataaca gtctgacact gctgaaggaa 60
gggtatttat ttattaaaaa cagaacagag cgctacaatt cagatctgtt tcaggcccgt 120
ttgttgggaa aaaactttat ttgcatgact ggcgctgagg cggcgaaggt gttttatgat 180
acggatcgat tccagcggca gaacgctttg cctaagcggg tgcagaaatc gctgtttggt 240
gttaatgcga ttcagggaat ggatggcagc gcgcatatcc atcggaagat gctttttctg 300
tcattgatga caccgccgca tcaaaaacgt ttggctgagt tgatgacaga ggagtggaaa 360
gcagcagtca caagatggga gaaggcagat gaggttgtgt tatttgaaga agcaaaagaa 420
atcctgtgcc gggtagcgtg ctattgggca ggtgttccgt tgaaggaaac ggaagtcaaa 480
gagagagcgg atgacttcat tgacatggtc gacgcgttcg gtgctgtggg accgcggcat 540
tggaaaggaa gaagagcaag gccgcgtgcg gaagagtgga ttgaagtcat gattgaagat 600
gctcgtgccg gcttgctgaa aacgacttcc ggaacagcgc tgcatgaaat ggcttttcac 660
acacaagaag atggaagcca gctggattcc cgcatggcag ccattgagct gattaatgta 720
ctgcggccta ttgtcgccat ttcttacttt ctggtgtttt cagctttggc gcttcatgag 780
catccgaagt ataaggaatg gctgcggtct ggaaacagcc gggaaagaga aatgtttgtg 840
caggaggtcc gcagatatta tccgttcggc ccgtttttag gggcgcttgt caaaaaagat 900
tttgtatgga ataactgtga gtttaagaag ggcacatcgg tgctgcttga tttatatgga 960
acgaaccacg accctcgtct atgggatcat cccgatgaat tccggccgga acgatttgcg 1020
gagcgggaag aaaatctgtt tgatatgatt cctcaaggcg gggggcacgc cgagaaaggc 1080
caccgctgtc caggggaagg cattacaatt gaagtcatga aagcgagcct ggatttcctc 1140
gtccatcaga ttgaatacga tgttccggaa caatcactgc attacagtct cgccagaatg 1200
ccatcattgc ctgaaagcgg cttcgtaatg agcggaatca gacgaaaaag ttaa 1254

Claims (9)

1. 一种脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体，其特征在于，所述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2. 一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体，所述核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 如权利要求1所述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，其特征在于，将野生型的P450BSβ第290位的甘氨酸突变成异亮氨酸，将第170位的缬氨酸突变成异亮氨酸，将第85位的谷氨酰胺突变丙氨酸，将第78位的亮氨酸突变成丙氨酸；野生型的P450BSβ的序列如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求1所述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建表达野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ的质粒，并将该质粒转化到大肠杆菌中；野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ的序列如SEQ ID NO:3所示；
通过四轮定点饱和突变，构建饱和突变库，筛选到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化脂肪酸β位C-H基团的P450BSβ突变体的突变质粒；
脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的表达及纯化。
5.根据权利要求4所述的脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，其特征在于，脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的表达及纯化包括如下步骤：
将筛选到的突变质粒在LB液体培养基中过夜培养，加入TB液体培养基扩培，于对数生长期内加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；
用缓冲液将得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
将上清液加入镍离子亲和柱内，使带有His标签的目的蛋白与镍离子结合，除去杂蛋白，洗脱目的蛋白，得到脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体。
6.一种生产β-羟基脂肪酸的方法，其特征在于，以C11-C18链长的直链饱和脂肪酸或不饱和的油酸、亚油酸作为底物，将过氧化氢作为氧化剂，以权利要求1所述的脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体为催化剂进行催化反应。
7.根据权利要求6所述的生产β-羟基脂肪酸的方法，其特征在于，所述β-羟基脂肪酸为R型β-羟基脂肪酸。
8.根据权利要求6所述的生产β-羟基脂肪酸的方法，其特征在于，催化反应以5％乙醇作为助溶剂。
9.根据权利要求1所述的脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体在合成β-羟基脂肪酸及衍生物的应用；β-羟基脂肪酸及衍生物选自R型1,3-脂肪二醇、S型β-氨基脂肪酸、R型β-脂肪内酯、S型β-羟基脂肪酸、S型β-脂肪内酰胺。
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GR01 Patent grant
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