CN110819641B

CN110819641B - 一种烯烃水合酶在制备伯醇中的应用

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Publication number: CN110819641B
Application number: CN201911214183.6A
Authority: CN
Inventors: 林晖; 陈红歌; 唐燕红; 杨森; 刘新育; 王旭
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN110819641A

Abstract

本发明提供了一种烯烃水合酶基因在制备伯醇中的应用，属于生物酶技术领域，所述烯烃水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述烯烃水合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明将来自于草螺菌基因组中被注释为丙氨酸磷酸核糖醇连接酶的基因经过密码子优化后表达，所述酶基因编码的蛋白质具有能够直接催化苯乙烯类化合物的反马氏不对称水合反应制备伯醇类化合物，命名该酶为烯烃水合酶。本发明提供的利用烯烃水合酶催化合成伯醇的方法，具有反应条件温和，过程简单，并且具有较高的转化率、对映选择性、较宽泛的底物谱、较高的催化效率，是一条绿色的制备伯醇的途径。

Description

一种烯烃水合酶在制备伯醇中的应用

技术领域

本发明属于生物酶技术领域，尤其涉及一种烯烃水合酶在制备伯醇中的应用。

背景技术

醇作为医药、农药以及一些精细化学品合成的重要中间体，其制备方法一直以来都是研究的热点。通过烯烃的水合反应制备醇，具有原子经济且不产生额外的热能等优点，因此通过该方法制备醇类物质为最经济的绿色途径。但是传统的酸催化烯烃水合反应遵循马尔可夫尼科夫规则(马氏规则，Markovnikov’s Rule)，即水合反应只能得到羟基加到取代基团多的碳原子上的产物醇，生成的产物主要为仲醇和叔醇，无法得到伯醇。到目前为止，伯醇的制备方法主要包括以下步骤：(1)可通过硼氢化-氧化步骤来制备伯醇，然而这一过程需要昂贵的硼烷试剂，且硼难以回收再利用，造成试剂的浪费(Loudon,G.M.；Allen,D.Organic chemistry；Oxford University Press:New York,2003)；(2)利用钯催化氧化、酸催化水解和钌催化还原的三步反应，可以由末端烯烃制备遵循反马氏规则的伯醇，但该过程依赖贵金属催化剂，且反应效率不高(Dong,G.B.；Teo,P.L.；Wickens,Z.K.；Grubbs,R.H.,Primary Alcohols from Terminal Olefins:Formal Anti-Markovnikov Hydrationvia Triple Relay Catalysis.Science 2011,333(6049),1609-1612.)；(3)采用可见光介导的有机光催化剂和助催化剂二苯二硫醚可直接催化烯烃反马氏规则水合反应，但需要使用大量的有毒有害的二苯二硫醚(Hu,X.；Zhang,G.；Bu,F.；Lei,A.,Visible-Light-Mediated Anti-Markovnikov Hydration of Olefins.ACS Catalysis 2017,7(2),1432-1437.)。上述伯醇制备方法主要有以下缺点：反应条件比较苛刻，过程复杂，效率低，环境污染比较严重，并且这些化学方法都不具对映选择性。另外，到目前为止仍没有发现可以直接催化烯烃反马氏不对称水合反应的酶，需要多酶级联反应实现该过程(Hammer,S.C.；Kubik,G.；Watkins,E.；Huang,S.；Minges,H.；Arnold,F.H.,Anti-Markovnikov alkeneoxidation by metal-oxo-mediated enzyme catalysis.Science 2017,358(6360),215-218.)，操作过程复杂，效率低，生产成本高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种烯烃水合酶基因、烯烃水合酶、重组载体、重组菌株及其在制备伯醇中的应用。本发明将来自于草螺菌(Herbaspirillum huttiense)基因组中被注释为alanine-phosphoribitol ligase(丙氨酸磷酸核糖醇连接酶)的基因经过密码子优化后表达，所述酶基因编码的蛋白质具有能够直接催化苯乙烯类化合物的反马氏不对称水合反应制备伯醇类化合物，产物是医药、农药，以及一些精细化学品合成的重要中间体，重新命名该基因为烯烃水合酶(Alkene hydrase,HhAH)基因，其编码蛋白为烯烃水合酶；相比较于目前化学催化制备伯醇的方法，本发明提供的利用烯烃水合酶催化合成伯醇的方法，具有反应条件温和，避免使用贵金属等催化剂，反应过程简单等优势，并且所述方法具有较高的转化率、对映选择性、较宽泛的底物谱、较高的催化效率，是一条绿色的制备伯醇的途径。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种烯烃水合酶在制备伯醇中的应用，所述烯烃水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述制备伯醇的底物包括苯乙烯类化合物和乙烯基苯并呋喃类化合物。

优选的，所述制备伯醇的底物包括苯乙烯，α-甲基苯乙烯，α-乙基苯乙烯，2-氯苯乙烯，3-氯苯乙烯，4-氯苯乙烯，2-甲氧基苯乙烯，3-甲氧基苯乙烯，4-甲氧基苯乙烯，2-甲基苯乙烯，3-甲基苯乙烯和2-乙烯基苯并呋喃。

优选的，所述制备伯醇的过程如下：

1)将包括烯烃水合酶基因的重组菌株与缓冲液混合获得菌悬液；

2)将所述菌悬液与底物混合反应获得伯醇产物；

步骤2)中所述反应的温度为18～35℃，所述反应的时间为40～55h。

优选的，所述重组菌株包括原始菌株和重组载体。

优选的，所述原始菌株为大肠杆菌.

优选的，所述重组载体包括所述的烯烃水合酶基因和初始载体。

优选的，所述初始载体为pET24(a)载体，所述烯烃水合酶基因连接于所述pET24(a)载体的HindIII和SacI酶切位点之间。

优选的，所述底物在反应体系中的浓度为0.05～1g/L。

优选的，步骤2)中所述反应的温度为20～35℃。

本发明的有益效果：本发明提供的烯烃水合酶基因为来自于草螺菌(Herbaspirillum huttiense)基因组中原本被注释为alanine-phosphoribitol ligase(丙氨酸磷酸核糖醇连接酶)的基因。经过密码子优化后表达，所述酶基因编码的蛋白质具有能够直接催化苯乙烯类化合物的反马氏不对称水合反应制备伯醇类化合物的催化活性，催化产物是医药、农药，以及一些精细化学品合成的重要中间体。本发明中命名所述基因为烯烃水合酶(Alkene hydrase，HhAH)基因，其编码蛋白为烯烃水合酶。相比较于目前化学催化制备伯醇的方法，本发明提供的利用烯烃水合酶催化合成伯醇的方法，具有反应条件温和，避免使用贵金属等催化剂，反应过程简单等优势，是一条绿色的制备伯醇的途径。

进一步的，本发明提供的烯烃水合酶烯烃反马氏不对称水合反应时具有较高的转化率和对映选择性；本发明提供的烯烃水合酶能够催化苯乙烯类化合物和乙烯基苯并呋喃类化合物，包括苯乙烯，α-甲基苯乙烯，α-乙基苯乙烯，2-氯苯乙烯，3-氯苯乙烯，4-氯苯乙烯，2-甲氧基苯乙烯，3-甲氧基苯乙烯，4-甲氧基苯乙烯，2-甲基苯乙烯，3-甲基苯乙烯和2-乙烯基苯并呋喃；具有较宽泛的底物谱，底物的转化率可以达到5％～100％，具有较高的催化效率。

进一步的，本发明以重组菌株全细胞为生物催化剂，细胞为烯烃水合酶提供了一个天然的保护屏障，提高了烯烃水合酶对有机化合物的耐受性，从而提高了烯烃水合酶对底物的转化率。

具体实施方式

本发明提供了一种烯烃水合酶在制备伯醇中的应用，所述烯烃水合酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。在本发明中，所述烯烃水合酶基因为来自于草螺菌(Herbaspirillum huttiense)基因组中原本被注释为alanine-phosphoribitol ligase(丙氨酸磷酸核糖醇连接酶)的基因。经过密码子优化后表达，所述酶基因编码的蛋白质具有能够直接催化苯乙烯类化合物的反马氏不对称水合反应制备伯醇类化合物的催化活性，因此命名为烯烃水合酶(Alkene hydrase，HhAH)基因。本发明对所述烯烃水合酶的制备方法没有特殊限定，采用常规的人工合成即可。

在本发明中，所述烯烃水合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述烯烃水合酶具有能够直接催化苯乙烯类化合物的反马氏不对称水合反应制备伯醇类化合物的催化活性。

在本发明中，所述制备伯醇的过程优选的如下：1)将重组菌株与缓冲液混合获得菌悬液；2)将所述菌悬液与底物混合反应获得伯醇产物。

在本发明中，将重组菌株与缓冲液混合获得菌悬液。在本发明中，所述重组菌株，包括所述的重组载体和原始菌株。在本发明中，所述原始菌株优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。在本发明中，所述重组菌株优选的通过将所述重组载体转入原始菌株获得；本发明对具体的转入方法和参数没有特殊限定，采用本领域常规方法和参数设定即可。

在本发明中，所述重组载体，包括所述的烯烃水合酶基因和初始载体。在本发明中，所述初始载体优选的为pET24(a)载体，所述烯烃水合酶基因优选的连接于所述pET24(a)载体的HindIII和SacI酶切位点之间。在本发明中，所述pET24(a)载体优选的为市售产品；所述重组载体优选的通过将所述烯烃水合酶基因与pET24(a)载体分别双酶切后连接、筛选获得；本发明对具体的酶切、连接与表重组载体的筛选的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的酶切、连接与重组载体的筛选的步骤即可。

在本发明中，优选的以所述重组菌株的全细胞为催化剂，催化制备伯醇。

在本发明中，所述制备伯醇的底物优选的包括苯乙烯类化合物和乙烯基苯并呋喃类化合物，具体的包括苯乙烯，α-甲基苯乙烯，α-乙基苯乙烯，2-氯苯乙烯，3-氯苯乙烯，4-氯苯乙烯，2-甲氧基苯乙烯，3-甲氧基苯乙烯，4-甲氧基苯乙烯，2-甲基苯乙烯，3-甲基苯乙烯和2-乙烯基苯并呋喃。

在本发明中，优选的将所述重组菌株进行液体培养、诱导表达烯烃水合酶后，收集菌体。在本发明中，所述液体培养优选的在LB培养基中进行，所述液体培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述液体培养的时间优选为12～14h，更优选为13h。在本发明中，所述LB培养基中优选的添加卡那霉素，所述卡那霉素的浓度优选为45～55μg/mL，更优选为50μg/mL。本发明在所述液体培养后，将获得的培养液转接于TB培养基中。在本发明中，所述转接的接种量优选为0.08％～0.12％，更优选为1％；本发明在所述转接后，于37℃培养3h；然后加入诱导剂IPTG诱导表达；所述IPTG的终浓度优选为0.05mmol/L，所述诱导表达的温度优选为15～17℃，更优选为16℃，所述诱导表达的时间优选为20～28h，更优选为22～26h，最优选为24h。在本发明上述的液体培养和诱导表达烯烃水合酶过程中，优选的伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为200～250rpm，更优选为220rpm。本发明在所述诱导表达后收集菌体；本发明中，所述收集菌体的方法优选为离心，所述离心的转速优选为5500～6500rpm，更优选为6000rpm；所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min；所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。

本发明在收集获得重组菌株后，重组菌株与缓冲液混合获得菌悬液。在本发明中，优选的用磷酸钾缓冲液冲洗菌体1～3次，更优选为2次；本发明在所述冲洗后优选的再次收集菌体细胞，所述再次收集菌体细胞的方法与上述离心方法一致，在此不再赘述。在本发明中，将所述再次收集的重组菌体细胞与磷酸钾缓冲液混合，以所述重组菌体细胞的湿重计，所述磷酸钾缓冲液与所述重组菌体细胞的比例优选为(75～85)mL:3g，更优选为80mL:3g。在本发明中，所述磷酸钾缓冲液的浓度优选为0.08～0.12mol/L，更优选为0.1mol/L，所述磷酸钾缓冲液的pH值优选为5.3～5.8，更优选为5.5。在本发明中，所述磷酸钾缓冲液可以替换为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液；所述磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液的浓度优选为0.08～0.12mol/L，更优选为0.1mol/L，所述磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液的pH值优选为5.8～6.2，更优选为6.0。

在本发明中，将所述菌悬液与底物混合反应获得伯醇产物。在本发明中，所述反应的温度优选为18～35℃，更优选为20～35℃，具体为20℃、25℃、30℃、35℃；所述反应的时间优选为40～55h，更优选为48h；所述底物在反应体系中的浓度优选为0.05～1g/L。在本发明中，所述反应过程中优选的添加底物辅溶剂，所述底物辅溶剂优选为邻苯二甲酸二异辛烷酯，所述底物辅溶剂的添加量优选为1.25％。

本发明在所述反应结束后，优选的还包括产物的收集和检测过程。在本发明中，优选的将所述反应结束后的反应液经过萃取、干燥后进行气相色谱检测。在本发明中，所述萃取优选的采用乙醚进行，所述乙醚的体积优选为所述反应液体积的40％～60％，更优选为50％；所述萃取的次数优选为1～3次，更优选为2次；本发明在所述萃取结束后，合并有机相进行干燥。在本发明中，所述干燥包括依次进行的无水硫酸钠干燥、减压蒸干获得粗产品。在本发明中，所述无水硫酸钠干燥的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；所述减压蒸干的真空度优选为0.08MPa，所述减压蒸干的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述减压蒸干的过程中，优选的伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为75～85rpm，更优选为80rpm。本发明在获得所述粗产品后进行气相色谱检测；所述气相色谱优选的用Agilent CP-Chirasil-DEX CB手性色谱柱对粗产品的的转化率和对映选择性进行测定。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

E.coli(pET-HhAh)催化α-甲基苯乙烯反马氏不对称水合反应

依据大肠杆菌密码子偏爱性，将HhAH基因(WP_039783212)进行密码子优化，由苏州金唯智生物科技有限公司合成该目的基因。将合成的基因和pET24(a)载体通过HindIII和SacI酶切，然后通过T4连接酶将HhAH基因片段插入到pET24(a)载体，将连接产物通过42℃热激转入到E.coli(DH5α)菌株感受态细胞，涂布至LB卡那抗性平板，挑取单克隆，提取质粒并测序确定正确序列，构建该酶表达载体pET-HhAh。在42℃热激条件下，将表达载体pET-HhAh转至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)菌株的感受态细胞，涂布至LB卡那抗性平板。挑取单克隆，在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中于37℃，220rpm培养13h作为种子培养基，以1％接种量接种于TB培养基中，37℃，220rpm振荡培养3h，加入诱导剂IPTG(终浓度0.05mmol/L)，16℃，220rpm诱导HhAH基因表达，24h后，4℃，6000rpm，5min收集菌体，并按照收集菌体的离心条件用0.1mol/L，pH 5.5磷酸钾缓冲液洗两遍，称取3g的湿菌体，用20mL、0.1mol/L，pH值5.5磷酸钾缓冲液将菌体细胞重悬，再用0.1mol/L，pH值5.5磷酸钾缓冲液补足到80mL，将菌悬液加入到250mL具塞三角瓶中，再将底物α-甲基苯乙烯直接加入到菌悬液中，底物终浓度为0.37g/L，20℃，80rpm反应48h。

反应结束后，向80mL反应液中加入40mL乙醚萃取两次，将有机相收集合并在100mL具塞三角瓶中，加入5.0g无水硫酸钠干燥2h，在真空度为0.08MPa，50℃，80rpm条件下减压蒸除溶剂得到粗产物，通过气相色谱用Agilent CP-Chirasil-DEX CB手性色谱柱对产物的转化率和对映选择性进行测定，检测结果表明该转化过程可以将10mg的α-甲基苯乙烯全部转化生成2-苯基-1-丙醇，转化率为100％，ee值为87％。然后通过薄层层析硅胶柱对产物2-苯基-1-丙醇进行分离，得到纯的2-苯基-1-丙醇，通过NMR对其结构进行氢谱分析。

2-苯基-1-丙醇数据如下：

无色液体，ee：87％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.22-7.36(m,5H,Ar–H),3.70(d,2H,CH₂,J＝6.98Hz)，2.91-3.00(m,1H,CH),1.44(br，1H,OH),1.28(d,3H,CH₃,J＝7.32Hz)

实施例2

操作如实施例1，反应温度为30℃，底物α-甲基苯乙烯10mg，反应48h，可将10mg的α-甲基苯乙烯全部转化生成2-苯基-1-丙醇。

实验结果同实施例1。

实施例3

操作如实施例1，反应温度为35℃，转速为150rpm，底物α-甲基苯乙烯10mg，反应24h，可将10mg的α-甲基苯乙烯全部转化生成2-苯基-1-丙醇。

实验结果同实施例1。

实施例4

缓冲液采用磷酸二氢钾-磷酸氢二钾(0.1M，pH6.0)体系，其它操作如实施例1，底物α-甲基苯乙烯10mg，反应48h，可将10mg的α-甲基苯乙烯全部转化生成2-苯基-1-丙醇。

实验结果同实施例1。

实施例5

反应体系中加入底物辅溶剂邻苯二甲酸二异辛烷酯1mL，其它操作如实施例1，反应48h，可将10mg的α-甲基苯乙烯全部转化生成2-苯基-1-丙醇。

实验结果同实施例1。

实施例6

E.coli(pET-HhAh)催化2-苯基-1-丁烯反马氏不对称水合反应

操作如实施例1，反应条件为20℃，80rpm反应48h，底物2-苯基-1-丁烯10mg，其它操作如实施例1，2-苯基-1-丁烯的转化率可以达到100％。

2-苯基-1-丁醇数据如下：

无色液体，ee:86％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.20-7.36(m,5H,Ar-H),3.70-3.80(m,2H,CH₂),2.66-2.73(m,H,CH),1.53-1.81(m,2H,CH₂),0.84(t,3H,CH₃,J＝7.44Hz)

实施例7

E.coli(pET-HhAh)催化苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为35℃，150rpm反应48h，底物苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，苯乙烯的转化率可以达到100％。

2-苯乙醇数据如下：

无色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.24-7.36(m,5H,Ar–H),3.86(t,2H,CH₂,J＝6.64Hz),2.88(t,2H,CH₂,J＝6.64Hz),1.69(br,1H,OH)

实施例8

E.coli(pET-HhAh)催化2-氯苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为25℃，150rpm反应48h，底物2-氯苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，2-氯苯乙烯的转化率可以达到10％。

2-氯苯乙醇数据如下：

无色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.17-7.38(m,4H,Ar–H),3.88(t,2H,CH₂,J＝6.87Hz)，3.02(t,2H,CH₂,J＝6.87Hz)，1.60(br,1H,OH)

实施例9

E.coli(pET-HhAh)催化3-氯苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为25℃，150rpm反应48h，底物3-氯苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，3-氯苯乙烯的转化率可以达到5％。

3-氯苯乙醇数据如下：

淡黄色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.13-7.30(m,4H,Ar–H),3.89(t,2H,CH₂,J＝6.52Hz)，2.88(t,2H,CH₂,J＝6.52Hz),1.59(br,1H,OH)

实施例10

E.coli(pET-HhAh)催化4-氯苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为25℃，150rpm反应48h，底物4-氯苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，4-氯苯乙烯的转化率可以达到26％。

4-氯苯乙醇数据如下：

无色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.14-7.28(m,4H,Ar–H),3.82(t,2H,CH₂,J＝6.62Hz),2.82(t,2H,CH₂,J＝6.62Hz),1.58(br,1H,OH)

实施例11

E.coli(pET-HhAh)催化3-甲氧基苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为30℃，150rpm反应48h，底物3-甲氧基苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，3-甲氧基苯乙烯的转化率可以达到14％。

3-甲氧基苯乙醇数据如下：

淡黄色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ6.78-7.26(m,4H,Ar-H),3.86(t,2H,CH₂,J＝6.58Hz),3.80(s,3H,CH₃),2.85(t,2H,CH₂,J＝6.58Hz),1.55(br,1H,OH)

实施例12

E.coli(pET-HhAh)催化4-甲氧基苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为30℃，150rpm反应48h，底物4-甲氧基苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，4-甲氧基苯乙烯的转化率可以达到100％。

3-甲氧基苯乙醇数据如下：

浅褐色固体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ6.85-7.16(m,4H,Ar-H),3.82(t,2H,CH₂,J＝6.60Hz),3.79(s,3H,CH₃),2.81(t,2H,CH₂,J＝6.60Hz),1.45(br,1H,OH)

实施例13

E.coli(pET-HhAh)催化2-甲基苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为35℃，150rpm反应48h，底物2-甲基苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，2-甲基苯乙烯的转化率可以达到42％。

2-甲基苯乙醇数据如下：

无色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.23-7.35(m,4H,Ar-H),3.92(t,2H,CH₂,J＝7.10Hz),2.99(t,2H,CH₂,J＝7.10Hz),2.44(s,3H,CH₃),1.72(br,1H,OH)

实施例14

E.coli(pET-HhAh)催化3-甲基苯乙烯反马氏水合反应

操作如实施例1，反应条件为35℃，150rpm反应48h，底物3-甲基苯乙烯10mg，其它操作如实施例1，3-甲基苯乙烯的转化率可以达到30％。

3-甲基苯乙醇数据如下：

无色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.02-7.23(m,4H,Ar-H),3.85(t,2H,CH₂,J＝6.59Hz),2.84(t,2H,CH2,J＝6.59Hz),2.35(s,3H,CH3),1.51(br,1H,OH)

实施例15

E.coli(pET-HhAh)催化2-乙烯基苯并呋喃反马氏水合反应

操作如实施案例1，反应条件为35℃，80rpm反应48h，底物2-乙烯基苯并呋喃10mg，其它操作如实施例1，2-乙烯基苯并呋喃的转化率可以达到100％。

2-苯并呋喃乙醇数据如下：

无色液体

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.17-7.52(m,4H,Ar-H),6.52(s,1H,CH),4.00(t,2H,CH₂,J＝6.22Hz),3.06(t,2H,CH₂,J＝6.22Hz)

由上述实施例可知，本发明提供的利用烯烃水合酶催化合成伯醇的方法，具有反应条件温和，反应过程简单等优势，并且所述方法具有较高的转化率、对映选择性、较宽泛的底物谱、较高的催化效率，是一条绿色的制备伯醇的途径。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种烯烃水合酶在制备伯醇中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgcgtagca tcgcaattgt tggtggcggt caagctggtc tgccgttagc ctttggtctg 60

ctggagcaag gttatcaagt tacagtggtg accaaccgca ccccggacga tttacgtaat 120

ggcaaagtga tgagcagcca gtgtatgttc gatccgtctt tacaaattga gcgtgatctg 180

ggtttaaacg actgggaaca gcagtgccct ccggtgcaag gtattagctt tgcagtgccg 240

catccggaag ttccgggcgc caaagccatt gattggagcg cacgcttaga tcgtccggcc 300

caagctgtgg atcagcgttt aaaaatgagc agctggctgg agcaagttga ggcccgtggt 360

ggtaaagtgc tgatccaaga tgccggtgtt gccgagctgg aggttctgag cgaacagcac 420

gatctggtga ttttagccgc tggtaaaggc gaagtggtga aactgtttga gcgcgatgcc 480

gcacgtagcc cgtttgacaa accgcaacgt agtctggctt taacctatgt tcacggtctg 540

aaacgtcagc cggattacag cagcgtggcc ttcaatttaa tcccgggcgt gggcgaatac 600

tttgtgtttc cggctttaac actgagcggc ccgtgcgata tcatggtgtt tgaaggcatc 660

cccggtggtc cgctggattg ctggcgcgag gttcgtaccc cgcaagaaca tctggccacc 720

agcaaagatt ttttacgcaa atttttaccg tgggaagcag aacgcgcaga gcatgccgaa 780

ctgaccgatg ataagggcat tctggccggt agtttcgccc cgaccgttcg taaaccggtg 840

ctgacactgc cgagtggtcg tctggttttc ggtctgggcg atgccgtggc aacaaacgat 900

ccgattaccg gtcaaggtgc aaataacgcc acaaaagccg ccaaagttta tttagatgca 960

attctggccc atggcgataa gccttacacc cgcgattgga tggagcagac ctttgagcag 1020

ttttgggact acgccaaatg ggtggtgcag tggaccaaca gtctgctgac cccgccgcct 1080

ccgcatattc tgggtctgct gggtgccgcc ggtcagatgc ctagcttagc caaggagatt 1140

gccgagggtt tcaaccatcc tccgcgctat tttccttggt gggccgatgc acaagcatgt 1200

gatgaactgg tggccggcca tcaagcaaag gctttagccg ttgcagccta a 1251

<210> 2

<211> 416

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Arg Ser Ile Ala Ile Val Gly Gly Gly Gln Ala Gly Leu Pro Leu

1 5 10 15

Ala Phe Gly Leu Leu Glu Gln Gly Tyr Gln Val Thr Val Val Thr Asn

20 25 30

Arg Thr Pro Asp Asp Leu Arg Asn Gly Lys Val Met Ser Ser Gln Cys

35 40 45

Met Phe Asp Pro Ser Leu Gln Ile Glu Arg Asp Leu Gly Leu Asn Asp

50 55 60

Trp Glu Gln Gln Cys Pro Pro Val Gln Gly Ile Ser Phe Ala Val Pro

65 70 75 80

His Pro Glu Val Pro Gly Ala Lys Ala Ile Asp Trp Ser Ala Arg Leu

85 90 95

Asp Arg Pro Ala Gln Ala Val Asp Gln Arg Leu Lys Met Ser Ser Trp

100 105 110

Leu Glu Gln Val Glu Ala Arg Gly Gly Lys Val Leu Ile Gln Asp Ala

115 120 125

Gly Val Ala Glu Leu Glu Val Leu Ser Glu Gln His Asp Leu Val Ile

130 135 140

Leu Ala Ala Gly Lys Gly Glu Val Val Lys Leu Phe Glu Arg Asp Ala

145 150 155 160

Ala Arg Ser Pro Phe Asp Lys Pro Gln Arg Ser Leu Ala Leu Thr Tyr

165 170 175

Val His Gly Leu Lys Arg Gln Pro Asp Tyr Ser Ser Val Ala Phe Asn

180 185 190

Leu Ile Pro Gly Val Gly Glu Tyr Phe Val Phe Pro Ala Leu Thr Leu

195 200 205

Ser Gly Pro Cys Asp Ile Met Val Phe Glu Gly Ile Pro Gly Gly Pro

210 215 220

Leu Asp Cys Trp Arg Glu Val Arg Thr Pro Gln Glu His Leu Ala Thr

225 230 235 240

Ser Lys Asp Phe Leu Arg Lys Phe Leu Pro Trp Glu Ala Glu Arg Ala

245 250 255

Glu His Ala Glu Leu Thr Asp Asp Lys Gly Ile Leu Ala Gly Ser Phe

260 265 270

Ala Pro Thr Val Arg Lys Pro Val Leu Thr Leu Pro Ser Gly Arg Leu

275 280 285

Val Phe Gly Leu Gly Asp Ala Val Ala Thr Asn Asp Pro Ile Thr Gly

290 295 300

Gln Gly Ala Asn Asn Ala Thr Lys Ala Ala Lys Val Tyr Leu Asp Ala

305 310 315 320

Ile Leu Ala His Gly Asp Lys Pro Tyr Thr Arg Asp Trp Met Glu Gln

325 330 335

Thr Phe Glu Gln Phe Trp Asp Tyr Ala Lys Trp Val Val Gln Trp Thr

340 345 350

Asn Ser Leu Leu Thr Pro Pro Pro Pro His Ile Leu Gly Leu Leu Gly

355 360 365

Ala Ala Gly Gln Met Pro Ser Leu Ala Lys Glu Ile Ala Glu Gly Phe

370 375 380

Asn His Pro Pro Arg Tyr Phe Pro Trp Trp Ala Asp Ala Gln Ala Cys

385 390 395 400

Asp Glu Leu Val Ala Gly His Gln Ala Lys Ala Leu Ala Val Ala Ala

405 410 415

Claims

1.一种烯烃水合酶在制备伯醇中的应用，其特征在于，所述烯烃水合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制备伯醇的底物包括苯乙烯类化合物或乙烯基苯并呋喃类化合物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制备伯醇的底物选自苯乙烯，α-甲基苯乙烯，α-乙基苯乙烯，2-氯苯乙烯，3-氯苯乙烯，4-氯苯乙烯，2-甲氧基苯乙烯，3-甲氧基苯乙烯，4-甲氧基苯乙烯，2-甲基苯乙烯，3-甲基苯乙烯和2-乙烯基苯并呋喃中的一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制备伯醇的过程如下：

2)将所述菌悬液与底物混合反应获得伯醇产物；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组菌株包括原始菌株和重组载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述原始菌株为大肠杆菌。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述重组载体包括所述的烯烃水合酶基因和初始载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述初始载体为pET24(a)载体，所述烯烃水合酶基因连接于所述pET24(a)载体的HindIII和SacI酶切位点之间。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述底物在反应体系中的浓度为0.05～1g/L。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述反应的温度为20～35℃。