CN105087704B - 一种可调控多酶级联反应用于合成光学纯烯丙型环氧酮或醇 - Google Patents
一种可调控多酶级联反应用于合成光学纯烯丙型环氧酮或醇 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可调控多酶级联反应用于合成两类光学纯环氧化合物的新方法。该方法以大肠杆菌中共表达羰基还原酶和苯乙烯单加氧酶的重组菌为生物催化剂,ɑ,β‑不饱和酮类化合物为底物,利用异丙醇作为开关进行调控,合成手性烯丙型环氧酮/醇。
Description
说明书
技术领域
本发明属于微生物与酶工程技术领域,具体涉及了一种共表达羰基还原酶与苯乙烯单加氧酶的重组大肠杆菌作为生物催化剂,催化ɑ,β-不饱和酮合成光学纯烯丙型环氧酮或醇的方法。
背景技术
光学纯环氧化合物是最重要的有机合成砌块之一,与亲核试剂开环可以衍生出众多的手性官能团。光学纯烯丙型环氧酮/醇是邻位带有羰基/羟基的特殊多官能团环氧化合物,它既具备环氧化合物共同的性质,也具有羟基/羰基的特殊反应性。因此,它们具有更为广泛的衍生性,通过官能团转化能够衍生出大量的手性官能团,是许多手性天然产物和药物的合成前体,如:著名抗癌类药物紫杉醇Paclitaxel,钙通道阻滞剂Diltiazem,受体拮抗剂白三烯Leukotriene。
Weitz-Scheffer环氧化是最著名的方法,它利用H2O2作为催化剂,在强碱性环境中催化α,β-不饱和酮环氧化合成光学纯环氧酮。近年来,从Weitz-Scheffer环氧化已衍生出多种缺电子烯烃不对称环氧化路线,并且针对不同底物表现出优异的转化率和立体选择性,其中经典的有机催化制备手性环氧酮的方法包括:手性配体-金属过氧化物催化环氧化、多聚氨基酸催化环氧化和相转移催化环氧化等。目前,尚无生物方法报道利用α,β-不饱和酮不对称环氧化合成光学纯环氧酮。
手性烯丙型环氧仲醇有2-3连个连续手性中心,目前,化学方法制备手性烯丙型环氧醇只有动力学拆分1-苯基-2-丙烯醇这一个底物,转化率为51%,对映体过量为93%,其在-20℃条件下反应时间长达12天才能完成(Zhang,W.Angewandte Chemie-InternationalEdition.200544,4389-4391)。生物方法主要是通过动力学拆分消旋体环氧醇类化合物来获得,Takeshita等人利用Lipase拆分消旋体环氧醇得到光学纯的(1S,2R)-环氧酯,其ee值为93%(Takeshita,M.et al.Tetrahedron Asymmetry.19923,1369-1372);Lin等人报道了利用苯乙烯单加氧酶StyAB2动力学拆分消旋体α-取代丙烯醇类化合物,其ee值最大为>99%,但是拆分过程中最大理论产率只有50%;拆分消旋体烯丙基仲醇合成烯丙型环氧醇,转化率为12-50%,ee值为78-99%,非对映体过量30-99%(Lin,H.et al.ChemicalCommunications.201147,2610-2612)。
发明内容
本发明的目的是提供一种可调控多酶级联反应用于合成光学纯烯丙型环氧酮或醇,具体说来,该方法是大肠杆菌重组菌E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)为生物催化剂,ɑ,β-不饱和酮为底物,利用异丙醇作为开关进行调控,从而生物催化合成光学纯烯丙型环氧酮或醇。本发明的思路可以用说明书附图1表示。
本发明所述的多酶级联反应合成光学纯烯丙型环氧酮或醇的方法为:
反应体系:生物催化剂为重组菌E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)全细胞,缓冲液为磷酸盐缓冲液,底物为ɑ,β-不饱和酮。该反应体系生成光学纯烯丙型环氧酮,底物到产物的反应历程见说明书附图2。
当向上述反应体系中加入异丙醇时,则产物为光学纯烯丙型环氧醇,底物到产物的反应历程见说明书附图3。反应体系中异丙醇体积浓度为1-15%,v/v。
上述底物ɑ,β-不饱和酮包括4-苯基-3-丁烯-2-酮或者该化合物在o-/m-/p-位的卤素或甲基取代的衍生物,以及4-(2-噻吩)-3-丁烯-2-酮,4-(3-噻吩)-3-丁烯-2-酮,4-(3-萘)-3-丁烯-2-酮。
底物先溶解于二甲基亚砜中(底物贮存液浓度10%,w/v),反应体系中底物终浓度为0.1-30mM。
生物催化剂重组大肠杆菌细胞(以湿重计)为100-200g/l;磷酸盐缓冲液为磷酸钾或者磷酸钠(0.1M,pH=6.0-8.0);反应温度为25-40℃,反应震荡转速为150-250rpm,反应时间为0.5-5h。
本发明所用生物催化剂大肠杆菌重组菌E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)是通过以下方法构建的:
(1)利用λRED重组系统敲除大肠杆菌E.coli BL21基因组中N-乙酰马来酰亚胺还原酶基因nemA,获得重组表达宿主菌E.coli BL21ΔnemA。
(2)将羰基还原酶READH和苯乙烯单加氧酶StyAB2共同连入双表达载体pRSFDuet-1T(Novagen公司)上,获得双酶共表达质粒,命名为pRSFD-REAB。
(3)将质粒pRSFD-REAB转入表达宿主菌E.coli BL21ΔnemA中,构建本发明所用生物催化剂E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)。
上述重组菌的详细构建方案见实施例1。
羰基还原酶READH(NCBI登录号为AY161280)克隆自Rhodococcus erythropolisDSM 43060(购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心),苯乙烯单加氧酶(StyAB2,NCBI登录号为GU593979)克隆自pseudomonas sp.LQ 26(中国典型培养物保藏中心,CCTCC NO:M2010188)。
产物的检测方法:
反应结束后,取1ml反应液,加入800μl乙酸乙酯萃取,12,000rpm离心2min,取有机相,加入适量无水硫酸钠干燥,减压蒸馏,1ml异丙醇溶解,有机滤膜过滤后HPLC检测。采用Shimadzu Prominence LC-20AD system大赛璐手性色谱柱AD-H,检测器为PDA。检测条件,异丙醇:正己烷=10:90,0.5ml/min,柱温35℃。
本发明的有益效果:本发明首次利用多酶级联反应实现了生物催化不对称环氧化ɑ,β-不饱和酮合成手性烯丙型环氧酮。同时,利用该级联反应,只需在反应体系中加入异丙醇,就可实现合成光学纯烯丙型环氧醇。反应体系十分简单,操作容易,转化效率高,得到的产物ee值和de值高,为光学纯烯丙型环氧酮/醇提供了高效的生物合成路线。
附图说明
图1,本发明的思路简图。
图2,光学纯烯丙醇环氧酮合成历程图。
图3,光学纯烯丙醇环氧醇合成历程图。
图4,模式底物4-苯基-3-丁烯-2-酮转化生成产物的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明的操作方法,需要指出的是,本实施例仅用于解释本发明,而非对本发明范围的限制。
实施例1:生物催化剂E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)的构建
(1)大肠杆菌表达菌株E.coli BL21ΔnemA的构建方法
由于E.coli BL21基因组中nemA基因表达的N-乙酰马来酰亚胺还原酶能够高效还原底物ɑ,β-不饱和酮的C=C键,所以我们引入λRed重组,敲除E.coli BL21基因组中nemA基因。
分别以P1/P3,P4/P2为引物(表1),以E.coli BL21基因组DNA为模板,分别扩增出nemA基因两侧同源序列。PCR扩增条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸0.5min,30个循环,72℃最后延伸10min。
以FRTf和FRTr为引物(表1),以质粒pKD4为模板,扩增出卡那霉素抗性基因片段。PCR扩增时由于片段长度不同,72℃延伸1.5min,其余条件同上。
利用引物P1/P2将上述三段DNA通过重叠PCR链接,制备成线性打靶DNA序列。PCR扩增时由于片段长度不同,72℃延伸2min,其余条件同上。
挑取E.coli BL21/pKD46(含有质粒pKD46)单克隆接种于10ml LB培养基(氨苄青霉素50μg/ml),30℃、230rpm培养过夜。转接1ml培养液至100ml SOB培养基(氨苄青霉素50μg/ml),30℃、230rpm、2h,添加2mM L-阿拉伯糖诱导,继续培养至OD620=7.0时,冰浴30min,离心(4℃,4,500rpm)10min,用预冷的10%甘油洗涤三次,浓缩至100μl,制成电转化感受态细胞,冻于-80℃备用。
取E.coli BL21/pKD46电转感受态细胞50μl与高浓度35μl(10μg)同源重组片段均匀混合。置于0.1cm预冷电击杯中,冰浴30min,1.8kV电击4-5ms。加入1ml SOB液体复苏液(1mM L-阿拉伯糖),37℃、复苏1h。将菌体全部涂布于LB平板(含卡那霉素50μg/ml)上37℃培养24h,筛选重组子。待筛选平板上长出单克隆,用P5/P6进行菌落PCR,并测序验证。
将pCP20质粒转入重组子中,涂布于LB平板(含氨苄青霉素50μg/ml),30℃,培养过夜。从平板上挑取单克隆,接种至LB液体培养基,30℃,培养10h后,培养温度提高到43℃,培养16h,热诱导FLP重组酶表达,同时,去除卡那霉素抗性片段和pCP20质粒。该重组子命名为E.coli BL21ΔnemA。
表1
(2)双表达质粒pRSFD-REAB的构建方法
利用引物EcoR I_RE/Hind III_RE扩增READH(表1),模板为Rhodococcuserythropolis DSM 43060,PCR产物连入pMD19T载体构建TA克隆。PCR条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环,72℃最后延伸20min。将测序正确的质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I消化,连接至经Nde I和Xho I消化后的pRSFDuet-1T上(Novagen公司),得到载体pRSFD-RE。利用引物Nde I_AB和Xho I_AB扩增苯乙烯单加氧酶基因StyAB2的DNA片段(表1),模板为pseudomonas sp.LQ 26,PCR产物连入pMD19T载体构建TA克隆,PCR扩增时由于片段长度不同,72℃延伸2min,其余条件同上。将测序正确的质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I消化后,连接至经Nde I和Xho I消化后的载体pRSFD-RE,构建成READH与StyAB2的共表达载体pRSFD-REAB。
(3)生物催化剂制备
将质粒pRSFD-REAB转入表达宿主菌E.coli BL21ΔnemA中,涂布于LB平板(含卡那霉素50μg/ml),37℃培养过夜,获得重组大肠杆菌E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)。用接种针从LB平板上挑取一个单克隆接种至10ml LB液体培养基,37℃,230rpm培养过夜,转接2ml培养液至200ml TB培养基中,30℃,培养6h,230rpm。加入IPTG诱导(1mM),20℃,230rpm,继续培养18h。离心收集菌体(4℃,8000rpm),用磷酸盐缓冲液(0.1M,pH=7.0)洗涤两次,置于4℃备用。
实施例2:合成(3R,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮
取实施例1的菌体1.5g重悬于10ml磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液(0.1M,pH=7.0)中,加入20mM模式底物4-苯基-3-丁烯-2-酮(表2中1a),30℃,230rpm,反应2h。取1ml反应液,加入800μl乙酸乙酯萃取,12,000离心2min,取有机相,加入适量无水硫酸钠干燥,减压蒸馏,1ml异丙醇溶解产物,有机滤膜过滤后HPLC检测。采用Shimadzu Prominence LC-20AD system大赛璐手性色谱柱AD-H,检测器为PDA。检测条件,异丙醇:正己烷=10:90,0.5ml/min,柱温35℃。产物为(3R,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮,转化率>99%、对映体选择性ee值>99%。产物以NMR-1H谱和NMR-13C谱鉴定。
标准品(3R,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮出峰时间为11.9min,(3S,4R)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮出峰时间为13.3min,见说明书附图4。
实施例3:合成其他手性烯丙型环氧酮
取实施例1的菌体2g重悬于10ml磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液(0.1M,pH=7.0)中,加入10mM底物,30℃,230rpm,反应2h。反应液处理方法同实施例2。
底物包括4-苯基-3-丁烯-2-酮以及分别在o-/m-/p-位的卤素、甲基取代得到的衍生物(表2)。转化率70-99%和ee值85-99%。对大多数底物具有良好的转化效率和优异的对应选择性ee值(>99%)。
表2
实施例4:合成(2S,3S,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇
取实施例1的菌体1g重悬于10ml磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液(0.1M,pH=7.0)中,加入15mM模式底物4-苯基-3-丁烯-2-酮和5%异丙醇,30℃,230rpm,反应0.5h。反应液处理方法和检测方法同实施例2。
产物为(2S,3S,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇,转化率>99%,对映体选择性ee值>99%,非对映体选择性de值>99%。产物以NMR-1H谱和NMR-13C鉴定。
标准品(2R,3R,4R)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇出峰时间为12.9min,(2R,3S,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇出峰时间为14.2min,(2S,3S,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇出峰时间为15.6min,(2S,3R,4R)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇出峰时间为20.9min,见说明书附图4。
实施例5:异丙醇浓度对合成手性烯丙型环氧醇的影响
取实施例1的菌体2g重悬于10ml磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液(0.1M,pH=7.0)中,加入10mM模式底物4-苯基-3-丁烯-2-酮(表3中1a),同时,加入0-15%异丙醇,30℃、230rpm,反应0.5h。反应液处理方法和检测方法同实施例2。结果说明,当异丙醇浓度为0%时,最终产物为(3R,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮,转化率>99%,对映体选择性ee值>99%;当异丙醇浓度为0.05-0.5%(v/v)时,最终产物为(3R,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮和(2S,3S,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇的混合物;当异丙醇浓度为1-15%(v/v)时,最终产物为(2S,3S,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁醇,其转化率>99%,对映体选择性ee值>99%,非对映体选择性de值>99%,无(3R,4S)-4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮生成。
实施例6:合成其他手性烯丙型环氧醇
取实施例1的菌体2g重悬于10ml磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液(0.1M,pH=7.0)中,加入10mM底物和2.5%(v/v)异丙醇。30℃,230rpm,反应0.5-5h。反应液处理方法和检测方法同实施例2。
底物包括4-苯基-3-丁烯-2-酮以及分别在o-/m-/p-位的卤素、甲基取代得到的衍生物(表3)。转化率60-99%,对映体选择性ee值>99%,非对映体选择性de值86-99%。对于绝大多数底物具有良好的转化率,对映体选择性以及非对映体选择性。
表3
Claims (1)
1.一种生物催化合成光学纯烯丙型环氧酮或醇的方法,其特征是以大肠杆菌重组菌E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)全细胞为生物催化剂,ɑ,β-不饱和酮为底物,在磷酸盐缓冲液中反应,反应体系中无异丙醇,则产物是光学纯烯丙型环氧酮,反应体系中加入体积浓度为1-15%的异丙醇,则产物是光学纯烯丙型环氧醇;其中,重组菌E.coli BL21ΔnemA(pRSFD-REAB)包含宿主E.coli BL21ΔnemA和质粒pRSFD-REAB,E.coli BL21ΔnemA为敲除了大肠杆菌E.coli BL21基因组上N-乙酰马来酰亚胺还原酶基因nemA后得到的工程菌;质粒pRSFD-REAB为一个双酶共表达质粒,是将NCBI中登录号为AY161280的羰基还原酶READH和NCBI中登录号为GU593979的苯乙烯单加氧酶StyAB2共同连入双表达载体pRSFDuet-1T后获得的;底物ɑ,β-不饱和酮为4-苯基-3-丁烯-2-酮或者该化合物在o-/m-/p-位的卤素或甲基取代的衍生物。
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