CN112458122B - 一种用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法，涉及生物催化技术领域。本发明技术方案主要用SMO、FAD、EH三种基因工程菌全细胞催化或SMO、FAD、GDH、EH四种基因工程菌全细胞混合催化底物正己烯，并进行水解最终得到己二醇。本发明技术方案生成己二醇的方法，具有反应温和，污染小，无毒副产物生成，转化率高，生产效率高，生产成本低等特点。

Description

一种用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，更具体地说，它涉及一种基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法。
背景技术
1，2-己二醇（Cas No：6920-22-5）是一种无色透明，有刺激性气味的液体，性能独特，能以任何比例与多种有机化合物混合，无腐蚀性。己二醇还可衍生出一系列新型精细化学品，广泛用于制造高级化妆品，多用途高级清洁剂，彩色喷墨打印机油墨。另外，己二醇还可应用于高级墨水，高级油漆，涂料，高级胶水，粘结剂溶剂及软化剂，可制造1,2-己二酸及氨基醇等产品。
近几年来，由于1，2-己二醇的优良特性，使其在化妆品及一些日化产品中得到了非常广泛的应用。1，2-己二醇是国内第一批被批准可以在化妆品中使用的添加剂，使用最高含量可以达到0.5%。1，2-己二醇作为小分子保湿剂，具有润滑，抑菌的效果，常用于婴儿用品、沐浴用品、眼妆、清洁产品、护肤产品和护发产品。此外，1，2-己二醇也是《欧盟化妆品条例规定》中可以用于化妆品和个人护理产品的三种产品之一。目前，宝洁公司已将1，2-己二醇添加到除臭剂和止汗剂产品中，得到的除臭剂和止汗剂在除臭及止汗效果更出色，且皮肤透明度感觉更好，对皮肤温和。美国奥秀索芙特将1，2-己二醇添加到眼睑擦洗液中，奇华顿公司将1，2-己二醇添加到皮肤护理组合物中，代替其他杀菌防腐剂使用。陶氏环球技术公司用1，2-己二醇代替酒精添加到香水中，一方面减少对皮肤的刺激，另一方面由于其优异的溶剂和增溶能力，在减少表面活性剂使用的情况下同样能得到稳定性较高的产品。
1，2-己二醇目前的市场份额较小。由于是HDO中的新型产品，因此也具有非常诱人的销售价格（180000每吨）。目前，1，2-己二醇在全球范围内仅有美国的 Across公司、捷克和斯洛伐克的 Agrofert公司有少量的生产，国内尚无专业生产厂家。
目前，制备1，2-己二醇的方法主要是化学方法。这些方法包含多种合成路线，在这些路线中所用到原料包含正己烯，羧酸，杂环酯类化合物等。综合原料来源﹑工艺条件﹑环保要求等因素，目前应用最多的还是以正己烯为起始物合成 1，2-己二醇，该路线大多为两步: 环氧化和水解，第一步正己烯被环氧化生成丁基环氧乙烷，第二步丁基环氧乙烷进一步水解生成目标产物 1，2-己二醇，如下所示，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
1，2-乙二醇的化学合成路线
公开号为CN107903146A，名称为一种催化氧化1-己烯制备1，2-己二醇的方法的中国专利公开了一种催化氧化正己烯制备1，2-己二醇的方法，其以甲酸为反应介质，双氧水为氧化剂，原位得到过氧化甲酸，在催化剂MVO2dipic的作用下将1-己烯氧化为环氧化合物，经过水解、分离提纯后得到1，2-己二醇。
在化学路线中，相比于第二步水解反应，烯烃的环氧化方法有很多，根据不同的氧化剂有以下可能方法：(1)氯醇环氧化法；(2)有机过氧酸法；(3)H2O2 氧化法；(4)氧气氧化法；(5)有机氧化物法；(6)无机物氧化法； (7)电化学法等。
化学法最大的优点是反应效率高，底物载量和产量一般比酶法要高，但是生产过程中会使用比较苛刻的反应条件，同时有毒有害的催化剂添加剂也会对产品造成污染。此外，在愈加严苛的环保法律监控下，化学法生产遭遇的成本压力及舆论压力也愈来愈巨大。正因为如此，跨国化工巨头巴斯夫关闭了生产HDO的美国工厂，间接造成了HDO相关产品的价格飞涨。
酶促生物转化是有机合成领域的先进技术，作为绿色催化的酶促生物转化，反应过程温和，无污染或者低污染，在蛋白质工程改造酶催化剂的助力下，反应的效率及底物载量不逊于化学法，目前是各个化工巨头大力发展的技术领域。
本发明设计了利用生物酶法进行1,2己二醇的合成方法，其基本路线以及主要底物是和化学方法重合的。本发明合成线路为两步: 酶促催化的环氧化和水解，第一步正己烯被环氧化酶催化生成丁基环氧乙烷，第二步丁基环氧乙烷通过环氧化物水解酶催化水解生成目标产物 1，2-己二醇，本发明合成线路如下所示，
Figure 548367DEST_PATH_IMAGE002
1，2-己二醇的酶促合成路线
发明内容
本发明的目的是提供一种用基因工程菌制备己二醇的方法，以达到减少杂质，节约成本、提高效率及减少污染等目的。
本发明提供了一种用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法，其制备步骤如下：
1）取SMO、FAD、EH三种基因工程菌全细胞催化剂或SMO、FAD、GDH、EH四种基因工程菌全细胞催化剂混合，每毫升反应体系中混合基因工程菌的用量为0.5～1.2 g；
2）用50 mM，pH6.0～7.0的PBS缓冲液或pH9.0的Tris-HCl重悬步骤1)混合菌后，加入底物正己烯反应，正己烯用量为0.5～5%，所述百分比为重量体积比；
3）反应温度为30～50℃，反应时间为8～16 h，生成己二醇。
所述苯乙烯单加氧酶(SMO)，黄素还原酶(FAD)，葡萄糖脱氢酶(GDH)，环氧化物水解酶(EH)的基因工程菌比例为1～2:1:0～1:0.1。
上述用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法，其基因工程菌全细胞催化剂菌株的制备方法为将种子培养基37℃，200rpm过夜活化，按10%比例接种到发酵培养基，37℃、200rpm培养至对数中期，加入诱导剂乳糖至终浓度1 mM，25～30℃、180rpm 诱导培养4～6h，离心收集菌体。
所述种子培养基为LB培养基配方如下：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L，NH3·H2O 调节至pH 7.0，在121℃灭菌20 min。
所述发酵培养基是TB培养基，配方如下：蛋白胨12 g/L、酵母膏24 g/L、甘油4 ml/L，定容到900 mL，同时配制100 mL 0.17 M的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾溶液，115℃灭菌20min，灭完菌两种溶液混合后待用。
所述SMO基因工程菌，其含有如SEQ.No.1所示核苷酸序列。
所述FAD基因工程菌，其含有如SEQ.No.2所示核苷酸序列。
所述GDH基因工程菌，其含有如SEQ.No.3所示核苷酸序列。
本发明还提供了上述SMO基因工程菌的制备方法，其通过基因工程PCR的方法得到Pseudomonas putida的SMO基因，基因产物序列号为ABX24519.1，并在基因两端加上NdeI和SacI酶切位点，并将基因构建到pET30a中，获得基因的高表达载体pET30SMO，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到所述的高产SMO酶的基因工程菌。
本发明提供了上述FAD基因工程菌的制备方法，其通过基因工程PCR的方法得到Pseudomonas putida的FAD基因，基因产物序列号为ABX24520.1，并在基因两端加上NdeI和SacI酶切位点，并将基因构建到pET30a中，获得基因的高表达载体pET30FAD，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到所述的高产FAD酶的基因工程菌。
本发明提供了上述GDH基因工程菌的制备方法，其通过基因工程PCR的方法得到Bacillus megaterium的GDH基因，基因产物序列号为AJI21421.1，并在基因两端加上NdeI和SacI酶切位点，并将基因构建到pET30a中，获得基因的高表达载体pET30GDH，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到所述的高产GDH酶的基因工程菌。
通过采用上述基因工程菌全细胞催化制备己二醇的技术方案，无任何副产物生成，显示了良好的工业利用潜力，达到减少杂质，节约成本的目的。
本发明具有以下有益效果：全细胞催化剂催化底物转化率能达到90%，与目前工业上通过化学法制备己二醇的方法相比，绿色环保，无副产物生成，可大幅降低有毒有害化合物的使用，生产效率高。
附图说明
图1为SMO、FAD、GDH三种基因工程菌全细胞催化剂的酶表达；
图2为用SMO和FAD混合工程菌全细胞催化正己烯制备环氧己烷的气相色谱分析图；
图3为用SMO，FAD和GDH（1:1:1）基因工程菌全细胞催化正己烯制备环氧己烷的气相色谱分析图；
图4为用SMO，FAD和GDH（2:1:1）基因工程菌全细胞催化正己烯制备环氧己烷的气相色谱分析图；
图5为用SMO，FAD，GDH和EH（2:1:1:0.1）混合工程菌全细胞催化转化正己烯制备己二醇的气相色谱分析图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，如无特别说明，本发明中所使用的试剂和耗材均为市购获得的常规产品。
实施例1 一种制备SMO酶的基因工程菌的方法
根据Pseudomonas putida的SMO基因的序列设计引物：
正向引物：GGGAATTCCATATGatgaaaaagcgtatcggtattgttg，下划线序列为酶切位点NdeI。
反向引物：CGAGCTCggccgcaatagtgggtgcgtactggct，下划线序列为SacI酶切位点。基因产物序列号为ABX24519.1。
PCR得到的基因序列两端带有NdeI、SacI两个位点，将基因插入到pET30a载体中，得到的高表达的基因工程载体质粒命名为pET30SMO，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，得到高产SMO酶的基因工程菌，得到的基因工程菌表达出的蛋白在C端带有His-Tag标签蛋白。
本方法高产SMO酶的基因工程菌表达出的目的蛋白能达到全蛋白的15～20％，实现了目的蛋白的高效异源表达。
此外供体菌为含有SMO基因的假单胞菌属、青枯菌属、红球菌属、芽孢杆菌属等菌属。
高表达菌株的获得：将制备得到的重组载体用常规方法导入大肠杆菌BL21(DE3)以构建重组酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好，以目的蛋白表达量不低于18％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。
具体转化方法如下：从冰箱中取出100 μL的感受态细胞，将细胞在冰上融化2-5min，后轻弹管壁1-2次以重悬细胞。将1 μL的pET30SMO质粒加入感受态细胞中，轻微摇动混和，随后将管重置于冰中，冰浴30 min，后42℃水浴90 s，然后迅速将管转移到冰上放置2min，使细胞冷却。再向每个离心管中加入500 μL无菌无抗的LB 培养基，混匀后置于37℃，150rpm摇床振荡培养45 min，使菌体复苏，后吸取100 μL加到含有100 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，用玻璃刮轻轻涂匀，将平板放置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 h，获得高表达的基因工程菌：大肠杆菌BL21(DE3)（pET30SMO）。
全细胞催化剂的制备过程如下：
(1) 种子培养基活化挑取培养皿上的单菌落于5 mL， 含100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm过夜活化。
(2) 发酵培养将过夜活化的种子液分别按10%比例接种到800 mL，含100 g/mL卡那霉素的TB发酵培养基，37℃、200rpm培养至对数中期OD600＝0.6～1。
(3) 诱导培养对数中期时加入乳糖进行诱导，使其终浓度为1 mM，25～ 30℃、180rpm 诱导培养4～6 h，离心收集细胞。
(4)SDS-PAGE 取将诱导完成的发酵液0.5 mL，12000rpm离心90 s， 加入200 μL上样缓冲液； SDS-PAGE分离胶浓度为12.5％，每孔上样5μL。SMO酶的蛋白表达见图1。
实施例2 一种制备FAD酶的基因工程菌的方法
根据Pseudomonas putida的FAD基因的序列设计引物：
正向引物：GGGAATTCCATATGgtgattcaaatgacgttaaaaaa，下划线序列为酶切位点NdeI。
反向引物：CGAGCTCattcagcggcaacgggttgccgtgataac，下划线序列为SacI酶切位点。基因产物序列号为ABX24520.1。
PCR 得到的基因序列两端带有NdeI、SacI两个位点，将基因插入到pET30a载体中，得到的高表达的基因工程载体质粒命名为pET30FAD，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，得到高产FAD酶的基因工程菌，得到的基因工程菌表达出的蛋白在C端带有His-Tag标签蛋白。
本发明高产FAD酶的基因工程菌表达出的目的蛋白能达到全蛋白的8～15％，实现了目的蛋白的高效异源表达。
此外供体菌为含有FAD基因的假单胞菌属、青枯菌属、红球菌属、芽孢杆菌属等菌属。
高表达菌株的获得：将制备得到的重组载体用常规方法导入大肠杆菌BL21(DE3)以构建重组酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好，以目的蛋白表达量不低于10％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。
具体转化方法如下：从冰箱中取出100 μL的感受态细胞，将细胞在冰上融化2-5min，后轻弹管壁1-2次以重悬细胞。将1 μL的pET30FAD质粒加入感受态细胞中，轻微摇动混和，随后将管重置于冰中，冰浴30 min，后42℃水浴90 s，然后迅速将管转移到冰上放置2min，使细胞冷却。再向每个离心管中加入500 μL无菌无抗的LB培养基，混匀后置于37℃，150rpm摇床振荡培养45 min，使菌体复苏，后吸取100 μL加到含有100 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，用玻璃刮轻轻涂匀，将平板放置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 h，获得高表达的基因工程菌：大肠杆菌BL21(DE3)（pET30FAD）。
全细胞催化剂制备过程同实施例1。FAD酶的蛋白表达见图1。
实施例3 一种制备GDH酶的基因工程菌的方法
根据Bacillus megaterium的GDH基因的序列设计引物：
正向引物：GGGAATTCCATATGATGTATACAGATTTAAAAGATAA，下划线序列为酶切位点NdeI。
反向引物：CGAGCTCGCCTCTTCCTGCTTGGAAA，下划线序列为SacI酶切位点。基因产物序列号为AJI21421.1。
PCR 得到的基因序列两端带有NdeI、SacI两个位点，将基因插入到pET30a载体中，得到的高表达的基因工程载体质粒命名为pET30GDH，然后将高表达载体转化入受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，得到高产FAD酶的基因工程菌，得到的基因工程菌表达出的蛋白在C端带有His-Tag标签蛋白。本方法高产GDH酶的基因工程菌表达出的目的蛋白能达到全蛋白的20～30％，实现了目的蛋白的高效异源表达。
高表达菌株的获得：将制备得到的重组载体用常规方法导入大肠杆菌BL21(DE3)以构建重组酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌，其中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好，以目的蛋白表达量不低于25％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。
具体转化方法如下：从冰箱中取出100 μL的感受态细胞，将细胞在冰上融化2-5min，后轻弹管壁1-2次以重悬细胞。将1 μL的pET30GDH质粒加入感受态细胞中，轻微摇动混和，随后将管重置于冰中，冰浴30 min。42℃水浴90 s，然后迅速将管转移到冰上放置2min，使细胞冷却。再向每个离心管中加入500 μL无菌无抗的LB培养基，混匀后置于37℃，150rpm摇床振荡培养45 min，使菌体复苏，后吸取100μL加到含有100μg/m卡那霉素的LB固体培养基上，用玻璃刮轻轻涂匀，将平板放置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 h，获得高表达的基因工程菌：大肠杆菌BL21(DE3)（pET30GDH）。
全细胞催化剂制备过程同实施例1。GDH酶的蛋白表达见图1。
实施例4 制备SMO和FAD全细胞催化剂以及用两种混合全细胞催化剂转化正己烯产生环氧己烷
1、SMO和FAD全细胞催化剂的制备方法相同，均采用下述制备方法：
(1) 种子培养基活化挑取培养皿上的单菌落于5 mL，含有100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜活化。种子培养基是常规的LB培养基，配方如下：蛋白胨10g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10g/L，NH3·H2O 调节至pH 7.0，平板培养基为LB培养基再加入15g/L琼脂粉，在121℃灭菌20 min。
(2) 发酵培养将过夜活化的种子液分别按10%比例接种到800 mL，含有100 μg/mL卡那霉素的TB发酵培养基，37℃，200rpm培养至对数中期OD600＝0.6～1。发酵培养基是常规的TB培养基，配方如下：蛋白胨12 g/L、酵母膏24 g/L、甘油 4 ml/L，定容到900 mL，同时配制100 mL 0.17 M的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾溶液，115℃灭菌20 min，灭完菌两种溶液混合后待用。
(3) 诱导培养对数中期时加入乳糖进行诱导，使其终浓度为1 mM，25～30℃，180rpm诱导培养4～6 h，8000rpm，10 min离心收菌。
混合的全细胞催化剂具有高活性和无需加入昂贵的辅酶的特点，实现了辅酶的自循环利用，使得底物转化反应效率高，底物转化率达到90%。
2、利用SMO和FAD两种混合全细胞催化剂转化正己烯产生环氧己烷的方法：分别称取0.5g两种全细胞催化剂菌体，用2 mL 50 mM，pH 6.0 PBS缓冲液重悬，每毫升反应体系中混合全细胞催化剂的用量为0.5 g。加入终浓度为0.5%（W/V）的底物正己烯，转化反应温度为30℃，200rpm 下转化16 h，生成环氧己烷。使用气相色谱分析检测生成的产品环氧己烷，转化率为90%，结果见附图2。
气相色谱分析条件如下：
色谱柱为Agilent HP-5（0.2mm×30m），恒定温度40℃，进样口和检测器温度都为280℃，进样量2μL。
实施例5 制备SMO，FAD和GDH全细胞催化剂以及用三种混合全细胞催化剂转化正己烯产生环氧己烷
SMO，FAD和GDH三种全细胞催化剂制备方法同实施例4。
利用SMO，FAD和GDH三种混合全细胞催化剂转化正己烯产生环氧己烷：分别称取1.6g三种全细胞催化剂菌体，用4 mL 50 mM， pH 9.0 Tris-HCl缓冲液重悬，加入终浓度为5%（W/V）的底物正己烯，转化反应温度为50℃，200rpm 下转化8 h，生成环氧己烷。每毫升反应体系中混合全细胞催化剂的用量为1.2 g。使用气相色谱分析检测生成的产品环氧己烷，气相色谱分析条件同实施例4，转化率为70%，结果见附图3。
实施例6 用三种混合全细胞催化剂转化正己烯产生环氧己烷
利用SMO，FAD和GDH三种混合全细胞催化剂转化正己烯产生环氧己烷：分别称取1.2 gSMO，0.6 gFAD和0.6 gGDH全细胞催化剂混合，用4 mL 50 mM ，pH 7.0 PBS缓冲液重悬，加入终浓度为5%（W/V）的底物正己烯，转化反应温度为37℃，200rpm下转化16 h，生成环氧己烷。每毫升反应体系中混合全细胞催化剂的用量为0.6 g。使用气相色谱分析检测生成的产品环氧己烷，气相色谱分析条件同实施例4，转化率为90%，结果见附图4。
实施例7 用SMO，FAD和GDH三种全细胞催化剂转化正己烯产生环氧己烷及EH基因工程菌催化水解环氧己烷得到己二醇：
EH基因工程菌，为现有技术的工程菌，具体菌和制备方法可以参考申请号为201811353198.6的中国专利申请。
分别称取1.2 g SMO，0.6 gFAD，0.6 gGDH和0.12 g EH全细胞菌体混合，用4 mL50 mM ，pH 7.0PBS缓冲液重悬，加入终浓度为5%（W/V）的底物正己烯，转化反应温度为37℃，200rpm下转化8 h，生成己二醇。每毫升反应体系中混合全细胞催化剂的用量为0.6 g。
使用气相色谱分析检测生成的产品己二醇，气相色谱分析条件同实施例4，正己烯转化率为90%，环氧己烷转化率为90%，最终转化率80%，结果见附图5。
实施例4至实施例6，均可以通过加入EH基因工程菌水解环氧己烷得到己二醇。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司
<120> 一种用基因工程菌制备己二醇的方法
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atgaaaaagc gtatcggtat tgttggtgca ggcactgccg gcctccatct tggcctcttc 60
ctccgccagc atgacgtcga cgtcactgtg tacactgatc gtaagcccga tgagtacagt 120
ggactgcggc tcctgaatac cgttgctcac aacgcggtga cggtgcagcg ggaggttgcc 180
ctcgacgtca atgagtggcc gtctgaggag tttggctatt tcggccacta ctactacgta 240
ggtgggccgc agcccatgcg tttctacggt gatctcaagg ctcccagccg tgcagtggac 300
taccgtctct acctgccgat gctgatgcgt gcactggaag ccaggggcgg caagttctgc 360
tacgacgccg tgtctgccga agatctggaa gggctgtcgg agcagtatga tctgctggtt 420
gtgtgcactg gtaaatacgc cctcggcaag gtgttcgaga agcagtccga aaactcgccc 480
ttcgagaagc cgcaacgggc actgtgcgtt ggtctcttca agggcatcaa ggaagcaccg 540
attcgcgcgg tgactatgtc cttctcgcca gggcatggcg agctgattga gattccaacc 600
ctgtcgttca atggcatgag cacagcgctg gtgctcgaaa accatattgg tagcgatctg 660
gaagtcctcg cccacaccaa gtatgacgat gacccgcgtg cgttcctcga tctgatgctg 720
gagaagctgc gtaagcatca tccttccgtt gccgagcgca tcgatccggc tgagttcgac 780
ctggccaaca gttctctgga catcctccag ggcggtgttg tgccagtatt ccgcgacggt 840
catgcgaccc tcaataacgg caaaaccatc atcgggctgg gcgacatcca ggcaactgtc 900
gatccggtct tgggccaggg cgcgaacatg gcgtcctatg cggcatggat tctgggcgag 960
gaaatccttg cgcactctgt ctacgacctg cgcttcagcg aacacctgga gcgtcgccgc 1020
caggatcgcg tgctgtgcgc cacccgctgg accaacttca ctctgagcgc cttcacggaa 1080
cttccgccgg aattcctcac cttccttcag atcctgagcc agagccgtga aatggctgat 1140
gagttcacgg acaacttcaa ctatccggaa cttcagtggg atcgcttctc cagcccggaa 1200
cgtatcggtc agtggtgcag ccagtacgca cccactattg cggcctga 1248
<210> 2
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gtgattcaaa tgacgttaaa aaaagatgtg gtggtggata tcgactccac cagcttccgc 60
caggcggttg cactgttcgc gacgggaatt gcggttctca gcgcggagac tgacgagggc 120
gaagtgcatg gcatgacggt gaacagcttc acctccatca gtctggaccc gccgactgtg 180
atggtgtccc tgaagtcggg ccgtatgcat gagctgctga ctcaaggcgg acgcttcggc 240
gtcagcctcc tgggtgaaag tcagaagatg ttatcggcat tcttcagcaa gcgtgtgatc 300
gatggcactc ctcctcctgc tttcacagtt caggccggcc tccccactct gcgggacgcc 360
atggcctggt tcgaatgcga ggtggagagc acggttgaag tacacgacca cacgctcttc 420
attgcgcgcg ttagcgcctg tggagtgccg gaggcgaatg ccccccagcc gctgctgttc 480
tttgccagcc gttatcacgg caacccgttg ccgctgaat 519
<210> 3
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atgtatacag atttaaaaga taaagtagtt gtaattacag gtggatcaac aggtttagga 60
cgcgcaatgg ctgttcgttt cggtcaagaa gaagcaaaag ttgttattaa ctattacaac 120
aatgaagaag aagctttaga tgcgaaaaaa gaagtagaag aagcaggcgg acaagcaatc 180
atcgttcaag gcgacgtaac aaaagaagaa gatgttgtaa accttgttca aacagctatt 240
aaagaattcg gtacattaga cgttatgatt aataacgctg gtgttgaaaa cccagttcct 300
tctcatgagt tatctttaga caactggaat aaagtaatcg atacaaactt aacgggcgca 360
tttttaggaa gccgcgaagc gattaaatat tttgttgaaa acgacattaa aggaaacgtt 420
attaacatgt ctagtgttca tgaaatgatt ccttggccat tatttgttca ttacgcagca 480
agtaaaggcg gtatgaaact aatgacgaaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540
atccgcgtaa ataacattgg accaggtgcg atgaacacac caattaacgc agagaaattt 600
gcagatcctg tacaacgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggtta catcggtaaa 660
ccagaagaag tagcagcagt tgcagcattc ttagcatcat cacaagcaag ctatgtaaca 720
ggtattacat tatttgctga tggtggtatg acgctgtacc cttctttcca agcaggaaga 780
ggctaa 786

Claims (4)

1.一种用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法，其特征在于，制备步骤如下：
1）取SMO苯乙烯单加氧酶、FAD黄素还原酶、EH环氧化物水解酶三种基因工程菌全细胞催化剂或SMO苯乙烯单加氧酶、FAD黄素还原酶、GDH葡萄糖脱氢酶、EH环氧化物水解酶四种基因工程菌全细胞催化剂混合，每毫升反应体系中混合基因工程菌全细胞催化剂的用量为0.5～1.2 g；
2）用50 mM，pH6.0～7.0的PBS缓冲液或pH9.0的Tris-HCl重悬步骤1）混合菌后，加入底物正己烯反应，正己烯用量为0.5～5%，所述百分比为重量体积比；
3）反应温度为30～50℃，反应时间为8～16 h，生成己二醇，
所述SMO苯乙烯单加氧酶基因工程菌，含有如SEQ.No.1所示的核苷酸序列，所述FAD黄素还原酶基因工程菌，含有如SEQ.No.2所示的核苷酸序列，所述GDH葡萄糖脱氢酶基因工程菌，含有如SEQ.No.3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法，其特征在于：所述SMO苯乙烯单加氧酶、FAD黄素还原酶、GDH葡萄糖脱氢酶、EH环氧化物水解酶四种基因工程菌全细胞催化剂的比例为1～2:1:0～1:0.1。
3.根据权利要求1或2所述用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法，其特征在于：基因工程菌全细胞催化剂菌株的制备方法均为：将种子培养基37℃，200rpm过夜活化，按10%比例接种到发酵培养基，37℃、200rpm 培养至对数中期，加入诱导剂乳糖至终浓度1mM，25～30℃、180rpm 诱导培养4～6 h，离心收集菌体。
4.根据权利要求3所述的用基因工程菌全细胞催化制备己二醇的方法，其特征在于：所述种子培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L ，NH3·H2O调节至pH 7.0，在121℃灭菌20 min；所述发酵培养基是TB培养基，配方如下：蛋白胨12 g/L、酵母膏24 g/L、甘油4 ml/L，定容到900 mL，同时配制100 mL 0.17 M的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾溶液，115℃灭菌20 min，灭完菌两种溶液混合后待用。
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