CN114381441B - 酶催化合成手性氨基醇化合物 - Google Patents

酶催化合成手性氨基醇化合物 Download PDF

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Abstract

本发明公布了生物催化剂催化α‑羟基酮与小分子胺反应生成光学纯手性氨基醇化合物的方法。更具体地，本发明提供了一种亚胺还原酶催化不同种类的α‑羟基酮与小分子胺还原胺化反应生成手性氨基醇的方法。本方法具有反应条件温和、立体选择性好、无污染等显著特点。

Description

酶催化合成手性氨基醇化合物
技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及利用生物催化剂亚胺还原酶催化α-羟基酮与小分子胺反应生成光学纯手性氨基醇化合物。
背景技术
手性氨基醇化合物是一类应用极其广泛的化合物。近年来，随着人们对手性化合物研究的深入，手性氨基醇化合物的应用也有更多的研究。手性氨基醇做为手性助剂或手性配体，在各种不对称合成中起着重要的作用。除此之外，手性氨基醇经常存在于次级代谢产物和活性药物成分中，很多具有手性邻氨基醇结构的天然产物都有一定的生理活性，如麻黄碱从麻草中提取出来，主要用作感冒药和止咳药；Bestatin是具有二肽结构的化合物，可以在临床上辅助癌症化疗；Hapalosin是从绿蓝藻中提取的化合物，也是一种抗癌药物；Sulfobacin B是一类含邻氨基醇的类脂化合物，具有抗血栓的作用；大多数治心律失常的药物也含有氨基醇结构，如索他洛尔、普萘洛尔、盐酸美西津和马来酸噻吗洛尔，它们都具有很好的临床效果；甲砜霉素、氯霉素和氟苯尼考是广谱抗生素，临床上广泛用于预防和治疗动物感染性疾病，它们也是含有氨基醇结构的化合物。
手性氨基醇化合物因其具有独特的生理活性而被广泛应用于药物的合成。目前报道的文献中，手性氨基醇化合物的合成主要有化学法和生物法。根据文献报道，化学合成手性氨基醇的方法主要有以下几种：通过还原氨基酸及其衍生物来合成，如利用LiAlH4还原氨基酸酯合成氨基醇化合物；通过采用醛或酮和亚胺或硝基物的偶合反应来合成，经典有机反应Henry反应的一个例子是醛和硝基化合物在手性Lewis酸的催化作用下可以得到顺式邻羟基硝基化合物，这类化合物再经还原可以得到氨基醇类化合物；通过环氧化合物的氨化开环来合成，这是制备邻氨基醇的一种常用方法，如环氧丙烷氨化制备异丙醇胺是很成熟的技术；通过氮杂环丙烷衍生物和含氧的亲核试剂开环反应也可以生成氨基醇化合物；此外，以α-氨基(硝基)羰基化合物、α-羟基亚胺衍生物原料也可以得到氨基醇化合物。生物法合成氨基醇化合物主要是通过酶催化反应。脂肪酶和酰化酶被用于催化合成光学纯的手性邻氨基醇化合物通过动力学拆分，但是产物得率最大只能到50％；ω-转氨酶被报道也可以催化合成手性邻氨基醇，但是存在得率低、副产物多等问题；ω-转氨酶和脱羧酶、转酮醇酶串联反应也可以得到手性氨基醇化合物；Arnold研究团队报告了利用细胞色素c将烯烃转化生成氨基醇化合物的方法；最近，许建和课题组开发了一种利用胺脱氢酶合成手性邻氨基醇的新方法，合成一系列氨基醇化合物。与化学合成相比，生物催化具有反应条件温和、立体选择性好等优点，生物催化剂成为手性氨基醇化合物合成的一个有利工具。
发明内容
本发明提供了可以产生10种不同亚胺还原酶的基因工程菌，以及利用这些菌体制备不同手性氨基醇化合物的方法(如化学方程式1)。
化学方程式1合成路线
本发明所述的产亚胺还原酶的基因工程菌，来自于本实验室亚胺还原酶酶库，从酶库49种亚胺还原酶基因工程菌中筛选获得。产亚胺还原酶的基因工程菌的具体构建方法是：将亚胺还原酶的基因进行基因合成，构建到能表达外源基因的质粒载体中，然后转化到能表达外源基因的宿主菌中，并对基因工程菌进行发酵培养，实现了亚胺还原酶的异源表达。本发明提供的亚胺还原酶基因工程菌IR-27，IR-30，IR-36，R-38，IR-40，IR-44，IR-51，IR-54，IR-56，IR-57，对应的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1—No.10。
在本发明中，任何一种人工的或者天然的含有碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能够满足宿主的生长并且能产生相应的亚胺还原酶即可。
用于制备手性氨基醇化合物的亚胺还原酶可以是上述亚胺还原酶基因工程菌的培养物，也可以是通过将培养基离心之后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液或者是对提取物亚胺还原酶进行的分离和/或纯化的得到的分离产品。在本发明中用的最多的是将培养基离心之后得到的菌体细胞。
本发明还涉及用全细胞催化不同类型的α-羟基酮底物转化生成对应的手性氨基醇的方法，所述方法为：
将所述亚胺还原酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定的比例接入到发酵培养基中，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG培养一段时间，离心收集菌体。用pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液重悬菌体，向其中加入羟基酮底物10mmol/L，小分子胺40mmol/L，10％无水甲醇，葡萄糖40mmol/L，NADP+0.5mg/mL，GDH 3U/mL，用1mol/L NaOH将反应体系调回到pH 8.0。25℃，200rpm下反应4-24h。反应之后，用1mol/L NaOH或1mol/LNa2CO3将反应体系调碱，离心，萃取，除去有机溶剂之后成盐纯化产物。
反应中所用的缓冲液是K2HPO4-KH2PO4缓冲液。
本发明所述的pH值优选能够使亚胺还原酶表达活性、有利于还原胺化反应发生的范围，优选pH值为8.0-10.0。反应温度优选保持在亚胺还原酶可以表达其活性的温度范围内，优选25-30℃。
本发明所述的底物浓度没有限制，通常底物浓度为5mmol/L-20mmol/L，考虑到底物转化率和产物得率，底物浓度最优选择10mmol/L。
本发明所用的生物催化剂是全细胞，其用量为20-50g/L。
本发明的有益效果：本发明选择了10种产亚胺还原酶基因工程菌，用于生物催化合成手性氨基醇化合物。所选的10种产亚胺还原酶基因工程菌底物谱比较广泛，对一系列α-羟基酮化合物普遍具有较好的催化活性。用产亚胺还原酶基因工程菌全细胞做催化剂，不同种类的α-羟基酮做底物，可以得到不同类型的光学纯手性氨基醇，而且底物转化率高，副产物少，制备方法简单方便、条件温和、立体选择性高。
附图说明
图1 1-羟基-3-苯基-2-丙酮氢谱；
图2 1-羟基-3-苯基-2-丙酮碳谱；
图3 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应R构型产物氢谱；
图4 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应R构型产物碳谱；
图5 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应S构型产物氢谱；
图6 1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺还原胺化反应S构型产物碳谱。
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1：亚胺还原酶基因工程菌的构建和诱导表达
将亚胺还原酶基因由通用生物系统(安徽)有限公司合成，连接在pET28a载体上，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆即得到重组菌。挑选平板上单菌落接种到20mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12h左右作为种子液，按照1％的接种量接种到700mL含相应抗生素的LB培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至OD600＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG于25℃进行诱导12h。以6000rpm离心培养液收集菌体。
实施例2：α-羟基酮底物的合成
200mL的无水乙醇做溶剂，加入500mL的烧瓶中，向其中加入2.8mL三乙胺(20mmol/L)，3.6g多聚甲醛(600mmol/L)，2.88g正丁醛(200mmol/L)或3.44g异戊醛(200mmol/L)或4.8g苯乙醛(200mmol/L)或5.36g苯丙醛(200mmol/L)或3.96g对溴苯乙醛(100mmol/L)或4.24g对溴苯丙醛(100mmol/L)，在2.88g噻唑盐(20mmol/L)催化作用下于60℃加热回流反应96h，反应过程中N2保护，得到α-羟基酮化合物1-羟基-2-戊酮或1-羟基-4-甲基-2-戊酮或1-羟基-3-苯基-2-丙酮或1-羟基-4-苯基-2-丁酮或1-羟基-3-(4-溴苯基)-2-丙酮或1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮。将反应后体系中的溶剂除去，柱层析分离得到目标化合物，核磁鉴定目标化合物，最终得到α-羟基酮化合物的收率为20-55％。以1-羟基-3-苯基-2-丙酮为例，其核磁图谱如图1和图2。
实施例3：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-苯基-2-丙酮和环丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在900μL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入1.5mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/L)溶在100μL的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-27催化反应得到S构型产物，ee值为99％，IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应得到R构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为70％，99％，99％，97％，98％，98％，51％，98％，98％。
选择IR-27和IR-36的基因工程菌做100mL制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入150mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/L)溶在10mL的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),50mg NADP+,3U/mL GDH酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应4-24h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的氨基醇产物，其中S构型产物得率为68.6％，R构型产物得率为83.7％。R构型核磁图谱见图3，图4，S构型核磁图谱见图5，图6。其结构式如下：
实施例4：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-苯基-2-丁酮和环丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在900μL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入1.64mg1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/L)溶在100μL的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-27,IR-30催化反应得到S构型产物，ee值为99％，99％，IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应得到R构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为95％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。
选择产IR-27和IR-36的基因工程菌做100mL制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入164mg 1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/L)溶在10mL的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),50mg NADP+,3U/mL GDH酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应4-24h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的氨基醇产物，其中S构型产物得率为43.0％，R构型产物得率为71.3％。其结构式如下：
实施例5：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-((4-溴苯基))-2-丙酮和环丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在900μL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲中，向其中加入2.28mg 1-羟基-3-((4-溴苯基))-2-丙酮(10mmol/L)溶在100μL的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-30催化反应得到S构型产物，ee值为99％，IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应得到R构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，96％，99％，99％。IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为70％，82％，99％，99％，97％，99％，99％，99％，99％。
选择产IR-51的基因工程菌做50mL制备反应，称取1g亚胺还原酶基因工程菌，溶在45mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入114mg 1-羟基-3-((4-溴苯基))-2-丙酮(10mmol/L)溶在5mL的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),25mg NADP+,3U/mL GDH酶粉，360mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到R构型的氨基醇产物，产物得率为65.9％。其结构式如下：
实施例6：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮和环丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在900μL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲中，向其中加入2.42mg 1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮(10mmol/L)溶在100μL的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-30催化反应得到S构型产物，ee值为99％，IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应得到R构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，93％，99％，99％。IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为66％，20％，99％，99％，98％，99％，99％，99％，99％。
选择产IR-30、IR-51的基因工程菌做50mL制备反应，称取1g亚胺还原酶基因工程菌，溶在45mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入121mg 1-羟基-4-(4-溴苯基)-2-丁酮(10mmol/L)溶在5mL的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),25mgNADP+,3U/mL GDH酶粉，360mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的氨基醇产物，其中S构型产物得率为41.0％，R构型产物得率为80.0％。其结构式如下：
实施例7：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-2-丁酮和环丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在1mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲中，向其中加入0.88mg1-羟基-2-丁酮(10mmol/L)，加入10倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱，加入等量的氯甲酸苄酯，25℃衍生1h，然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为88％，99％，99％，99％，95.4％，95.3％，99％，99％，99％,IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应生成产物的ee值分别为23S,99R,99R,57R,48R,99R,99R,99R,99R。
选择产IR-36的基因工程菌做100mL制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在100mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入88mg 1-羟基-2-丁酮(10mmol/L)，加入4倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),50mg NADP+,3U/mL GDH酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/LNa2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到R构型的氨基醇产物，产物得率为54.1％。其结构式如下：
实施例8：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-2-戊酮和环丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在1mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲中，向其中加入1.02mg1-羟基-2-戊酮(10mmol/L)，加入10倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱，加入等量的氯甲酸苄酯，25℃衍生1h，然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为97％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％,IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应生成产物的ee值分别为33S,99R,99R,99R,58R,99R,99R,99R,99R
实施例9：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-甲基-2-戊酮和环丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在1mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲中，向其中加入1.16mg1-羟基-4-甲基-2-戊酮(10mmol/L)，加入10倍当量配制好的环丙胺(pH 8.0),0.5mgNADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱，加入等量的氯甲酸苄酯，25℃衍生1h，然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为17％，80.2％，59.2％，85.1％，69.4％，80.2％，81.9％，84.8％，87.4％,IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应生成产物的ee值分别为99S,99R,99R,99R,7R,99R,99R,99R,99R。
实施例10：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-苯基-2-丙酮和炔丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在900μL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲中，向其中加入1.5mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/L)溶在100μL的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的炔丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-27,IR-30催化反应得到S构型产物，ee值为99％，IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应得到R构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为99％，85％，99％，99％，99％，99％，87％，58％，99％,99％。
选择产IR-36的基因工程菌做100mL制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入150mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/L)溶在10mL的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的炔丙胺(pH 8.0),50mg NADP+,3U/mL GDH酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到R构型的氨基醇产物，产物得率为54.6％。其结构式如下：
实施例11：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-苯基-2-丁酮和炔丙胺发生还原胺化反应。
分别称取0.05g的亚胺还原酶基因工程菌IR-27,IR-30,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57，溶在900μL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲中，向其中加入1.64mg 1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/L)溶在100μL的无水甲醇中，加入10倍当量配制好的炔丙胺(pH 8.0),0.5mg NADP+,3U GDH酶粉，7.2mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应24h。反应之后，将反应体系用1mol/L Na2CO3调碱然后用乙酸乙酯萃取，溶剂挥干之后HPLC检测。检测结果为：IR-27催化反应得到S构型产物，ee值为99％，IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应得到R构型产物，ee值为99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％，99％。IR-27,IR-36,IR-38,IR-40,IR-44,IR-51,IR-54,IR-56,IR-57催化反应的底物转化率分别为83％，99％，99％，99％，88％，99％，47％，99％，30％。
选择产IR-27和IR-36的基因工程菌分别做100mL制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入164mg 1-羟基-4-苯基-2-丁酮(10mmol/L)溶在10mL的无水甲醇中，加入4倍当量配制好的炔丙胺(pH 8.0),50mgNADP+,3U/mL GDH酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到两种单一构型的的氨基醇产物，R构型产物得率为77.2％，S构型产物得率为54％。其结构式如下：
实施例12：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-3-苯基-2-丙酮和烯丙基胺盐酸盐发生还原胺化反应。
选择产IR-36的基因工程菌做100mL制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入150mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/L)溶在10mL的无水甲醇中，加入374mg烯丙基胺盐酸盐(40mmol/L),50mg NADP+,3U/mL GDH酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。得到R构型的氨基醇产物，产物ee值为99％，底物转化率为95％，产物得率为70.4％。其结构式如下：
实施例13：亚胺还原酶基因工程菌全细胞催化1-羟基-4-苯基-2-丁酮和烯丙基胺盐酸盐发生还原胺化反应。
选择产IR-30,IR-36的基因工程菌分别做100mL制备反应，称取2g亚胺还原酶基因工程菌，溶在90mL pH 8.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，向其中加入164mg 1-羟基-3-苯基-2-丙酮(10mmol/L)溶在10mL的无水甲醇中，加入374mg烯丙基胺盐酸盐(40mmol/L),50mgNADP+,3U/mL GDH酶粉，720mg葡萄糖(40mmol/L)，混合均匀后，在200rpm，25℃条件下反应12h。反应后向反应体系加1mol/L Na2CO3调节反应体系pH大于10，乙酸乙酯萃取，薄层层析色谱确认萃取干净，将溶剂旋干之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚溶解收到的产物，向其中加入二氧六环氯化氢溶液，产物以盐酸盐形式析出。IR-36催化得到R构型的氨基醇产物，产物ee值为99％，底物转化率为99％，产物得率为73.4％，IR-30催化得到S构型的氨基醇产物，产物ee值为99％，底物转化率为97％，产物得率为64.0％。其结构式如下：
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 酶催化合成手性氨基醇化合物
<130> Enantioselective synthesis of chiral vicinal amino alcoholsusingamine dehydrogenases[J]. Acs Catalysis, 2019, 9(12):11813-11818
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> Mesorhizobium temperatum
<400> 1
Met Ser Asp Val Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Leu Leu Lys Ser Gly Leu Ser Val Thr Leu Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Pro Ala Lys Ala Glu Ala Leu Val Ala Lys Gly Ala Val Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Val Lys Asp Ala Ile Glu Ala Ser Lys Leu Val Val Ala Cys
50 55 60
Leu Leu Val Tyr Asp Thr Val Tyr Glu Ala Phe Glu Pro Ala Lys Asp
65 70 75 80
Ala Leu Ala Gly Arg Thr Leu Val Asn Leu Thr Asn Gly Thr Pro Ala
85 90 95
Gln Ala Arg Glu Met Ala Gln Trp Ala Ala Thr Arg Gly Ala Asp Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Gly Ile Met Ala Val Pro Pro Met Ile Gly Gln Ala Glu
115 120 125
Ala Leu Ile Leu Tyr Ser Gly Ala His Ala Ala Phe Glu Ala His Gly
130 135 140
Lys Thr Leu Gly Ala Leu Gly Ala Ala Arg Tyr Leu Gly Asp Asp Ala
145 150 155 160
Gly Leu Ala Pro Leu His Asp Ile Ala Leu Leu Thr Ala Met Tyr Gly
165 170 175
Leu Phe Ser Gly Val Thr Asn Ala Phe Ala Leu Thr Gly Ser Glu Lys
180 185 190
Val Pro Ala Glu Lys Phe Leu Pro Met Leu Thr Asn Trp Leu Gly Ala
195 200 205
Val Met Thr Trp Leu Pro Asp Met Ala Arg Arg Ile Asp Ser Gly Asp
210 215 220
Tyr Arg Ser Asp Val Val Ser Asn Leu Glu Met Gln Ala Ala Ala Phe
225 230 235 240
Asp Asn Phe Ile Ala Ala Ser Glu Gly Gln Gly Val Ser Ser Glu Leu
245 250 255
Ile Ala Pro Met Phe Gln Leu Ile Lys Lys Ala Val Ala Ser Gly Tyr
260 265 270
Gly Asp Ala Asp Gln Ala Ser Leu Val Glu Met Ile Arg Thr Arg Pro
275 280 285
Gln Ala Glu Arg Gln Arg Val Ala Gly
290 295
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> Sciscionella marina
<400> 2
Met Thr Asp Lys Pro Pro Val Thr Val Leu Gly Leu Gly Ala Met Gly
1 5 10 15
Thr Ala Leu Ala Arg Thr Leu Leu Asn Ala Gly Tyr Pro Thr Thr Val
20 25 30
Trp Asn Arg Thr Ala Ser Lys Thr Ala Pro Leu Thr Glu Leu Gly Ala
35 40 45
His Ala Ala Asp Ser Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Gly Glu Leu Val
50 55 60
Leu Ala Cys Leu Leu Asp Tyr Asp Ser Val His Gln Thr Leu Ala Gly
65 70 75 80
Thr Gly Asp Ala Leu Arg Gly Lys Ala Phe Val Asn Leu Thr Asn Gly
85 90 95
Thr Pro Glu Gln Ala Arg Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Thr Ala Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Gly Ile Met Ala Val Pro Pro Met Ile Gly Ser Pro Gly
115 120 125
Ala Phe Leu Phe Tyr Ser Gly Glu Ile Ala Val Phe Glu Gln Tyr Arg
130 135 140
Pro Val Leu Glu Ser Phe Gly Glu Ala Ile Glu Val Gly Thr Asp Pro
145 150 155 160
Gly Leu Ala Ala Leu His Asp Leu Ala Leu Leu Ser Ala Met Tyr Gly
165 170 175
Met Phe Gly Gly Val Leu Gln Ala Phe Ala Leu Thr Gly Ser Ala Gly
180 185 190
Val Ser Ala Ala Ser Leu Ala Pro Leu Leu His Arg Trp Leu Asp Gly
195 200 205
Met Ser Gly Phe Ile Ala Gln Ser Ala Ala Gln Leu Asp Ser Gly Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Gly Val Val Ser Asn Leu Ala Met Gln Asp Thr Gly Phe
225 230 235 240
Ala Asn Leu Phe Arg Ala Ala Lys Glu Gln Gly Ile Ser Thr Gly Gln
245 250 255
Leu Glu Pro Leu Gly Ala Leu Ile Arg Arg Arg Val Glu Asp Gly His
260 265 270
Gly Ala Glu Asp Leu Ala Gly Ile Val Glu Tyr Leu Lys Ile Gly Ala
275 280 285
Asn Ala
290
<210> 3
<211> 293
<212> PRT
<213> Mesorhizobium sp
<400> 3
Met Lys Pro Ala Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Arg Met Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Val His Ala Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Pro Val Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Leu Glu Lys Ala Thr Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ala Val Val
35 40 45
Ala Thr Ser Val Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala Glu Ile Ile Ile Val
50 55 60
Asn Val Thr Asp Tyr Pro Ala Thr Ala Ala Leu Leu Arg Gly Asp Val
65 70 75 80
Ala Thr Ala Leu Arg Gly Lys Leu Val Val Glu Leu Thr Ser Gly Thr
85 90 95
Pro His Gly Ala Arg Asp Ala Gly Glu Trp Ala Ala Ala His Gly Val
100 105 110
Ser Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Phe Val Gly Thr
115 120 125
Glu His Gly Thr Ile Leu Val Ser Gly Pro Arg Gln Ala Phe Asp Arg
130 135 140
Asn Lys Asp Met Phe Arg Ala Leu Gly Gly Asn Val Gln His Val Gly
145 150 155 160
Glu Asp Leu Gly Leu Ala Asn Ala Leu Asp Ser Ala Leu Leu Ala Leu
165 170 175
Met Trp Gly Ala Leu Phe Gly Ala Leu Gln Ser Ile Ala Val Cys Arg
180 185 190
Ala Glu Arg Ile Asp Leu Gly Glu Leu Ala Arg Gln Trp Thr Ala Thr
195 200 205
Ala Pro Val Val Gln Gly Leu Val Ala Asp Leu Ile Lys Arg Thr Ala
210 215 220
Ala Gly Arg Leu Ala Ala Asp Asp Glu Thr Leu Ser Ser Leu Ser Pro
225 230 235 240
His Tyr Ser Ala Phe Gln His Leu Val Glu Leu Met Glu Val Arg Lys
245 250 255
Ile Asp Arg Thr Val Val Asp Gly Tyr Asp Ala Ile Phe Arg Arg Ala
260 265 270
Ile Ala Ala Gly His Leu His Asp Asp Phe Ala Ala Leu Ser Gln Phe
275 280 285
Met Gly Lys Ala Gly
290
<210> 4
<211> 294
<212> PRT
<213> Sinorhizobium sp
<400> 4
Met Gln Pro Ala Ile Ser Val Leu Gly Met Gly Arg Met Gly Thr Ala
1 5 10 15
Leu Ala Tyr Ala Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Thr Thr Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Pro Ala Lys Ala Ala Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ala Glu Val
35 40 45
Ala Ala Ser Val Arg Asn Ala Val Ala Ala Ser Glu Val Val Ile Val
50 55 60
Asn Val Ser Asp Tyr Gln Ala Thr Gln Ser Leu Leu Arg Asp Lys Glu
65 70 75 80
Val Ala Gly Ala Leu Glu Gly Arg Leu Ile Ile Glu Leu Thr Ser Gly
85 90 95
Thr Pro Asp Gly Gly Arg Glu Ala His Gly Trp Ala Gln Arg Gln Gly
100 105 110
Ala Arg Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Leu Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly
115 120 125
Thr Glu Ala Gly Thr Leu Leu Val Ser Gly Pro Ser Gly Val Phe Glu
130 135 140
Glu Ser Arg Asn Val Leu Gly Ala Leu Gly Gly Asn Val Gln Phe Ile
145 150 155 160
Gly Glu Asp Pro Gly Leu Ala Asn Ala Leu Asp Ser Ala Val Leu Ala
165 170 175
Leu Met Trp Gly Ala Leu Phe Gly Ala Leu Gln Ser Ile Ala Val Cys
180 185 190
Arg Ala Glu Ala Ile Asp Leu Gly Val Leu Ala Arg Gln Trp Thr Ala
195 200 205
Thr Ala Pro Val Val Glu Gly Leu Val Ser Asp Leu Ile Lys Arg Ser
210 215 220
Ala Ala Gly Arg Tyr Asp Ala Asp Ala Glu Thr Leu Ser Ser Val Ser
225 230 235 240
Pro His Tyr Ser Ala Phe His His Leu Val Asp Leu Met Glu Ala Arg
245 250 255
Gly Ile Asp Arg Thr Ile Thr Gly Gly Tyr Glu Ala Ile Phe Arg Arg
260 265 270
Ala Ile Glu Ala Gly His Leu His Asp Asp Phe Ala Ser Leu Ser Gln
275 280 285
Phe Met Gly Gln Pro Ala
290
<210> 5
<211> 289
<212> PRT
<213> Sandaracinus amylolyticus
<400> 5
Met Ala Arg Val Ser Ile Leu Gly Ala Gly Arg Met Gly Ala Ala Leu
1 5 10 15
Val Arg Ala Leu Ala Lys Ala Gly His Ala Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Thr Glu Ser Lys Ala Arg Ala Leu Glu Pro Ala Gly Ala Arg Thr Ala
35 40 45
Arg Ser Leu Val Asp Ala Val Asp Ala Asp Leu Val Ile Asp Ile Val
50 55 60
Ser Asp Tyr Asp Thr Ser Ala Ala Leu Leu Arg Asp Ala Glu Val Gln
65 70 75 80
Arg Ala Leu Arg Gly Thr Thr Leu Leu Glu Leu Ala Ser Gly Thr Pro
85 90 95
Ala Glu Ala Gln Arg Ala Gly Ala Trp Ala Glu Glu His Gly Ile Arg
100 105 110
Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly Gln Pro
115 120 125
Gly Cys Thr Ile Leu Tyr Ser Gly Pro Thr Glu Leu Phe Glu Ala His
130 135 140
Gln Ala Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp Asn Gly Leu Tyr Leu Gly Arg
145 150 155 160
Glu Ile Gly His Ala Asn Val Leu Asp Asn Ala Ile Leu Val Val Leu
165 170 175
Trp Gly Ala Val His Gly Val Leu His Gly Ala Ala Ile Cys Glu Ala
180 185 190
Glu Arg Phe Ser Leu Ala Thr Phe Arg Gly Ala Leu Arg Gly Ser Trp
195 200 205
Pro Val Val Glu Pro Leu Leu Ser Ser Ala Leu Glu Arg Ile Glu Gly
210 215 220
Arg Arg Trp Ala Ala Asp Ala Thr Thr Gln Ser Ala Leu Ala Pro Gly
225 230 235 240
Leu Ala Ser Val Arg His Leu Leu Ala Ile Ser Glu Ala His Gly Ile
245 250 255
Asp Ala Gly Leu Pro Gln Ala Phe His Arg Val Ile Gln Arg Ala Val
260 265 270
Glu Arg Gly His Arg Asp Asp Asp Ile Ala Ser Ala Tyr Glu Gly Met
275 280 285
Arg
<210> 6
<211> 329
<212> PRT
<213> Rhizobium sp.
<400> 6
Met Val Ser Ser Pro Tyr Leu Asn Val Thr Ala Tyr Pro Lys Val Arg
1 5 10 15
Asn Leu Pro Trp Pro Val Pro Gly Pro Ile Arg Val Ala Ser Gln Ile
20 25 30
Leu Glu Leu Arg Pro Met Thr Thr Ile Gly Phe Leu Gly Ala Gly Arg
35 40 45
Met Gly Ser Ala Leu Val Lys Ser Leu Leu Glu Ala Gly His Ser Val
50 55 60
His Val Trp Asn Arg Thr Ala Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Asp Phe
65 70 75 80
Gly Ala Val Pro Glu Pro Ser Ala Glu Arg Ala Ala Gly Pro Ala Glu
85 90 95
Ile Val Ile Val Asn Leu Leu Asp Tyr Glu Ala Ser Asp Ala Glu Leu
100 105 110
Arg Lys Pro Asp Val Ala Glu Ala Leu Lys Gly Lys Leu Leu Val Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Ser Pro Lys Thr Ala Arg Glu Thr Gly Arg Trp Ala
130 135 140
Gly Asp His Gly Ile Ala Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro
145 150 155 160
Asn Phe Ile Gly Gly Ala Glu Thr Val Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Lys
165 170 175
Thr His Phe Glu Lys His Glu Gly Leu Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys
180 185 190
Ser Ala Phe Val Gly Glu Asp Phe Gly Thr Ala Ser Ala Leu Asp Ser
195 200 205
Ala Leu Leu Ser Gln Met Trp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Leu Gln Ala
210 215 220
Leu Ala Val Cys Arg Ala Glu Gly Ile Glu His Asp Val Tyr Ala Gly
225 230 235 240
Phe Leu Met Ser Ala Gln Pro Met Ile Asp Gly Ala Gln Gln Asp Leu
245 250 255
Met Glu Arg Ile Arg Asp Gly Arg Asp Leu Ala Asp Ala Gln Thr Leu
260 265 270
Ala Thr Val Ala Val His Asn Val Ala Phe His His Leu Arg Asp Leu
275 280 285
Ile Ala Asp Arg Asp Leu Asn Pro Ala Phe Gly Asp Ala Leu Gly Ser
290 295 300
Leu Leu Glu Thr Ala Leu Arg Asn Asp His Gln Asp Asp Asp Phe Ala
305 310 315 320
Val Leu Ala Arg Phe Met Gly Ala Lys
325
<210> 7
<211> 291
<212> PRT
<213> Myxococcus fulvus
<400> 7
Met Lys Pro His Ile Ser Ile Leu Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Ala Phe Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Thr Thr Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Ile
35 40 45
Ala Asp Ser Val Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Ser Val Val Ile Val
50 55 60
Asn Val Asn Asp Tyr Asp Thr Ser Asp Ala Leu Leu Arg Gln Asp Glu
65 70 75 80
Val Thr Gln Glu Leu Arg Gly Lys Val Leu Val Gln Leu Thr Ser Gly
85 90 95
Ser Pro Lys Leu Ala Arg Glu Gln Ala Thr Trp Ala Arg Arg His Gly
100 105 110
Ile Asp Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Leu Ile Gly
115 120 125
Arg Pro Asp Cys Thr Leu Leu Tyr Ala Gly Pro Lys Ala Leu Tyr Asp
130 135 140
Lys His Gln Ala Val Leu Ala Ala Leu Gly Gly Asn Thr Gln His Val
145 150 155 160
Ser Glu Asp Glu Gly His Ala Ser Ala Leu Asp Ser Ala Ile Leu Phe
165 170 175
Gln Leu Trp Gly Ser Leu Phe Ser Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ile Cys
180 185 190
Arg Ala Glu Gly Ile Ala Leu Asp Ala Leu Gly Pro His Leu Glu Ala
195 200 205
Val Ala Ala Met Ile Gln Phe Ser Met Lys Asp Leu Leu Gln Arg Ile
210 215 220
Gln Lys Glu Gln Phe Gly Ala Asp Thr Glu Ser Pro Ala Thr Leu Asp
225 230 235 240
Thr His Asn Val Ala Phe Gln His Leu Leu His Leu Cys Glu Glu Arg
245 250 255
Asn Ile His Arg Ala Leu Pro Glu Ala Met Asp Ala Leu Ile Gln Thr
260 265 270
Ala Arg Lys Ala Gly His Gly Gln Asp Asp Phe Ser Val Leu Ala Arg
275 280 285
Phe Leu Arg
290
<210> 8
<211> 294
<212> PRT
<213> Ensifer adhaerens
<400> 8
Met Gln Pro Ala Ile Ser Val Leu Gly Met Gly Arg Met Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ala His Ala Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Thr Thr Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Pro Ala Lys Ala Ala Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ala Glu Val
35 40 45
Ala Ala Ser Val Arg Asn Ala Val Ala Ala Ser Asp Ile Val Ile Val
50 55 60
Asn Val Ser Asp Tyr Gln Ala Thr Gln Ser Leu Leu Arg Ala Pro Asp
65 70 75 80
Val Thr Gly Thr Leu Lys Gly Lys Leu Ile Ile Glu Leu Thr Ser Gly
85 90 95
Thr Pro Asp Gly Ala Arg Glu Val Gln Ala Trp Ala Thr Arg His Gly
100 105 110
Ile Arg His Leu Asp Gly Ala Ile Leu Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly
115 120 125
Thr Glu Ala Gly Thr Leu Leu Val Ser Gly Pro Ser Ala Val Phe Glu
130 135 140
Glu Ser Arg Ala Val Leu Ser Ala Leu Gly Gly Asn Val Gln Phe Ile
145 150 155 160
Gly Glu Asp Pro Gly Leu Ala Asn Ala Leu Asp Ser Ala Val Leu Ala
165 170 175
Leu Met Trp Gly Ala Leu Phe Gly Gly Leu Gln Ala Ile Ala Val Ser
180 185 190
Arg Ala Glu Ala Ile Asp Leu Glu Thr Leu Gly Lys Gln Trp Ser Ala
195 200 205
Thr Ala Pro Val Ile Asp Gly Leu Val Ser Asp Leu Ile Lys Arg Ser
210 215 220
Ala Ala Gly Arg Tyr Ala Ala Asp Gly Glu Thr Leu Ser Thr Val Ser
225 230 235 240
Pro His Tyr Gly Ala Phe His His Leu Val Glu Leu Met Lys Ala Arg
245 250 255
Gly Ile Asp Arg Thr Ile Thr Asp Gly Tyr Gln Thr Val Phe Arg Arg
260 265 270
Ala Ile Glu Ala Gly His Leu His Asp Asp Phe Ala Ser Leu Ser Leu
275 280 285
Phe Met Lys Arg Pro Ala
290
<210> 9
<211> 293
<212> PRT
<213> Mesorhizobium mediterraneum
<400> 9
Met Lys Leu Ser Ile Ser Val Val Gly Thr Gly Arg Met Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ala Arg Ala Leu Leu Gln Ser Gly Tyr Arg Thr Thr Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Lys Gln Lys Ala Glu Pro Leu Val Ala Leu Gly Ala Thr Val
35 40 45
Ala Gly Ser Val Leu Glu Ala Val Asn Ala Ala Glu Ile Ile Ile Val
50 55 60
Asn Val Ser Asp Tyr Gln Ala Ser Ala Val Leu Arg Asp Asp Ala Val
65 70 75 80
Ala Ser Ala Ile Arg Gly Lys Leu Ile Val Glu Leu Thr Ser Gly Thr
85 90 95
Pro His Gly Ala Arg Glu Ala Ala Glu Trp Val Ala Glu His Gly Ala
100 105 110
Asn Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly Thr
115 120 125
Asp Ala Gly Thr Ile Leu Ile Ser Gly Pro Arg Gln Ala Phe Asp Ala
130 135 140
Asn Glu Glu Met Phe Arg Ala Leu Gly Gly Asn Val Gln His Val Gly
145 150 155 160
Glu Glu Pro Gly Arg Ala Asn Ala Leu Asp Ser Ala Leu Leu Ala Leu
165 170 175
Met Trp Gly Ala Leu Phe Gly Ala Leu His Ala Ile Ala Val Ser Gln
180 185 190
Ala Glu Glu Ile Asp Leu Gly Glu Leu Ala Arg Gln Trp Thr Ala Thr
195 200 205
Ala Pro Val Val Asp Gly Leu Val Val Asp Leu Ile Lys Arg Thr Asn
210 215 220
Ala Gly Arg Phe Ala Ser Asp Asn Glu Thr Leu Ser Ser Ile Ser Pro
225 230 235 240
His Tyr Gly Ala Phe Gln His Leu Leu Glu Leu Met Glu Ala Arg Lys
245 250 255
Ile Asp Arg Ser Val Val Asn Ala Tyr Asp Ala Ile Phe Gln Arg Ala
260 265 270
Ile Ala Ala Gly His Leu His Asp Asp Phe Ala Ala Leu Ser Gln Phe
275 280 285
Leu Gly Lys Ser Arg
290
<210> 10
<211> 293
<212> PRT
<213> Rhizobiales bacterium
<400> 10
Met Lys Pro Ser Ile Ser Val Leu Gly Met Gly Arg Met Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ala Arg Ala Leu Leu Glu Ala Gly Tyr Arg Thr Thr Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Ala Gln Lys Thr Ala Pro Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ser Val
35 40 45
Ala Pro Ser Val Arg Glu Ala Ile Asp Ala Ala Glu Ile Ile Val Val
50 55 60
Asn Val Thr Asp Tyr Gly Ala Thr Ser Ala Leu Leu Arg Gly Ser Asp
65 70 75 80
Val Ala Pro Gly Leu Ala Gly Lys Val Ile Val Glu Leu Thr Ser Gly
85 90 95
Thr Pro Asp Gly Ala Arg Glu Thr Ser Arg Trp Ala Lys Ala Gln Gly
100 105 110
Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Ala Ile Leu Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly
115 120 125
Thr Glu Ala Gly Thr Ile Leu Leu Ser Gly Ala Pro Glu Leu Tyr Thr
130 135 140
Gly Asn Ala Glu Val Phe Arg Ala Leu Gly Gly Asn Val Gln His Leu
145 150 155 160
Gly Ala Glu Pro Gly Leu Ala Asn Ala Leu Asp Ser Ala Val Leu Ala
165 170 175
Leu Met Trp Gly Ala Leu Phe Gly Gly Leu His Ala Ile Ala Val Ala
180 185 190
Glu Ala Glu Lys Ile Asp Leu Gly Glu Leu Gly Arg Gln Trp Thr Ala
195 200 205
Thr Ala Pro Val Ile Glu Gly Leu Val Gly Asp Leu Ile Arg Arg Ser
210 215 220
Asn Ala Gly Arg Phe Ala Ser Asp Ala Glu Thr Leu Ser Ser Val Ser
225 230 235 240
Pro His Tyr Gly Ala Phe Gln His Leu Lys Ala Leu Met Gln Ala Arg
245 250 255
Ser Ile Asp Arg Thr Val Ile Asp Gly Tyr Asp Val Ile Phe Arg Arg
260 265 270
Ala Ile Ala Ala Gly His Leu His Asp Asp Phe Ala Ala Leu Ser Gln
275 280 285
Phe Met Arg Ala Ala
290

Claims (5)

1.一种生物催化合成手性氨基醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将表达了氨基酸序列为SEQ ID No .3的亚胺还原酶的基因工程菌与反应底物α-羟基酮和小分子胺接触，进行催化反应；
所述的α-羟基酮为1-羟基-2-丁酮、1-羟基-2-戊酮、1-羟基-4-甲基-2-戊酮、1-羟基-3-苯基-2-丙酮、1-羟基-4-苯基-2-丁酮、对溴1-羟基-3-苯基-2-丙酮、对溴1-羟基-4-苯基-2-丁酮，且α-羟基酮的浓度为5mmol/L-20mmol/L；
所述的小分子胺为环丙胺、烯丙胺、炔丙胺，且小分子胺的浓度为20mmol/L-100mmol/L；
b)反应完成后，加入碱溶液调节反应体系pH至10 .0以上，并用有机溶剂多次萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，回收溶剂成盐得到目标产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的α-羟基酮的浓度为10mmol/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小分子胺的浓度为40mmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱溶液是1 mol/L NaOH或1 mol/LNa2CO3。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的成盐得到目标产物为回收溶剂之后，用异丙醚或甲基叔丁基醚将回收产物溶解，向其中加入二氧六环氯化氢溶液使氨基醇产物以盐酸盐形式析出。
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