CN111826332A - 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌 - Google Patents

一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌 Download PDF

Info

Publication number
CN111826332A
CN111826332A CN201910321978.0A CN201910321978A CN111826332A CN 111826332 A CN111826332 A CN 111826332A CN 201910321978 A CN201910321978 A CN 201910321978A CN 111826332 A CN111826332 A CN 111826332A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
anethole
gene
monooxygenase
trans
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910321978.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111826332B (zh
Inventor
郑璞
文鹏
吴丹
陈鹏程
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910321978.0A priority Critical patent/CN111826332B/zh
Priority to US16/517,792 priority patent/US10711291B2/en
Publication of CN111826332A publication Critical patent/CN111826332A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111826332B publication Critical patent/CN111826332B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/99033—Formate dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌，包括，甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体的构建；重组基因工程菌的诱导表达；利用所述重组基因工程菌生产胡椒醛。在进行催化时最终能得到15.91g/L、转化率为79.55％，时空转化率为2.27g/L/h的胡椒醛，比现有的胡椒醛产量具有显著提高，因而更有利于顺利实现工业化生产。

Description

一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程 菌生产胡椒醛的方法及其工程菌
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌。
背景技术
胡椒醛(Piperonal)又称洋茉莉醛(Heliotropin)，具有清甜的樱桃以及香草的香气。胡椒醛在食用香料、化妆品行业、医药行业、农业以及电镀工业上都有着广泛的应用。天然洋茉莉醛主要存在于甜瓜、刺槐、香胡椒、香荚兰豆等植物中，但含量极少，人们无法从植物中直接提取获得。
目前，洋茉莉醛的工业生产主要是通过以黄樟油素为原料的半合成法和以邻苯二酚为原料的全合成法，该方法环境污染严重，并且耗能较多。随着人们对物质生产过程中的关注及对食品添加物质的要求，生物发酵法及酶法合成的香料物质，越来越受到人们的青睐。
胡椒醛的微生物合成目前并没有应用于工业生产。在巴西Santos团队，发现几株能利用异黄樟素生成胡椒醛的微生物，其中效率最高的菌株为宛氏拟青霉菌，但只有在添加H2O2条件下，最高产量为64mg/L，转化率仅为20％。中国专利CN105779363A中发现，一株液化沙雷氏菌能产282mg/L胡椒醛。
因此，如何提高反式茴香脑单加氧酶的酶活性，加快催化其合成胡椒醛的速率是胡椒醛的微生物合成领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中胡椒醛产量和转化率低的不足，提供一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其包括，
甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体的构建；
重组基因工程菌的诱导表达；
利用所述重组基因工程菌生产胡椒醛；
其中，所述重组载体以pETDuet-1质粒为基础；反式茴香脑单加氧酶基因 tao的核苷酸序列如SEQ IDNO.2；反式茴香脑单加氧酶基因tao突变体基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3；甲酸脱氢酶基因fdh来源于博伊丁假丝酵母 Candida boidinii，GenBank：AJ011046.2。
作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述甲酸脱氢酶基因fdh与所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因以串联的方式连接到pETDuet-1载体，甲酸脱氢酶基因fdh位于pETDuet-1载体的第一个多克隆位点MSC1，所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因位于pETDuet-1载体的第二个多克隆位点MSC2。
作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述甲酸脱氢酶基因fdh，经过密码子优化后，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述重组基因工程菌来源于E.Coli BL21(DE3)。
作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述重组基因工程菌的诱导表达，为将甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体转化E.Coli BL21(DE3)菌株，之后接种于含有30～100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养获得种子液；再将种子液以2-5％的接种量接种于含有30～100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至OD600nm为 0.5～1.8，添加终浓度为0.1～1mmol/LIPTG，在16-28℃下诱导培养6～10h，离心，收集菌体细胞。
作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述利用重组基因工程菌生产胡椒醛，为经过所述重组基因工程菌的诱导表达后，以所述重组基因工程菌为生物催化剂，以黄樟油素为底物，甲酸钠为辅底物，pH3～9缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～40℃、50～240rpm条件下进行转化0.5～12h。
作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述利用重组基因工程菌生产胡椒醛，其反应体系中，所述底物浓度为0～30g/L，辅底物浓度为0～60g/L，所述生物催化剂用量以菌体湿重为计为10～100g/L。
作为本发明所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法的一种优选方案：所述胡椒醛产量15.91g/L、转化率为 79.55％、时空转化率为2.27g/L/h。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中胡椒醛产量和转化率低的不足，提供所述的共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶的重组工程菌。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述的共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶的重组工程菌。
本发明的有益效果：本发明构建了共表达甲酸脱氢酶基因和反式茴香脑单加氧酶基因及其突变体基因的重组载体，获得了重组基因工程菌，在进行催化时最终能得到15.91g/L、转化率为79.55％，时空转化率为2.27g/L/h的胡椒醛，比现有的胡椒醛产量具有显著提高，因而更有利于顺利实现工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中反式茴香脑单加氧酶与甲酸脱氢酶共表达载体pETDuet-1-fdh-tao的载体图谱。
图2为本发明中E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-fdh-tao3g2菌株底物转化图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao(及其突变体基因) 克隆和共表达重组体系构建：
编码所述甲酸脱氢酶的基因fdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其来源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii(GenBank：AJ011046.2)并经过密码子优化，连接于载体pET-28a上，即为重组载体pET-28a-fdh；编码所述反式茴香脑单加氧酶的基因核苷酸序列如SEQID NO.2，其突变体基因tao(tao3g2) 的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其来源于假单胞菌(Pseudomonas putida)。其中含有tao3g2基因的突变体的反式茴香脑单加氧酶酶活较原始提高了约1.4 倍。
以pET-28a-fdh为模板，通过上下游引物(上游：5’ -ccacagccaggatccgaattcatgaaaattgtgctggtgctgta-3’，见SEQ ID NO.4；下游：5’ -cgacttaagcattatgcggccgcttatttcttatcatgtttgccataggc-3’，见SEQ ID NO.5)进行PCR 扩增含有甲酸脱氢酶基因的产物。用EcoRI与NotI双酶酶切质粒pETDuet-1 (MSC1)，回收线性质粒，然后通过一步克隆就可以获得重组质粒 pETDuet-1-fdh。随后再通过设计上下游引物(上游：5’ -agatatacatatggcagatctatggaggacatcatgcaaggc-3’，见SEQ ID NO.6；下游：5’ -ggtttctttaccagactcgagtcagttagtcctcaagtcggaattg-3’，SEQ ID NO.7)PCR扩增所述含有反式茴香脑单加氧基因tao(及其突变体基因tao3g2。先用BglII与XhoI双酶酶切质粒pETDuet-1-fdh(MSC2)，回收线性质粒，然后通过一步克隆获得重组质粒pETDuet-1-fdh-tao(及其突变体共表达重组载体pETDuet-1-fdh-tao3g2) (如图1所示)，即为共表达甲酸脱氢酶与反式茴香脑单加氧酶的重组载体。其中PCR反应条件为：94℃5min；98℃10s，56℃5s，72℃15s(35个循环)；72℃10min，之后用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段。一步克隆具体方法：将片段(0.04-0.08ng/bp)和载体(0.005-0.01ng/bp)混合于同一PCR管中，加入2-4ul的重组酶缓冲液和1-2ul的重组酶，加ddH2O补齐至10-20ul，在37℃反应30min，得到重组质粒。将上述的甲酸脱氢酶与反式茴香脑单加氧酶交换多克隆位点的位置，即可得到pETDuet-1-tao-fdh。考虑到在反应中反式茴香脑单加氧酶发挥主要作用，所以将甲酸脱氢酶克隆到拷贝数较低的质粒pCDFDUet-1中，最终得到pCDFDUet-1-fdh。最终得到如下几种共表达体系：pETDuet-1-fdh-tao及其突变体共表达重组载体pETDuet-1-fdh-tao3g2、pETDuet-1-tao-fdh、 pETDuet-1-tao/pCDFDUet-1-fdh、pETDuet-1-fdh-tao/pCDFDUet-1-fdh。
实施例2：
不同共表达体系的重组基因工程菌的诱导表达：
将上述实施例1得到的不同共表达菌株，接种于含有30-100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养获得种子液；再将种子液以2-5％的接种量接种于含有30-100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至OD600nm为 0.5-1.8，添加终浓度为0.1-1mmol/LIPTG在16-28℃下诱导培养6-10h。最后，在4℃、5000-8000rpm离心菌体8-15min，弃上清，获得湿菌体，用生理盐水洗涤菌体2次，离心，收集菌体细胞，即为生物催化剂。
实施例3：
不同共表达菌株的反式茴香脑单加氧酶酶活比较：
反式茴香脑单加氧酶酶活(TAO)测定方式：在反应体系中加入适量的生物催化剂以及黄樟油素和甲酸钠，于30℃反应20min，取一定体积反应液，加入等体积的甲醇混匀，终止反应，10000rpm离心5min，上清液采用0.22μ M的有机膜过滤，通过HPLC检测胡椒醛的含量.
反式茴香脑单加氧酶酶活(U)定义：在菌体OD600nm＝1时，每分钟生成 1μmol/L胡椒醛所需要的酶量。
HPLC检测条件：采用Amethst C18-H反向柱(4.6mm×250mm，5μm)，以60％乙腈，以及0.1％的甲酸为流动相，柱温箱温度为35℃，进样量为10 μL，270nm处检测胡椒醛含量。
进行酶活比较的菌株如下：E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-tao、E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-fdh-tao、E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-tao-fdh、E.coli BL21 (DE3)pETDuet-1-tao3g2-fdh、E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-tao/pCDFDUet-1-fdh、 E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-fdh-tao/pCDFDUet-1-fdh。通过TAO酶活比较发现：以上构建的共表达菌株其酶活均高于单表达反式茴香脑单加氧酶基因的菌株E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-tao。此外，构建的共表达甲酸脱氢酶基因与反式茴香脑单加氧酶基因的重组基因工程菌株E.coli BL21(DE3) pETDuet-1-fdh-tao的酶活较高，为182U。我们进一步优选此共表达方式(体系)应用于反式茴香脑单加氧酶突变体中，得到了重组基因工程菌株E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-fdh-tao3g2，酶活为205U。
表1为本发明尝试不同共表达体系构建菌株的反式茴香脑单加氧酶酶活比较
Figure BDA0002035035500000061
实施例4：
E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-fdh-tao3g2菌株实际转化底物黄樟油素产生胡椒醛：
将实施例3得到的反式茴香脑单加氧酶酶活最高菌株E.coli BL21(DE3)pETDuet-1-fdh-tao3g2按照实施例2方法进行诱导表达得到生物催化剂，来进行底物转化。在pH7.4的PBS缓冲液中，添加7.5％的生物催化剂、20g/L的黄樟油素以及40g/L甲酸钠，在30℃、110rpm条件下进行转化8h，每隔1h取样观察产物生成情况。如图2所示，以20g/L底物进行转化时，最终可得到15.91g/L、转化率为79.55％，时空转化率为2.27g/L/h的胡椒醛。
综上，本发明构建了共表达甲酸脱氢酶基因和反式茴香脑单加氧酶基因 (及其突变体基因)的重组载体，获得了重组基因工程菌，机理可能是在催化反应过程中，通过提供NADH将TAO辅基FAD还原，提高催化反应中FADH 的浓度，实验结果显示，本发明方法大大提高了整体的催化效率，本发明在进行催化时最终能得到15.91g/L、转化率为79.55％，时空转化率为2.27g/L/h的胡椒醛，比现有的胡椒醛产量具有显著提高，因而更有利于顺利实现工业化生产。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Figure BDA0002035035500000081
Figure BDA0002035035500000091
Figure BDA0002035035500000101
Figure BDA0002035035500000111
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaattg tgctggtgct gtatgatgcc ggcaaacatg ccgccgatga agagaagctg 60
tacggttgca ccgagaacaa actgggcatt gccaactggc tgaaagatca aggtcacgag 120
ctgattacca caagcgataa agagggcggc aacagcgttc tggatcagca catcccggac 180
gccgatatca ttatcaccac cccgttccat ccggcctata ttaccaaaga gcgcatcgat 240
aaagccaaaa agctgaaact ggtggtggtg gccggcgtgg gtagcgatca tattgattta 300
gactatatta accagaccgg caagaagatc agcgtgctgg aagttaccgg cagcaacgtg 360
gtgagcgttg cagagcatgt ggtgatgacc atgctggtgt tagtgcgcaa cttcgtgccg 420
gcacacgagc agattatcaa ccacgactgg gaagtggccg ccattgccaa agacgcctac 480
gacattgagg gcaagacaat tgccaccatc ggtgccggtc gcattggtta tcgcgtgctg 540
gagcgtttag tgccgttcaa cccgaaggag ctgctgtact acgactatca agctttaccg 600
aaagatgccg aagaaaaagt gggcgcccgc cgcgtggaaa atattgagga actggtggcc 660
caagctgaca tcgtgaccgt gaacgccccg ttacacgccg gcaccaaagg tctgatcaat 720
aaagaactgt taagcaagtt caaaaagggc gcttggctgg ttaataccgc acgcggtgcc 780
atttgtgtgg cagaagatgt tgcagcagct ttagaaagcg gtcaactgcg cggctatggc 840
ggcgatgtgt ggtttccgca gcccgctccg aaagatcacc cgtggcgcga catgcgtaac 900
aaatatggcg ccggcaatgc catgacccct cactattctg gtaccacact ggatgcccag 960
acccgctatg cacaaggtac caaaaacatt ctggaaagct ttttcaccgg caagtttgac 1020
tatcgcccgc aagatatcat tttactgaac ggcgaatatg ttaccaaagc ctatggcaaa 1080
catgataaga aataa 1095
<210> 2
<211> 1047
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 2
atggaggaca tcatgcaagg caccaacgca gcggttagcg acaaccgcgg atacaaatgg 60
atagccaggg aaatagagcg gctggaccct gaaaaggact ttgccgaaat ctggcggctg 120
tccacaacgt actatgtgaa cgactttgtg atgaacctgg tttacacgct gggcatccct 180
gcttttaccc aaccgccggc gggcagcgtc gtgatgggag taacgacaga aaaagccatc 240
aaaaaaccgc agaagcgtac cgacgacacc ttgcagcatt tttggacctg gttcgaatac 300
gggccggatg atccgaggat gcaagcttca ttggcgcatg tgaatcgcgg gcatgcagca 360
cttgccaagc gttcccctgg tacattcccg gctcgcgatg tgatctatac cacagcctgg 420
atcggggcca acctgcaccg cttgcgcctg agcgtcggtc ttccgggttt taccaaaaat 480
cagcaaatcg cttcgcagcg ctactgggcc gctatctgcc ggcaattctg gagtgaagac 540
ggtttagtca ctgagtatcc ggaaagcttc gaggccatgc tgcagtacat cgaggattac 600
gaagcccagc catgggaaca ggttgaatcc gggcgagtgc tgaccgaggc catcatcaag 660
caattcgtgg atgcctactt cccaggccca ttagggtgga ttggccgtca actctatctc 720
tcgttccagc ttcccaccat caacggcttg atgcagtccg ggaaacctaa cccgatcatg 780
aagtgggtga tgcgaaaggg cctgtggttc ggcttaacgc ttcaggagcg tgtcttcccc 840
gacccgaaat tatcaactcc agaaaaggcg cgcaggaaac cggtacgccc aggccaacac 900
attgatccgc ctacagccga ggtgaaatgt cctttccctg gagcgactag ccaaccctcc 960
ataccgtccg ccgattcatc tggttgccct ttccacgctg gcaaagcgaa cggggaagcc 1020
aacaattccg acttgaggac taactga 1047
<210> 3
<211> 1047
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 3
atggaggaca tcatgcaagg caccaacgca gcggttagcg acaaccgcgg atacaaatgg 60
atagccaggg aaatagagcg gctggaccct gaaaaggact ttgccgaaat ctggcggctg 120
tccacaacgt actatgtgaa cgactttgtg atgaacctgg tttacacgct gggcatccct 180
gcttttaccc aaccgccggc gggcagcgtc ttgatgggag taacgacaga aaaagccatc 240
aaaaaaccgc agaagcgtac cgacgacacc ttgcagcatt tttggacctg gttcgaatac 300
gggccggatg atccgaggat gcaagcttcg ttggcgcatg tgaatcgcgg gcatgcagca 360
cttgccaagc gttcccctgg tacattcccg gctcgcgatg tgatctatac cacagcctgg 420
atcggggcca acctgcaccg cttgcgcctg agcgtcggtc ttccgggttt taccaaaaat 480
cagcaaatcg cttcgcagcg ctactgggcc gctatctgcc ggcaattctg gagtgaagac 540
ggtttagtca ctgagtatcc ggaaagcttc gaggccatgc tgcagtacat cgaggattac 600
gaagcccagc catgggaaca ggttgaatcc gggcgagtgc tgaccgaggc catcatcaag 660
caattcgtgg atgcctactt cccaggccca ttagggtgga ttggccgtca actctatctc 720
tcgttccagc ttcccaccat caactgcttg atgcagtccg ggaaacctaa cccgatcatg 780
aagtgggtga tgcgaaaggg cctgtggttc ggcttaacgc ttcaggagcg tgtcttcccc 840
gacccgaaat tatcaactcc agaaaaggcg cgcaggaaac cggtacgccc aggccaacac 900
attgatccgc ctacagccga ggtgaaatgt cctttccctg gagcgactag ccaaccctcc 960
ataccgtccg ccgattcatc tggttgccct ttccacgctg gcaaagcgaa cggggaagcc 1020
aacaattccg acttgaggac taactga 1047
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccacagccag gatccgaatt catgaaaatt gtgctggtgc tgta 44
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgacttaagc attatgcggc cgcttatttc ttatcatgtt tgccataggc 50
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agatatacat atggcagatc tatggaggac atcatgcaag gc 42
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtttcttta ccagactcga gtcagttagt cctcaagtcg gaattg 46

Claims (9)

1.一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：包括，
甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体的构建；
重组基因工程菌的诱导表达；
利用所述重组基因工程菌生产胡椒醛；
其中，所述重组载体以pETDuet-1质粒为基础；反式茴香脑单加氧酶基因tao的核苷酸序列如SEQ IDNO.2；反式茴香脑单加氧酶基因tao突变体基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3；甲酸脱氢酶基因fdh来源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii。
2.如权利要求1所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述甲酸脱氢酶基因fdh与所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因以串联的方式连接到pETDuet-1载体，甲酸脱氢酶基因fdh位于pETDuet-1载体的第一个多克隆位点MSC1，所述反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因位于pETDuet-1载体的第二个多克隆位点MSC2。
3.如权利要求1或2所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述甲酸脱氢酶基因fdh，经过密码子优化后，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
4.如权利要求1或2所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述重组基因工程菌来源于E.Coli BL21(DE3)。
5.如权利要求1或2所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述重组基因工程菌的诱导表达，为将甲酸脱氢酶基因fdh与反式茴香脑单加氧酶基因tao或其突变体基因共表达重组载体转化E.Coli BL21(DE3)菌株，之后接种于含有30～100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养获得种子液；再将种子液以2-5％的接种量接种于含有30～100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至OD600nm为0.5～1.8，添加终浓度为0.1～1mmol/LIPTG，在16-28℃下诱导培养6～10h，离心，收集菌体细胞。
6.如权利要求5所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述利用重组基因工程菌生产胡椒醛，为经过所述重组基因工程菌的诱导表达后，以所述重组基因工程菌为生物催化剂，以黄樟油素为底物，甲酸钠为辅底物，pH3～9缓冲液为反应介质构成反应体系，在20～40℃、50～240rpm条件下进行转化0.5～12h。
7.如权利要求6所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述利用重组基因工程菌生产胡椒醛，其反应体系中，所述底物浓度为0～30g/L，辅底物浓度为0～60g/L，所述生物催化剂用量以菌体湿重为计为10～100g/L。
8.如权利要求6所述的利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法，其特征在于：所述胡椒醛产量15.91g/L、转化率为79.55％、时空转化率为2.27g/L/h。
9.权利要求1～8中任一项所述的共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶的重组工程菌。
CN201910321978.0A 2018-07-04 2019-04-22 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌 Active CN111826332B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910321978.0A CN111826332B (zh) 2019-04-22 2019-04-22 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌
US16/517,792 US10711291B2 (en) 2018-07-04 2019-07-22 Recombinant engineered bacterium co-expressing trans-anethole oxygenase and formate dehydrogenase and application thereof in production of piperonal

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910321978.0A CN111826332B (zh) 2019-04-22 2019-04-22 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111826332A true CN111826332A (zh) 2020-10-27
CN111826332B CN111826332B (zh) 2022-12-23

Family

ID=69102511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910321978.0A Active CN111826332B (zh) 2018-07-04 2019-04-22 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌

Country Status (2)

Country Link
US (1) US10711291B2 (zh)
CN (1) CN111826332B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826332B (zh) * 2019-04-22 2022-12-23 江南大学 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌
CN110408604B (zh) * 2019-08-14 2020-11-27 华东理工大学 底物亲和力和辅酶亲和力提高的甲酸脱氢酶突变体
CN116121308B (zh) * 2023-03-16 2024-07-26 福州大学 一种基于nadph辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105238807A (zh) * 2015-11-23 2016-01-13 江南大学 一种辅酶高效再生体系的构建及其应用
CN106479988A (zh) * 2016-11-08 2017-03-08 江南大学 一种酶活和稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其构建方法
CN107699587A (zh) * 2017-09-22 2018-02-16 江南大学 一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法
US20200010864A1 (en) * 2018-07-04 2020-01-09 Jiangnan University Recombinant Engineered Bacterium Co-Expressing Trans-Anethole Oxygenase and Formate Dehydrogenase and Application thereof in Production of Piperonal

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105238807A (zh) * 2015-11-23 2016-01-13 江南大学 一种辅酶高效再生体系的构建及其应用
CN106479988A (zh) * 2016-11-08 2017-03-08 江南大学 一种酶活和稳定性提高的甲酸脱氢酶突变体及其构建方法
CN107699587A (zh) * 2017-09-22 2018-02-16 江南大学 一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法
US20200010864A1 (en) * 2018-07-04 2020-01-09 Jiangnan University Recombinant Engineered Bacterium Co-Expressing Trans-Anethole Oxygenase and Formate Dehydrogenase and Application thereof in Production of Piperonal

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘思琴等: "合成洋茉莉醛重组菌株的构建与产物鉴定", 《食品与发酵工业》 *
李小东等: "洋茉莉醛的合成及其应用研究进展", 《化工中间体》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111826332B (zh) 2022-12-23
US20200010864A1 (en) 2020-01-09
US10711291B2 (en) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111826332B (zh) 一种利用共表达反式茴香脑单加氧酶和甲酸脱氢酶重组工程菌生产胡椒醛的方法及其工程菌
CN109468291B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN108048416A (zh) 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用
CN109593702B (zh) 一种基因工程菌株实现全细胞转化合成l-苯乳酸的方法
CN117866866A (zh) 一种利用富马酸生产依克多因的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
KR101312835B1 (ko) 알데히드 디하이드로지네이즈를 코딩하는 ｐｕｕＣ 유전자가 형질도입된 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 단독 혹은 １，３―프로판디올 및 ３―하이드록시프로피온산의 동시 제조방법
CN102864116A (zh) 产丁二酸基因工程菌及其构建及应用
CN111334459B (zh) 一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用
CN116478942B (zh) 一种异丁香酚单加氧酶突变体、工程菌及应用
CN109722442B (zh) 7β-羟基胆酸脱氢酶及其应用
CN107299074B (zh) 甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用
WO2010050231A1 (ja) シロ－イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ－イノシトール製造方法
CN115261292B (zh) 改造的克雷伯氏菌属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用和方法
CN115927152A (zh) 香兰素在基因工程菌大肠杆菌中的合成与积累
CN113151131B (zh) 一种产异丁香酚单加氧酶的自诱导培养基及其应用
CN111394396B (zh) 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法
CN105820966B (zh) 一株高效壳聚糖酶产生菌及其发酵方法
CN115975964A (zh) 一种高活性酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因和应用
CN109517778B (zh) 一种枯草芽孢杆菌全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法
CN111575258B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN115786221B (zh) 一种生产3,4-二羟基苯乙醇的重组菌及其构建方法和应用
CN117106836B (zh) 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用
CN116606824B (zh) 一种异丁香酚单加氧酶突变体iem-f305w-l470e、工程菌及应用
CN112980895B (zh) 一种(r)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法
CN108587993B (zh) 一种酶法催化高产α-酮异己酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant