CN109321509A

CN109321509A - 一种利用全细胞转化生产1,2-氨基醇类化合物的方法

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Publication number: CN109321509A
Application number: CN201811344825.XA
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 刘松; 高仁杰; 张显; 杨套伟; 徐美娟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-11-13
Also published as: US11060076B2; CN109321509B; US20200149077A1

Abstract

本发明公开了一种利用全细胞转化生产1,2‑氨基醇类化合物的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的大肠杆菌工程菌共表达了环氧化物水解酶、醇脱氢酶、ω‑转氨酶以及谷氨酸脱氢酶，可一步全细胞催化环氧化物合成1,2‑氨基醇类化合物，同时，可实现辅酶NADP⁺和氨基供体L‑Glu的再生；本发明大肠杆菌工程菌所表达的醇脱氢酶为经RBS优化的醇脱氢酶，此RBS优化可控制醇脱氢酶的表达量，使醇脱氢酶和转氨酶的催化速率达到最佳配比，以去除催化途径中限速步骤带来的影响；利用本发明的方法，可以多种环氧化物为底物进行全细胞转化制备出相对应的1,2‑氨基醇类化合物，具有重要的工业应用价值。

Description

一种利用全细胞转化生产1,2-氨基醇类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种利用全细胞转化生产1,2-氨基醇类化合物的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

手性邻氨基醇类化合物(1,2-氨基醇类化合物)是一种重要的医药中间体，它既可用于合成多种具有生理活性的药物，如用作治疗抗心绞痛抑制剂的拉洛来静(Randolazine)、用作治疗许多心血管疾病的美托洛尔(Metoprolol)以及同样用作治疗许多心血管疾病的奈必洛尔(Nebivolol)，也可作为不对称合成中手性催化剂的配体或作为合成手性化合物中的手性砌块，因此，手性邻氨基醇类化合物(1,2-氨基醇类化合物)在医药、化学合成等领域均具有重要的应用。

目前，1,2-氨基醇类化合物的制备主要通过化学合成法和生物转化法。其中，化学合成法虽然工艺成熟，但反应条件剧烈，且会生成许多副产物，有时还需要利用一些会对环境造成污染的有机溶剂；相比之下，生物转化法的条件就相对温和，安全且成本低，另外，生物转化法生成的1,2-氨基醇类化合物具有光学纯度高，特异性强，副产物少等优点，因此，近年来生物法制备1,2-氨基醇类化合物得到了广泛关注。

在1,2-氨基醇类化合物的生物合成方面，国外起步较早，2006年，Iwasaki等利用产(R)-转氨酶的节杆菌(Arthrobacter sp.)，结合全细胞转化的方式，以3,4-二甲氧基苯丙酮作为底物，(R)-1-苯乙胺作为氨基供体，成功地合成了(R)-3,4-二甲氧基安非他命[(R)-DMA]，且转化率达到82％，ee值大于99％，但是，此方法存在底物价格高、转化时间长(20h以上)、有副产物生成等的缺陷；2016年，韩国的Shuke Wu利用共表达了恶臭假单孢菌Gpo1来源醇脱氢酶和紫色色杆菌来源ω-转氨酶的大肠杆菌，结合全细胞转化的方式，以邻二醇作为底物，成功催化得到了多种芳香族1,2-氨基醇类化合物，且转化率达到65％以上，但是，此方法也存在底物价格高、摩尔转化率低、中间产物易积累等的缺陷，这些缺陷均大大限制了1,2-氨基醇类化合物的应用。

因此，有必要寻找一种稳定高效且成本低廉的制备1,2-氨基醇化合物的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌以及利用此大肠杆菌工程菌全细胞转化生产1,2-氨基醇类化合物的方法。本发明的大肠杆菌工程菌共表达了环氧化物水解酶(SpEH)、醇脱氢酶(MnADH)、ω-转氨酶(PAKω-TA)以及谷氨酸脱氢酶(GluDH)，可一步全细胞催化环氧化物合成1,2-氨基醇类化合物，且可同时实现合成1,2-氨基醇类化合物过程中所必需的辅酶NADP⁺和氨基供体L-Glu的再生；本发明的大肠杆菌工程菌所表达的醇脱氢酶(MnADH)为经RBS优化的醇脱氢酶(MnADH)，此RBS优化可控制醇脱氢酶的表达量，使醇脱氢酶和转氨酶的催化速率达到最佳配比，以去除催化途径中限速步骤带来的影响；利用本发明的方法，可以多种环氧化物(如环氧苯乙烷、环氧丙烷以及环氧丁烷等)为底物进行全细胞转化制备出相对应的1,2-氨基醇类化合物；利用本发明的方法制备1,2-氨基醇类化合物，操作方便、底物廉价，且转化过程中不需要添加任何辅因子和氨基供体，不仅能提高转化效率，同时也降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。

本发明的技术效果如下：

本发明提供了一种大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌包含重组质粒A、重组质粒B以及表达宿主；所述重组质粒A包含目的基因A以及表达载体；所述重组质粒B包含目的基因B、目的基因C以及表达载体；所述目的基因A为编码环氧化物水解酶(SpEH)的基因；所述目的基因B为编码醇脱氢酶(MnADH)的基因；所述目的基因C为编码ω-转氨酶(PAKω-TA)的基因；所述表达宿主为大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶(SpEH)来源于鞘氨醇单胞菌HXN-200(Sphingomonas sp.HXN-200)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述环氧化物水解酶(SpEH)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶(MnADH)来源于新金分支杆菌(Mycobacterium neoaurum)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述醇脱氢酶(MnADH)的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述ω-转氨酶(PAKω-TA)来源于铜绿假单胞菌PAK(Pseudomonas aeruginosa PAK)。

在本发明的一种实施方式中，所述ω-转氨酶(PAKω-TA)的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒A上的表达载体为pACYCDuet。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒B上的表达载体为pETDuet。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为E.coli BL21。

在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶(MnADH)是经过RBS优化的；所述醇脱氢酶(MnADH)的RBS优化是指将重组质粒B上位于醇脱氢酶(MnADH)上游的用于调控醇脱氢酶(MnADH)的RBS序列进行替换；所述替换后的RBS序列的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒A还包含目的基因D；所述目的基因D为编码谷氨酸脱氢酶(GluDH)的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸脱氢酶(GluDH)来源于大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述谷氨酸脱氢酶(GluDH)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了一种生产1,2-氨基醇类化合物的方法，所述方法为使用上述一种大肠杆菌工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为以环氧苯乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷、环氧氯丙烷或环氧戊烷为底物，以上述一种大肠杆菌工程菌为催化剂、添加辅酶NADP⁺、氨基供体L-Glu以及氯化铵构成催化体系，反应10～15h。

本发明提供了上述一种大肠杆菌工程菌或上述一种生产1,2-氨基醇类化合物的方法在制备1,2-氨基醇类化合物方面的应用。

有益效果：

(1)本发明的大肠杆菌工程菌共表达了环氧化物水解酶(SpEH)、醇脱氢酶(MnADH)、ω-转氨酶(PAKω-TA)以及谷氨酸脱氢酶(GluDH)，可一步全细胞催化环氧化物合成1,2-氨基醇类化合物，且可同时实现合成1,2-氨基醇类化合物过程中所必需的辅酶NADP⁺和氨基供体L-Glu的再生；

(2)本发明的大肠杆菌工程菌所表达的醇脱氢酶(MnADH)为经RBS优化的醇脱氢酶(MnADH)，此RBS优化可控制醇脱氢酶的表达量，使醇脱氢酶和转氨酶的催化速率达到最佳配比，以去除催化途径中限速步骤带来的影响(将本发明的大肠杆菌工程菌于培养基中培养至OD₆₀₀为0.8后在培养基中加入IPTG诱导12h，可使发酵液中醇脱氢酶的酶活高达0.78U/mL)；

(3)利用本发明的方法，可以多种环氧化物(如环氧苯乙烷、环氧丙烷以及环氧丁烷等)为底物进行全细胞转化制备出相对应的1,2-氨基醇类化合物(产物转化率可高达97.5％)；

(4)利用本发明的方法制备1,2-氨基醇类化合物，操作方便、底物廉价，且转化过程中不需要添加任何辅因子和氨基供体，不仅能提高转化效率，同时也降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的E.coli BL21感受态细胞购自上海生工生物工程股份有限公司。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

SpEH酶活测定方法：

1mL反应体系包括150μL的10mM环氧苯乙烷以及50μL的酶液；

酶活定义：37℃下，1min转化1μmol环氧苯乙烷生成苯基1,2-乙二醇的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

PAKω-TA酶活测定方法：

1mL反应体系包括150μL的10mM环氧苯乙烷以及50μL的酶液；

酶活定义：37℃下，1min转化1μmol羟基苯乙醛生成2-氨基1-苯乙醇的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

MnADH酶活力测定方法：

1mL反应体系包括790μL的50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)、150μL的10mM苯基1,2-乙二醇、10μL的1μmol NADP⁺以及50μL的酶液；

反应结束后，根据反应液在340nm下的NADPH吸光值变化测定活力；

酶活力单位定义：1min产生1μmol NADPH所需要的酶量。

GluDH酶活力测定方法：

1mL反应体系包括790μL的50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)、150μL的10mM2-酮戊二酸、10μL的1μmol NADPH以及50μL的酶液；

酶活力单位定义：1min消耗1μmol NADPH所需要的酶量。

环氧化物消耗量测定方法：

色谱条件：色谱柱：DinosoilC18(5μL，250nm×4.6nm)，流动相：乙腈-水(V/V＝85:15)，柱温：30℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min。

色谱结束后，于220nm紫外波长检测特征吸收峰，其中，底物标准品浓度为0.5g/L。

1,2-氨基醇化合物产量测定方法：

色谱结束后，于220nm紫外波长检测特征吸收峰，其中，产物标准品浓度为0.5g/L。

中间产物邻二醇和1,2-羟基醛类化合物的测定方法：

色谱条件：色谱柱：Sepax Carbomix H-NP(10:8,7.8mm*300mm)，流动相：3mM高氯酸溶液，柱温：50℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min。

色谱结束后，于338nm紫外波长检测特征吸收峰，其中，中间产物标准品浓度为0.5g/L。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。

LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl。

实施例1：重组质粒的构建

具体步骤如下：

(1)根据NCBI中Sphingomonas sp.HXN-200的全基因组核酸序列中speh基因序列(SEQ ID NO.1)，设计环氧化物水解酶SpEH的PCR引物P1和P2(SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7)；

(2)根据NCBI中Mycobacterium neoaurum的全基因组核酸序列中mnadh基因序列(SEQ ID NO.2)，设计醇脱氢酶MnADH的PCR引物P3和P4(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)；

(3)根据NCBI中Pseudomonas aeruginosa PAK的全基因组核酸序列中pakω-ta基因序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.3)，设计ω-转氨酶PAKω-TA的PCR引物P5和P6(SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11)；

(4)根据NCBI中Chromobacterium violaceum的全基因组核酸序列中cvω-ta基因序列(SEQ ID NO.12)，设计ω-转氨酶Cvω-TA的PCR引物P7和P8(SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14)；

(5)根据NCBI中Pseudomonas putida的全基因组核酸序列中ppta基因序列(SEQID NO.15)，设计转氨酶PPTA的PCR引物P9和P10(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17)；

(6)根据NCBI中Vibrio fluvialis的全基因组核酸序列中vfta基因序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.18)，设计转氨酶VFTA的PCR引物P11和P12(SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20)；

(7)以上述基因组DNA为模板，利用上述引物做PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，一个循环；95℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃终延伸10min，扩增结束后，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收；

(8)回收产物speh与pACYCDuet经BamH I和Hind III酶切后通过PCR连接，mnadh、pakω-ta与pETDuet分别经BamH I/Hind III和Bgl II/EcoR V酶切后通过PCR连接，mnadh、cvω-ta与pETDuet分别经BamH I/Hind III和Bgl II/EcoR V酶切后通过PCR连接，mnadh、ppta与pETDuet分别经BamH I/Hind III和Bgl II/EcoR V酶切后通过PCR连接，mnadh、vfta与pETDuet分别经BamH I/Hind III和Bgl II/EcoR V酶切后通过PCR连接，得到重组质粒pACYCDuet-speh、pETDuet-mnadh-pakω-ta、pETDuet-mnadh-cvω-ta、pETDuet-mnadh-ppta、pETDuet-mnadh-vfta。

实施例2：重组菌的构建

具体步骤如下：

取100μL的E.coli BL21感受态细胞放入1.5mL离心管中，分别加入5μL需要转化的重组质粒pACYCDuet-speh和pETDuet-mnadh-pakω-ta、pACYCDuet-speh和pETDuet-mnadh-cvω-ta、pACYCDuet-speh和pETDuet-mnadh-ppta、pACYCDuet-speh和pETDuet-mnadh-vfta，轻轻吹吸，并在冰上放置45min；将离心管放入42℃精确热激90s后再置于冰上5min，然后加入800μL LB液体培养基，37℃摇床培养1-1.5h；离心后弃去大部分上清，重新吹吸悬浮，将剩余菌液涂布于含有氨苄抗性和氯霉素抗性的LB平板上，待转化子长出后提质粒验证，得到重组菌BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-pakω-ta、BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-cvω-ta、BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-ppta以及BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-vfta。

实施例3：重组菌的验证

具体步骤如下：

(1)将实施例2得到的重组菌BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-pakω-ta、BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-cvω-ta、BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-ppta以及BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-vfta用LB培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；

(2)将种子液以1％的接种量转接入100mL的LB液培养基中，继续培养2h至OD₆₀₀为0.8，得到发酵液；

(3)在发酵液中加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；

(4)将菌体用pH 7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后，取菌体加入催化体系中于37℃反应10h，得到反应液；其中，菌体在催化体系中的OD₆₀₀＝30，除菌体外，催化体系还含有100mM底物环氧苯乙烷、5mM L-Glu、0.02mM NADP⁺、0.35mM PLP和275mM NH₄Cl(pH8.0)；

(5)将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。

HPLC分析结果显示：重组菌BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-pakω-ta全细胞转化100mM环氧苯乙烷10h后，产物2-氨基1-苯乙醇的量为22.4mM，中间产物苯基1,2-乙二醇的积累量为76.5mM，另一中间产物羟基苯乙醛无积累；

重组菌BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-cvω-ta全细胞转化100mM环氧苯乙烷10h后，产物2-氨基1-苯乙醇的量为10.2mM，中间产物苯基1,2-乙二醇的积累量为78.4mM，另一中间产物羟基苯乙醛积累量为11.2mM；

重组菌BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-ppta全细胞转化100mM环氧苯乙烷10h后，产物2-氨基1-苯乙醇的量为0mM，中间产物苯基1,2-乙二醇的积累量为82mM，另一中间产物羟基苯乙醛16.5mM；

重组菌BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-vfta全细胞转化100mM环氧苯乙烷10h后，产物2-氨基1-苯乙醇的量为3.5mM，中间产物苯基1,2-乙二醇的积累量为80.2mM，另一中间产物羟基苯乙醛13.6mM。

由结果可知：尝试使用四种不同来源的ω-转氨酶时，通过检测产物2-氨基1-苯乙醇的产量，发现来源于Pseudomonas aeruginosa PAK的ω-转氨酶产量最高，说明PAKω-TA酶活较另外三种来源的酶酶活更高，因此，应选用ω-转氨酶PAKω-TA构建重组菌。

并且，通过检测催化反应过程中间产物苯基1,2-乙二醇和羟基苯乙醛的含量发现，中间产物苯基1,2-乙二醇大量积累，羟基苯乙醛无积累，而整个催化体系中醇脱氢酶MnADH的作用是催化中间产物苯基1,2-乙二醇合成羟基苯乙醛，ω-转氨酶PAKω-TA的作用是催化羟基苯乙醛合成最终产物2-氨基1-苯乙醇；当外源添加醇脱氢酶MnADH粗酶液时，中间产物苯基1,2-乙二醇能逐渐消耗，最终全部转化成终产物2-氨基1-苯乙醇，在整个催化过程中无中间产物羟基苯乙醛积累，该结果表明，重组菌BL21/pACYCDuet-speh&pETDuet-mnadh-pakω-ta转化制备1,2-氨基醇类化合物会受到醇脱氢酶酶活力偏低的限制，而其他酶的转化速率不受限制，最终导致中间产物大量积累，终产物产量偏低，因此，仍需要进一步提高醇脱氢酶在整个级联催化体系中的酶活力。

实施例4：醇脱氢酶的RBS序列优化

具体步骤如下：

(1)根据pETDuet质粒上的T7启动子及MnADH的基因序列，设计含有不同强度的RBS序列(序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：24)的PCR上游引物r1、r2、r3、r4、r5(序列如SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：29)；

(2)以重组质粒pETDuet-mnadh-pakω-ta为模板，分别以含有不同强度的RBS序列上游引物r1、r2、r3、r4、r5与MnADH的下游引物r6、r7、r8、r9、r10(序列如SEQ ID NO：30～SEQ ID NO：34)组成引物对，进行PCR，得到多条含有不同强度RBS序列醇脱氢酶基因的片段，将其与线性化的pETDuet-pakω-ta质粒相连，得到具有不同RBS强度的共表达质粒pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r2-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r3-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r4-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r5-mnadh-pakω-ta；

(3)将重组质粒转化到感受态E.coli BL21中，筛选正确的转化子，即得到醇脱氢酶不同RBS优化后的共表达重组菌；

(4)将构建好的重组菌按实施例3中的条件进行诱导表达，然后收集洗涤后将重组大肠杆菌重悬于10mL的50mM磷酸缓冲液中；

(5)将悬浮好的细胞进行超声波破碎，破1s停3s，工作15min，取破碎液于离心机内4℃，10000r/min离心25min去除沉淀，测定上清液中MnADH酶活。

由结果可知：重组菌pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r2-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r3-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r4-mnadh-pakω-ta、pETDuet-r5-mnadh-pakω-ta中MnADH的酶活分别为0.78U/mL、0.58U/mL、0.52U/mL、0.43U/mL、0.38U/mL，与RBS未优化的原始菌pETDuet-mnadh-pakω-ta有一定提高(原始菌MnADH酶活力0.32U/mL)。

因此，应选用序列为SEQ ID NO：4的RBS序列对醇脱氢酶进行优化。

实施例5：谷氨酸脱氢酶的引入

经上述实验发现，三酶催化体系需要不断地提供辅酶NADP⁺和氨基供体L-Glu，谷氨酸脱氢酶的引入可同时再生反应体系消耗的NADP和L-Glu，因此，可尝试引入谷氨酸脱氢酶，具体步骤如下：

(1)根据NCBI中Escherichia coli Bl21的全基因组核酸序列中gludh基因序列(SEQ ID NO.5)，设计谷氨酸脱氢酶的PCR引物P7和P8(SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36)；

(2)以上述基因组DNA为模板，利用上述引物做PCR扩增，回收产物与pACYCDuet-speh经Nde I和EcoR V酶切后通过PCR连接，得到重组质粒pACYCDuet-speh-gludh；

(3)将重组质粒pACYCDuet-speh-gludh和RBS序列优化后的重组质粒pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta同时转化到感受态E.coli BL21中，验证正确，获得可共表达四个酶的重组菌E.coli BL21(SGMP)；

(4)将获得的重组菌E.coli BL21(SGMP)用LB培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；

(5)将种子液以1％的接种量转接入100mL的LB液培养基中，继续培养2h至OD₆₀₀为0.8，得到发酵液；

(6)在发酵液中加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；

(7)将菌体用pH 7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后，取菌体加入催化体系中于37℃反应10h，得到反应液；其中，菌体在催化体系中的OD₆₀₀＝30，除菌体外，催化体系还含有100mM底物环氧苯乙烷、5mM L-Glu、0.02mM NADP⁺、0.35mM PLP和275mM NH₄Cl(pH8.0)；

(8)将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。

HPLC分析结果表明：重组菌全细胞转化100mM环氧苯乙烷10h后，产物2-氨基1-苯乙醇的量为96.5mM，无中间产物积累及副产物2-酮戊二酸生成。

由结果可知，重组菌E.coli BL21(SGMP)能高效转化制备1,2-氨基醇类化合物，且整个反应过程不需要持续添加辅酶和氨基供体。

实施例6：四酶串联共表达

具体步骤如下：

(1)将上述回收产物speh和gludh与pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta分别经Kpn I/Xho I和Nde I/EcoR V酶切后通过PCR连接，得到重组质粒pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta-speh-gludh；

(2)将pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta-speh-gludh转化到感受态E.coli BL21中，验证正确，获得四个酶串联表达在同一质粒上的的重组菌E.coliBL21/pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta-speh-gludh；

(3)参考实施例5，使用E.coli BL21/pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta-speh-gludh转化含有100mM底物环氧苯乙烷；

(4)将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。

HPLC分析结果表明：重组菌E.coli BL21/pETDuet-r1-mnadh-pakω-ta-speh-gludh全细胞转化100mM环氧苯乙烷10h后，产物2-氨基1-苯乙醇的量仅为50.6mM，且有中间产物苯基1,2-乙二醇(24mM)和羟基苯乙醛(14.5mM)积累。

由结果可知，四个酶共表达在同一质粒上会受到各个酶表达水平不均衡的限制，因此选择合适的表达质粒，达到最佳的适配关系尤为重要。

实施例7：重组菌的应用

具体步骤如下：

以环氧丙烷为底物：将实施例5获得的重组菌E.coli BL21(SGMP)用LB培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；将种子液以1％的接种量转接入100mL的LB液培养基中，继续培养2h至OD₆₀₀为0.8，得到发酵液；在发酵液中加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；将菌体用pH7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后，取菌体加入催化体系中于37℃反应10h，得到反应液；其中，菌体在催化体系中的OD₆₀₀＝30，除菌体外，催化体系还含有100mM底物环氧丙烷、5mML-Glu、0.02mMNADP⁺、0.35mM PLP和275mM NH₄Cl(pH8.0)；将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。

以环氧丁烷为底物：将实施例5获得的重组菌E.coli BL21(SGMP)用LB培养基活化后于37℃、160r/min的条件下培养12h，得到种子液；将种子液以1％的接种量转接入100mL的LB液培养基中，继续培养2h至OD₆₀₀为0.8，得到发酵液；在发酵液中加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导12h后，于4℃，8000r/min的条件下离心10min收集菌体；将菌体用pH7.5的磷酸盐缓冲液清洗两次后，取菌体加入催化体系中于37℃反应10h，得到反应液；其中，菌体在催化体系中的OD₆₀₀＝30，除菌体外，催化体系还含有100mM底物环氧丁烷、5mML-Glu、0.02mMNADP⁺、0.35mM PLP和275mM NH₄Cl(pH8.0)；将反应液稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。

HPLC分析结果表明：重组菌全细胞转化100mM环氧丙烷10h后，产物2-氨基1-丙醇的量为94.3mM，重组菌全细胞转化100mM环氧丁烷10h后，产物2-氨基1-丁醇的量为97.5mM，生成相应的1,2-氨基醇化合物摩尔产率分别达到94.3％和97.5％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种利用全细胞转化生产1,2-氨基醇类化合物的方法

<160> 36

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacgtcg aacatatccg cccgttccgc gtcgaggtgc cgcaggacgc gctcgacgat 60

cttcgcgacc ggctggcgcg cactcgctgg cccgagaagg aaacggtcga cgactgggat 120

cagggcatcc cgctcgccta tgcccgcgaa ctcgccatct actggcgcga cgagtacgac 180

tggcggcgga tcgaggcgcg gctcaacacc tggcccaact ttctggccac agtcgacggg 240

ctcgatatcc atttcctcca tatccgctcg gacaatcctg ccgcgcggcc gctggtgttg 300

acgcacggct ggccgggatc ggtcctcgaa tttctcgacg tcatcgaacc gctgtcggcc 360

gactatcacc tcgtcatccc gtcgcttccc ggtttcggtt tctcgggcaa gcccacccgc 420

cccggctggg atgtcgagca tatcgccgcc gcgtgggacg cgctgatgcg cgcgctcggc 480

tatgaccgct attttgcgca gggcggcgac tggggcagcg cggtaacctc ggcgatcggc 540

atgcaccacg ccggccattg cgcgggcatc cacgtcaaca tggtcgtcgg cgcgccgccg 600

cccgagttga tgaacgacct caccgacgaa gagaagctct atctcgcgcg cttcggctgg 660

tatcaggcga aggacaatgg ctattcgacg cagcaggcga cgcggccgca gacgatcggc 720

tatgcgctca ccgattcccc ggccggacag atggcgtgga tcgcggagaa attccacggc 780

tggaccgatt gcgggcacca gcccggcggc cagtcggtcg gcggccaccc cgaacaggcg 840

gtctcgaagg atgcgatgct cgacacgatc agcctctatt ggctgaccgc cagcgccgct 900

tcgtcggcgc ggctatactg gcacagcttc cgtcagttcg cggcgggcga gatcgacgtg 960

ccgacgggat gcagcctgtt cccgaacgag atcatgcgcc tgtcgcggcg ctgggccgaa 1020

cggcggtatc gcaacatcgt ctattggagc gaagcggctc gcggcggcca tttcgccgcc 1080

tgggaacaac ccgagctgtt tgccgccgag gtccgcgcgg cctttgcaca gatggatctt 1140

tga 1143

<210> 2

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctagatcgtg gcggtgtcga tcacgaaccg gtaccgcaca tcgctggaga gcacgcggtc 60

ccaggcctcg ttgacgtagg acgcctcgat gacctcgatc tccggggtga cgccgtgttc 120

ggcgcagaaa tcgagcatct cctgggtctc cgggataccg ccgatcatcg agccggagat 180

gctgcgtcgg ccacctgcca gcgggaagaa gggcacctcg agcggatgct cgggcgctcc 240

cagctcgacc agcgtgccat cgatcttgag cagcgagagg tactgaccga gatcgagatt 300

ggccgatacg gtgttcagga tcagatcgaa cttgccggcc agcttgctga aggtgtcggg 360

atcgctggtc gcgtagtact cgtcggcgcc gagtcgcagg ccgtcttcca tcttcttgag 420

cgactggctg agaacggtca ccttggcgcc catcgcgtgg gccagcttga cgcccatgtg 480

gccgaggccg ccgagtccga cgattgcgac ctccttgccg gggccggcgt tccagtgctt 540

cagcggggag aacagcgtga tgcccgcgca cagcagggga gcggccttgt ccagcggaat 600

gctgtccggg atgcgcagga cgaacttttc gtcgacgacg atggcctggc tgtacccacc 660

ctgggtgatg gtgccgtccc ggtcggtggc gccgtaggtg ccgatcatgc cggtgcccag 720

gcagtactgc tccaggcccg ccgcgcagtt ctcgcagttc tggcaggagt tcaccatgca 780

gccgacgccg acgtggtcgc cgaccttgta cttggtgacc tccgagccga cctcggtgac 840

gacgccggcg atctcgtgac cgacgacgag cgggtagctg ggggtgcccc actcggcctt 900

ggcggtgtgg atgtcgctgt gacagatgcc ggcgaacttg atgtcgaagg ccacatcgtg 960

cgggccgacg tcacggcgct cgatggtggt cttggccagc ggatctgtcg cggaggtggc 1020

ggcgtaggcg gaaacggttg tggtcat 1047

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asn Ser Gln Ile Thr Asn Ala Lys Thr Arg Glu Trp Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ser Arg Asp His His Leu Pro Pro Phe Thr Asp Tyr Lys Gln Leu Asn

20 25 30

Glu Lys Gly Ala Arg Ile Ile Thr Lys Ala Glu Gly Val Tyr Ile Trp

35 40 45

Asp Ser Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu Trp Cys

50 55 60

Val Asn Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Gln Met Arg Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His

85 90 95

Pro Pro Val Val Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Glu

100 105 110

Gly Met Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp

115 120 125

Thr Val Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Thr Lys Gly Gln Pro

130 135 140

Gln Lys Lys Val Val Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr

145 150 155 160

Val Ala Gly Val Ser Leu Gly Gly Met Lys Ala Leu His Glu Gln Gly

165 170 175

Asp Phe Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Ala Gln Pro Tyr Trp Tyr

180 185 190

Gly Glu Gly Gly Asp Met Ser Pro Asp Glu Phe Gly Val Trp Ala Ala

195 200 205

Glu Gln Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Glu Asn Val Ala

210 215 220

Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro

225 230 235 240

Pro Asp Thr Tyr Trp Pro Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp

245 250 255

Ile Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly

260 265 270

Glu Trp Phe Gly Ser Gln Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Asp Leu Met Pro

275 280 285

Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Val

290 295 300

Val Arg Asp Glu Ile Val Glu Val Leu Asn Gln Gly Gly Glu Phe Tyr

305 310 315 320

His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu

325 330 335

Glu Asn Ile Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Glu Lys Val Lys

340 345 350

Ala Glu Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Trp Gln Glu Leu Ala Asp

355 360 365

His Pro Leu Val Gly Glu Ala Arg Gly Val Gly Met Val Ala Ala Leu

370 375 380

Glu Leu Val Lys Asn Lys Lys Thr Arg Glu Arg Phe Thr Asp Lys Gly

385 390 395 400

Val Gly Met Leu Cys Arg Glu His Cys Phe Arg Asn Gly Leu Ile Met

405 410 415

Arg Ala Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val Ile Asp

420 425 430

Pro Ser Gln Ile Asp Glu Leu Ile Thr Leu Ala Arg Lys Cys Leu Asp

435 440 445

Gln Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala

450 455

<210> 4

<211> 1139

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctagagg gaggagcaac tcccctaccc tacgctcatt ttcatgacca caaccgtttc 60

cgcctagatc gtggcggtgt cgatcacgaa ccggtaccgc acatcgctgg agagcacgcg 120

gtcccaggcc tcgttgacgt aggacgcctc gatgacctcg atctccgggg tgacgccgtg 180

ttcggcgcag aaatcgagca tctcctgggt ctccgggata ccgccgatca tcgagccgga 240

gatgctgcgt cggccacctg ccagcgggaa gaagggcacc tcgagcggat gctcgggcgc 300

tcccagctcg accagcgtgc catcgatctt gagcagcgag aggtactgac cgagatcgag 360

attggccgat acggtgttca ggatcagatc gaacttgccg gccagcttgc tgaaggtgtc 420

gggatcgctg gtcgcgtagt actcgtcggc gccgagtcgc aggccgtctt ccatcttctt 480

gagcgactgg ctgagaacgg tcaccttggc gcccatcgcg tgggccagct tgacgcccat 540

gtggccgagg ccgccgagtc cgacgattgc gacctccttg ccggggccgg cgttccagtg 600

cttcagcggg gagaacagcg tgatgcccgc gcacagcagg ggagcggcct tgtccagcgg 660

aatgctgtcc gggatgcgca ggacgaactt ttcgtcgacg acgatggcct ggctgtaccc 720

accctgggtg atggtgccgt cccggtcggt ggcgccgtag gtgccgatca tgccggtgcc 780

caggcagtac tgctccaggc ccgccgcgca gttctcgcag ttctggcagg agttcaccat 840

gcagccgacg ccgacgtggt cgccgacctt gtacttggtg acctccgagc cgacctcggt 900

gacgacgccg gcgatctcgt gaccgacgac gagcgggtag ctgggggtgc cccactcggc 960

cttggcggtg tggatgtcgc tgtgacagat gccggcgaac ttgatgtcga aggccacatc 1020

gtgcgggccg acgtcacggc gctcgatggt ggtcttggcc agcggatctg tcgcggaggt 1080

ggcggcgtag gcggaaacgg ttgtggtcat cccaagcttc tagatcgtgg cggtgtcga 1139

<210> 5

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggatcaga catattctct ggagtcattc ctcaaccatg tccaaaagcg cgacccgaat 60

caaaccgagt tcgcgcaagc cgttcgtgaa gtaatgacca cactctggcc ttttcttgaa 120

caaaatccaa aatatcgcca gatgtcatta ctggagcgtc tggttgaacc ggagcgcgtg 180

atccagtttc gcgtggtatg ggttgatgat cgcaaccaga tacaggtcaa ccgtgcatgg 240

cgtgtgcagt tcagctctgc catcggcccg tacaaaggcg gtatgcgctt ccatccgtca 300

gttaaccttt ccattctcaa attcctcggc tttgaacaaa ccttcaaaaa tgccctgact 360

actctgccga tgggcggtgg taaaggcggc agcgatttcg atccgaaagg aaaaagcgaa 420

ggtgaagtga tgcgtttttg ccaggcgctg atgactgaac tgtatcgcca cctgggcgcg 480

gataccgacg ttccggcagg tgatatcggg gttggtggtc gtgaagtcgg ctttatggcg 540

gggatgatga aaaagctctc caacaatacc gcctgcgtct tcaccggtaa gggcctttca 600

tttggcggca gtcttattcg cccggaagct accggctacg gtctggttta tttcacagaa 660

gcaatgctaa aacgccacgg tatgggtttt gaagggatgc gcgtttccgt ttctggctcc 720

ggcaacgtcg cccagtacgc tatcgaaaaa gcgatggaat ttggtgctcg tgtgatcact 780

gcgtcagact ccagcggcac tgtagttgat gaaagcggat tcacgaaaga gaaactggca 840

cgtcttatcg aaatcaaagc cagccgcgat ggtcgagtgg cagattacgc caaagaattt 900

ggtctggtct atctcgaagg ccaacagccg tggtctctac cggttgatat cgccctgcct 960

tgcgccaccc agaatgaact ggatgttgac gccgcgcatc agcttatcgc taatggcgtt 1020

aaagccgtcg ccgaaggggc aaatatgccg accaccatcg aagcgactga actgttccag 1080

caggcaggcg tactatttgc accgggtaaa gcggctaatg ctggtggcgt cgctacatcg 1140

ggcctggaaa tggcacaaaa cgctgcgcgc ctgggctgga aagccgagaa agttgacgca 1200

cgtttgcatc acatcatgct ggatatccac catgcctgtg ttgagcatgg tggtgaaggt 1260

gagcaaacca actacgtgca gggcgcgaac attgccggtt ttgtgaaggt tgccgatgcg 1320

atgctggcgc agggtgtgat ttaa 1344

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgggatccat gaacgttgaa cacatccgtc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccaagcttt tacaggtcca tctgagcgaa 30

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgggatccat gaccacaacc gtttccgc 28

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccaagcttc tagatcgtgg cggtgtcga 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaagatctat gaacagccaa atcaccaac 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccctcgagtc aagccaggac ggcggcggc 29

<210> 12

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgcaaaaac aacgcaccac ctcacaatgg cgcgaactgg atgccgcaca ccacctgcac 60

ccgtttaccg acaccgcaag cctgaatcag gccggcgccc gtgttatgac ccgcggcgaa 120

ggtgtgtatc tgtgggattc tgagggtaac aaaattatcg acggcatggc tggtctgtgg 180

tgcgttaatg tcggctatgg tcgtaaagat tttgccgaag cggcccgtcg ccaaatggaa 240

gaactgccgt tctacaacac ctttttcaaa accacgcatc cggcggtggt tgaactgagc 300

agcctgctgg cggaagttac gccggccggc tttgatcgtg tgttctatac caattcaggt 360

tcggaaagcg tggatacgat gatccgcatg gttcgtcgct actgggacgt ccagggcaaa 420

ccggaaaaga aaaccctgat cggtcgttgg aacggctatc atggttctac gattggcggt 480

gcaagtctgg gcggtatgaa atacatgcac gaacagggcg atctgccgat tccgggtatg 540

gcgcatatcg aacaaccgtg gtggtacaaa cacggcaaag atatgacccc ggacgaattt 600

ggtgtcgtgg cagctcgctg gctggaagaa aaaattctgg aaatcggcgc cgataaagtg 660

gcggcctttg ttggcgaacc gattcagggt gcgggcggtg tgattgttcc gccggccacc 720

tattggccgg aaattgaacg tatctgccgc aaatacgatg ttctgctggt cgcagacgaa 780

gttatttgtg gctttggtcg taccggcgaa tggttcggtc atcagcactt tggcttccaa 840

ccggacctgt ttacggcagc taaaggcctg agttccggtt atctgccgat cggcgccgtc 900

ttcgtgggta aacgcgttgc agaaggtctg attgctggcg gtgattttaa tcatggcttc 960

acctatagcg gtcacccggt ctgtgcggcc gtggcacatg ctaatgtggc agctctgcgt 1020

gacgaaggca tcgtgcagcg cgttaaagat gacattggtc cgtatatgca aaaacgttgg 1080

cgcgaaacgt ttagccgttt cgaacacgtc gatgacgtgc gcggcgttgg tatggtccag 1140

gcatttaccc tggtgaaaaa taaagctaaa cgcgaactgt ttccggattt cggcgaaatt 1200

ggtacgctgt gccgtgacat ctttttccgc aacaatctga ttatgcgtgc gtgtggtgat 1260

cacattgtta gcgccccgcc gctggttatg acccgcgcag aagtcgacga aatgctggcc 1320

gtggcggaac gctgcctgga agaatttgaa cagaccctga aagctcgtgg cctggcgtaa 1380

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

catgcatcag tcaagatgca aaaacaacgc 30

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

actgcagtct tacgccaggc cac 23

<210> 15

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgagcgtca acaacccgca aacccgtgaa tggcaaaccc tgagcgggga gcatcacctc 60

gcacctttca gtgactacaa gcagctgaag gagaaggggc cgcgcatcat caccaaggcc 120

cagggtgtgc atttgtggga tagcgagggg cacaagatcc tcgacggcat ggccggtcta 180

tggtgcgtgg cggtcggcta cggacgtgaa gagctggtgc aggcggcgga aaaacagatg 240

cgcgagctgc cgtactacaa cctgttcttc cagaccgctc acccgcctgc gctcgagctg 300

gccaaggcga tcaccgacgt ggcgccgaaa ggtatgaccc atgtgttctt caccggctcc 360

ggctccgaag gcaacgacac tgtgctgcgc atggtgcgtc actactgggc gctgaagggc 420

aaaccgcaca agcagaccat catcggccgc atcaacggtt accacggctc caccttcgcc 480

ggtgcatgcc tgggcggtat gagcggcatg cacgagcagg gtggcctgcc gatcccgggc 540

atcgtgcaca tccctcagcc gtactggttc ggcgagggag gcgacatgac ccctgacgaa 600

ttcggtgtct gggccgccga gcagttggag aagaagatcc tcgaagtcgg cgaagacaac 660

gtcgcggcct tcatcgccga gccgatccag ggcgctggtg gcgtgatcat cccgccggaa 720

acctactggc cgaaggtgaa ggagatcctc gccaggtacg acatcctgtt cgtcgccgac 780

gaggtgatct gcggcttcgg ccgtaccggc gagtggttcg gctcggacta ctacgacctc 840

aagcccgacc tgatgaccat cgcgaaaggc ctgacctccg gttacatccc catgggcggt 900

gtgatcgtgc gtgacaccgt ggccaaggtg atcagcgaag gcggcgactt caaccacggt 960

ttcacctact ccggccaccc ggtggcggcc gcggtgggcc tggaaaacct gcgcattctg 1020

cgtgacgaga aaattgtcga gaaggcgcgc acggaagcgg caccgtattt gcaaaagcgt 1080

ttgcgcgagc tgcaagacca tccactggtg ggtgaagtgc gcggcctggg catgctggga 1140

gcgatcgagc tggtcaagga caaggcaacc cgcagccgtt acgagggcaa gggcgttggc 1200

atgatctgtc gcaccttctg cttcgagaac ggcctgatca tgcgtgcggt gggtgacacc 1260

atgatcatcg cgccgccgct ggtaatcagc catgcggaga tcgacgaact ggtggaaaag 1320

gcgcgcaagt gcctggacct gacccttgag gcgattcaat aa 1362

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgggatccat gagcgtcaac aacccgcaaa ccc 33

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cccaagcttt tattgaatcg cctcaagggt cagg 34

<210> 18

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val

20 25 30

Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg

35 40 45

Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp

50 55 60

His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro

65 70 75 80

Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu

85 90 95

Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe

100 105 110

Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu

115 120 125

Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu

130 135 140

Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met

145 150 155 160

Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe

165 170 175

Val His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu

180 185 190

Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr

195 200 205

Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro

210 215 220

Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln

225 230 235 240

Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp

245 250 255

Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val

260 265 270

Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr

275 280 285

Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser

290 295 300

Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly

305 310 315 320

Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala

325 330 335

Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu

340 345 350

Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn

355 360 365

Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val

370 375 380

Lys Asp Lys Ala Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser

385 390 395 400

Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro

405 410 415

Leu Gly Gln Ser Val Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala

420 425 430

Gln Met Asp Glu Met Phe Asp Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val

435 440 445

Phe Ala Glu Val Ala

450

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtcgcggatc cgaattcatg accacaaccc aatctcgcct 40

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atttcgccgg attcagcgac ccgtttagag gc 32

<210> 21

<211> 1127

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gctctagagg gaggagcaac tcccctaccc tacgctcatt ttcatgacca caaccgtttc 60

cgcctagatc gtggcggtgt cgatcacgaa ccggtaccgc acatcgctgg agagcacgcg 120

gtcccaggcc tcgttgacgt aggacgcctc gatgacctcg atctccgggg tgacgccgtg 180

ttcggcgcag aaatcgagca tctcctgggt ctccgggata ccgccgatca tcgagccgga 240

gatgctgcgt cggccacctg ccagcgggaa gaagggcacc tcgagcggat gctcgggcgc 300

tcccagctcg accagcgtgc catcgatctt gagcagcgag aggtactgac cgagatcgag 360

attggccgat acggtgttca ggatcagatc gaacttgccg gccagcttgc tgaaggtgtc 420

gggatcgctg gtcgcgtagt actcgtcggc gccgagtcgc aggccgtctt ccatcttctt 480

gagcgactgg ctgagaacgg tcaccttggc gcccatcgcg tgggccagct tgacgcccat 540

gtggccgagg ccgccgagtc cgacgattgc gacctccttg ccggggccgg cgttccagtg 600

cttcagcggg gagaacagcg tgatgcccgc gcacagcagg ggagcggcct tgtccagcgg 660

aatgctgtcc gggatgcgca ggacgaactt ttcgtcgacg acgatggcct ggctgtaccc 720

accctgggtg atggtgccgt cccggtcggt ggcgccgtag gtgccgatca tgccggtgcc 780

caggcagtac tgctccaggc ccgccgcgca gttctcgcag ttctggcagg agttcaccat 840

gcagccgacg ccgacgtggt cgccgacctt gtacttggtg acctccgagc cgacctcggt 900

gacgacgccg gcgatctcgt gaccgacgac gagcgggtag ctgggggtgc cccactcggc 960

cttggcggtg tggatgtcgc tgtgacagat gccggcgaac ttgatgtcga aggccacatc 1020

gtgcgggccg acgtcacggc gctcgatggt ggtcttggcc agcggatctg tcgcggaggt 1080

ggcggcgtag gcggaaacgg ttgtggtcat tccgctacga aactaga 1127

<210> 22

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gctctagaag gggatccgcc cctcaaatct acggtcctat gaccacaacc gtttccgcct 60

agatcgtggc ggtgtcgatc acgaaccggt accgcacatc gctggagagc acgcggtccc 120

aggcctcgtt gacgtaggac gcctcgatga cctcgatctc cggggtgacg ccgtgttcgg 180

cgcagaaatc gagcatctcc tgggtctccg ggataccgcc gatcatcgag ccggagatgc 240

tgcgtcggcc acctgccagc gggaagaagg gcacctcgag cggatgctcg ggcgctccca 300

gctcgaccag cgtgccatcg atcttgagca gcgagaggta ctgaccgaga tcgagattgg 360

ccgatacggt gttcaggatc agatcgaact tgccggccag cttgctgaag gtgtcgggat 420

cgctggtcgc gtagtactcg tcggcgccga gtcgcaggcc gtcttccatc ttcttgagcg 480

actggctgag aacggtcacc ttggcgccca tcgcgtgggc cagcttgacg cccatgtggc 540

cgaggccgcc gagtccgacg attgcgacct ccttgccggg gccggcgttc cagtgcttca 600

gcggggagaa cagcgtgatg cccgcgcaca gcaggggagc ggccttgtcc agcggaatgc 660

tgtccgggat gcgcaggacg aacttttcgt cgacgacgat ggcctggctg tacccaccct 720

gggtgatggt gccgtcccgg tcggtggcgc cgtaggtgcc gatcatgccg gtgcccaggc 780

agtactgctc caggcccgcc gcgcagttct cgcagttctg gcaggagttc accatgcagc 840

cgacgccgac gtggtcgccg accttgtact tggtgacctc cgagccgacc tcggtgacga 900

cgccggcgat ctcgtgaccg acgacgagcg ggtagctggg ggtgccccac tcggccttgg 960

cggtgtggat gtcgctgtga cagatgccgg cgaacttgat gtcgaaggcc acatcgtgcg 1020

ggccgacgtc acggcgctcg atggtggtct tggccagcgg atctgtcgcg gaggtggcgg 1080

cgtaggcgga aacggttgtg gtcattccgc tacgaaacta ga 1122

<210> 23

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gctctagaag gggatccgcc cctcaaatct acggtcctat gaccacaacc gtttccgcct 60

agatcgtggc ggtgtcgatc acgaaccggt accgcacatc gctggagagc acgcggtccc 120

aggcctcgtt gacgtaggac gcctcgatga cctcgatctc cggggtgacg ccgtgttcgg 180

cgcagaaatc gagcatctcc tgggtctccg ggataccgcc gatcatcgag ccggagatgc 240

tgcgtcggcc acctgccagc gggaagaagg gcacctcgag cggatgctcg ggcgctccca 300

gctcgaccag cgtgccatcg atcttgagca gcgagaggta ctgaccgaga tcgagattgg 360

ccgatacggt gttcaggatc agatcgaact tgccggccag cttgctgaag gtgtcgggat 420

cgctggtcgc gtagtactcg tcggcgccga gtcgcaggcc gtcttccatc ttcttgagcg 480

actggctgag aacggtcacc ttggcgccca tcgcgtgggc cagcttgacg cccatgtggc 540

cgaggccgcc gagtccgacg attgcgacct ccttgccggg gccggcgttc cagtgcttca 600

gcggggagaa cagcgtgatg cccgcgcaca gcaggggagc ggccttgtcc agcggaatgc 660

tgtccgggat gcgcaggacg aacttttcgt cgacgacgat ggcctggctg tacccaccct 720

gggtgatggt gccgtcccgg tcggtggcgc cgtaggtgcc gatcatgccg gtgcccaggc 780

agtactgctc caggcccgcc gcgcagttct cgcagttctg gcaggagttc accatgcagc 840

cgacgccgac gtggtcgccg accttgtact tggtgacctc cgagccgacc tcggtgacga 900

cgccggcgat ctcgtgaccg acgacgagcg ggtagctggg ggtgccccac tcggccttgg 960

cggtgtggat gtcgctgtga cagatgccgg cgaacttgat gtcgaaggcc acatcgtgcg 1020

ggccgacgtc acggcgctcg atggtggtct tggccagcgg atctgtcgcg gaggtggcgg 1080

cgtaggcgga aacggttgtg gtcattccgc tacgaaacta ga 1122

<210> 24

<211> 1127

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gctctagaga ttacagaaaa cccactctct acgagttatt tatatgacca caaccgtttc 60

cgcctagatc gtggcggtgt cgatcacgaa ccggtaccgc acatcgctgg agagcacgcg 120

gtcccaggcc tcgttgacgt aggacgcctc gatgacctcg atctccgggg tgacgccgtg 180

ttcggcgcag aaatcgagca tctcctgggt ctccgggata ccgccgatca tcgagccgga 240

gatgctgcgt cggccacctg ccagcgggaa gaagggcacc tcgagcggat gctcgggcgc 300

tcccagctcg accagcgtgc catcgatctt gagcagcgag aggtactgac cgagatcgag 360

attggccgat acggtgttca ggatcagatc gaacttgccg gccagcttgc tgaaggtgtc 420

gggatcgctg gtcgcgtagt actcgtcggc gccgagtcgc aggccgtctt ccatcttctt 480

gagcgactgg ctgagaacgg tcaccttggc gcccatcgcg tgggccagct tgacgcccat 540

gtggccgagg ccgccgagtc cgacgattgc gacctccttg ccggggccgg cgttccagtg 600

cttcagcggg gagaacagcg tgatgcccgc gcacagcagg ggagcggcct tgtccagcgg 660

aatgctgtcc gggatgcgca ggacgaactt ttcgtcgacg acgatggcct ggctgtaccc 720

accctgggtg atggtgccgt cccggtcggt ggcgccgtag gtgccgatca tgccggtgcc 780

caggcagtac tgctccaggc ccgccgcgca gttctcgcag ttctggcagg agttcaccat 840

gcagccgacg ccgacgtggt cgccgacctt gtacttggtg acctccgagc cgacctcggt 900

gacgacgccg gcgatctcgt gaccgacgac gagcgggtag ctgggggtgc cccactcggc 960

cttggcggtg tggatgtcgc tgtgacagat gccggcgaac ttgatgtcga aggccacatc 1020

gtgcgggccg acgtcacggc gctcgatggt ggtcttggcc agcggatctg tcgcggaggt 1080

ggcggcgtag gcggaaacgg ttgtggtcat tccgctacga aactaga 1127

<210> 25

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gctctagagg gaggagcaac tcccctaccc tacgctcatt ttcatgacca caaccgtttc 60

cgc 63

<210> 26

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gctctagaat cgtctgatct cctacggtta ttttttatga ccacaaccgt ttccgc 56

<210> 27

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gctctagaag gggatccgcc cctcaaatct acggtcctat gaccacaacc gtttccgc 58

<210> 28

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gctctagaga ttacagaaaa cccactctct acgagttatt tatatgacca caaccgtttc 60

cgc 63

<210> 29

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gctctagaca cagtctactg ttatttttat gaccacaacc gtttccgc 48

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ctagctccaa gcttctagat cgtggcggtg tcga 34

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

caattggcca agcttctaga tcgtggcggt gtcga 35

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ccatatggcc aagcttctag atcgtggcgg tgtcga 36

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atactggcca agcttctaga tcgtggcggt gtcga 35

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cctactggcc aagcttctag atcgtggcgg tgtcga 36

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gaagatctat ggatcagaca tattctctgg 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ccctcgagtt aaatcacacc ctgcgccagc 30

Claims

1.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌包含重组质粒A、重组质粒B以及表达宿主；所述重组质粒A包含目的基因A以及表达载体；所述重组质粒B包含目的基因B、目的基因C以及表达载体；所述目的基因A为编码环氧化物水解酶(SpEH)的基因；所述目的基因B为编码醇脱氢酶(MnADH)的基因；所述目的基因C为编码ω-转氨酶(PAKω-TA)的基因；所述表达宿主为大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述环氧化物水解酶(SpEH)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述醇脱氢酶(MnADH)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述ω-转氨酶(PAKω-TA)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求1-4任一所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述醇脱氢酶(MnADH)是经过RBS优化的；所述醇脱氢酶(MnADH)的RBS优化是指将重组质粒B上位于醇脱氢酶(MnADH)上游的用于调控醇脱氢酶(MnADH)的RBS序列进行替换；所述替换后的RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.如权利要求1-5任一所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组质粒A还包含目的基因D；所述目的基因D为编码谷氨酸脱氢酶(GluDH)的基因。

7.如权利要求1-6任一所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述谷氨酸脱氢酶(GluDH)的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.一种生产1,2-氨基醇类化合物的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1-7任一所述的一种大肠杆菌工程菌。

9.如权利要求8所述的一种生产1,2-氨基醇类化合物的方法，其特征在于，所述方法为以环氧苯乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷、环氧氯丙烷或环氧戊烷为底物，以权利要求1-7任一所述的一种大肠杆菌工程菌为催化剂、添加辅酶NADP⁺、氨基供体L-Glu以及氯化铵构成催化体系，反应10～15h。

10.权利要求1-7任一所述的一种大肠杆菌工程菌或权利要求8或9所述的一种生产1,2-氨基醇类化合物的方法在制备1,2-氨基醇类化合物方面的应用。