CN112980895B - 一种(r)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种(R)‑3‑氯苯丙醇的酶催化合成方法。该方法以3‑氯苯丙酮为底物，以优化后的羰基还原酶为催化剂，生物催化制备(R)‑3‑苯丙醇。本发明酶法制备R构型中间体，操作简便，对环境友好，成本低，副产物少，产物ee值高，实现了托莫西汀手性中间体的高效合成。

Description

一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法。
背景技术
(R)-3-氯苯丙醇是一种可被用于制备盐酸托莫西汀和盐酸达泊西汀的重要手性中间体。CN101012147A中提及一种(R)-3-氯苯丙醇的制备方法，该方法以3-氯苯丙酮与NaBH4或KBH4反应，生产(R)-3-氯苯丙醇，其中手性氨基酸衍生物的左旋体包括左旋色氨酸衍生物、左旋异亮氨酸衍生物等，氨基酸衍生物的成本较高，该方法在实际生产应用上，有一定的限制。
CN104496830A中提供了一种盐酸达泊西汀的新合成路线(路线如下)，在该路线中，提及了(R)-3-氯苯丙醇另一种合成方法，该方法通过以3-氯苯丙酮与(-)二异松蒎基氯硼烷在有机相溶剂中，10～80℃下发生反应，得到化合物(R)-3-氯苯丙醇，该方法有机溶剂使用量较大，对环境有一定的污染，且反应条件要求较高，在操作上有一定的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法。该方法利用重组羰基还原酶催化进行不对称还原反应制备R构型手性醇。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其包括如下步骤：以3-氯苯丙酮为底物，在重组酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH、辅酶循环酶、助溶剂和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成(R)-3-氯苯丙醇，其中所述重组酮羰基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，合成路线如下：
本发明的羰基还原酶基因来源菌株为一株野生酵母菌株，它为光滑假丝酵母Candida glabrata ATCC2001，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的重组酮羰基还原酶是优化后的羰基还原酶，该重组酮羰基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该重组酮羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
我们提供了一种本申请所采用的酮羰基还原酶的制备方法，具体为：将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的羰基还原酶经过优化DNA序列后，进行PCR扩增，随后导入羰基还原酶表达载体的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点获得重组表达载体，将重组表达载体电转入羰基还原酶表达细胞中，得到酮羰基还原酶表达工程菌，经过抗生素抗性平板涂布筛选后，获得克隆菌株，检测其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示后，对获得的菌株进行活化后发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，冻干得到重组酮羰基还原酶。
在重组酮羰基还原酶的制备中，优选的，羰基还原酶表达载体为pRSFDuet-1；羰基还原酶表达细胞为E.coli BL21(DE3)。
本方法中优选的，3-氯苯丙酮与酮羰基还原酶的质量比为1:0.1～1。
本方法中优选的，助溶剂选自异丙醇、DMSO或乙醇。
本方法中优选的，3-氯苯丙酮与助溶剂的质量体积比为1:10～50g：mL。
本方法中优选的，缓冲液为PB缓冲液，其浓度为0.2mM，pH为6.5。
本方法中优选的，辅酶循环酶采用现有技术中的异丙醇脱氢酶、葡糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
本申请涉及一种重组酮羰基还原酶，该重组酮羰基还原酶的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本申请涉及一种能够表达核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的重组酮羰基还原酶的基因工程菌。
本发明所提供的重组酮羰基还原酶可以用来进行生物催化反应制备(R)-3-氯苯丙醇。
本发明的有益效果：
与现有的采用纯化学路线合成(R)-3-氯苯丙醇的方法相比，本申请的方法不需要高温高压等极端催化环境，也可以减少使用对人及环境有危害的催化剂，降低了废物的产生，环境友好；更重要地是，酶具有优异的立体选择性，可以有效提高产率和产品的光学纯度，具有极好的产业化潜力。
本发明将生物法与化学法相结合，以3-氯苯丙酮为底物，在酶法还原阶段，可直接获得R构型的中间体(R)-3-氯苯丙醇，操作方法简单，反应条件温和，对环境友好，光化学纯度高，纯度可高达99.68％，ee值可达99.9％。
附图说明
图1是重组PRSFDuet质粒的构建示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
实施例1
步骤1：酮羰基还原酶基因工程菌的制备
酮羰基还原酶来源于一株野生酵母菌株(Candida ATCC2001)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
将来源于野生酵母菌的酮羰基还原酶的核苷酸序列经过易错PCR扩增后，载入表达质粒pRSFDuet-1，双酶切位点为HindⅢ和BamHⅠ，引物为：
F：CGCGGATCCATGGCTGCTCTACATAAGAACA和
R：CCCAAGCTTTTACACAAATGGCTTAAATGGCC，将重组表达质粒(图1)转入E.coli BL21(DE3)感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定其核苷酸序列如SEQ ID No.1(优化后羰基还原酶DNA序列)所示后，获得酮羰基还原酶表达工程菌：TM-01。
步骤2：重组酮羰基还原酶的制备
将获得的羰基还原酶工程菌株TM-01，接种到含有抗生素卡那抗性的LB液体培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液。将种子培养液接种按照1-2％比例接种至到TB液体发酵培养基中。然后置于37℃下培养至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mol/L的IPTG，置于25℃继续培养16h后，12000rmp，5℃下离心收集菌体，采用pH值为6.5的200mmol/L的PB缓冲液将收集后菌株进行洗涤并重悬，通过超声波破碎仪进行破碎，超声破碎功率为120W，运行5S，间隔5S，共运行6min，获得重组酮羰基还原酶粗酶液，冻干后获得冻干粉。该重组酮羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：(R)-3-氯苯丙醇的制备
于250ml锥形瓶中，加入60ml PB缓冲液(0.2mM，pH6.5)，依次溶解800mg实施例1得到的重组酮羰基还原酶，200mg异丙醇脱氢酶酶粉(商品酶，商品编号WT2302，购买公司：阿尔法科技)，10mgNADP+/NADPH。1g底物3-氯苯丙酮溶于40ml异丙醇中，加入反应器，200rpm搅拌，于25℃下反应16h，得到(R)-3-氯苯丙醇。反应结果经HPLC检测，转化率为90％，纯度99.68％，ee值99.9％。
对比例1：(R)-3-氯苯丙醇的制备
于250ml锥形瓶中，加入60ml PB缓冲液(0.2mM，pH6.5)，依次溶解800mg酮羰基还原酶(产自Candida ATCC2001野生菌株，氨基酸序列详见SEQ ID No.4)，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，10mgNADP+/NADPH。1g底物3-氯苯丙酮溶于40ml异丙醇中，加入反应器，200rpm搅拌，于30℃下反应12h，得到(R)-3-氯苯丙醇。反应结果经HPLC检测，转化率为64％，纯度84.60％，ee值35.1％。
<110> 宿迁阿尔法科技有限公司
<120>一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法
<160> 4
<210> 1
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctgctc tacataagaa cacttctact ttgaaattga acaccggtgc ccacattcct 60
gttggtttga cctggcacag tgaaaacgag ggttacaatg cgttggaggc cttcggctac 120
agacacattg acactgctgc tatctataag aacgaggagg agattggcag agccatcagg 180
gactcgaaca tccccagact aaatgagttg tttgtcacca cattgtgggc gcaacatcgc 240
aacccaaccc tggaccaatc tttgaaaagg ttgggcctgg actacggagt tgatttgtta 300
aatttaatgc actggcccgt tgccttgaag actgatttga tcaaagaaga cggaaacttg 360
cttcagatcc ccgagagaga agatggctcc agagatgttg acctcgagga ctggaatttt 420
gtgacatggg agctgatgca agagcttcca aaggaaatca aggccagagc tattggtagt 480
gtttcaaact tttctattaa taacttgaag gagcttttga actctaaggg aaacaaagta 540
gtacctgctg cagcgagtaa ccaaattgac ttgatccatc ctctcctacc tcaagatgaa 600
ttgatcaatt gtaaaggaaa aaagggaatc gttcttgaag cgtactcacc attgggtagt 660
acttcagacg ccccaatctt gaagaaagag gaagagatca cagaaatagc caaaaatggc 720
gtccaaaacg ctggccaatt ggttatcagc tggcacgcac aaaggggata cgttctacca 780
aaatccgtta aacctgagag gattcacggt aagggctgcc aagaaacttt caagtctgat 840
gaggacttcg ctaccttaag caactatgca aagccaaatg gtgagagaag agtggtcagt 900
ccaaactggg ggccatttaa gccatttgtg taa 933
<210> 2
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Ala Leu His Lys Asn Thr Ser Thr Leu Lys Leu Asn Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ile Pro Val Gly Leu Thr Trp His Ser Glu Asn Glu Gly Tyr
20 25 30
Asn Ala Leu Glu Ala Phe Gly Tyr Arg His Ile Asp Thr Ala Ala Ile
35 40 45
Tyr Lys Asn Glu Glu Glu Ile Gly Arg Ala Ile Arg Asp Ser Asn Ile
50 55 60
Pro Arg Leu Asn Glu Leu Phe Val Thr Thr Leu Trp Ala Gln His Arg
65 70 75 80
Asn Pro Thr Leu Asp Gln Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Gly
85 90 95
Val Asp Leu Leu Asn Leu Met His Trp Pro Val Ala Leu Lys Thr Asp
100 105 110
Leu Ile Lys Glu Asp Gly Asn Leu Leu Gln Ile Pro Glu Arg Glu Asp
115 120 125
Gly Ser Arg Asp Val Asp Leu Glu Asp Trp Asn Phe Val Thr Trp Glu
130 135 140
Leu Met Gln Glu Leu Pro Lys Glu Ile Lys Ala Arg Ala Ile Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn Leu Lys Glu Leu Leu Asn Ser Lys
165 170 175
Gly Asn Lys Val Val Pro Ala Ala Ala Ser Asn Gln Ile Asp Leu Ile
180 185 190
His Pro Leu Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ile Asn Cys Lys Gly Lys Lys
195 200 205
Gly Ile Val Leu Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Thr Ser Asp Ala
210 215 220
Pro Ile Leu Lys Lys Glu Glu Glu Ile Thr Glu Ile Ala Lys Asn Gly
225 230 235 240
Val Gln Asn Ala Gly Gln Leu Val Ile Ser Trp His Ala Gln Arg Gly
245 250 255
Tyr Val Leu Pro Lys Ser Val Lys Pro Glu Arg Ile His Gly Lys Gly
260 265 270
Cys Gln Glu Thr Phe Lys Ser Asp Glu Asp Phe Ala Thr Leu Ser Asn
275 280 285
Tyr Ala Lys Pro Asn Gly Glu Arg Arg Val Val Ser Pro Asn Trp Gly
290 295 300
Pro Phe Lys Pro Phe Val
305 310
<210> 3
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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Claims (10)

1.一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，包括如下步骤：以3-氯苯丙酮为底物，在重组酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH、辅酶循环酶、助溶剂和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成(R)-3-氯苯丙醇；其中所述重组酮羰基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，合成路线如下：
2.根据权利要求1所述的(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，所述重组酮羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，所述重组酮羰基还原酶的制备方法为：将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的羰基还原酶经过优化DNA序列后，进行PCR扩增，随后导入羰基还原酶表达载体的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点获得重组表达载体，将重组表达载体电转入羰基还原酶表达细胞中，得到酮羰基还原酶表达工程菌，经过抗生素抗性平板涂布筛选后，获得克隆菌株，检测其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示后，对获得的菌株进行活化后发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，冻干得到重组酮羰基还原酶。
4.根据权利要求3所述的(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，所述羰基还原酶表达载体为pRSFDuet-1；所述羰基还原酶表达细胞为E.coli BL21(DE3)。
5.根据权利要求3所述的(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的羰基还原酶来源于一株野生酵母菌株，它为光滑假丝酵母Candida glabrata ATCC2001。
6.根据权利要求1所述的(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，3-氯苯丙酮与酮羰基还原酶的质量比为1:0.1～1；所述助溶剂选自异丙醇、DMSO或乙醇。
7.根据权利要求1所述的(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，3-氯苯丙酮与助溶剂的质量体积比为1:10～50g/mL；所述缓冲液为PB缓冲液，其浓度为0.2mM，pH为6.5。
8.根据权利要求1所述的(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其特征在于，所述辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶、葡糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
9.一种重组酮羰基还原酶，其特征在于，该重组酮羰基还原酶的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
10.一种表达权利要求9所述的重组酮羰基还原酶的基因工程菌。
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