CN110564755B - 一种生物酶催化制备(s)-3-苯基-1,2-环氧丙烷及其衍生物的方法 - Google Patents

一种生物酶催化制备(s)-3-苯基-1,2-环氧丙烷及其衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生物酶催化制备(S)‑3‑苯基‑1,2‑环氧丙烷及其衍生物的方法，属于化合物合成技术领域，所述方法包括以下步骤：1)合成HhAPL基因，并将所述HhAPL基因插入到pET24(a)载体的多克隆位点，获得表达载体pET‑Apl；2)将所述表达载体pET‑Apl转入大肠杆菌获得表达HhAPL基因的重组细胞；3)用缓冲液将所述重组细胞配制成50～200g/L的菌悬液；4)将所述菌悬液、底物辅助溶剂和底物混合获得反应体系，反应，获得目标产物。本发明所述方法中使用的生物酶催化烯烃不对称环氧化具有更高的对映选择性和催化反应活力。

Description

一种生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷及其衍生物 的方法
技术领域
本发明属于化合物合成技术领域，尤其涉及一种生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷及其衍生物的方法。
背景技术
光学纯1,2-环氧丙烷类化合物是合成许多药物的重要前体，其中如缩水甘油类化合物是合成β-受体抑制剂药物的前体原料。近年来，对于该类光学活性化合物的合成取得了一定的进步，特别是对于邻位含有羟基的烯烃可以通过苯乙烯单加氧酶催化环氧化和Sharpless不对称环氧化方法获得光学纯环氧化合物(Lin,H.,Liu,J.-Y.,Wang,H.-B.,Ahmed,A.A.Q.,Wu,Z.-L.2011.Biocatalysis as an alternative for the productionof chiral epoxides:A comparative review.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,72(3),77-89.)。但是，其中苯乙烯单加氧催化过程中对于某些底物烯烃，其催化过程的非对映选择性较低；而对于Sharpless不对称环氧化过程，其催化反应的效率很低，且反应过程需要金属催化剂，增加了生产成本，产物中也会残留金属，同时伴有大量有机试剂的使用，对环境造成了严重的污染。但是，对于邻位不含羟基取代的末端非共轭烯烃不对称环氧化目前没有可靠的方法获得光学纯的环氧产物，少数苯乙烯单加氧可以催化此类烯烃的不对称环氧化，但是其对映选择性比较低(ee<86％)(Lin,H.,Qiao,J.,Liu,Y.,Wu,Z.-L.2010.Styrene monooxygenase from Pseudomonas sp.LQ26 catalyzes theasymmetric epoxidation of both conjugated and unconjugatedalkenes.J.Mol.Catal.B:Enzym.,67(3-4),236-241.)；(Toda,H.,Imae,R.,Itoh,N.2012.Efficient biocatalysis for the production of enantiopure(S)-epoxidesusing a styrene monooxygenase (SMO)and Leifsonia alcohol dehydrogenase(LSADH)system.Tetrahedron:Asymmetry,23(22-23),1542-1549.)，虽然有报道来自Rhodococcusopacus 1CP的苯乙烯单加氧酶可以高对映选择性催化烯丙苯不对称环氧化(ee>99％)，但其催化活性非常低(<1％)(Paul,C.E.,Tischler,D.,Riedel,A.,Heine,T.,Itoh,N.,Hollmann,F.2015.Nonenzymatic regeneration of styrene monooxygenase forcatalysis.ACS Catal.,5(5),2961-2965.)；另外可以通过一些脂肪酶拆分消旋缩环氧化合物获得光学纯该类化合物，但是其产率仅为投入原料的50％，极大地浪费资源。因此通过开发新型的高效高对映选择性催化烯丙基不对称环氧化的酶，可以有效的获得一系列用于药物合成的重要光学活性环氧化合物前体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷及其衍生物的方法，所述方法中使用的生物酶的对映选择性和催化反应活力更高。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物的方法，包括以下步骤：
1)合成HhAPL基因，并将所述HhAPL基因插入到pET24(a)载体的多克隆位点，获得表达载体pET-Apl；
2)将所述表达载体pET-Apl转入大肠杆菌获得表达HhAPL基因的重组细胞；
3)用磷酸钾缓冲液将所述重组细胞配制成50～200g/L的菌悬液；
4)将所述菌悬液、底物辅助溶剂和底物混合获得反应体系，反应，获得目标产物；所述菌悬液和底物辅助溶剂的体积比为(18～22):1；所述底物在反应体中的浓度为1～20g/L；
所述底物为烯丙基苯或烯丙基苯衍生物；
所述目标产物为(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物。
优选的，步骤1)中所述HhAPL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，步骤2)中所述离心的转速为5000～7000rpm，所述离心的时间为4～6min；所述离心的温度为3～5℃。
优选的，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸钾缓冲液；所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.08～0.12mol/L，所述磷酸钾缓冲液的pH值为5.5～8.0。
优选的，步骤4)中所述反应的温度为25～40℃，所述反应的时间为22～26h，步骤4)中所述反应的过程中伴随震荡，所述震荡的转速为200～240rpm。
优选的，步骤4)中底物辅助溶剂为正辛烷或邻苯二甲酸二异辛烷酯。
优选的，所述烯丙基苯衍生物包括1-烯丙基-2-甲苯，1-烯丙基-3-甲苯，1-烯丙基-4-甲苯，3-(4-甲氧基苯基)-1-丙烯，2-烯丙基苯酚，3-烯丙基苯酚，(±)-1-苯基-2-丙烯醇，(±)-1-(3-氟苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(4-氟苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(2-萘基)-2-丙烯醇，(±)-1-(1-萘基)-2-丙烯醇，(±)-1-(3-甲基苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(4-甲基苯基)-2-丙烯醇和(±)-1-(4-甲基苯基)-2-丙烯醇或(±)-1-苯基-3-丁烯-2-醇。
优选的，步骤4)所述反应结束后，还包括目标产物的提取步骤：
将反应结束后的体系与乙醚混合，萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、蒸出溶剂、硅胶柱层析获得目标产物。
优选的，反应结束后的体系与乙醚的体积比为1:(0.8～1.2)；所述萃取的次数为1～3次。
优选的，所述硅胶柱层析的流动相为石油醚和乙酸乙酯；所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为100:1；所述硅胶柱层析的硅胶的粒径为200～300目。
本发明的有益效果：
本发明提供了生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物的方法，将来自草螺菌(Herbaspirillum huttiense)中被注释为丙氨酸磷酸核糖醇连接酶(alanine-phosphoribitol ligase)基因HhAPL基因克隆至表达载体获得重组载体，并将所述重组载体转化大肠该菌获得重组细胞，以所述重组细胞为催化介质，将烯丙基苯或烯丙基苯衍生物催化获得(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物。
本发明所述方法中使用的丙氨酸磷酸核糖醇连接酶能够高对映选择性高效催化烯丙基苯类化合物不对称环氧化制备相应的(S)-环氧化合物，1g的重组细胞E.coli(pET-Apl)湿菌体24h能够100％转化10mg烯丙基苯生成(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷，获得的环氧产物ee达99％以上。与现有催化剂苯乙烯单加氧酶相比，本发明提供的丙氨酸磷酸核糖醇连接酶催化反应具有更高的对映选择性和催化反应活力。
进一步的，本发明使用的丙氨酸磷酸核糖醇连接酶可以催化1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物环氧化动力学拆分，所述丙氨酸磷酸核糖醇连接酶催化(S)-1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物的不对称环氧化具有很高的反应活性和催化效率，具有很高的对映选择性和对α-位的羟基非对映性。1g的重组细胞E.coli(pET-Apl)湿菌体4h就能转化10mg(±)-1-苯基-2-丙烯醇中(S)-1-苯基-2-丙烯醇(6mg)生成(1R,2R)-1-苯基-2,3-环氧丙醇，而对(R)-1-苯基-2-丙烯醇的催化活性非常低(<0.5％)。与传统的催化剂Sharpless催化反应过程相比，丙氨酸磷酸核糖醇连接酶催化过程具有更高的催化活性和对映选择性，与已经报道的苯乙烯单加氧酶催化1-苯基-2-丙烯醇及其衍生物环氧化动力学拆分过程相比较，丙氨酸磷酸核糖醇连接酶催化二级醇的环氧化动力学拆分过程具有更高的非对映选择性。
本发明采用表达丙氨酸磷酸核糖醇连接酶的大肠杆菌全细胞作为催化剂，反应过程在水介质中实现，避免目前化学催化烯烃不对称环氧化中贵重金属催化剂和有毒有机溶剂的使用，相比脂肪酶催化拆分消旋缩水甘油衍生物的方法提高了对原料的利用率。
具体实施方式
本发明提供了一种生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物的方法，包括以下步骤：1)合成HhAPL基因，并将所述HhAPL基因插入到pET24(a)载体的多克隆位点，获得表达载体pET-Apl；2)将所述表达载体pET-Apl转入大肠杆菌获得表达HhAPL基因的重组细胞；3)用磷酸钾缓冲液将所述重组细胞配制成50～200g/L的菌悬液；4)将所述菌悬液、正辛烷和底物混合获得反应体系，反应，获得目标产物；所述菌悬液和正辛烷的体积比为(18～22):1；所述底物在反应体中的浓度为1～20g/L；所述底物为烯丙基苯或烯丙基苯衍生物；所述目标产物为(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物。
在本发明中，首先合成HhAPL基因，并将所述HhAPL基因插入到pET24(a)载体的多克隆位点，获得表达载体pET-Apl。在本发明中，所述HhAPL基因来源于草螺菌(Herbaspirillum huttiense)，是编码丙氨酸磷酸核糖醇连接酶的基因；在本发明中，所述HhAPL基因优选的为经过大肠杆菌密码子优化后的HhAPL基因，所述HhAPL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
ATGCGTAGCATCGCAATTGTTGGTGGCGGTCAAGCTGGTCTGCCGTTAGCCTTTGGTCTGCTGGAGCAAGGTTATCAAGTTACAGTGGTGACCAACCGCACCCCGGACGATTTACGTAATGGCAAAGTGATGAGCAGCCAGTGTATGTTCGATCCGTCTTTACAAATTGAGCGTGATCTGGGTTTAAACGACTGGGAACAGCAGTGCCCTCCGGTGCAAGGTATTAGCTTTGCAGTGCCGCATCCGGAAGTTCCGGGCGCCAAAGCCATTGATTGGAGCGCACGCTTAGATCGTCCGGCCCAAGCTGTGGATCAGCGTTTAAAAATGAGCAGCTGGCTGGAGCAAGTTGAGGCCCGTGGTGGTAAAGTGCTGATCCAAGATGCCGGTGTTGCCGAGCTGGAGGTTCTGAGCGAACAGCACGATCTGGTGATTTTAGCCGCTGGTAAAGGCGAAGTGGTGAAACTGTTTGAGCGCGATGCCGCACGTAGCCCGTTTGACAAACCGCAACGTAGTCTGGCTTTAACCTATGTTCACGGTCTGAAACGTCAGCCGGATTACAGCAGCGTGGCCTTCAATTTAATCCCGGGCGTGGGCGAATACTTTGTGTTTCCGGCTTTAACACTGAGCGGCCCGTGCGATATCATGGTGTTTGAAGGCATCCCCGGTGGTCCGCTGGATTGCTGGCGCGAGGTTCGTACCCCGCAAGAACATCTGGCCACCAGCAAAGATTTTTTACGCAAATTTTTACCGTGGGAAGCAGAACGCGCAGAGCATGCCGAACTGACCGATGATAAGGGCATTCTGGCCGGTAGTTTCGCCCCGACCGTTCGTAAACCGGTGCTGACACTGCCGAGTGGTCGTCTGGTTTTCGGTCTGGGCGATGCCGTGGCAACAAACGATCCGATTACCGGTCAAGGTGCAAATAACGCCACAAAAGCCGCCAAAGTTTATTTAGATGCAATTCTGGCCCATGGCGATAAGCCTTACACCCGCGATTGGATGGAGCAGACCTTTGAGCAGTTTTGGGACTACGCCAAATGGGTGGTGCAGTGGACCAACAGTCTGCTGACCCCGCCGCCTCCGCATATTCTGGGTCTGCTGGGTGCCGCCGGTCAGATGCCTAGCTTAGCCAAGGAGATTGCCGAGGGTTTCAACCATCCTCCGCGCTATTTTCCTTGGTGGGCCGATGCACAAGCATGTGATGAACTGGTGGCCGGCCATCAAGCAAAGGCTTTAGCCGTTGCAGCCTAA。在本发明中，所述HhAPL基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
MRSIAIVGGGQAGLPLAFGLLEQGYQVTVVTNRTPDDLRNGKVMSSQCMFDPSLQIERDLGLNDWEQQCPPVQGISFAVPHPEVPGAKAIDWSARLDRPAQAVDQRLKMSSWLEQVEARGGKVLIQDAGVAELEVLSEQHDLVILAAGKGEVVKLFERDAARSPFDKPQRSLALTYVHGLKRQPDYSSVAFNLIPGVGEYFVFPALTLSGPCDIMVFEGIPGGPLDCWREVRTPQEHLATSKDFLRKFLPWEAERAEHAELTDDKGILAGSFAPTVRKPVLTLPSGRLVFGLGDAVATNDPITGQGANNATKAAKVYLDAILAHGDKPYTRDWMEQTFEQFWDYAKWVVQWTNSLLTPPPPHILGLLGAAGQMPSLAKEIAEGFNHPPRYFPWWADAQACDELVAGHQAKALAVAA*。
在本发明中，所述HhAPL基因合成优选的通过基因合成的方法进行，在本发明具体实施过程中，所述基因合成优选的委托生物技术公司进行。本发明在合成所述HhAPL基因后，将所述HhAPL基因插入到pET24(a)载体的多克隆位点，获得表达载体pET-Apl。在本发明中，所述pET24(a)载体优选的为市售产品；所述HhAPL基因的插入位点优选为HindIII和SacI酶切位点酶切位点之间。本发明对具体的酶切、连接与表达载体pET-Apl的筛选的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的酶切、连接与重组载体的筛选的步骤即可。
本发明获得所述表达载体pET-Apl之后，将所述表达载体pET-Apl转入大肠杆菌获得表达HhAPL基因的重组细胞。本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转入方法即可。本发明在所述转化结束后，优选的将获得的重组细胞置于含卡那霉素的LB平板上培养进行筛选、培养后，诱导表达。在本发明中，挑选所述含卡那霉素的LB平板上生长的单菌落进行液体培养获得种子液；所述液体培养为将所述单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中进行培养；所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度优选为45～55μg/mL，更优选为50μg/mL。在本发明中，所述液体培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述液体培养的时间优选为12～14h，更优选为13h；所述液体培养的转速优选为200～240rpm，更优选为220rpm。本发明在获得种子液后，进行诱导表达。在本发明中，所述诱导表达优选的将所述种子液接种于TB培养基中，36～38℃培养2～4h后，加入IPTG，16℃诱导表达20～28h，获得表达HhAPL基因的重组细胞。在本发明中，所述种子液的接种量优选为0.8％～1.2％，更优选为1％；所述IPTG的终浓度优选为0.08～0.12mmol/L，更优选为0.1mmol/L。本发明优选的在所述诱导表达后，进行离心，收集重组细胞。在本发明中，所述离心的转速优选为5000～7000rpm，更优选为6000rpm；所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min；所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。
本发明在获得所述重组细胞后，用缓冲液将所述重组细胞配制成50～200g/L的菌悬液。在本发明中，所述重组细胞优选的为诱导表达后收集的到重组细胞重新培养获得的重组细胞。在本发明中，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸钾缓冲液；所述磷酸钾缓冲液的浓度优选为0.08～0.12mol/L，更优选为0.1mol/L，所述磷酸钾缓冲液的pH值优选为5.5～8.0。在本发明中，所述菌悬液的浓度优选的以细胞湿重计，所述菌悬液的浓度优选为80～150g/L，更优选为100～120g/L。
本发明在获得所述菌悬液后，将所述菌悬液、底物辅助溶剂和底物混合获得反应体系，反应，获得目标产物。在本发明中，所述菌悬液和底物辅助溶剂的体积比优选为(18～22):1，更优选为20:1；所述底物辅助溶剂为正辛烷或邻苯二甲酸二异辛烷酯；所述底物在反应体中的浓度优选为1～20g/L，更优选为5～15g/L。在本发明中，所述底物为烯丙基苯或烯丙基苯衍生物；所述烯丙基苯衍生物包括1-烯丙基-2-甲苯，1-烯丙基-3-甲苯，1-烯丙基-4-甲苯，3-(4-甲氧基苯基)-1-丙烯，2-烯丙基苯酚，3-烯丙基苯酚，(±)-1-苯基-2-丙烯醇，(±)-1-(3-氟苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(4-氟苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(2-萘基)-2-丙烯醇，(±)-1-(1-萘基)-2-丙烯醇，(±)-1-(3-甲基苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(4-甲基苯基)-2-丙烯醇和(±)-1-(4-甲基苯基)-2-丙烯醇或(±)-1-苯基-3-丁烯-2-醇。在本发明中，所述目标产物为(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物。
在本发明中，所述反应结束后，还包括目标产物的提取步骤：将反应结束后的体系与乙醚混合，萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、蒸出溶剂、硅胶柱层析获得目标产物。在本发明中，所述反应结束后的体系与乙醚的体积比优选为1:(0.8～1.2)，更优选为1:1；所述萃取的次数优选为1～3次，更优选为2次。在本发明中，所述无水硫酸钠干燥优选为将所述有机相与无水硫酸钠混合静置；所述有机相与无水硫酸钠的比例优选为(18～22)mL:5g，更优选为20mL:5g；所述无水硫酸钠干燥的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2.0h。在本发明中，所述无水硫酸钠干燥后进行过滤，所述过滤优选为滤纸过滤，更优选的采用1#滤纸布氏漏斗过滤。本发明在所述过滤后，收集滤液蒸出溶剂，所述蒸出溶剂的方法优选的减压浓缩的方法，所述减压浓缩的真空度优选为0.1MPa，所述减压浓缩的温度优选为45℃。本发明在蒸出溶剂后，用硅胶柱层析分离获得目标产物；所述硅胶柱层析的流动相优选为石油醚和乙酸乙酯；所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为100:1；所述硅胶柱层析的硅胶的粒径优选为200～300目。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1～7中发生的反应为烯丙基苯环环氧化，反应式如下：
Figure GDA0002747657940000091
实施例1
依据大肠杆菌密码子偏爱性，将HhAPL基因(WP_039783212)进行密码子优化，合成获得包含HindIII和SacI酶切位点的基因(HhApl)，将合成的基因和pET24(a)载体通过HindIII和SacI酶切，然后通过T4连接酶将HhApl基因片段插入到pET24(a)载体，将连接产物转入到E.coli(DH5α)菌株，挑取单克隆，提取质粒并测序确定正确序列，构建该酶表达载体pET-Apl。将pET-Apl转入E.coli(BL21)，获得表达菌株E.coli(pET-APL)保存在含卡那霉素的LB平板。挑取E.coli(pET-APL)单菌落，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中于37℃，220rpm培养13h作为种子液。以1％接种量接种于TB培养基中，37℃，220rpm振荡培养3h，然后加入IPTG(0.1mM)，在16℃下诱导HhAPL表达，24h后，4℃冷冻离心，收获菌体。
取新鲜培养的E.coli(pET-Apl)湿菌体1g，重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.1M,pH6.0)中，加入烯丙基苯10mg，底物辅溶剂正辛烷1mL，于摇床(37℃，220rpm)震荡反应24h。反应结束后，向反应液加入20mL乙醚萃取2次，合并收集乙醚溶液，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂得到粗产物。经硅胶柱层析分离，得到烯丙基苯环氧。该转化过程可将烯丙基苯10mg全部转化生成烯丙基苯环氧，效率为100％。得到的烯丙基苯环氧经液相色谱(Daicel CHIRALCEL AS-H手性色谱柱)测定，其对映体过量ee值99％.
(S)-烯丙基环氧数据如下：
黄色液体，[α]D 20＝-27°(c0.5,CHCl3)，dr:49:1，ee:99％；
1HNMR(CDCl3):δ＝7.25-7.33(m,5H),3.15(m,1H),2.92(dd,1H),2.81(dd,1H),2.79(m,1H),2.55(dd,J＝5.0,2.7Hz,1H)ppm.
实施例2
操作如实施例1，反应温度为30℃，底物10mg，转化36h，其它操作如实施例1，可将烯丙基苯10mg全部转化生成(S)-烯丙基环氧。
产物数据同实施例1。
实施例3
操作如实施例1，反应温度为40℃，底物10mg，转化30h，其它操作如实施例1，可将烯丙基苯10mg全部转化生成(S)-烯丙基环氧。
产物数据同实施例1。
实施例4
缓冲液采用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(0.1M，pH5.5)体系，底物10mg，转化36h，其它操作如实施例1，可将烯丙基苯10mg全部转化生成(S)-烯丙基环氧。
实验结果同实施例1。
实施例5
缓冲液采用磷酸钾缓钾冲液(0.1M，pH8.0)体系，底物10mg，转化36h，其它操作如实施例1，可将烯丙基苯10mg全部转化生成(S)-烯丙基环氧。实验结果同实施例1。
实施例6
缓冲液采用Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 6.0)体系，其它操作如实施例1，得到(S)-烯丙基环氧。实验结果同实施例1。
实施例7
底物辅溶剂采用邻苯二甲酸二异辛烷酯，其它操作如实施例1，得到(S)-烯丙基环氧。实验结果同实施例1。
实施例8 E.coli(pET-Apl)催化3-(2-甲基苯基)-1-丙烯环氧化
Figure GDA0002747657940000101
操作如实施例1，反应24h，转化率为75％，得到(S)-3-(2-甲基苯基)-1,2-环氧-丙烷。
(S)-3-(2-甲基苯基)-1,2-环氧-丙烷数据如下：
无色液体，[α]D 20＝+16.2°(c0.12,CHCl3)，ee:83％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.15–7.25(m,4H,Ar–H),3.08–3.19(m,1H,CH),2.97(dd,1H,CH2,J＝5.24Hz,J＝14.8Hz),2.79–2.85(m2H,CH2),2.55(dd,1H,CH2,J＝2.64Hz,J＝5.04Hz),2.34(s,3H,CH3).
实施例9 E.coli(pET-Apl)催化3-(3-甲基苯基)-1-丙烯环氧化
Figure GDA0002747657940000111
操作如实施例1，反应24h，转化率为95％，得到(S)-3-(3-甲基苯基)-1,2-环氧-丙烷。
(S)-3-(3-甲基苯基)-1,2-环氧-丙烷数据如下：
无色液体，[α]D 20＝+19.6°(c0.5,CHCl3)，ee:98％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.19–7.23(m,1H,Ar–H),7.05–7.08(m,3H,Ar–H),3.12–3.18(m,1H,CH),2.92(dd,1H,CH2,J＝5.24Hz,J＝14.8Hz),2.75–2.81(m2H,CH2),2.55(dd,1H,CH2,J＝2.64Hz,J＝5.04Hz),2.34(s,3H,CH3).
实施例10 E.coli(pET-Apl)催化3-(4-甲基苯基)-1-丙烯环氧化
Figure GDA0002747657940000112
操作如实施例1，反应24h，转化率为95％，得到(S)-3-(4-甲基苯基)-1,2-环氧-丙烷。
(S)-3-(4-甲基苯基)-1,2-环氧-丙烷数据如下：
无色液体，[α]D 20＝+8.2°(c0.1,CHCl3)，ee:87％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.12–7.17(m,1H,Ar–H),7.05–7.08(m,3H,Ar–H),3.12–3.16(m,1H,CH),2.91(dd,1H,CH2,J＝5.56Hz,J＝14.48Hz),2.75–2.80(m2H,CH2),2.55(dd,1H,CH2,J＝2.6Hz,J＝5.08Hz),2.34(s,3H,CH3).
实施例11 E.coli(pET-Apl)催化3-(4-甲氧基苯基)-1-丙烯环氧化
Figure GDA0002747657940000121
操作如实施例1，反应24h，转化率为95％，得到(S)-3-(4-甲氧基苯基)-1,2-环氧-丙烷。
(S)-3-(4-甲氧基苯基)-1,2-环氧-丙烷数据如下：
无色液体，[α]D 20＝+1.2°(c0.15,CHCl3)，ee:90％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.16-7.18(m,2H,Ar–H),6.84-6.87(m,2H,Ar–H),3.79(s,3H,CH3),3.10–3.14(m,1H,CH),2.86(dd,1H,CH2,J＝5.64,J＝14.64),2.74–2.79(m,2H,CH2),2.81(dd,1H,CH2,J＝2.64,J＝4.96).
实施例12 E.coli(pET-Apl)催化2-烯丙基苯酚环氧化
Figure GDA0002747657940000122
操作如实施例1，反应24h，转化率为95％，得到(S)-2-(2,3-环氧丙烷基)-苯酚。
(S)-2-(2,3-环氧丙烷基)-苯酚数据如下：
黄色液体，[α]D 20＝+0.8°(c0.08,CHCl3)，ee:90％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.10–7.17(m,2H,Ar–H),6.78–6.86(m,2H,Ar–H),4.88–4.93(m,1H,CH),3.85(dd,1H,CH2,J＝3.36Hz,J＝12.18Hz),3.75(dd,1H,CH2,J＝6.36Hz,J＝12.18Hz),3.25(dd,1H,CH2,J＝9.54Hz,J＝15.54Hz),J＝12.18Hz,3.02(dd,1H,CH2,J＝7.5Hz,J＝15.54Hz).
实施例13 E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-苯基-2-丙烯醇环氧化
Figure GDA0002747657940000123
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(1R,2R)-1-苯基-2,3-环氧丙醇。
(1R,2R)-1-苯基-2,3-环氧丙醇数据如下：
无色液体，[α]D 20＝-12.0°(c0.25,CHCl3)，dr:99:1，ee:>99％；
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.33-7.44(m,5H,Ar-H),4.48(d,1H,-CH,J＝5.43),3.22-3.25(m,1H,-CH),2.83-2.88(m,2H,-CH2),2.32-2.36(br,1H,OH).
实施例14 E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-(3-氟苯基)-2-丙烯醇环氧化
Figure GDA0002747657940000131
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(1R,2R)-1-(3-氟-苯基)-2,3-环氧丙醇。
(1R,2R)-1-(3-氟-苯基)-2,3-环氧丙醇数据如下：
无色液体，[α]D 20＝-9.6°(c0.15,CHCl3)，dr:94:1，ee:>99％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.01-7.37(m,4H,Ar-H),4.50(m,1H,-CH),3.19-3.22(m,1H,-CH),2.83-2.88(m,2H,-CH2),2.58(br,1H,OH).
实施例15 E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-(4-氟苯基)-2-丙烯醇环氧化
Figure GDA0002747657940000132
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(1R,2R)-1-(4-氟-苯基)-2,3-环氧丙醇。
(1R,2R)-1-(4-氟-苯基)-2,3-环氧丙醇数据如下：
无色液体，[α]D 20＝-5.1°(c0.32,CHCl3)，dr:87:1，ee:>99％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.43(m,2H,Ar-H),7.06-7.10(m,2H,Ar-H),4.48(d,1H,-CH,J＝5.16),3.18-3.20(m,1H,-CH),2.86-2.87(m,1H,-CH2),2.82-2.83(m,1H,-CH2),2.39(br,1H,OH).
实施例16 E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-(1-萘基)-2-丙烯醇环氧化
Figure GDA0002747657940000141
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(1R,2R)-1-(1-萘基)-2,3-环氧丙醇。
(1R,2R)-1-(1-萘基)-2,3-环氧丙醇数据如下：
黄色液体，[α]D 20＝-1.7°(c0.15,CHCl3)，dr:>99:1，ee:>99％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.83-7.91(m,2H,Ar-H),7.68-7.73(m,2H,Ar-H),7.48-7.55(m,3H,Ar-H),5.30-5.33(m,1H,-CH),3.48-3.51(m,1H,-CH),2.87-2.97(m,2H,-CH2),2.49(br,1H,OH).
实施例17 E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-(2-萘基)-2-丙烯醇环氧化
Figure GDA0002747657940000142
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(1R,2R)-1-(2-萘基)-2,3-环氧丙醇。
(1R,2R)-1-(2-萘基)-2,3-环氧丙醇数据如下：
白色固体，[α]D 20＝-5.3°(c0.16,CHCl3)，dr:>87:1，ee:>99％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.84-7.90(m,4H,Ar-H),7.48-7.54(m,3H,Ar-H),4.65-4.68(m,1H,-CH),3.30-3.34(m,1H,-CH),2.78-2.90(m,2H,-CH2),2.38(br,1H,OH).
实施例18 E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-(3-甲基苯基)-2-丙烯醇环氧化
Figure GDA0002747657940000143
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(1R,2R)-1-(3-甲基苯基)-2,3-环氧丙醇。
(1R,2R)-1-(3-甲基苯基)-2,3-环氧丙醇数据如下：
无色液体，[α]D 20＝-15.9°(c0.13,CHCl3)，dr:>99:0.1，ee:>99％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.13-7.28(m,4H,Ar-H),4.43(m,1H,-CH),3.21-3.23(m,1H,-CH),2.82-2.86(m,2H,-CH2),2.40(br,1H,OH),2.37(s,3H,-CH3).
实施例19 E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-(4-甲基苯基)-2-丙烯醇环氧化
Figure GDA0002747657940000151
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(1R,2R)-1-(4-甲基苯基)-2,3-环氧丙醇。
(1R,2R)-1-(4-甲基苯基)-2,3-环氧丙醇数据如下：
无色液体，[α]D 20＝-1.1°(c0.37,CHCl3)，dr:>99:1，>ee:99％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.19-7.33(m,4H,Ar-H),4.47(d,1H,-CH,J＝5.1),3.20-3.23(m,1H,-CH),2.81-2.87(m,2H,-CH2),2.36(s,3H,-CH3),2.33(br,1H,OH).
实施例20E.coli(pET-Apl)催化(±)-1-苯基-3-丁烯-2-醇环氧化环氧化
Figure GDA0002747657940000152
操作如实施例1，反应24h，转化率为50％，得到(2R,3R)-1-苯基-3,4-环氧-2-丁醇。
(2R,3R)-1-苯基-3,4-环氧-2-丁醇数据如下：
无色液体，[α]D 25＝-9.2°(c0.35,CHCl3)，dr:93:1，ee:>99％；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.25-7.37(m,5H,Ar-H),3.73-3.76(m,1H,-CH),3.06-3.09(m,1H,-CH),2.97(dd,1H,-CH2,J＝7.26,J＝13.87),2.90(dd,1H,-CH2,J＝6.56,J＝13.52),2.74-2.76(m,1H,-CH2),2.62-2.63(m,1H,-CH2),1.95(br,1H,OH)
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷及其衍生物的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgcgtagca tcgcaattgt tggtggcggt caagctggtc tgccgttagc ctttggtctg 60
ctggagcaag gttatcaagt tacagtggtg accaaccgca ccccggacga tttacgtaat 120
ggcaaagtga tgagcagcca gtgtatgttc gatccgtctt tacaaattga gcgtgatctg 180
ggtttaaacg actgggaaca gcagtgccct ccggtgcaag gtattagctt tgcagtgccg 240
catccggaag ttccgggcgc caaagccatt gattggagcg cacgcttaga tcgtccggcc 300
caagctgtgg atcagcgttt aaaaatgagc agctggctgg agcaagttga ggcccgtggt 360
ggtaaagtgc tgatccaaga tgccggtgtt gccgagctgg aggttctgag cgaacagcac 420
gatctggtga ttttagccgc tggtaaaggc gaagtggtga aactgtttga gcgcgatgcc 480
gcacgtagcc cgtttgacaa accgcaacgt agtctggctt taacctatgt tcacggtctg 540
aaacgtcagc cggattacag cagcgtggcc ttcaatttaa tcccgggcgt gggcgaatac 600
tttgtgtttc cggctttaac actgagcggc ccgtgcgata tcatggtgtt tgaaggcatc 660
cccggtggtc cgctggattg ctggcgcgag gttcgtaccc cgcaagaaca tctggccacc 720
agcaaagatt ttttacgcaa atttttaccg tgggaagcag aacgcgcaga gcatgccgaa 780
ctgaccgatg ataagggcat tctggccggt agtttcgccc cgaccgttcg taaaccggtg 840
ctgacactgc cgagtggtcg tctggttttc ggtctgggcg atgccgtggc aacaaacgat 900
ccgattaccg gtcaaggtgc aaataacgcc acaaaagccg ccaaagttta tttagatgca 960
attctggccc atggcgataa gccttacacc cgcgattgga tggagcagac ctttgagcag 1020
ttttgggact acgccaaatg ggtggtgcag tggaccaaca gtctgctgac cccgccgcct 1080
ccgcatattc tgggtctgct gggtgccgcc ggtcagatgc ctagcttagc caaggagatt 1140
gccgagggtt tcaaccatcc tccgcgctat tttccttggt gggccgatgc acaagcatgt 1200
gatgaactgg tggccggcca tcaagcaaag gctttagccg ttgcagccta a 1251
<210> 2
<211> 416
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Arg Ser Ile Ala Ile Val Gly Gly Gly Gln Ala Gly Leu Pro Leu
1 5 10 15
Ala Phe Gly Leu Leu Glu Gln Gly Tyr Gln Val Thr Val Val Thr Asn
20 25 30
Arg Thr Pro Asp Asp Leu Arg Asn Gly Lys Val Met Ser Ser Gln Cys
35 40 45
Met Phe Asp Pro Ser Leu Gln Ile Glu Arg Asp Leu Gly Leu Asn Asp
50 55 60
Trp Glu Gln Gln Cys Pro Pro Val Gln Gly Ile Ser Phe Ala Val Pro
65 70 75 80
His Pro Glu Val Pro Gly Ala Lys Ala Ile Asp Trp Ser Ala Arg Leu
85 90 95
Asp Arg Pro Ala Gln Ala Val Asp Gln Arg Leu Lys Met Ser Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Gln Val Glu Ala Arg Gly Gly Lys Val Leu Ile Gln Asp Ala
115 120 125
Gly Val Ala Glu Leu Glu Val Leu Ser Glu Gln His Asp Leu Val Ile
130 135 140
Leu Ala Ala Gly Lys Gly Glu Val Val Lys Leu Phe Glu Arg Asp Ala
145 150 155 160
Ala Arg Ser Pro Phe Asp Lys Pro Gln Arg Ser Leu Ala Leu Thr Tyr
165 170 175
Val His Gly Leu Lys Arg Gln Pro Asp Tyr Ser Ser Val Ala Phe Asn
180 185 190
Leu Ile Pro Gly Val Gly Glu Tyr Phe Val Phe Pro Ala Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Gly Pro Cys Asp Ile Met Val Phe Glu Gly Ile Pro Gly Gly Pro
210 215 220
Leu Asp Cys Trp Arg Glu Val Arg Thr Pro Gln Glu His Leu Ala Thr
225 230 235 240
Ser Lys Asp Phe Leu Arg Lys Phe Leu Pro Trp Glu Ala Glu Arg Ala
245 250 255
Glu His Ala Glu Leu Thr Asp Asp Lys Gly Ile Leu Ala Gly Ser Phe
260 265 270
Ala Pro Thr Val Arg Lys Pro Val Leu Thr Leu Pro Ser Gly Arg Leu
275 280 285
Val Phe Gly Leu Gly Asp Ala Val Ala Thr Asn Asp Pro Ile Thr Gly
290 295 300
Gln Gly Ala Asn Asn Ala Thr Lys Ala Ala Lys Val Tyr Leu Asp Ala
305 310 315 320
Ile Leu Ala His Gly Asp Lys Pro Tyr Thr Arg Asp Trp Met Glu Gln
325 330 335
Thr Phe Glu Gln Phe Trp Asp Tyr Ala Lys Trp Val Val Gln Trp Thr
340 345 350
Asn Ser Leu Leu Thr Pro Pro Pro Pro His Ile Leu Gly Leu Leu Gly
355 360 365
Ala Ala Gly Gln Met Pro Ser Leu Ala Lys Glu Ile Ala Glu Gly Phe
370 375 380
Asn His Pro Pro Arg Tyr Phe Pro Trp Trp Ala Asp Ala Gln Ala Cys
385 390 395 400
Asp Glu Leu Val Ala Gly His Gln Ala Lys Ala Leu Ala Val Ala Ala
405 410 415

Claims (8)

1.一种生物酶催化制备(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成HhAPL基因，并将所述HhAPL基因插入到pET24(a)载体的多克隆位点，获得表达载体pET-Apl；
2)将所述表达载体pET-Apl转入大肠杆菌获得表达HhAPL基因的重组细胞，离心收集所述重组细胞；
3)用缓冲液将所述重组细胞配制成50～200g/L的菌悬液；
4)将所述菌悬液、底物辅助溶剂和底物混合获得反应体系，反应，获得目标产物；所述菌悬液和底物辅助溶剂的体积比为(18～22):1；所述底物在反应体中的浓度为1～20g/L；
所述底物为烯丙基苯或烯丙基苯衍生物；
所述目标产物为(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷或(S)-3-苯基-1,2-环氧丙烷衍生物；
步骤1)中所述HhAPL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述烯丙基苯衍生物为3-(4-甲氧基苯基)-1-丙烯，2-烯丙基苯酚，(±)-1-苯基-2-丙烯醇，(±)-1-(3-氟苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(4-氟苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(2-萘基)-2-丙烯醇，(±)-1-(1-萘基)-2-丙烯醇，(±)-1-(3-甲基苯基)-2-丙烯醇，(±)-1-(4-甲基苯基)-2-丙烯醇或(±)-1-苯基-3-丁烯-2-醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述离心的转速为5000～7000rpm，所述离心的时间为4～6min；所述离心的温度为3～5℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸钾缓冲液；所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.08～0.12mol/L，所述磷酸钾缓冲液的pH值为5.5～8.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述反应的温度为25～40℃，所述反应的时间为22～26h，所述反应的过程中伴随震荡，所述震荡的转速为200～240rpm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中底物辅助溶剂为正辛烷或邻苯二甲酸二异辛烷酯。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述反应结束后，还包括目标产物的提取步骤：
将反应结束后的体系与乙醚混合，萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、蒸出溶剂、硅胶柱层析获得目标产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应结束后的体系与乙醚的体积比为1:(0.8～1.2)；所述萃取的次数为1～3次。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述硅胶柱层析的流动相为石油醚和乙酸乙酯；所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为100:1；所述硅胶柱层析的硅胶的粒径为200～300目。
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