CN114381484B - UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用 - Google Patents
UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,属于微生物技术领域。本发明公开的糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,通过特异性强且催化效率高的糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3,采用生物合成的手段,利用菌体转化的方式来实现高效绿色的糖苷类化合物的生产。本发明利用糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3催化多种底物生成糖苷化合物,转化效率高,且底物杂泛性高,可用于大规模生产多种糖苷类化合物。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,更具体的说是涉及糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用。
背景技术
糖苷类化合物广泛存在于各种植物体中,它由糖基部分和非糖基部分组成,非糖基部分称之为苷元。许多糖苷化合物具有多种生物活性,具有重要的药用价值。其中代表性化合物例如天麻素,它存在于兰科植物天麻的块茎中,是中药天麻的有效成分之一,具有镇静、安眠、抗炎、抗氧化等多种生物活性,在临床上得到广泛应用;豆腐果苷也具有抗炎抗氧化的功能,同时也具有潜在的治疗抑郁症的能力;淫羊藿次苷具有抗疲劳抗氧化功能,可用于治疗高血压。
目前获取糖苷化合物主要从植物中提取或者通过化学合成。但是随着城市化进程的发展,可利用的植物资源逐渐减少,且植物体中糖苷化合物含量较低,从植物中提取的糖苷化合物成本高,工作量大,且产量远不能满足于人们的需要。因此急需寻找新的方法来生产糖苷化合物。
从19世纪80年代开始,人们开始利用化学合成的方法合成糖苷化合物中的天麻素。1980年周俊等人利用化学合成的手段,成功合成了天麻素,在此过程中,用到毒性较高的红磷和溴素,容易造成环境污染,且不利于实验者的安全[周俊,杨雁宾,杨崇仁,天麻素的化学合成Ⅱ,化学学报,1980,32(2),162-166]。2004年戴晓畅等人改进了化学合成方法,用三溴化磷代替化学合成过程中用到的红磷和溴素[戴晓畅,彭啸,吴松福,杨万松,毛宇,天麻素及其类似酚性糖甙的化学合成工艺研究,云南民族大学学报(自然科学版),2004,3(2),83-85],提高了收率,但是依然存在污染问题。2014年王多平简化了化学合成步骤,采用对羟基苯甲醇作为初始底物,不再需要催化加氢过程[王多平,天麻素的生产工艺,CN104072549A,2014],但是该方法需要五乙酰葡萄糖作为糖基供体,之后再脱去乙酰基保护基团,步骤依然繁琐。与之相比,生物合成糖苷类化合物具有重大优势。
因此,提供糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,利用微生物全细胞催化合成糖苷化合物;具体是利用表达糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3的大肠杆菌转化烷基酚衍生物生成糖苷化合物。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,即糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3具有底物杂泛性。
所述UGT85A1催化的底物为4-羟基苯甲醇、3-羟基苯甲醇、4-(1-羟乙基)苯酚、3-(1-羟乙基)苯酚、4-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲酸;所述RrUGT3催化的底物为对甲酚、对乙酚、对异丙基酚、对丙基苯酚、3-乙基苯酚、3-甲酚、4-羟基苯乙酮、4-羟基苯丙酮、3-羟基苯乙酮、3-乙烯基苯酚、3-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醇、4-羟基苯甲醛、3-(1-羟乙基)苯酚、4-(1-羟乙基)苯酚、2-(4-羟基苯基)异丙醇、4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲醇。除本发明所列举底物外,带有酚羟基、醇羟基或羧基的酚类底物均在本发明保护范围内。
进一步,利用糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3催化底物生成糖苷化合物的方法如下:
(1)将糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3的基因分别整合至pCDFDuet-1质粒,分别转化进大肠杆菌DH5α,获得pCDFDuet-1-UGT85A1质粒和pCDFDuet-1-RrUGT3质粒;再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,分别获得转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株和转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株;
(2)分别将转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株和转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株接种于含有50μg/ml链霉素的LB液体培养基,37℃,220rpm培养过夜,获得种子液;
(3)分别按照体积比为1:100的接种量将种子液接种至培养基中,37℃,220rpm培养3-4小时;
(4)待OD600达0.6-0.8时,加入1mM IPTG进行诱导,同时加入1mM糖基转移酶底物,30℃,220rpm进行发酵;
(5)发酵48h后,将发酵液高速离心后收集上清液;
(6)取上清液,等体积加入甲醇,混匀后高速离心取上清进行HPLC检测以及MS检测以测定产物生成;
(7)以流速为1BV/h将步骤(5)的上清液加入到AB-8大孔吸附树脂柱中;
(8)向大孔吸附树脂柱中以2BV/h的流速加入水,以除去大孔吸附树脂柱中残留的上清液以及极性较大的杂质,同样的方法冲洗3-5个柱体积;
(9)在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30%-40%的乙醇水溶液进行洗脱,并收集乙醇水洗脱液,速率为1BV/h,洗脱3个柱体积;
(10)将洗脱液进行旋蒸,蒸干后用甲醇进行溶解,再经HPLC制备得纯净的糖苷化合物;
(11)利用核磁鉴定产物结构。
进一步,步骤(3)所述培养基包括但不限于M9CA培养基、LB培养基,适用于种子液培养的培养基均可。
进一步,M9CA培养基成分包括酪蛋白水解物2.0g/L、Na2HPO46.8 g/L、KH2PO43.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.5g/L,使用时额外添加40g/L葡萄糖,2mM MgSO4以及0.1mMCaCl2。
生物合成糖苷类化合物的过程中,糖基转移酶发挥重要功能,它可以将糖基与苷元结合形成糖苷类化合物,此过程条件温和,且不会产生环境污染物。同时酶的位点特异性强,能够将特定的位点糖基化,不需要繁琐的保护和去保护步骤。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明公开提供了糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,通过特异性强且催化效率高的糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3,采用生物合成的手段,利用菌体转化的方式来实现高效绿色的糖苷类化合物的生产。本发明利用糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3催化多种底物生成糖苷化合物,转化效率高,且底物杂泛性高,可用于大规模生产多种糖苷类化合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明不同底物由转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株转化生成的醇羟基糖基化产物结构;
其中,1:底物为4-羟基苯甲醇的产物;2:底物为3-羟基苯甲醇的产物;3:底物为4-(1-羟乙基)苯酚的产物;4:底物为3-(1-羟乙基)苯酚的产物;
图2附图为本发明不同底物由转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株转化生成的羧基糖基化产物结构;
其中,1:底物为4-羟基苯甲酸的产物;2:底物为3-羟基苯甲酸的产物;
图3附图为本发明不同底物由转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株转化生成的产物结构;
其中,1:底物为对甲酚的产物;2:底物为对乙酚的产物;3:底物为对异丙基酚的产物;4:底物为对丙基苯酚的产物;5:底物为3-乙基苯酚的产物;6:底物为3-甲酚的产物;7:底物为4-羟基苯乙酮的产物;8:底物为4-羟基苯丙酮的产物;9:底物为3-羟基苯乙酮的产物;10:底物为3-乙烯基苯酚的产物;11:底物为3-羟基苯甲醛的产物;12:底物为4-羟基苯甲醇的产物;13:底物为4-羟基苯甲醛的产物;14:底物为3-(1-羟乙基)苯酚的酚羟基糖基化产物;15:底物为4-(1-羟乙基)苯酚的产物;16:底物为2-(4-羟基苯基)异丙醇的产物;17:底物为4-羟基苯甲酸的酚羟基糖基化产物;18:底物为3-羟基苯甲酸的酚羟基糖基化产物;19:底物为4-羟基苯甲酸的羧基糖基化产物;20:底物为3-羟基苯甲酸的羧基糖基化产物;21:底物为3-羟基苯甲醇的醇羟基糖基化产物;22:底物为3-(1-羟乙基)苯酚的醇羟基糖基化产物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
菌株构建过程中用到的两种糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3基因分别来自植物拟南芥和红景天,两者位点选择性不同,UGT85A1特异性催化醇羟基糖基化,RrUGT3主要催化酚羟基糖基化。
用到的大肠杆菌DH5α以及大肠杆菌BL21(DE3)均为市售所得,大肠杆菌DH5α用于基因克隆,大肠杆菌BL21(DE3)用于基因表达。
M9CA培养基成分包括酪蛋白水解物2.0g/L、Na2HPO46.8 g/L、KH2PO43.0g/L、NH4Cl1.0g/L、NaCl 0.5g/L,使用时需额外添加40g/L葡萄糖,2mM MgSO4以及0.1mM CaCl2。
AB-8大孔吸附树脂购自北京索莱宝科技有限公司。大孔吸附树脂需预处理,方法如下:取上清液体积的五分之一体积的AB-8大孔吸附树脂,将其浸泡至95%乙醇中过夜;用纯水洗涤AB-8大孔吸附树脂至无醇味,湿法装柱。
实施例1pCDFDuet-1-UGT85A1质粒和pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的构建
(1)UGT85A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
ATGGGTTCTCAGATCATTCATAACTCTCAAAAACCACATGTAGTTTGTGTTCCATATCCGGCTCAAGGCCACATCAACCCGATGATGCGTGTGGCTAAACTGCTGCACGCCCGTGGCTTTTACGTTACATTCGTTAACACCGTTTACAACCACAACCGTTTCCTGCGTTCTCGTGGTTCCAACGCCCTGGATGGTCTCCCATCGTTCCGTTTTGAGTCGATTGCTGACGGTCTGCCAGAGACCGACATGGATGCCACCCAGGACATCACCGCTCTGTGCGAGTCCACCATGAAGAACTGTCTGGCTCCGTTCCGTGAGCTGCTGCAACGTATCAACGCTGGTGATAACGTTCCGCCGGTAAGCTGTATTGTATCTGACGGTTGTATGAGCTTTACTCTGGATGTTGCGGAGGAGCTGGGTGTTCCCGAGGTTCTGTTCTGGACCACCAGCGGCTGTGCGTTCCTGGCTTATCTGCACTTTTATCTGTTCATCGAGAAGGGCCTGTGTCCGCTGAAAGATGAGTCTTACCTGACCAAGGAGTACCTGGAAGACACCGTTATCGATTTTATCCCAACCATGAAGAACGTGAAACTGAAGGATATTCCGAGCTTCATCCGTACCACTAACCCGGATGATGTTATGATTTCTTTCGCCCTGCGCGAGACCGAGCGTGCCAAACGTGCTTCTGCTATCATTCTGAACACCTTTGATGACCTGGAGCATGATGTTGTTCATGCTATGCAATCTATCCTCCCACCGGTGTATAGCGTTGGTCCGCTGCATCTGCTGGCAAACCGTGAGATTGAAGAAGGTTCTGAGATTGGTATGATGTCTTCTAACCTGTGGAAAGAGGAGATGGAGTGTCTGGATTGGCTGGATACTAAGACTCAAAACTCTGTTATTTATATCAACTTTGGTAGCATCACCGTTCTGTCTGTGAAGCAGCTGGTGGAGTTTGCTTGGGGTCTGGCGGGTTCTGGTAAAGAGTTTCTGTGGGTGATCCGTCCAGATTTAGTAGCGGGTGAGGAGGCTATGGTTCCGCCGGACTTTCTGATGGAGACTAAAGACCGCTCTATGCTGGCGTCTTGGTGTCCGCAAGAGAAAGTACTGTCTCATCCGGCTATTGGTGGTTTTCTGACCCATTGCGGTTGGAACTCTATCCTGGAATCTCTGTCTTGTGGTGTTCCGATGGTGTGTTGGCCATTTTTTGCTGACCAGCAAATGAACTGTAAGTTTTGTTGTGACGAGTGGGATGTTGGTATTGAGATCGGTGGTGATGTGAAGCGTGAGGAAGTTGAGGCGGTGGTTCGTGAGCTGATGGATGGTGAGAAGGGTAAGAAAATGCGTGAAAAGGCGGTAGAGTGGCAGCGCCTGGCCGAGAAAGCGACCGAACATAAACTGGGTTCTTCCGTTATGAACTTTGAGACCGTTGTTAGCAAGTTTCTGCTGGGTCAAAAATCTCAGGATTAA;SEQ ID NO.1。
利用引物UGT85A1-P1和UGT85A1-P2对UGT85A1基因进行PCR扩增,获得UGT85A1插入片段。
UGT85A1-P1和UGT85A1-P2的引物序列如下:
UGT85A1-P1:5’-CTTTAATAAGGAGATATACCATGGGTTCTCAGATCATTCA-3’;SEQ IDNO.2;
UGT85A1-P2:5’-ATGATGGTGATGGCTGCTGCTTAATCCTGAGATTTTTGAC-3’;SEQ IDNO.3。
PCR反应程序:98℃2min;98℃10s,55℃15s,72℃90s,33个循环;72℃2min。
酶切体系:2μl pCDFDuet-1质粒(600ng/μl),2μlbuffer,1μlNcoI,15μl蒸馏水。37℃酶切3h。
连接体系:1μl pCDFDuet-1线性载体(100ng/μl),1μl UGT85A1插入片段(60ng/μl),2μl 2×ClonExpress Mix。50℃连接30min,获得连接产物。
连接产物转化DH5α感受态细胞,具体步骤如下:
A、将DH5α感受态细胞由-80℃取出后,放置冰上15min,至感受态融化;
B、取100-200ng连接产物,加至50μl DH5α感受态细胞中,轻轻混匀后置于冰上20min;
C、将反应体系置于42℃水浴热激90s;
D、置于冰上5min;
E、在体系中加入无抗LB液体培养基1ml,37℃,220rpm,复苏1h;
F、5000rpm,1min,离心收集菌体,去除多余上清,剩余150μl重悬菌体;
G、将菌液涂布于含50μg/ml链霉素的LB固体平板,37℃过夜培养;
挑取单克隆,经菌液PCR和测序验证,获得阳性克隆,提取pCDFDuet-1-UGT85A1质粒。
将pCDFDuet-1-UGT85A1质粒转化BL21(DE3)感受态细胞(转化步骤同转化DH5α感受态细胞),获得转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株。
(2)RrUGT3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
ATGTCTGGCACCCCACACATCGCCATCCTGCCGAGCCCGGGCATGGGCCACCTGATCCCGATGGCCGAGTTCGCCAAGCGCCTGGTTCACCACCACAACTTCTCTATCACCTTCGTTATCCCGACCGACGGCCCACCGTCCTCCGCCTACCAACAAGTTCTGACCTCCCTGCCATCTTCCATCGATCACATCTTCCTGCCACAAGTTGACCTGACCGACGTTGTATCTCAATCTCCAGCTCATCCGCGTATCGAAACCCTGATCTCCCTGACCGTTGCTCGCTCCCTGTCCTCCCTGCGCACCACCCTGTCCTCTCTGCAATCTTCTAAAAACCTGGTTTCTCTGGTTGTTGATCTGTTCGGCACTGATGCATTCGACCCGGCCATCGAGCTGGGCATCTCTCCGTACATTTTCTTCCCGTCCACCGCCATGACCCTGTCTCTGTTCCTGTACATGCCGCAGCTGGACAAATCTGTTACCTGCGAATTTCGTCACATGACCGATCTGGTTCGTATTCCGGGTTGCGTTCCGGTTCGTGGTTCTGATCTGTTCGACCCGGTTCAAGACCGTACCGACGAGGCTTATAAATGGGTTATCCATCACTCCAACCGTTACCCGATGGCGGAGGGTGTTATCGAGAACAGCTTCATGGAGCTGGAACATGGTGCGCTGAAGTATCTGCAAACCGTTCAATCTGGTAAGCCGCCGGTTTACGCGGTTGGTCCGCTGATTAAAATGGATTATGATGTTGACGATTCCGGTTCTAAGATCATCGAGTGGCTGGATGATCAACCGGTTGGTTCTGTTCTGTTTGTTTCTTTTGGTAGCGGCGGTACTCTGTCTTATGAGCAAATGACCGAGCTGGCTCACGGTCTGGAATCTAGCCAGCAACGTTTCCTGTGGGTGGTTCGTTCTCCGAACCAAATCCCGAACAGCACCTATTTCTCTGTACAAAGCCAAAAAGACCCGCTGGCTTACCTCCCAGAAGGCTTCCTGAACCGTACCGAGGGTCGTGGTCTGGTTGTATCTAACTGGGCCCCACAGGCTCAAATTCTGTCTCACGGCTCTACTGGTGGCTTCATGAGCCACTGCGGTTGGAACTCTATTCTGGAGTCTGTGGTGCACGGCGTGCCGATCATCGCGTGGCCGCTGTACGCCGAGCAGAAGATGAACTCTATCATCGTGGTGGAGGACGTTAAGGTGGCGCTGCGTCCGGCGGGTGTAGGTGAGCGTGTGGTGGAGCGTTCTGAGATCACCGCAGTGGTGAAGGCGCTGATGGAGGGTGAGGAGGGTAAGAAGGTACGTAACCGTATGAAGGAACTGAAGGAAGCGGCGGCACGTGCGGTTTCTGATGACGGTGCGTCTACCATCGCGATTGCGGACCTGGCGCAAAAATGGCGTTCTTCTATGAAGCATTAA;SEQ ID NO.4。
利用引物RrUGT3-P1和RrUGT3-P2对RrUGT3基因进行PCR扩增,获得RrUGT3插入片段。
RrUGT3-P1和RrUGT3-P2的引物序列如下:
RrUGT3-P1:5’-CTTTAATAAGGAGATATACCATGTCTGGCACCCCACA-3’;SEQ ID NO.5;
RrUGT3-P2:5’-ATGATGGTGATGGCTGCTGCTTAATGCTTCATAGAAGAAC-3’;SEQ ID NO.6。
PCR反应程序:98℃2min;98℃10s,55℃15s,72℃90s,33个循环;72℃2min。
酶切体系:2μl pCDFDuet-1质粒(600ng/μl),2μlbuffer,1μlNcoI,15μl蒸馏水。37℃酶切3h。
连接体系:1μl pCDFDuet-1线性载体(100ng/μl),1μlRrUGT3插入片段(60ng/μl),2μl 2×ClonExpress Mix。50℃连接30min,获得连接产物。
连接产物转化DH5α感受态细胞,步骤同步骤(1)的转化步骤,获得pCDFDuet-1-RrUGT3质粒,备用。
将pCDFDuet-1-RrUGT3质粒转化BL21(DE3)感受态细胞(转化步骤同转化DH5α感受态细胞),获得转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株。
实施例2
利用表达糖基转移酶UGT85A1的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,饲喂1mM含有醇羟基的底物,具体步骤如下:
(1)接种转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株于含有50μg/ml链霉素的LB液体培养基,37℃,220rpm培养过夜,获得种子液;
(2)按照体积比为1:100的接种量将种子液接种至M9CA(额外添加有40g/L葡萄糖,2mM MgSO4以及0.1mM CaCl2)培养基中,37℃,220rpm培养约3-4小时;
(3)待OD600达0.6-0.8时,加入1mM IPTG进行诱导,同时加入1mM含醇羟基的底物:4-羟基苯甲醇、3-羟基苯甲醇、4-(1-羟乙基)苯酚或3-(1-羟乙基)苯酚(每个底物是一个单独的反应),30℃,220rpm进行发酵;
(4)发酵48h后,将发酵液高速离心后收集上清;
(5)取上清液500μl,等体积加入甲醇,混匀后高速离心取上清进行HPLC检测以及MS检测以测定产物生成;
(6)剩余上清液以流速为1BV/h加入到AB-8大孔吸附树脂柱中;
(7)向大孔吸附树脂柱中以2BV/h的流速加入水,以除去大孔吸附树脂柱中残留的上清液以及极性较大的杂质,同样的方法冲洗3-5个柱体积;
(8)在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30%-40%的乙醇水溶液进行洗脱,并收集乙醇水洗脱液,速率为1BV/h,洗脱3个柱体积;
(9)将洗脱液进行旋蒸,蒸干后用甲醇进行溶解,再经HPLC制备得纯净的糖苷化合物;
(10)利用核磁鉴定产物结构。
试验例1
大肠杆菌发酵产物HPLC检测:
上清液:甲醇=1:1,共1ml,14000rpm离心10min后,取上清200μl,进行HPLC分析检测。
分析条件如下:Thermo液相色谱仪,测定条件包括:C18柱(4.6×250mm);检测波长230nm;流动相A=水(含0.1%体积三氟乙酸),B=乙腈;流速=1mL/min;梯度洗脱条件为0-1min 10%乙腈,1-26min升至100%乙腈,26-30min 100%乙腈,30-31min降至10%乙腈,31-35min 10%乙腈。进样量20μl,同时HPLC检测1mM底物标品,进样量10μl。同时利用质谱以及核磁鉴定产物的结构。
经鉴定,底物4-OH苯甲醇、3-OH苯甲醇、4-(1-羟乙基)苯酚、3-(1-羟乙基)苯酚分别由转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株转化,分别生成了1种醇羟基糖基化产物,结构见图1。
利用表达糖基转移酶UGT85A1的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,饲喂1mM含有醇羟基的底物:4-羟基苯甲醇、3-羟基苯甲醇、4-(1-羟乙基)苯酚或3-(1-羟乙基)苯酚,48h内转化效率均在71.79%以上(表1),产物为醇羟基糖基化产物,四种产物产量(根据转化率计算所得)分别为285、286、244、215mg/L。
表1
底物 | UGT85A1转化底物的转化率 |
4-羟基苯甲醇 | 99.77% |
3-羟基苯甲醇 | 100% |
4-(1-羟乙基)苯酚 | 81.36% |
3-(1-羟乙基)苯酚 | 71.79% |
实施例3
利用表达糖基转移酶UGT85A1的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,饲喂1mM含有羧基的底物,具体步骤如下:
(1)接种转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株于含有50μg/ml链霉素的LB液体培养基,37℃,220rpm培养过夜,获得种子液;
(2)按照体积比为1:100的接种量将种子液接种至M9CA(额外添加有40g/L葡萄糖,2mM MgSO4以及0.1mM CaCl2)培养基中,37℃,220rpm培养约3-4小时;
(3)待OD600达0.6-0.8时,加入1mM IPTG进行诱导,同时加入1mM含羧基的底物:4-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲酸(每个底物是一个单独的反应),30℃,220rpm进行发酵;
(4)发酵48h后,将发酵液高速离心后收集上清;
(5)取上清液500μl,等体积加入甲醇,混匀后高速离心取上清进行HPLC检测以及MS检测以测定产物生成;
(6)剩余上清液以流速为1BV/h加入到AB-8大孔吸附树脂柱中;
(7)向大孔吸附树脂柱中以2BV/h的流速加入水,以除去大孔吸附树脂柱中残留的上清液以及极性较大的杂质,同样的方法冲洗3-5个柱体积;
(8)在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30%-40%的乙醇水溶液进行洗脱,并收集乙醇水洗脱液,速率为1BV/h,洗脱3个柱体积;
(9)将洗脱液进行旋蒸,蒸干后用甲醇进行溶解,再经HPLC制备得纯净的糖苷化合物;
(10)利用核磁鉴定产物结构。
试验例2
大肠杆菌发酵产物HPLC检测:
上清液:甲醇=1:1,共1ml,14000rpm离心10min后,取上清200μl,进行HPLC分析检测。
分析条件如下:Thermo液相色谱仪,测定条件包括:C18柱(4.6×250mm);检测波长230nm;流动相A=水(含0.1%体积三氟乙酸),B=乙腈;流速=1mL/min;梯度洗脱条件为0-1min 10%乙腈,1-26min升至100%乙腈,26-30min 100%乙腈,30-31min降至10%乙腈,31-35min 10%乙腈。进样量20μl,同时HPLC检测1mM底物标品,进样量10μl。同时利用质谱以及核磁鉴定产物的结构。
经鉴定,底物4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸分别由转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株转化,分别生成了1种羧基糖基化产物,结构见图2。
利用表达糖基转移酶UGT85A1的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,饲喂1mM含有羧基的底物:4-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲酸,48h内可实现部分转化(表2),产物为羧基糖基化产物,两种产物产量(根据转化率计算所得)分别为5mg/L、10mg/L。
表2
底物 | UGT85A1转化底物的转化率 |
4-羟基苯甲酸 | 1.67% |
3-羟基苯甲酸 | 3.27% |
实施例4
利用表达糖基转移酶RrUGT3的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,饲喂1mM含有酚羟基的底物,具体步骤如下:
(1)接种转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株于含有50μg/ml链霉素的LB液体培养基,37℃,220rpm培养过夜,获得种子液;
(2)按照体积比为1:100的接种量将种子液接种至M9CA(额外添加有40g/L葡萄糖,2mM MgSO4以及0.1mM CaCl2)培养基中,37℃,220rpm培养约3-4小时;
(3)待OD600达0.6-0.8时,加入1mM IPTG进行诱导,同时加入1mM含酚羟基的底物:对甲酚、对乙酚、对异丙基酚、对丙基苯酚、3-乙基苯酚、3-甲酚、4-羟基苯乙酮、4-羟基苯丙酮、3-羟基苯乙酮、3-乙烯基苯酚、3-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醇、4-羟基苯甲醛、3-(1-羟乙基)苯酚、4-(1-羟乙基)苯酚、2-(4-羟基苯基)异丙醇、4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲醇(每个底物是一个单独的反应),30℃,220rpm进行发酵;
(4)发酵48h后,将发酵液高速离心后收集上清;
(5)取上清液500μl,等体积加入甲醇,混匀后高速离心取上清进行HPLC检测以及MS检测以测定产物生成;
(6)剩余上清液以流速为1BV/h加入到AB-8大孔吸附树脂柱中;
(7)向大孔吸附树脂柱中以2BV/h的流速加入水,以除去大孔吸附树脂柱中残留的上清液以及极性较大的杂质,同样的方法冲洗3-5个柱体积;
(8)在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30%-40%的乙醇水溶液进行洗脱,并收集乙醇水洗脱液,速率为1BV/h,洗脱3个柱体积;
(9)将洗脱液进行旋蒸,蒸干后用甲醇进行溶解,再经HPLC制备得纯净的糖苷化合物;
(10)利用核磁鉴定产物结构。
试验例3
大肠杆菌发酵产物HPLC检测:
上清液:甲醇=1:1,共1ml,14000rpm离心10min后,取上清200μl,进行HPLC分析检测。
分析条件如下:Thermo液相色谱仪,测定条件包括:C18柱(4.6×250mm);检测波长230nm;流动相A=水(含0.1%体积三氟乙酸),B=乙腈;流速=1mL/min;梯度洗脱条件为0-1min 10%乙腈,1-26min升至100%乙腈,26-30min 100%乙腈,30-31min降至10%乙腈,31-35min 10%乙腈。进样量20μl,同时HPLC检测1mM底物标品,进样量10μl。同时利用质谱以及核磁鉴定产物的结构。
经鉴定,底物对甲酚、对乙酚、对异丙基酚、对丙基苯酚、3-乙基苯酚、3-甲酚、4-羟基苯乙酮、4-羟基苯丙酮、3-羟基苯乙酮、3-乙烯基苯酚、3-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醇、4-羟基苯甲醛、3-(1-羟乙基)苯酚、4-(1-羟乙基)苯酚、2-(4-羟基苯基)异丙醇、4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲醇分别由转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株转化,产物结构见图3;共生成了18种酚羟基糖基化产物,以及两种醇羟基糖基化产物,两种羧基糖基化产物。
利用表达糖基转移酶RrUGT3的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,饲喂1mM含有酚羟基的底物对甲酚、对乙酚、对异丙基酚、对丙基苯酚、3-乙基苯酚、3-甲酚、4-羟基苯乙酮、4-羟基苯丙酮、3-羟基苯乙酮、3-乙烯基苯酚、3-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醇、4-羟基苯甲醛、3-(1-羟乙基)苯酚、4-(1-羟乙基)苯酚、2-(4-羟基苯基)异丙醇、4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲醇,除催化3-羟基苯甲醇只能生成醇羟基糖基化产物外,其余均可生成酚羟基糖基化产物。且3-(1-羟乙基)苯酚既可生成酚羟基糖基化产物,又可生成醇羟基糖基化产物;对于含羧基的底物也可生成少量羧基糖基化产物。各个产物转化率和产量(根据转化率计算所得)见表3。
表3
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 山东大学
<120> UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1470
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgggttctc agatcattca taactctcaa aaaccacatg tagtttgtgt tccatatccg 60
gctcaaggcc acatcaaccc gatgatgcgt gtggctaaac tgctgcacgc ccgtggcttt 120
tacgttacat tcgttaacac cgtttacaac cacaaccgtt tcctgcgttc tcgtggttcc 180
aacgccctgg atggtctccc atcgttccgt tttgagtcga ttgctgacgg tctgccagag 240
accgacatgg atgccaccca ggacatcacc gctctgtgcg agtccaccat gaagaactgt 300
ctggctccgt tccgtgagct gctgcaacgt atcaacgctg gtgataacgt tccgccggta 360
agctgtattg tatctgacgg ttgtatgagc tttactctgg atgttgcgga ggagctgggt 420
gttcccgagg ttctgttctg gaccaccagc ggctgtgcgt tcctggctta tctgcacttt 480
tatctgttca tcgagaaggg cctgtgtccg ctgaaagatg agtcttacct gaccaaggag 540
tacctggaag acaccgttat cgattttatc ccaaccatga agaacgtgaa actgaaggat 600
attccgagct tcatccgtac cactaacccg gatgatgtta tgatttcttt cgccctgcgc 660
gagaccgagc gtgccaaacg tgcttctgct atcattctga acacctttga tgacctggag 720
catgatgttg ttcatgctat gcaatctatc ctcccaccgg tgtatagcgt tggtccgctg 780
catctgctgg caaaccgtga gattgaagaa ggttctgaga ttggtatgat gtcttctaac 840
ctgtggaaag aggagatgga gtgtctggat tggctggata ctaagactca aaactctgtt 900
atttatatca actttggtag catcaccgtt ctgtctgtga agcagctggt ggagtttgct 960
tggggtctgg cgggttctgg taaagagttt ctgtgggtga tccgtccaga tttagtagcg 1020
ggtgaggagg ctatggttcc gccggacttt ctgatggaga ctaaagaccg ctctatgctg 1080
gcgtcttggt gtccgcaaga gaaagtactg tctcatccgg ctattggtgg ttttctgacc 1140
cattgcggtt ggaactctat cctggaatct ctgtcttgtg gtgttccgat ggtgtgttgg 1200
ccattttttg ctgaccagca aatgaactgt aagttttgtt gtgacgagtg ggatgttggt 1260
attgagatcg gtggtgatgt gaagcgtgag gaagttgagg cggtggttcg tgagctgatg 1320
gatggtgaga agggtaagaa aatgcgtgaa aaggcggtag agtggcagcg cctggccgag 1380
aaagcgaccg aacataaact gggttcttcc gttatgaact ttgagaccgt tgttagcaag 1440
tttctgctgg gtcaaaaatc tcaggattaa 1470
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ctttaataag gagatatacc atgggttctc agatcattca 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgatggtga tggctgctgc ttaatcctga gatttttgac 40
<210> 4
<211> 1419
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgtctggca ccccacacat cgccatcctg ccgagcccgg gcatgggcca cctgatcccg 60
atggccgagt tcgccaagcg cctggttcac caccacaact tctctatcac cttcgttatc 120
ccgaccgacg gcccaccgtc ctccgcctac caacaagttc tgacctccct gccatcttcc 180
atcgatcaca tcttcctgcc acaagttgac ctgaccgacg ttgtatctca atctccagct 240
catccgcgta tcgaaaccct gatctccctg accgttgctc gctccctgtc ctccctgcgc 300
accaccctgt cctctctgca atcttctaaa aacctggttt ctctggttgt tgatctgttc 360
ggcactgatg cattcgaccc ggccatcgag ctgggcatct ctccgtacat tttcttcccg 420
tccaccgcca tgaccctgtc tctgttcctg tacatgccgc agctggacaa atctgttacc 480
tgcgaatttc gtcacatgac cgatctggtt cgtattccgg gttgcgttcc ggttcgtggt 540
tctgatctgt tcgacccggt tcaagaccgt accgacgagg cttataaatg ggttatccat 600
cactccaacc gttacccgat ggcggagggt gttatcgaga acagcttcat ggagctggaa 660
catggtgcgc tgaagtatct gcaaaccgtt caatctggta agccgccggt ttacgcggtt 720
ggtccgctga ttaaaatgga ttatgatgtt gacgattccg gttctaagat catcgagtgg 780
ctggatgatc aaccggttgg ttctgttctg tttgtttctt ttggtagcgg cggtactctg 840
tcttatgagc aaatgaccga gctggctcac ggtctggaat ctagccagca acgtttcctg 900
tgggtggttc gttctccgaa ccaaatcccg aacagcacct atttctctgt acaaagccaa 960
aaagacccgc tggcttacct cccagaaggc ttcctgaacc gtaccgaggg tcgtggtctg 1020
gttgtatcta actgggcccc acaggctcaa attctgtctc acggctctac tggtggcttc 1080
atgagccact gcggttggaa ctctattctg gagtctgtgg tgcacggcgt gccgatcatc 1140
gcgtggccgc tgtacgccga gcagaagatg aactctatca tcgtggtgga ggacgttaag 1200
gtggcgctgc gtccggcggg tgtaggtgag cgtgtggtgg agcgttctga gatcaccgca 1260
gtggtgaagg cgctgatgga gggtgaggag ggtaagaagg tacgtaaccg tatgaaggaa 1320
ctgaaggaag cggcggcacg tgcggtttct gatgacggtg cgtctaccat cgcgattgcg 1380
gacctggcgc aaaaatggcg ttcttctatg aagcattaa 1419
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctttaataag gagatatacc atgtctggca ccccaca 37
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atgatggtga tggctgctgc ttaatgcttc atagaagaac 40
Claims (3)
1.糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,其特征在于,所述UGT85A1催化多种底物生成的糖苷化合物为(4-羟苯基)甲基β-D-吡喃葡萄糖苷、(3-羟苯基)甲基β-D-吡喃葡萄糖苷、(4-羟苯基)乙基β-D-吡喃葡萄糖苷、(3-羟苯基)乙基β-D-吡喃葡萄糖苷,4-羟基苯甲酸β-D-葡萄糖基酯、3-羟基苯甲酸β-D-葡萄糖基酯;所述RrUGT3催化多种底物生成的糖苷化合物为4-甲苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、4-乙基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、4-(1-甲基乙基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、4-丙基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、3-乙基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、3-甲苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、云杉苷、4-丙酰基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、3-乙酰基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、3-乙烯基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、3-醛基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、天麻素、豆腐果苷、3-(1-羟乙基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、4-(1-羟乙基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、4-(2-羟丙基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、4-羧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、3-羧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、4-羟基苯甲酸β-D-葡萄糖基酯、3-羟基苯甲酸β-D-葡萄糖基酯、(3-羟苯基)甲基β-D-吡喃葡萄糖苷、(3-羟苯基)乙基β-D-吡喃葡萄糖苷;
所述UGT85A1催化的底物为4-羟基苯甲醇、3-羟基苯甲醇、4-(1-羟乙基)苯酚、3-(1-羟乙基)苯酚、4-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲酸;所述RrUGT3催化的底物为对甲酚、对乙酚、对异丙基酚、对丙基苯酚、3-乙基苯酚、3-甲酚、4-羟基苯乙酮、4-羟基苯丙酮、3-羟基苯乙酮、3-乙烯基苯酚、3-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醇、4-羟基苯甲醛、3-(1-羟乙基)苯酚、4-(1-羟乙基)苯酚、2-(4-羟基苯基)异丙醇、4-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸或3-羟基苯甲醇;
所述UGT85A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述RrUGT3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,其特征在于,利用糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3催化底物生成糖苷化合物的方法如下:
(1)将糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3的基因分别整合至pCDFDuet-1质粒,分别转化进大肠杆菌DH5α,获得pCDFDuet-1-UGT85A1质粒和pCDFDuet-1-RrUGT3质粒;再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,分别获得转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株和转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株;
(2)分别将转化有pCDFDuet-1-UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株和转化有pCDFDuet-1-RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株接种于含有50μg/ml链霉素的LB液体培养基,37℃,220rpm培养过夜,获得种子液;
(3)分别按照体积比为1:100的接种量将种子液接种至培养基中,37℃,220rpm培养3-4小时;
(4)待OD600达0.6-0.8时,加入1mM IPTG进行诱导,同时加入1mM糖基转移酶底物,30℃,220rpm进行发酵;
(5)发酵48h后,将发酵液高速离心后收集上清液;
(6)取上清液,等体积加入甲醇,混匀后高速离心取上清进行HPLC检测以及MS检测以测定产物生成;
(7)以流速为1BV/h将步骤(5)的上清液加入到AB-8大孔吸附树脂柱中;
(8)向大孔吸附树脂柱中以2BV/h的流速加入水,同样的方法冲洗3-5个柱体积;
(9)在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30%-40%的乙醇水溶液进行洗脱,并收集乙醇水洗脱液,速率为1BV/h,洗脱3个柱体积;
(10)将洗脱液进行旋蒸,蒸干后用甲醇进行溶解,再经HPLC制备得纯净的糖苷化合物;
(11)利用核磁鉴定产物结构。
3.根据权利要求2所述的糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用,其特征在于,步骤(3)所述培养基为M9CA培养基或LB培养基。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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