CN110172484A - 一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法 - Google Patents
一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属生物技术领域,提供一种级联生物催化烯烃化合物不对称胺羟化制备手性β‑氨基醇的方法,以烯烃单加氧酶、环氧化物水解酶、醇脱氢酶和转氨酶为生物催化剂,以烯烃为底物,在磷酸盐缓冲液中反应,合成手性β‑氨基醇。转化率为高达99%,ee值为97‑99%。用级联生物催化体系中的烯烃单加氧酶/醇脱氢酶(ADH)/(R)‑(+)‑1苯基乙胺(R‑MBA)驱动反应向利于产物生成的方向进行,并使辅因子NAD+再生。用工程重组大肠杆菌细胞实现了全细胞级联生物催化,得到的手性β‑氨基醇。用于将廉价烯烃化合物转化为各种不同的手性β‑氨基醇,催化效率高、反应条件温和、反应过程简单且能耗低,符合绿色化学原则。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法。
背景技术
手性β-氨基醇是一类十分重要的手性分子,在医药活性分子和天然产品中用作砌块和中间体,是不对称合成中手性化合物的主要来源。例如,(S)-(+)-2-氨基-1-丁醇是合成一种重要的抗结核药物乙胺丁醇(EMB)的中间体;以(S)-2-氨基-2-苯基乙醇为砌块,制备的吲哚啉-2-酮衍生物,其是P21-活化激酶(PAK4)的抑制剂;(S)-2-氨基-2-(4-溴苯基)乙醇是合成4,4`-双(联苯)取代双(恶唑啉)(BOX)配体的中间体,是不对称催化中研究最为广泛的配体之一。
由于烯烃化合物的价格低廉,因此,烯烃化合物的不对称胺羟化为手性β-氨基醇的合成提供了一种直接有效的途径。在过去的几十年里,人们致力于研究以胺作为亲核试剂的烯烃不对称胺羟化,并且得到了中等到良好的选择性。但是到目前为止,大多数方法主要是通过化学方法实现的,且存在如底物范围有限、产品得率和ee值不高、区域选择性较低、反应过程需要高温高压等缺点。在研究过程中,人们发现酶在有机合成中展现出了良好的化学选择性、区域选择性和立体选择性,因此在有机合成中,广泛使用酶作为绿色催化剂。近几年来,多酶体系的级联生物催化反应成为研究热点,并成为一种绿色、实用的工具。利用酶催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇目前仍面临许多挑战,这可能是因为难以找到具有良好活性和对映选择性的酶。此外,解决某些级联生物催化反应中的辅因子再生问题也仍面临巨大挑战。
发明内容
本发明提供了一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,该方法属于四酶一锅煮的级联催化反应,用于烯烃不对称胺羟化制备对映体纯的β-氨基醇。本发明避免了中间产物的损失,催化效率高,同时在反应中实现了辅因子NAD+/NADH的循环再生,节约成本,适合级联催化体系的工业应用。
本发明是通过以下技术方案实现的:一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,以烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH和转氨酶TA为生物催化剂,以烯烃为底物,在磷酸盐缓冲液中反应,合成手性β-氨基醇。
所述反应体系中:重组大肠杆菌E. coli(SMO)表达烯烃单加氧酶SMO,反应后的产物为手性环氧化物;重组大肠杆菌E. coli(EH)表达环氧化物水解酶EH,反应后的产物为对映纯二醇;重组大肠杆菌E. coli(ADH)表达醇脱氢酶,反应后的产物为羟酮化合物;E. coli(TA)表达转氨酶,反应后的产物为S-构型的β-氨基醇或R-构型的β-氨基醇。
所述反应体系中:重组大肠杆菌E.coli(SMO-EH-ADH-TA)同时表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA的全细胞,反应后的产物为S-构型的β-氨基醇或R-构型的β-氨基醇。
具体步骤为:
(1)构建重组菌株E. coli (SMO) 、E. coli (EH)、E. coli (ADH)、E. coli (TA),高效表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA,得到SMO、EH、ADH和TA的粗酶液;
(2)使用醇脱氢酶对不同二醇进行氧化活性以及反应中的副产物苯乙酮还原性检测,确定0.80 U mg-1醇脱氢酶RADH对二醇的活性最高,0.428 U mg-1对苯乙酮的活性中等;
(3)将转氨酶TA作为催化剂,转化羟酮生成β-氨基醇,确定产物得率以及ee;将烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA以不同比例混合作为生物催化剂,加入终浓度为20-50 mM的烯烃化合物作为底物,终浓度为25-55 mM的(R)-(+)-1-苯乙胺,终浓度为0.1 mM的5′-磷酸吡哆醛PLP,在0.1-0.5 mM NAD+的存在下,检测烯烃转化生成相对应的手性β-氨基醇;
(4)构建共表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA的工程菌株E. coli (SMO-EH-ADH-TA),获得重组菌株E. coli (SMO-EH-ADH-TA)的全细胞;
(5)将重组菌E. coli (SMO-EH-ADH-TA) 静息细胞作为生物催化剂,细胞用量为10-25g cdw/L,加入终浓度为10-100mM的烯烃化合物作为底物,终浓度为15-110 mM的氨基供体,终浓度为0.1-1.0 mM的5′-磷酸吡哆醛PLP,10 %二甲基亚砜,终浓度为0.5 mM的NAD+,浓度为0.1 M、pH7.5的磷酸钠缓冲液作为反应介质,对于2相体系反应,添加等量有机相,有机相为正己烷、乙酸乙酯或十六烷有机试剂;反应温度为0-50℃,反应6-24 h,通过全细胞催化合成手性β-氨基醇;
(6)反应液的分离:反应结束后,将反应液用氢氧化钠溶液调节pH>10,用等体积乙酸乙酯萃取出手性β-氨基醇。
所述底物为苯乙烯、4-氟苯乙烯、4-氯苯乙烯或4-溴苯乙烯中任意一种烯烃化合物。
所述级联生物催化合成反应均在搅拌转速200-300 rpm条件下进行。
所述的烯烃单加氧酶、环氧化物水解酶EH和醇脱氢酶SADH和RADH来自微生物、动物或植物。
所述氨基供体为含有氨基的任一化合物。所述氨基供体优选为(R)-(+)-1-苯乙胺。所述烯烃单加氧酶、环氧化物水解酶和醇脱氢酶为 (R)-选择性或(S)-选择性。
本发明所述的反应路线如附图1所示。
本发明通过烯烃单加氧酶(SMO)催化烯烃不对称环氧化反应生成手性环氧化物,环氧化物水解酶(EH)将环氧化物完全水解为邻位二醇,再通过醇脱氢酶(ADH)将邻位二醇中间体氧化为α-羟基酮,最后通过转氨酶(TA)将α-羟基酮中间体不对称还原胺化为对映体纯的β-氨基醇。在级联系统中还利用了SMO/ADH/(R)-(+)-1-苯乙胺(R-MBA)来驱动反应向有利于产物生成的方向进行,并实现了NAD+辅因子的循环再生。
本反应中使用重组大肠杆菌E. coli(SMO)表达烯烃单加氧酶(SMO),大肠杆菌E. coli(EH)表达环氧化物水解酶即EH,反应产物为二醇。重组大肠杆菌E. coli(ADH)表达醇脱氢酶ADH,反应产物为羟酮。重组大肠杆菌E. coli(TA)表达转氨酶TA,反应产物为手性β-氨基醇。
下面以苯乙烯(底物)为例来解释本发明所述应用的反应步骤:
步骤1,分别构建重组菌株E. coli (SMO)、E. coli (SpEH)、E. coli (BDHA)、E. coli(GoSCR)、E. coli (MVTA)用于高效表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶SpEH、醇脱氢酶BDHA以及转氨酶MVTA。烯烃单加氧酶SMO来自假单胞菌Pseudomonas sp., 环氧化物水解酶SpEH来自Sphingomonas sp.,醇脱氢酶BDHA来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),转氨酶MVTA来自结核分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)。然后从平板上挑取单菌落,接种至含100 mg/L氨苄青霉素抗性或者50 mg/L卡纳霉素抗性的LB培养基中,于37℃、200 rpm条件下振荡培养7 h,按2%的接种量接入含100 mg/L氨苄青霉素抗性或50 mg/L卡纳霉素抗性的50 mL TB培养基中,37℃、200 rpm培养,当培养液的OD600达到0.6时加入0.5 mM的IPTG,20℃,200 rpm诱导12 h。收集菌种,4℃,8000 rpm离心5 min后去除上清液,得到重组菌株E. coli (SpEH)、E. coli (BDHA)、E. coli (GoSCR)、E. coli (MVTA)的细胞。
步骤2,将步骤1中所得的细胞使用去离子水悬浮起来,置于冰上,在400 W下进行超声破碎90次,工作时间为4秒,间歇时间为4秒,然后将混合物在1000 rpm,4℃的条件下离心30分钟,以去除细胞碎片,获得重组菌E. coli (SpEH)、E. coli (BDHA)、E. coli(GoSCR)、E. coli (MVTA)的粗酶液,使用Bradford法进行粗酶液蛋白浓度的测定,检测酶活性。然后将粗酶液放置于-80℃下冷冻过夜,然后冻干48小时,得到冻干酶粉。
步骤3,使用步骤2所得到的重组菌E. coli (SMO)、E. coli (SpEH)、E. coli(BDHA)、E. coli (GoSCR)、E. coli (MVTA)的冻干酶粉,按照不同比例混合作为生物催化剂,加入终浓度为20-100 mM的底物,终浓度为25-110 mM的(R)-(+)-1-苯乙胺,终浓度为0.1 mM的5′-磷酸吡哆醛(PLP),0.5 mM NAD+,最终使用磷酸缓冲液(100 mM,pH7.5)将反应体系补足至5 mL。在200 rpm,30℃条件下反应16-24小时,产物提取并使用气相色谱进行检测分析。
步骤4,构建共表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶SpEH、醇脱氢酶BDHA、转氨酶MVTA的工程菌株E. coli (SMO-SpEH-BDHA-MVTA),同步骤1即可得到重组菌株E. coli(SMO-SpEH-BDHA-MVTA)的细胞。以整体细胞作为催化剂进行反应,细胞用量为10-20 gcdw/L,底物终浓度为10-100 mM,(R)-(+)-1-苯乙胺的终浓度为15-110 mM,其余反应条件同步骤5,最后使用气相色谱对产物进行检测。
步骤5,采用磷酸钠缓冲液(100 mM,pH7.5)和十六烷1:1(v/v)组成的水-有机两相体系作为反应介质,使用步骤4中构建的重组菌株E. coli (SMO-SpEH-BDHA-MVTA)细胞作为催化剂,其细胞用量为10-20 g cdw/L,底物浓度、反应条件以及检测方法同步骤5。
上述方法中其特征在于步骤1中重组菌株E. coli (SMO)、E. coli (SpEH)、E. coli (BDHA)、E. coli (GoSCR)、E. coli (MVTA)构建步骤为:
烯烃单加氧酶SMO,环氧化物水解酶SpEH基因由通用生物公司(中国安徽)合成,以此为模板进行PCR扩增,得到SMO、SpEH基因,将其连接到表达载体pRSFDuet上,构建重组质粒pRSFDuet-SMO和pRSFDuet-SpEH,然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中,筛选阳性克隆,获得表达烯烃单加氧酶和环氧化物水解酶的重组菌E. coli (SMO) 、E. coli (SpEH)。对于醇脱氢酶BDHA、转氨酶MVTA,构建重组质粒pETduet-BDHA和pET28a-MVTA,将质粒导入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中,获得重组菌E. coli (BDHA)、E. coli (MVTA)。
上述方法中其特征在于步骤5中共表达SMO、SpEH、BDHA和MVTA的工程菌株E. coli(SMO-SpEH-BDHA -MVTA)构建步骤为:
分别构建重组质粒pRSFDuet-SMO-SpEH和pETduet-BDHA-MVTA,将重组质粒pRSFDuet-SMO-SpEH和重组质粒pETduet-BDHA-MVTA同时导入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中,筛选阳性克隆,即可获得重组菌E. coli (SMO-SpEH-BDHA-MVTA)。
上述方法中其特征在于步骤3、步骤4、步骤5中反应液的处理,详细方法为:
在不同的反应时间取反应液300微升于1.5 mL的离心管中,加入过量NaCl,加入NaOH(0.1 M,10 N)至pH>10,然后加入等量的含有20 mM十二烷的乙酸乙酯,混匀后离心取上清液,加入无水硫酸钠干燥,气相色谱检测。
本发明采用一锅煮法将烯烃化合物转化为对映体纯的氨基醇,该方法不仅减少了中间产物的提取纯化步骤,避免中间产物的损失,而且增加了反应效率。
采用本发明所述烯烃单加氧酶、环氧化物水解酶、醇脱氢酶和转氨酶,通过烯烃单加氧酶不对称环氧化、环氧化物水解、二醇氧化和α-羟基酮不对称还原胺化,成功地开发了一种新型的级联生物催化反应合成手性β-氨基醇的方法。本发明与传统化学法相比,有着非常高的选择性和转化率,而且反应条件温和,对环境污染小,符合绿色化学的理念;与其他生物法相比,级联催化简化了反应过程,节约成本的同时,避免了中间产物的损失,对于医药及化工领域手性β-氨基醇的高效、绿色合成具有重大意义。所设计的级联过程一般可用于从相应的廉价烯烃化合物出发,通过组合不同的酶来获得各种不同的手性β-氨基醇。
附图说明
图1为烯烃单加氧酶/环氧化物水解酶/醇脱氢酶/转氨酶级联生物催化烯烃不对称胺羟化合成对映体纯的β-氨基醇的路线图。
具体实施方式
下面结合附图,给出本发明的较佳实施例,并予以详细描述。
SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(SK8141)购于生工生物工程(上海)股份有限公司。SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(SK8192)购于生工生物工程(上海)股份有限公司;PCR扩增试剂dNTPs,Buffer,Plus DNA Taq Polymerase购于生工生物工程(上海)股份有限公司;限制性内切酶BamHI、XhoI、HindIII、NdeI、 BglII购于Takara;连接酶和ligation buffer购于SCIENTIFIC;PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;DNA上样缓冲液,DNA标准分子量Marker购于生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白双染色Marker购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
下列实施中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。
在本发明的下述实施例中,使用的大肠杆菌培养基配制方法如下:
(1)LB培养基:配置1 L的LB液体培养基需加入10.0 g NaCl,10.0 g胰蛋白胨,5.0 g酵母提取物,使用去离子水定容到1 L后,用pH计检测其pH,一般显酸性,然后用5 mol/L的NaOH慢慢调节pH至7.0。若是配置固体培养基,可在液体培养基的基础上,按1.5%-2.0%的含量加入琼脂粉。密封好后,放入高压蒸汽灭菌锅中,在121 ℃下,灭菌30 min,待冷却后放在4 ℃低温冰箱中保存待用。
(2)TB培养基:将下列药品溶解在0.9 L水中:胰蛋白胨12 g,酵母提取物24 g,甘油4 mL,溶解混匀后分装到20个250 mL的摇瓶中,每瓶培养基的体积大约为45 mL。在121℃下,灭菌30 min。在使用时,加入100 mL灭过菌的磷酸缓冲液(2.65 g的NaH2PO4和25.78 g的Na2HPO4溶于100 mL水中)。
产物手性β-氨基醇含量的检测方法:将反应液用氢氧化钠溶液调pH至大于10,加氯化钠至饱和,用等体积含有20 mM十二烷的乙酸乙酯进行萃取,取上层有机相后用无水硫酸钠干燥,用气相色谱进行分析,所用色谱柱为HP-5柱(30 m × 0.320 mm × 0.25 mm;安捷伦科技公司),检测条件:进样口250 ℃,检测器275 ℃,柱温:丁胺醇、缬胺醇、苯甘氨醇、2-氨基-2-(4-氟苯基)乙醇柱温为120 ℃,保留时间10 min;2-氨基-2-(4-氯苯基)乙醇柱温为140 ℃,保留时间10 min;2-氨基-2-(4-溴苯基)乙醇柱温为150 ℃,保留时间10 min。
产物手性β-氨基醇对映体过量值(ee)的检测方法:检测前需要使用衍生剂对样品进行衍生,将反应液用氢氧化钠溶液调pH至大于10,加氯化钠到饱和,用等体积乙酸乙酯进行萃取,取有机相用无水硫酸钠干燥后将有机相移到新的1.5 mL离心管,加入50 μL含有50mg/mL的4-二甲氨基吡啶(DMAP)的醋酸酐溶液,在40 ℃、700 rpm下反应4 h后再加500 μL饱和NH4Cl溶液充分震荡混匀,离心取有机相,加入无水硫酸钠进行干燥,气相色谱检测,使用手性柱(CP Chirasil Dex CB,25 m × 0.32 mm × 0.25 μm;安捷伦科技有限公司)分析样品。检测条件:进样口温度250℃,检测器温度270℃,柱温为程序升温。对于丁胺醇(4a),柱温为由120 ℃以每分钟2 ℃的速度升温至160 ℃,保持10 min;对于缬胺醇,柱温为由100 ℃,以每分钟2 ℃的速度升温至120 ℃,保持3 min,然后每分钟2 ℃的速度升温至160 ℃,保持5 min;对于苯甘氨醇,柱温为由120 ℃以每分钟2 ℃的速度升温至160 ℃,保持20 min;对于2-氨基-2-(4-氟苯基)乙醇,柱温为由100℃以每分钟2 ℃的速度升温至120 ℃,然后以每分钟5 ℃的速度升温至160°C,保持22 min;对于2-氨基-2-(4-氯苯基)乙醇,柱温为由140 ℃以每分钟2 ℃的速度升温至180 ℃,保持20 min;对于2-氨基-2-(4-溴苯基)乙醇,柱温为由140 ℃以每分钟2 ℃的速度升温至180 ℃,保持30 min。底物的对映体过量值的计算公式为:;其中[R]、[S]分别代表底物R和S构型对映体在气相色谱图中各自的峰面积大小。
实验例1:构建重组表达载体:
SpEH基因上游引物为CGCGGATCCGATGAAGTCGAACATATCCG,下游引物为CCCAAGCTTTCAAAGATCCATCTGTGCAAAGGC;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,下划线部分为BamHI和HindIII酶切位点,再以质粒pET28a-SpEH为模板PCR扩增得到SpEH基因。PCR扩增体系为:灭菌蒸馏水40 µL,10×Taq plus buffer 5 µL,dNTPs 1 µL,模板1 µL,上游引物1 µL,下游引物1 µL,Taq plus DNA polymerase 1 µL。PCR条件如下:在PCR仪上于95℃预加热5分钟,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于94 ℃下保持45秒使模板变性,然后将温度降到复性温度65 ℃保持40秒,使引物与模板充分退火;在72℃保持1.5分钟,使引物在模板上延伸,合成DNA完成一个循环,重复这样的循环30次,使扩增的DNA片段大量累积。最后,在72℃保持10分钟,使产物延伸完整。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果表明扩增得到的基因大小与理论值一致,然后对PCR产物进行纯化操作。将纯化产物与质粒pRSFDuet使用相同的限制性内切酶BamHI和HindIII在37 ℃水浴中进行双酶切,时间一般为3-4小时。双酶切50 μL反应体系为:目的基因SpEH/表达载体pRSFDuet 15 μL,10×buffer 5 μL,内切酶各1 μL,灭菌蒸馏水28 μL。纯化回收双酶切产物,使用T4 DNA连接酶在4 ℃条件下连接目的基因SpEH和表达载体pRSFDuet,连接时间为7-8小时。酶连20 μL体系为:酶切后载体3 μL,酶切后目的基因7 μL,10×buffer for T4 ligase 2 μL,T4 DNAligase 2 μL,灭菌蒸馏水6 μL。得到重组表达载体pRSFDuet-SpEH。pRSFduet-SMO、pETduet-BDHA和pET28a-MVTA在本实验室以前的研究中已成功构建,故在本实验中直接使用。采用热击法将重组表达载体pRSFduet-SMO、pRSFDuet-SpEH、pETduet-BDHA、pET28a-GoSCR和pET28a-MVTA转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布含有卡那霉素(50 µg/mL)或氨苄青霉素(100 µg/mL)的LB固体培养基平板上,37 ℃培养过夜。待长出菌落后,随机挑取抗性平板上的单克隆转化子于含相应抗生素的LB液体培养基中,于37 ℃摇床培养12-16 h,提取质粒,进行质粒PCR以及双酶切验证。
将重组表达载体转化至宿主微生物中制得所述重组表达转化体。所述宿主微生物只要可以稳定的自行复制重组表达载体,且能有效的表达所携带的本发明的SMO、SpEH、BDHA、MVTA基因即可。本发明中采用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为宿主微生物。
实验例2:构建共表达载体
将基因SpEH连接到重组质粒pRSFDuet-SMO的另一个多克隆区,使用限制性内切酶NedI和XhoI对基因SpEH和重组质粒pRSFDuet-SMO进行双酶切,酶切条件与实验例1相同。然后使用T4 DNA连接酶在4 ℃条件下连接目的基因SpEH和表达载体pRSFDuet-SMO,构建重组质粒pRSFDuet-SMO-SpEH,采用热击法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于含有卡那霉素(50 µg/mL)的LB固体培养基平板上,37 ℃培养过夜。待长出菌落后,随机挑取抗性平板上的单克隆转化子于含相应抗生素的LB液体培养基中,于37 ℃摇床培养12-16 h,提取质粒,进行质粒PCR以及双酶切验证。
将基因MVTA连接到重组质粒pETduet-BDHA另一个克隆区域,使用限制性内切酶BamHI和HindIII对基因MVTA和重组质粒pETduet-BDHA进行双酶切,酶切条件与实验例1相同。然后使用T4 DNA连接酶在4 ℃条件下连接目的基因MVTA和表达载体pETduet-BDHA,构建重组质粒pETduet-BDHA-MVTA,采用热击法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于含有氨苄青霉素(100 µg/mL)的LB固体培养基平板上,37 ℃培养过夜。待长出菌落后,随机挑取抗性平板上的单克隆转化子于含相应抗生素的LB液体培养基中,于37 ℃摇床培养12-16h,提取质粒,进行质粒PCR以及双酶切验证。
实验例3:大肠杆菌重组菌的表达
对于大肠杆菌重组菌的表达本发明选用下述方法:将实验例1中构建好的菌株,接种至含有相对应抗生素(卡那霉素或氨苄青霉素)的LB培养基中,37 ℃,200 rpm振荡培养8 h,按2 %的接种量接入装有45 mL TB培养基的摇瓶中,加入5 mL的灭菌的磷酸缓冲液;37 ℃,200 rpm培养,当培养液的OD600达到0.6时加入终浓度为0.1 mM的IPTG,20 ℃,200 rpm诱导12 h。然后4 ℃,8000 rpm离心5 min收集菌体,用100 mM, pH为7.0的磷酸钠缓冲液洗涤两次。将获得的菌体用100 mM, pH为7.5的磷酸钠缓冲液悬浮,在冰浴条件下超声破碎,离心收集上清,即为粗酶液,进行SDS-PAGE电泳分析蛋白表达结果并测定其酶活。
共表达重组菌E.coli(SpEH-BDHA-GoSCR-MVTA)的表达,从实验例2构建成功的重组菌中分别提取重组质粒,将重组质粒pRSFDuet-SMO-SpEH和pETduet-BDHA-MVTA,通过热击法共同转入大肠杆菌BL21感受态细胞中,涂布于含有100 µg/mL氨苄霉素和50 µg/mL卡那霉素的平板上,37℃过夜培养。待长出菌落后,分别挑取平板上的单菌落于含有100 µg/mL氨苄霉素和50 µg/mL卡那霉素的培养基中培养和诱导表达。然后于4 ℃,8000 rpm离心5min收集菌体,用100 mM, pH为7.0的磷酸钠缓冲液洗涤两次,最后使用100 mM, pH7.5的磷酸钠缓冲液悬浮起来,进行SDS-PAGE电泳分析四种蛋白是否全部表达并进行活性检测。
实验例4:烯烃单加氧酶(SMO)、环氧化物水解酶(SpEH)、醇脱氢酶(BDHA)、转氨酶(MVTA)四酶级联催化烯烃化合物生成光学纯的β-氨基醇。
标准反应体系为5 mL的100 mM pH 7.5的磷酸钠缓冲液,含有20-50 mM环氧化物,0.1 mM PLP,10 %二甲基亚砜,25-55 mM的(R)-(+)-1-苯乙胺,0.5 mM NAD+,粗酶液SMO(蛋白浓度为10-20 mg/mL)、SpEH(蛋白浓度为10-20 mg/mL)、BDHA(蛋白浓度为20-40 mg/mL)和MVTA(蛋白浓度为10-20 mg/mL)。反应液置于50 mL摇瓶中,30℃,200 rpm振荡反应,隔不同时间取样测定转化率和ee值。取反应液300 μL,加入氯化钠至饱和,用等体积含有内标(20 mM的十二烷)的乙酸乙酯进行萃取,然后加入100 μL NaOH((0.1 M,10 N),调节pH至碱性,充分振荡混匀后,10000 rpm离心5 min,取有机相并用无水硫酸钠干燥,用气相色谱仪测定目标产物胺醇的含量;以4-二甲氨基吡啶在醋酸酐中的浓度为50 mg/mL作为衍生剂,在40℃、700 rpm下衍生有机相2-4小时,再与饱和氯化胺溶液混合均匀后离心,取有机相,并用无水硫酸钠干燥后,进行气相色谱分析测定目标产物手性胺醇ee值。所有实验皆重复进行2次。实验结果如表1中所示。
表1 组合使用SMO、SpEH、BDHA、GoSCR和MVTA粗酶液级联催化烯烃化合物不对称胺羟化合成(S)-β-氨基醇
实验例5:全细胞E.coli(SMO-SpEH-BDHA -MVTA)催化烯烃化合物不对称胺羟化合成对映体纯的苯甘氨醇。
将新制备的大肠杆菌E.coli(SMO-SpEH-BDHA -MVTA)细胞重新悬浮在5 mL 100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中,细胞密度为10-20 g cdw/L。标准反应混合物含有10-50 mM烯烃化合物1a-f,0.1 mM PLP,10%二甲基亚砜,15-55 mM (R)-(+)-1-苯乙胺,混合物在30℃下, 200 rpm进行反应。对于双液相反应体系,添加等量的十六烷。在不同的时间点提取反应液样品,以用于产品浓度和ee的分析,如上文实验例4中所述。所有实验均重复进行2次。实验结果如表2中所示。
表2 在水-有机相两相反应体系中使用重组菌E. coli (SMO-SpEH-BDHA-MVTA)(催化剂3)细胞进行反应催化烯烃化合物不对称胺羟化合成(S)-β-氨基醇
实验例6:全细胞E.coli(SMO-SpEH-BDHA -MVTA)催化外消旋苯乙烯制备手性(S)-β-氨基醇.
将新制备的大肠杆菌E.coli(SMO-SpEH-BDHA -MVTA)细胞重新悬浮在100 mL 100 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中,细胞密度为20 g cdw/L。使用水-有机相双相反应体系,有机相添加等量的十六烷, 50 mM苯乙烯(1c),0.1 mM PLP, 55 mM (R)-(+)-1-苯乙胺,30℃,200rpm的条件下振荡反应。反应24 h后水相和有机相分离,水相中加入NaOH调节pH至12,加入100mL乙酸乙酯进行萃取,连续萃取3次,合并有机相,减压蒸馏,过硅胶柱得到纯品产物(S)-β-氨基醇(80%分离得率,>99% ee)。
Claims (10)
1.一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:以烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH和转氨酶TA为生物催化剂,以烯烃为底物,在磷酸盐缓冲液中反应,合成手性β-氨基醇。
2.根据权利要求1所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述反应体系中:重组大肠杆菌E. coli(SMO)表达烯烃单加氧酶SMO,反应后的产物为手性环氧化物;重组大肠杆菌E. coli(EH)表达环氧化物水解酶EH,反应后的产物为对映纯二醇;重组大肠杆菌E. coli(ADH)表达醇脱氢酶,反应后的产物为羟酮化合物;E. coli(TA)表达转氨酶,反应后的产物为S-构型的β-氨基醇或R-构型的β-氨基醇。
3.根据权利要求1所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述反应体系中:重组大肠杆菌E.coli(SMO-EH-ADH-TA)同时表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA的全细胞,反应后的产物为S-构型的β-氨基醇或R-构型的β-氨基醇。
4.根据权利要求2或3所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:具体步骤为:
(1)构建重组菌株E. coli (SMO) 、E. coli (EH)、E. coli (ADH)、E. coli (TA),高效表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA,得到SMO、EH、ADH和TA的粗酶液;
(2)将环氧化物水解酶EH作为催化剂,对不同的环氧化物进行水解,确定其底物特异性和对映体选择性;使用醇脱氢酶对不同二醇进行氧化活性以及反应中的副产物苯乙酮还原性检测,确定0.80 U mg-1醇脱氢酶RADH对二醇的活性最高,0.428 U mg-1对苯乙酮的活性中等;
(3)将转氨酶TA作为催化剂,转化羟酮生成β-氨基醇,确定产物得率以及ee;将烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA以不同比例混合作为生物催化剂,加入终浓度为20-50 mM的烯烃化合物作为底物,终浓度为25-55 mM的(R)-(+)-1-苯乙胺,终浓度为0.1 mM的5′-磷酸吡哆醛PLP,在0.1-0.5 mM NAD+的存在下,检测烯烃转化生成相对应的手性β-氨基醇;
(4)构建共表达烯烃单加氧酶SMO、环氧化物水解酶EH、醇脱氢酶ADH、转氨酶TA的工程菌株E. coli (SMO-EH-ADH-TA),获得重组菌株E. coli (SMO-EH-ADH-TA)的全细胞;
(5)将重组菌E. coli (SMO-EH-ADH-TA) 静息细胞作为生物催化剂,细胞用量为10-25g cdw/L,加入终浓度为10-100mM的烯烃化合物作为底物,终浓度为15-110 mM的氨基供体,终浓度为0.1-1.0 mM的5′-磷酸吡哆醛PLP,10 %二甲基亚砜,终浓度为0.5 mM的NAD+,浓度为0.1 M、pH7.5的磷酸钠缓冲液作为反应介质,对于2相体系反应,添加等量有机相,有机相为正己烷、乙酸乙酯或十六烷有机试剂;反应温度为0-50℃,反应6-24 h,通过全细胞催化合成手性β-氨基醇;
(6)反应液的分离:反应结束后,将反应液用氢氧化钠溶液调节pH>10,用等体积乙酸乙酯萃取出手性β-氨基醇。
5.根据权利要求4所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述底物为苯乙烯、4-氟苯乙烯、4-氯苯乙烯或4-溴苯乙烯中任意一种烯烃化合物。
6.根据权利要求4所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述级联生物催化合成反应均在搅拌转速200-300 rpm条件下进行。
7.根据权利要求4所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述的烯烃单加氧酶、环氧化物水解酶EH和醇脱氢酶SADH和RADH来自微生物、动物或植物。
8.根据权利要求4所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述氨基供体为含有氨基的任一化合物。
9.根据权利要求8所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述氨基供体为(R)-(+)-1-苯乙胺。
10.根据权利要求4所述的一种级联生物催化烯烃不对称胺羟化制备手性β-氨基醇的方法,其特征在于:所述烯烃单加氧酶、环氧化物水解酶和醇脱氢酶为 (R)-选择性或(S)-选择性。
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