CN110423740B - 一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用，属于酶工程和生物催化技术领域。本发明所述卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO.1所示序列中第89位精氨酸、第137位缬氨酸、第178位脯氨酸、第179位天冬酰胺、第187位苯丙氨酸进行单点突变或组合突变得到突变体。本发明获得的突变体与野生型卤醇脱卤酶相比，在制备(S)‑邻硝基苯基缩水甘油醚、(R)‑苄基缩水甘油醚和(R)‑苯基缩水甘油醚时的对映体选择率（E值）均有明显提高，最大提高分别为原始酶44.6、2.9、和9.4倍，具有良好的工业应用前景。

Description

一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用。
背景技术
卤醇脱卤酶(Halohydrin Dehalogenase,HHDHs,EC 4.5.1.X)也叫卤醇-卤化氢裂解酶，属于短链脱氢酶/还原酶家族。卤醇脱卤酶备受关注的原因是其在生物催化领域的应用，其介导的生物催化反应具有反应条件温和、立体选择性高和不需要辅酶等优点。卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应合成手性卤代醇和环氧化物，更可以高选择性地催化接受一系列非自然亲核试剂，如N3 -、NO2 -、CN-等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列手性环氧化物和β-取代醇，在药物研发和有机合成等方面具有较高的应用价值。
目前虽然已通过多种策略获得卤醇脱卤酶大约70余种，主要分为7大类型。但目前研究最多的卤醇脱卤酶仍然局限于来自菌株Agrobacterium radiobacter AD1的HheC、来自菌株Corynebacterium sp.N-1074的HheB、来自菌株Arthrobacter sp.AD2的HheA2和来自菌株Corynebacterium sp.N-1074的HheA；尤其是HheC由于其高活性及高对映立体选择性而被广泛研究。立体选择性优异的卤醇脱卤酶也仅仅只有HheC，立体选择性优异的卤醇脱卤酶的匮乏，严重制约了卤醇脱卤酶立体选择性生物催化在手性β-取代醇合成中的开发应用。近几年来，像理性设计、非理性设计以及半理性设计等分子生物学技术广泛用于改造酶的催化活性、热稳定性以及对映选择性等性质，并利用高通量筛选手段获得优异的突变体酶。但是目前，还鲜有关于提高卤醇脱卤酶催化环氧化物开环反应立体选择性的报道。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用，得到的卤醇脱卤酶突变体具有高对映选择性，有利于提高催化合成手性环氧化物和手性β-取代醇对映纯度和收率，从而降低生产成本，具有较强的工业应用价值。
技术方案：一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体，所述卤醇脱卤酶突变体在SEQ IDNO.1所示序列中R位进行单点突变，所述R位为R1位、R2位、R3位、R4位和R5位中的至少一种，所述R1位为第89位精氨酸，R2位为第137位缬氨酸、R3位为第178位脯氨酸、R4位为第179位天冬酰胺、R5位为第187位苯丙氨酸，当R为R1时，将第89位精氨酸分别突变为酪氨酸和赖氨酸，得到突变体R89Y、R89K；
当R为R2时，将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸，得到突变体V137I；
当R为R3时，将第178位脯氨酸突变为丙氨酸，得到突变体P178A；
当R为R4时，将第179位天冬酰胺分别突变为谷氨酰胺和亮氨酸，得到突变体N179Q和N179L；
当R为R5时，将第187位苯丙氨酸突变为丙氨酸或亮氨酸，得到突变体F187A、F187L；
当R为R1和R2或R4时，将第89位精氨酸突变为酪氨酸且第137位缬氨酸突变为异亮氨酸或将第89位精氨酸突变为酪氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸，分别得到突变体R89Y-V137I和R89Y-N179L；
当R为R2和R3时，将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第178位脯氨酸突变为丙氨酸，得到突变体V137I-P178A；
当R为R2和R4时，将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且第179位天冬酰胺突变为谷氨酰胺，得到突变体V137I-N179Q；
当R为R4和R5时，将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸且将第187位苯丙氨酸突变为亮氨酸，得到突变体N179L-F187L；
当R为R1、R2和R3时，将第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第178位脯氨酸突变为丙氨酸，得到突变体R89Y-V137I-P178A；
当R为R1、R2和R4时，将第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第179位天冬酰胺分别突变为亮氨酸，得到突变体R89Y-V137I-N179L；
当R为R2、R3和R4时，将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸、第178位脯氨酸突变为丙氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸，得到突变体V137I-P178A-N179L。
原始酶的氨基酸序列，即SEQ ID NO.1：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPNFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGG
原始酶的核苷酸序列，即SEQ ID NO.2：
Figure BDA0002167649420000021
Figure BDA0002167649420000031
R89Y(将第89位精氨酸突变为酪氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.3：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIYASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPNFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
R89Y(将第89位精氨酸突变为酪氨酸)的核苷酸序列，SEQ ID NO.4：
Figure BDA0002167649420000032
R89K(第89位精氨酸突变为赖氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.5：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIKASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPNFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
R89K(第89位精氨酸突变为赖氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.6：
Figure BDA0002167649420000041
V137I(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.7：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAIPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPNFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
V137I(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.8：
Figure BDA0002167649420000042
Figure BDA0002167649420000051
P178A(第178位脯氨酸突变为丙氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.9：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAANFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
P178A(第178位脯氨酸突变为丙氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.10：
Figure BDA0002167649420000052
N179Q(第179位天冬酰胺突变为谷氨酰胺)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.11：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPQFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
N179Q(第179位天冬酰胺突变为谷氨酰胺)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.12：
Figure BDA0002167649420000061
N179L(天冬酰胺突变为亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.13：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPLFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
N179L(天冬酰胺突变为亮氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.14：
Figure BDA0002167649420000062
Figure BDA0002167649420000071
F187A(第187位苯丙氨酸突变为丙氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.15：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPNFIESPTYAPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
F187A(第187位苯丙氨酸突变为丙氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.16：
Figure BDA0002167649420000072
F187L(第187位苯丙氨酸突变为亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.17：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPNFIESPTYLPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
F187L(第187位苯丙氨酸突变为亮氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.18：
Figure BDA0002167649420000081
R89Y-V137I(第89位精氨酸突变为酪氨酸且第137位缬氨酸突变为异亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.19：
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R89Y-V137I(第89位精氨酸突变为酪氨酸且第137位缬氨酸突变为异亮氨酸)的氨基酸序列，SEQ ID NO.20：
Figure BDA0002167649420000082
Figure BDA0002167649420000091
R89Y-N179L(第89位精氨酸突变为酪氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.21：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIYASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPLFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
R89Y-N179L(第89位精氨酸突变为酪氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸)的核苷酸序列，SEQ ID NO.22：
Figure BDA0002167649420000092
V137I-N178A(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第178位脯氨酸突变为丙氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.23：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAIPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAANFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
V137I-N178A(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第178位脯氨酸突变为丙氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.24：
Figure BDA0002167649420000101
V137I-N179Q(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且第179位天冬酰胺突变为谷氨酰胺)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.25：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAIPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPQFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
V137I-N179Q(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且第179位天冬酰胺突变为谷氨酰胺)的核苷酸序列，SEQ ID NO.26：
Figure BDA0002167649420000102
Figure BDA0002167649420000111
N179L-F187L(第179位天冬酰胺突变为亮氨酸且将第187位苯丙氨酸突变为亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.27：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAVPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPLFIESPTYLPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
N179L-F187L(第179位天冬酰胺突变为亮氨酸且将第187位苯丙氨酸突变为亮氨酸)的核苷酸序列，SEQ ID NO.28：
Figure BDA0002167649420000112
Figure BDA0002167649420000121
R89Y-V137I-P178A(第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第178位脯氨酸突变为丙氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.29：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIYASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAIPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAANFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
R89Y-V137I-P178A(第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第178位脯氨酸突变为丙氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.30：
Figure BDA0002167649420000122
R89Y-V137I-N179L(第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第179位天冬酰胺分别突变为亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.31：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIYASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAIPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAPLFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
R89Y-V137I-N179L(第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第179位天冬酰胺分别突变为亮氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.32：
Figure BDA0002167649420000131
V137I-P178A-N179L(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸、第178位脯氨酸突变为丙氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸)的氨基酸序列，即SEQ ID NO.33：
MLKNKNILITDATHFVGKPGASVLIREGATVFAQDASFVDENARLAFSELVPGVTPLAEQDPEEVLKAVLAIAGHLDVLVNNDAYPAIRASIDEADIEDFRNTLDALLVRGFTYAKYVAAHMKKRGSGKIIFISSAIPKHGLPNYSMYVAARGGANALAVTLAKELGKSGIQVNSLAALFIESPTYFPKELLENEETLKKITKPIPLGRLGKPEEAGEYLAFLSSDKSDYITGQVLYFAGGWA
V137I-P178A-N179L(第137位缬氨酸突变为异亮氨酸、第178位脯氨酸突变为丙氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸)的核苷酸序列，即SEQ ID NO.34：
Figure BDA0002167649420000132
Figure BDA0002167649420000141
一种编码上述提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体的基因。
一种携带上述基因的重组质粒。
作为优选，所述重组质粒的表达载体是pET28a(+)，所述表达宿主是E.coli BL21(DE3)。
一种表达上述基因的基因工程菌。
作为优选，所述基因工程菌以携带编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的基因的重组质粒为模板，设计合成引物，并通过PCR定点饱和突变或组合突变到的携带编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的基因重组质粒进行转化表达宿主。
上述提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体、上述重组质粒或上述基因工程菌在制备催化拆分环氧化物开环合成手性环氧化物和手性β-取代醇的催化剂中的应用。
作为优选，所述环氧化物为苯基缩水甘油醚、苄基缩水甘油醚和邻硝基苯基缩水甘油醚。
作为优选，上述基因工程菌制备催化拆分环氧化物开环合成手性环氧化物和手性β-取代醇催化剂的方法如下：将含有卤醇脱卤酶基因的重组工程菌接种于含有质量浓度为50mg/L卡那霉素的50mL LB液体培养基于37℃，200r/min条件下培养10h；然后以1vt.％的接种量接种到新的含终质量浓度为50mg/L的卡那霉素的50mL LB培养基中，仍以37℃，200r/min培养，待培养至光学密度OD600为0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，至终浓度为0.15mM，在28℃，200r/min下诱导表达12h；5000×g，5min离心收集菌体，并以pH 8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬清洗菌体，5000×g离心5min，收集E.coli菌体，于-20℃储存备用。
有益效果：本发明所述提高对映选择性卤醇脱卤酶突变体为来自于alphaproteobacterium的卤醇脱卤酶基因的分子改造而获得的突变体，具有对映立体选择性高，催化合成手性环氧化物和手性β-取代醇效率高。因此本发明所获得的突变体更有利于手性环氧化物和手性beta-取代醇的生产需求，具有较强的工业应用价值。
本发明所述突变体与母本相比，酶催化反应的对映体选择性均有提高。其中突变体N179L催化苯基缩水甘油醚和邻硝基苯基缩水甘油醚的对映体选择率(E)相比于原始酶提高了9.4倍和44.6。突变体R89Y-V137I催化苄基缩水甘油醚的对映体选择率(E)相比于原始酶提高了2.9倍。另外：
(1)25g/L突变体N179L催化10mM邻硝基苯基缩水甘油醚合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚，在5min时ee>99％，且E为469.2，比HHDHAb的E值提高了44.6倍；25g/L突变体N179Q催化10mM邻硝基苯基缩水甘油醚合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚，在3min时ee>99％，且E为382.3，比HHDHAb的E值提高了27.1倍；25g/L突变体R89Y-N179L催化10mM邻硝基苯基缩水甘油醚合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚，在7min时ee>99％，且E为321.8，比HHDHAb的E值提高了30.6倍；25g/L突变体R89Y-V137I催化10mM邻硝基苯基缩水甘油醚合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚，在4min时ee>99％，且E为106.1，比HHDHAb的E值提高了10.1倍；25g/L突变体V137I-N179Q催化10mM邻硝基苯基缩水甘油醚合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚，在5min时ee>99％，且E为75.7，比HHDHAb的E值提高了7.2倍；25g/L突变体V137I催化10mM邻硝基苯基缩水甘油醚合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚，在3min时ee>99％，且E为53.4，比HHDHAb的E值提高了5.1倍；25g/L突变体R89Y催化10mM邻硝基苯基缩水甘油醚合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚，在1min时ee>99％，且E为64，比HHDHAb的E值提高了6.1倍。
(2)40g/L的突变体V137I催化20mM的苄基缩水甘油醚合成(R)-苄基缩水甘油醚，在20min时ee>99％，且E为28.6，比HHDHAb的E值提高了1.5倍；40g/L的突变体R89Y催化20mM的苄基缩水甘油醚合成(R)-苄基缩水甘油醚，在20min时ee>99％，且E为25.5，比HHDHAb的E值提高了1.4倍；40g/L的突变体R89K催化20mM的苄基缩水甘油醚合成(R)-苄基缩水甘油醚，在25min时ee>99％，且E为23.3，比HHDHAb的E值提高了1.2倍；40g/L的突变体R89Y-V137I催化20mM的苄基缩水甘油醚合成(R)-苄基缩水甘油醚，在15min时ee>99％，且E为54.6，比HHDHAb的E值提高了2.9倍；
(3)25g/L的卤醇脱卤酶突变体与野生型酶催化20mM的苯基缩水甘油醚合成(R)-苯基缩水甘油醚的结果参见下表。
Figure BDA0002167649420000161
附图说明
图1为底物苄基缩水甘油醚的结构式；
图2为底物苯基缩水甘油醚的结构式；
图3为底物邻硝基苯基缩水甘油醚的结构式；
图4为实施例4中野生型酶和突变酶N179L催化拆分邻硝基苯基缩水甘油醚的高效液相色谱图，其中a为邻硝基苯基缩水甘油醚标准样品图(S构型出峰时间15.1min，R构型出峰时间16.0min)，b为野生型酶催化拆分邻硝基苯基缩水甘油醚反应图(底物S构型出峰时间15.06min，R构型出峰时间15.89min，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇出峰时间45.7min，(S)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇出峰时间33.7min)，c为突变体N179L催化拆分邻硝基苯基缩水甘油醚反应图(底物S构型出峰时间15min，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇出峰时间45.6min)；
图5为实施例12中突变体R89Y-V137I和野生型酶催化拆分苄基缩水甘油醚的高效液相色谱图，其中a为苄基缩水甘油醚标准样品图(S构型出峰时间9.3min，R构型出峰时间10.1min)，b为野生型酶催化拆分苄基缩水甘油醚反应图(剩余底物R构型出峰时间10.1min，产物(R)-1-叠氮-3-苄氧基-2-丙醇出峰时间13.6min，(S)-1-叠氮-3-苄氧基-2-丙醇出峰时间14.96min)，c为突变体R89Y-V137I突变体催化拆分苄基缩水甘油醚反应图(剩余底物R构型出峰时间10.5min，产物(R)-1-叠氮-3-苄氧基-2-丙醇出峰时间13.4min，(S)-1-叠氮-3-苄氧基-2-丙醇出峰时间15.0min)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
定点饱和突变的实施
以重组质粒pET28a-HHDHAb为突变模板(构建方法参见专利公开号CN107881182A)，设计合适的突变引物。
用于定点突变的引物为：
Figure BDA0002167649420000171
PCR扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，dNTP(2.5mM each)4μL，正反向突变引物各0.5μL，模板质粒0.5μL，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL，定容至50μL。
PCR条件为98℃预变性2min，25个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min，最后72℃10min。取PCR溶液20μL，加入1μL Dpn I，37℃酶切2-3h去除作为模板的质粒DNA，65℃灭活10min，立即转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(50mg/L)的LB平板，37℃培养，挑取阳性转化子进行验证，并送实验室进行测序。
将测序正确的重组质粒于E.coli BL21(DE3)中进行转化，获得重组E.coli BL21(DE3)菌株。
实施例2
突变体和亲本的诱导表达
将实施例1制备的重组工程菌株在终质量浓度为50mg/L的卡那霉素的50mL LB培养基中于37℃，200r/min条件下培养10h。然后以1vt.％的接种量接种到新的含终质量浓度为50mg/L的卡那霉素的50mL LB培养基中，仍以37℃，200r/min培养，待培养至光学密度(OD600)为0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，至终浓度为0.15mM，在28℃，200r/min下诱导表达12h。5000×g，5min离心收集菌体，并以pH 8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬洗涤，5000×g离心5min，收集E.coli菌体，于-20℃储存备用。
实施例3
突变酶对映选择性的测定
底物苄基缩水甘油醚(结构式参见图1)的高效液相分析方法：采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mM，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为254nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为9.3和10.1。底物苯基缩水甘油醚(结构式参见图2)的高效液相分析方法：采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mM，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝83:17(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为220nm；(R)-和(S)-底物保留时间(min)分别约为8.1和12.4。底物邻硝基苯基缩水甘油醚(结构式参见图3)的高效液相分析方法：采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mM，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.5和16.5。底物ees＝[(S-R)/(S+R)]×100％或者ees＝[(R-S)/(R+S)]×100％；E＝ln[(1-c)×(1-ees)]/ln[(1-c)×(1+ees)]。其中，R和S为(R)-和(S)-底物的峰面积，c为rac-底物转化率。
实施例4
野生型和突变酶N179L催化合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇中的比较
分别称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL含100mMNaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入终浓度10mM的邻硝基苯基缩水甘油醚底物(结构式参见图3)，30℃恒温水浴反应，反应5min后，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.1和16.1。产物出峰时间(min)分别为：33.7和45.7。野生型酶和突变酶N179L催化拆分邻硝基苯基缩水甘油醚的高效液相色谱图参见图4，从图中可以看出：野生型HHDHAb和突变体N179L都优先水解(R)-邻硝基苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有10.5，而突变体N179L催化的对映体选择率达469.2。突变体催化生成的(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚的ees值大于99％，收率接近50％，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇的ees值为大于99％，收率为接近50％。
实施例5
野生型和突变酶N179Q催化合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇中的比较
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL含100mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入终浓度10mM的邻硝基苯基缩水甘油醚底物(结构式参见图3)，30℃恒温水浴反应，反应3min后，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.1和16.1。产物出峰时间(min)分别为：33.7和45.7。
结果：野生型HHDHAb和突变体N179Q都优先水解(R)-邻硝基苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有10.5，而突变体N179Q催化的对映体选择率达382.3。突变体催化生成的(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为48.7％，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇的ee值为95.0％，收率为49.9％。
实施例6
野生型和突变酶R89Y-N179L催化合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇中的比较
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL含100mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5,100mM),加入终浓度10mM的邻硝基苯基缩水甘油醚底物(结构式参见图3)，30℃恒温水浴反应，反应7min后，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.1和16.1。产物出峰时间(min)分别为：33.7和45.7。
结果：野生型HHDHAb和突变体R89Y-N179L都优先水解(R)-邻硝基苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有10.5，而突变体R89Y-N179L催化的对映体选择率达321.8。突变体催化生成的(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为48.5％，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇的ee值为94.1％，收率为49.9％。
实施例7
野生型和突变酶R89Y-V137I催化合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇中的比较
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL含100mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5,100mM),加入终浓度10mM的邻硝基苯基缩水甘油醚底物(结构式参见图3)，30℃恒温水浴反应，反应15min后，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.1和16.1。产物出峰时间(min)分别为：33.7和45.7。
结果：野生型HHDHAb和突变体R89Y-V137I都优先水解(R)-邻硝基苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有10.5，而突变体R89Y-V137I催化的对映体选择率达106.1。突变体催化生成的(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为45.5％，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇的ee值为85.5％。
实施例8
野生型和突变酶V137I-N179Q催化合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇中的比较
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL含100mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5,100mM),加入终浓度10mM的邻硝基苯基缩水甘油醚底物(结构式参见图3)，30℃恒温水浴反应，反应5min，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.1和16.1。产物出峰时间(min)分别为：33.7和45.7。
结果：野生型HHDHAb和突变体V137I-N179Q都优先水解(R)-邻硝基苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有10.5，而突变体V137I-N179Q催化的对映体选择率达75.7。突变体催化生成的(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为43.8％，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇的ee值为77.9％。
实施例9
野生型和突变酶V137I催化合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇中的比较
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL含100mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5,100mM),加入终浓度10mM的邻硝基苯基缩水甘油醚底物(结构式参见图3)，30℃恒温水浴反应，反应3min，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.1和16.1。产物出峰时间(min)分别为：33.7和45.7。
结果：野生型HHDHAb和突变体V137I都优先水解(R)-邻硝基苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有10.5，而突变体V137I催化的对映体选择率达53.4。突变体催化生成的(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为41.4％，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇的ee值为70.6％。
实施例10
野生型和突变酶R89Y催化合成(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇中的比较
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL含100mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5,100mM),加入终浓度10mM的邻硝基苯基缩水甘油醚底物(结构式参见图3)，30℃恒温水浴反应，反应2.5min，定时取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel AD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5(v/v)；流速：1.0mL/min；UV波长为218nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为15.1和16.1。产物出峰时间(min)分别为：33.7和45.7。
结果：野生型HHDHAb和突变体R89Y都优先水解(R)-邻硝基苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有10.5，而突变体R89Y催化的对映体选择率达64。突变体催化生成的(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为42.7％，产物(R)-1-叠氮-3-(2-硝基苯氧基)-2-丙醇的ee值为74.6％。
实施例11
野生型和突变酶V137I催化合成(R)-苄基缩水甘油醚
称取0.40g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL 80mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入终浓度20mM的苄基缩水甘油醚(结构式参见图1)，30℃恒温水浴反应，定时取样0.5mL，反应20min后，取样加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H(Daicel Co.，Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为254nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为10.7和9.6。
结果：野生型HHDHAb和突变体V137I都优先水解(S)-苄基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有18.7，而突变体V137I催化的对映体选择率达28.6，为HHDHAb的1.5倍；催化生成的(R)-苄基缩水甘油醚的ee值大于99％，且收率为34.5％。
实施例12
野生型和突变酶R89Y-V137I催化合成(R)-苄基缩水甘油醚
称取0.40g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL 80mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入终浓度20mM的苄基缩水甘油醚(结构式参见图1)，30℃恒温水浴反应，反应15min后，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H(Daicel Co.，Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为254nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为10.7和9.6。
结果：突变体R89Y-V137I和原始酶(即野生型HHDHAb)催化拆分苄基缩水甘油醚的高效液相色谱图参见图5，野生型HHDHAb和突变体R89Y-V137I都优先水解(S)-苄基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有18.7，而突变体R89Y-V137I催化的对映体选择率达54.6，为HHDHAb的2.9倍，催化生成的(R)-苄基缩水甘油醚的ee值大于99％，且收率为42％。
另外，对野生型和突变体酶R89Y和R89K催化合成(R)-苄基缩水甘油醚结果进行比较，方法同实施例12，具体结果参见下表1。
表1野生型和突变体催化拆分苄基缩水甘油醚结果比较
Figure BDA0002167649420000241
实施例13
野生型和突变酶N179L催化合成(R)-苯基缩水甘油醚
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL 80mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5,100mM),加入终浓度20mM的苯基缩水甘油醚(结构式参见图2)，30℃恒温水浴反应，反应35min，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H(Daicel Co.，Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为220nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为12.6和8.1。
结果：野生型HHDHAb和突变体N179L都优先水解(S)-苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有9.9，而突变体N179L催化的对映体选择率达93.0，为HHDHAb的9.4倍，催化生成的(R)-苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为44.9％。
实施例14
野生型和突变酶V137I-P178A催化合成(R)-苯基缩水甘油醚
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL 80mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入终浓度20mM的苯基缩水甘油醚(结构式参见图2)，30℃恒温水浴反应，反应48min，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H(Daicel Co.，Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为220nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为12.6和8.1。
结果：野生型HHDHAb和突变体V137I-P178A都优先水解(S)-苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有9.9，而突变体V137I-P178A催化的对映体选择率达25.7，为HHDHAb的2.6倍，催化生成的(R)-苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为33.5％。
实施例15
野生型和突变酶R89Y-N179L催化合成(R)-苯基缩水甘油醚
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL 80mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入终浓度20mM的苯基缩水甘油醚(结构式参见图2)，30℃恒温水浴反应，反应40min，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H(Daicel Co.，Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为220nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为12.6和8.1。
结果：野生型HHDHAb和突变体R89Y-N179L都优先水解(S)-苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有9.9，而突变体R89Y-N179L催化的对映体选择率达48.0，为HHDHAb的4.8倍，催化生成的(R)-苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为40.5％。
实施例16
野生型和突变酶R89Y-V137I催化合成(R)-苯基缩水甘油醚
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL 80mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100MM)，加入终浓度20mM的苯基缩水甘油醚(结构式参见图2)，30℃恒温水浴反应，反应15min，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H(Daicel Co.，Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为220nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为12.6和8.1。
结果：野生型HHDHAb和突变体R89Y-V137I都优先水解(S)-苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有9.9，而突变体V137I-P178A催化的对映体选择率达29.0，为HHDHAb的2.9倍，催化生成的(R)-苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为35.1％。
实施例17
野生型和突变酶R89Y-V137I-P178A催化合成(R)-苯基缩水甘油醚
称取0.25g实施例2中得到的野生型和突变体的湿菌体悬浮于10mL 80mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入终浓度20mM的苯基缩水甘油醚(结构式参见图2)，30℃恒温水浴反应，反应50min，取样0.5mL，加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。
样品分析条件如下：
采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H(Daicel Co.，Japan；4.6×250mm，5μm)；色谱条件：柱温30℃；流动相：正己烷：异丙醇＝9:1(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为220nm；(S)-和(R)-底物保留时间(min)分别约为12.6和8.1。
结果：野生型HHDHAb和突变体R89Y-V137I-P178A都优先水解(S)-苯基缩水甘油醚，但是野生型催化的对映体选择性只有9.9，而突变体R89Y-V137I-P178A催化的对映体选择率达34.8，为HHDHAb的3.5倍，催化生成的(R)-苯基缩水甘油醚的ee值大于99％，收率为37.3％。
另外，对野生型和突变体酶V137I、F187L、F187A、R89K、R89Y、P178A、N179Q、N179L-F187L、V137I-N179Q、V137I-P178A-N179L、R89Y-V137I-N179L催化合成(R)-苯基缩水甘油醚结果进行比较，方法同实施例17，具体结果参见下表2。
表2卤醇脱卤酶突变体与野生型催化苯基缩水甘油醚对映选择性比较
Figure BDA0002167649420000261
Figure BDA0002167649420000271
序列表
<110> 盐城工学院
<120> 一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Lys Asn Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Ala Thr His Phe Val
1 5 10 15
Gly Lys Pro Gly Ala Ser Val Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Phe
20 25 30
Ala Gln Asp Ala Ser Phe Val Asp Glu Asn Ala Arg Leu Ala Phe Ser
35 40 45
Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Pro Leu Ala Glu Gln Asp Pro Glu Glu
50 55 60
Val Leu Lys Ala Val Leu Ala Ile Ala Gly His Leu Asp Val Leu Val
65 70 75 80
Asn Asn Asp Ala Tyr Pro Ala Ile Arg Ala Ser Ile Asp Glu Ala Asp
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Tyr Ser Met Tyr Val Ala Ala Arg Gly Gly Ala Asn Ala Leu Ala Val
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Asp Lys Ser Asp Tyr Ile Thr Gly Gln Val Leu Tyr Phe Ala Gly
225 230 235 240
Gly
<210> 2
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gcctctgttt taatcagaga aggggccacg gtatttgcgc aagatgcgtc attcgtggat 120
gaaaatgccc gtcttgcctt ttctgaatta gtgccgggtg taacacccct ggcagagcag 180
gaccccgaag aggttttaaa agccgtattg gctatcgcag gacatctgga tgttctggtc 240
aataatgatg cctatccagc tatcagagcc tcaattgacg aggcggatat tgaagatttc 300
agaaacactt tggatgcgct gttggtaaga ggcttcactt atgcaaaata tgtggctgcc 360
catatgaaaa aacgtggctc gggcaagata atattcatct cgtctgcggt gccaaaacat 420
ggtttaccta attattcgat gtatgtggca gcgcgcggtg gcgcgaacgc gctggcggtg 480
acacttgcca aagagcttgg aaaatcagga attcaagtga actcacttgc gcctaatttt 540
attgaaagcc caacttattt tccaaaagag cttttggaaa acgaagagac tttaaagaaa 600
attacgaagc ccatacctct gggacgcctt ggaaagcccg aagaagcggg ggaatatctc 660
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<210> 3
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Leu Lys Asn Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Ala Thr His Phe Val
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Gly Lys Pro Gly Ala Ser Val Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Phe
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Val Leu Lys Ala Val Leu Ala Ile Ala Gly His Leu Asp Val Leu Val
65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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Gly Trp Ala
<210> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Leu Lys Ala Val Leu Ala Ile Ala Gly His Leu Asp Val Leu Val
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<211> 243
<212> PRT
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agaaacactt tggatgcgct gttggtaaga ggcttcactt atgcaaaata tgtggctgcc 360
catatgaaaa aacgtggctc gggcaagata atattcatct cgtctgcggt gccaaaacat 420
ggtttaccta attattcgat gtatgtggca gcgcgcggtg gcgcgaacgc gctggcggtg 480
acacttgcca aagagcttgg aaaatcagga attcaagtga actcacttgc gcctctattt 540
attgaaagcc caacttatct tccaaaagag cttttggaaa acgaagagac tttaaagaaa 600
attacgaagc ccatacctct gggacgcctt ggaaagcccg aagaagcggg ggaatatctc 660
gcatttctgt cttcagataa gtcagactat atcacagggc aggtgctata ttttgctggt 720
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<210> 29
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Met Leu Lys Asn Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Ala Thr His Phe Val
1 5 10 15
Gly Lys Pro Gly Ala Ser Val Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Phe
20 25 30
Ala Gln Asp Ala Ser Phe Val Asp Glu Asn Ala Arg Leu Ala Phe Ser
35 40 45
Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Pro Leu Ala Glu Gln Asp Pro Glu Glu
50 55 60
Val Leu Lys Ala Val Leu Ala Ile Ala Gly His Leu Asp Val Leu Val
65 70 75 80
Asn Asn Asp Ala Tyr Pro Ala Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Glu Ala Asp
85 90 95
Ile Glu Asp Phe Arg Asn Thr Leu Asp Ala Leu Leu Val Arg Gly Phe
100 105 110
Thr Tyr Ala Lys Tyr Val Ala Ala His Met Lys Lys Arg Gly Ser Gly
115 120 125
Lys Ile Ile Phe Ile Ser Ser Ala Ile Pro Lys His Gly Leu Pro Asn
130 135 140
Tyr Ser Met Tyr Val Ala Ala Arg Gly Gly Ala Asn Ala Leu Ala Val
145 150 155 160
Thr Leu Ala Lys Glu Leu Gly Lys Ser Gly Ile Gln Val Asn Ser Leu
165 170 175
Ala Ala Asn Phe Ile Glu Ser Pro Thr Tyr Phe Pro Lys Glu Leu Leu
180 185 190
Glu Asn Glu Glu Thr Leu Lys Lys Ile Thr Lys Pro Ile Pro Leu Gly
195 200 205
Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Leu Ala Phe Leu Ser
210 215 220
Ser Asp Lys Ser Asp Tyr Ile Thr Gly Gln Val Leu Tyr Phe Ala Gly
225 230 235 240
Gly Trp Ala
<210> 30
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgctgaaaa acaaaaatat cctgatcact gatgcgaccc attttgtcgg aaagcccggc 60
gcctctgttt taatcagaga aggggccacg gtatttgcgc aagatgcgtc attcgtggat 120
gaaaatgccc gtcttgcctt ttctgaatta gtgccgggtg taacacccct ggcagagcag 180
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<210> 31
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Met Leu Lys Asn Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Ala Thr His Phe Val
1 5 10 15
Gly Lys Pro Gly Ala Ser Val Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Phe
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35 40 45
Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Pro Leu Ala Glu Gln Asp Pro Glu Glu
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gcatttctgt cttcagataa gtcagactat atcacagggc aggtgctata ttttgctggt 720
ggttgggcct ag 732
<210> 33
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Met Leu Lys Asn Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Ala Thr His Phe Val
1 5 10 15
Gly Lys Pro Gly Ala Ser Val Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Phe
20 25 30
Ala Gln Asp Ala Ser Phe Val Asp Glu Asn Ala Arg Leu Ala Phe Ser
35 40 45
Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Pro Leu Ala Glu Gln Asp Pro Glu Glu
50 55 60
Val Leu Lys Ala Val Leu Ala Ile Ala Gly His Leu Asp Val Leu Val
65 70 75 80
Asn Asn Asp Ala Tyr Pro Ala Ile Arg Ala Ser Ile Asp Glu Ala Asp
85 90 95
Ile Glu Asp Phe Arg Asn Thr Leu Asp Ala Leu Leu Val Arg Gly Phe
100 105 110
Thr Tyr Ala Lys Tyr Val Ala Ala His Met Lys Lys Arg Gly Ser Gly
115 120 125
Lys Ile Ile Phe Ile Ser Ser Ala Ile Pro Lys His Gly Leu Pro Asn
130 135 140
Tyr Ser Met Tyr Val Ala Ala Arg Gly Gly Ala Asn Ala Leu Ala Val
145 150 155 160
Thr Leu Ala Lys Glu Leu Gly Lys Ser Gly Ile Gln Val Asn Ser Leu
165 170 175
Ala Ala Leu Phe Ile Glu Ser Pro Thr Tyr Phe Pro Lys Glu Leu Leu
180 185 190
Glu Asn Glu Glu Thr Leu Lys Lys Ile Thr Lys Pro Ile Pro Leu Gly
195 200 205
Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Leu Ala Phe Leu Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Gly Trp Ala
<210> 34
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atgctgaaaa acaaaaatat cctgatcact gatgcgaccc attttgtcgg aaagcccggc 60
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ggttgggcct ag 732

Claims (9)

1.一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO. 1所示序列中R位进行单点突变，所述R位为R1位、R2位、R4位中的至少一种，所述R1位为第89位精氨酸，R2位为第137位缬氨酸、R4位为第179位天冬酰胺，当R为R1时，将第89位精氨酸分别突变为酪氨酸和赖氨酸，得到突变体R89Y、R89K；
当R为R2时，将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸，得到突变体V137I；
当R为R4时，将第179位天冬酰胺分别突变为谷氨酰胺和亮氨酸，得到突变体N179Q和N179L；
当R为R1和R2或R4时，将第89位精氨酸突变为酪氨酸且第137位缬氨酸突变为异亮氨酸或将第89位精氨酸突变为酪氨酸且将第179位天冬酰胺突变为亮氨酸，分别得到突变体R89Y-V137I和R89Y-N179L；
当R为R2和R4时，将第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且第179位天冬酰胺突变为谷氨酰胺，得到突变体V137I-N179Q；
当R为R1、R2和R4时，将第89位精氨酸分别突变为酪氨酸、第137位缬氨酸突变为异亮氨酸且将第179位天冬酰胺分别突变为亮氨酸，得到突变体R89Y-V137I-N179L。
2.一种编码如权利要求1所述的提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体的基因。
3.一种携带如权利要求2所述基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体是pET28a(+)，所述重组质粒的表达宿主是E.coliBL21(DE3)。
5.一种表达如权利要求2所述基因的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的制备步骤为：以携带编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的基因的重组质粒为模板，设计合成引物，并通过PCR定点饱和突变或组合突变制备携带编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的基因的重组质粒，进行转化表达宿主。
7.权利要求1所述的提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体、权利要求3所述的重组质粒或权利要求5所述的基因工程菌在制备催化拆分环氧化物开环合成手性环氧化物和手性β-取代醇的催化剂中的应用，所述手性环氧化物为（S）-邻硝基苯基缩水甘油醚、（R）-苄基缩水甘油醚、（R）-苯基缩水甘油醚，所述手性β-取代醇为（R）-1-叠氮-3-（2-硝基苯氧基）-2-丙醇。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述环氧化物为苯基缩水甘油醚、苄基缩水甘油醚和邻硝基苯基缩水甘油醚。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，权利要求5所述基因工程菌制备催化拆分环氧化物开环合成手性环氧化物和手性β-取代醇催化剂的方法如下：将含有卤醇脱卤酶基因的重组工程菌接种于含有质量浓度为50 mg/L卡那霉素的50 mL LB液体培养基于37 ℃，200 r/min条件下培养10 h；然后以1 vt.%的接种量接种到新的含终质量浓度为50 mg/L的卡那霉素的50 mL LB培养基中，仍以37 ℃，200 r/min培养，待培养至光学密度OD600为0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，至终浓度为0.15 mM，在28 ℃，200 r/min下诱导表达12 h；5000×g，5 min离心收集菌体，并以pH 8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬清洗菌体，5000×g离心5 min，收集E. coli菌体，于-20 ℃储存备用。
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