CN111471662A

CN111471662A - SlEH1突变体及其在对映归一水解环氧化物中的应用

Info

Publication number: CN111471662A
Application number: CN202010288719.5A
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 胡博淳; 胡蝶; 柳又祎; 张东; 文正
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111471662B

Abstract

本发明涉及SlEH1突变体及其在对映归一水解环氧化物中的应用，属于酶工程与生物催化领域。本发明通过番茄来源的环氧水解酶(SlEH1)的106和189位进行组合点突变，获得对映归一性提高的突变体。突变体SlEH1^W106T/F189L归一性合成(R)‑1,2‑辛二醇的ee_p值提高至95.4％，相比于野生型酶提高了44.1％；并且SlEH1^W106T/F189L可单次归一性合成400mmol/L(R)‑1,2‑辛二醇，最终得到(R)‑1,2‑辛二醇的ee_p>99.0％，总产率为82.6％，是目前报道的最佳催化剂。并且四种突变体对另外五种脂肪类环氧化物的归一性也有明显提高。

Description

SlEH1突变体及其在对映归一水解环氧化物中的应用

技术领域

本发明涉及SlEH1突变体及其在对映归一水解环氧化物中的应用，属于酶工程与生物催化领域。

背景技术

近年来，随着生物医学以及化工领域的蓬勃发展，人们逐渐地意识到具有光学活性的手性化合物在生物体内的代谢途径、代谢速率、生物毒性及药理等方面表现出较为明显的差异性。因此，制备具有高对映体纯度的手性化合物是目前化学合成工业研究的重要领域。手性环氧化物和邻二醇是其中一种重要的具有高附加值的多功能合成砌块，其主要应用于药物、精细化学品和功能性材料等的合成，具有重要的应用价值。例如，(R)-1,2-辛二醇可用来合成一种HIV-1逆转录酶抑制剂，mniopetal C、(R)-1,2-己二醇则可用来合成一种治疗疟疾和腹泻的天然化合物—umuravumbolide、(R)-7-辛烯-1,2-二醇可应用于合成具有抗癌活性的greensporone C。目前用于(R)-1,2-辛二醇及其类似的脂肪类手性邻二醇的方法中，化学法为主要合成方式。然而，这些化学合成法主要依赖毒性重金属催化剂，同时也存在反应条件苛刻、立体选择性不强和低产率等一系列问题。随着可持续发展浪潮的兴起和生物技术的发展，使用全细胞或酶试剂作为催化剂的生物催化法，被人们视为对化学法的补充或替代。

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH,EC 3.3.2.-)因其来源广泛、底物谱广、反应条件温和立体选择性高等优点而逐渐走进人们的视野。EHs能催化环氧化物的立体选择性开环，通过加成一个水分子生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物(即对映归一性水解或动力学拆分两种形式)。动力学拆分是具有较高对映选择性的EHs优先水解某一构型的环氧化物保留另外一种构型，其理论产率为50％。对映归一性水解则是具有互补区域选择性(regioselectivity)的一种或两种EHs催化外消旋(rac-)环氧化物完全水解，得到其相应高对映体纯度的手性邻二醇，且可达到100％的理论产率。区域选择性系数(regioselectivity coefficients,α_R/β_R和α_S/β_S)用以表示EHs在水解过程中攻击两种构型环氧化物的环氧碳原子时的频率。当EHs水解进攻(S)-环氧化物环氧环上的C_α时，生成反转构型的邻二醇，进攻频率用区域选择性系数α_S表示；当EHs进攻(R)-环氧化物环氧环上的C_β时，生成的邻二醇保持原构型，进攻频率则用β_R表示。华东理工大学许建和课题组，通过对绿豆EH，VrEH2，的定向改造，得到了一株最优突变体，M236N，其可催化rac-对硝基环氧苯乙烷完全转化(α_S＝99％,α_R＝1％)，得到高对映体纯度的(R)-对硝基苯基-1,2-乙二醇(ee_p＝98％,产率为99％)。由于归一性水解得到高ee_p的手性邻二醇要求EHs具有高且互补的α_S和β_R和低的对映选择性，所以目前大多数EHs很难独自实现理想的归一性水解过程。对于归一性合成(R)-1,2-辛二醇及其类似物的脂肪类手性邻二醇，更是无理性的EHs选择。

随着基因工程技术和高通量筛选技术的发展，需要对已知的EHs进行定向改造，赋予或提高EHs的对映归一性，来满足日益增长的工业化需要。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种番茄来源的环氧化物水解酶(SlEH1)突变体，所述突变体具有如下一种或两种以上的位点突变：

W106C、W106I、W106L、W106S、W106T、W106V、F109I、F109L、F109S、F109T、M180C、M180I、M180V、F189I、F189L、F189V、F301I、W106T/F189L、W106T/F189I、W106L/F189L、W106L/F189I、W106T/F109I/F189L、W106T/F109I/F189I、W106L/F109I/F189L、W106L/F109I/F189I、W106T/M180V/F189、W106T/M180V/F189I、W106L/M180V/F189L、W106L/M180V/F189I、W106T/F109I/M180V/F189L、W106T/F109I/M180V/F189I、W106L/F109I/M180V/F189L、W106L/F109I/M180V/F189I。

在一种实施方式中，所述突变体是在如SEQ ID NO.1所示的野生型SlEH1氨基酸序列基础上，将第106位的色氨酸、第189位的苯丙氨酸进行一个或多个突变。

在一种实施方式中，所述突变体是将环氧化物水解酶第106位的色氨酸突变为苏氨酸或亮氨酸，并将第189位的苯丙氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸。

在一种实施方式中，所述突变体为(1)～(4)任一种：

(1)将第106位的色氨酸突变为苏氨酸，并将第189位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，获得的突变体具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)将第106位的色氨酸突变为苏氨酸，并将第189位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸，获得的突变体具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

(3)将第106位的色氨酸突变为亮氨酸，并将第189位的苯丙氨酸突变为亮氨酸。获得的突变体具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

(4)将第106位的色氨酸突变为亮氨酸，并将第189位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸，获得的突变体具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在一种实施方式中，编码突变体SlEH1^W106T/F189L的基因如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，编码突变体SlEH1^W106T/F189I的基因如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，编码突变体SlEH1^W106L/F189L的基因如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，编码突变体SlEH1^W106L/F189I的基因如SEQ ID NO.9所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体上携带所述突变体的编码序列。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的微生物细胞。

在一种实施方式中，将携带编码所述突变体基因的载体转入微生物细胞中，获得表达所述突变体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌细胞。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

本发明的第五个目的是提供一种催化剂，所述催化剂含有具有酶的活性的所述突变体，或含有具有细胞活性的表达所述突变体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述催化剂含有表达所述突变体的微生物细胞及催化剂载体；所述催化剂载体可以为细胞保护剂。

本发明的第六个目的是提供利用所述环氧水解酶突变体或所述微生物细胞水解脂肪类外消旋环氧化物，制备相应的光学纯的手性邻二醇的应用。

在一种实施方式中，所述的脂肪类外消旋环氧化物的化学通式为：

其中取代基R为正丁基、正戊基、正己基、正辛基、正丁烯基或正己烯基。

在一种实施方式中，所述水解是在10～30℃反应1～30h。

在一种实施方式中，底物浓度≥400mmol/L时，水解反应时间≥5h。

在一种实施方式中，以环氧化物酶作为催化剂时，以5～100U/mmol底物的浓度加入所述环氧化物酶。

在一种实施方式中，以表达环氧化物酶的微生物细胞作为催化剂时，以0.1～10g菌体/mmol底物的浓度加入所述微生物细胞。

本发明的有益效果：本发明通过番茄来源的环氧水解酶(SlEH1)的106和189位进行单突变或组合突变，获得对多种脂肪类环氧化物对映归一性明显提高的四种突变体SlEH1^W106T/F189L、SlEH1^W106T/F189I、SlEH1^W106L/F189L和SlEH1^W106L/F189I。SlEH1^W106T/F189L归一性合成(R)-1,2-辛二醇的ee_p值提高至95.4％，相比于野生型酶(51.3％)提高了44.1％；并且SlEH1^W106T/F189L可单次归一性合成400mmol/L(R)-1,2-辛二醇，最终得到(R)-1,2-辛二醇的ee_p>99.0％，总产率为82.6％，是目前报道的最佳生物催化剂。

具体实施方式

(1)底物及产物的分析方法：取200μL样品用1mL乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后通过气相色谱分析，具体为：样品分析采用气相色谱仪GC-2010(Shimadzu公司)、手性气相色谱柱CP-Chiralsil-DEX-CB(安捷伦公司；规格：25m×0.25mm×0.25μm)和氢火焰离子化检测器。分析条件为：进样口和检测器温度250℃；初始柱温110℃，以15℃/min升温至160℃，后在160℃保持5min；载气为氮气，流速3.0mL/min，分流比1:50。rac-1,2-环氧辛烷和(S)-和(R)-1,2-辛二醇的出峰时间分别为2.00、5.42和5.49min。

(2)底物的转化率根据底物的消耗量算出，通过下式计算产率α_S、转化率β_R：

α_S＝[R_d ^S/(R_d ^S+S_d ^S)]×100％；β_R＝[R_d ^R/(R_d ^R+S_d ^R)]×100％；

其中：R_d ^S和S_d ^S分别表示由(S)-1,2-环氧辛烷转化的(R)-和(S)-1,2-辛二醇浓度，R_d ^R和S_d ^R表示由(R)-1,2-环氧辛烷转化的(R)-和(S)-1,2-辛二醇浓度。

(3)通过下式计算产物对映体纯度ee_p：

产物对映体纯度ee_p＝[(R_d-S_d)/(R_d+S_d)]×100％；其中：R_d和S_d表示产物(R)-和(S)-1,2-辛二醇浓度。

实施例1突变酶基因及其相应重组菌的构建

基因工程菌E.coli/sleh1的构建方法参见专利公开号为CN109652354A的专利申请。将重组菌E.coli/sleh1接种于5mL LB培养基中，于37℃、220rpm振荡培养12h。培养结束后，将菌体于13,000rpm下离心1min并收集细胞，利用高纯度质粒小提试剂盒PurePlasmidMini Kit(购于康为试剂有限公司)从E.coli/sleh1中提取得到重组质粒pET28a(+)-sleh1。

设计特异性引物，进行单点迭代突变。设计并合成特异性定点突变引物如下：

W106T-F:5-TTTGTTGTTGCGCATGAT

GGCGCGTTTATTGCTTGG-3'，含突变位点；

W106L-F:5-TTTGTTGTTGCGCATGAT

GGCGCGTTTATTGCTTGG-3'，含突变位点；

F189I-F:5-TACCGCGATCCTGCACCA

TGTTTTCCTAAAGGCAAA-3'，含突变位点；

F189L-F:5-TACCGCGATCCTGCACCA

TGTTTTCCTAAAGGCAAA-3'，含突变位点；

pET28a-R:5-GCCTTACTGGTTAGCAGAATG-3'。

以提取得到的重组质粒pET28a(+)-sleh1为模板，以W106T-F/W106L-F和pET-28a-R分别作为上下游引物，利用PrimeSTAR DNA聚合酶(购自TaKaRa)进行第一轮PCR扩增(95℃4min；98℃10s，58℃10s，72℃3min，30个循环；72℃10min)获得一段大引物W106T/W106L-1st；以大引物W106T/W106L-1st作为引物，重组质粒pET28a(+)-sleh1为模板进行第二轮PCR扩增(95℃4min；98℃10s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min)；第二轮PCR产物经Dpn I消化(25℃，过夜)，后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板37℃培养12～16h，分别获得重组工程菌E.coli/sleh1^W106T和E.coli/sleh1^W106L。然后分别提取重组质粒pET28a(+)-sleh1^W106T和pET28a(+)-sleh1^W106L作为模板，以F189I-F/F189L-F和pET-28a-R分别作为上下游引物，利用同样的两步PCR方法，获得重组质粒，后转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，最终分别获得重组菌E.coli/sleh1^W106T/F189L、E.coli/sleh1^W106T ^/F189I、E.coli/sleh1^W106L/F189L和E.coli/sleh1^W106L/F189I。

实施例2突变酶的诱导表达及纯化

突变酶的诱导表达：将四种重组菌E.coli/sleh1^W106T/F189L、E.coli/sleh1^W106T ^/F189I、E.coli/sleh1^W106L/F189L和E.coli/sleh1^W106L/F189I单菌落分别接种于2mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、220r/min培养过夜；取2mL培养液转接于100mL同样含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加10μL IPTG(终浓度0.05mmol/L)，25℃诱导8h后离心收集菌体，每g湿菌体用5mL磷酸钠缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,50mmol/L,pH 7.5)悬浮得到四种湿菌体终浓度为200mg/mL的菌悬液。

突变酶的纯化：将诱导后离心收集到的四种突变酶的重组菌体，每g湿菌体用5mL纯化缓冲液(Tris-HCl,20mmol/L,pH 7.5)悬浮得到四种湿菌体终浓度为200mg/mL的菌悬液。菌悬液在冰水浴的条件下经超声波破碎(功率200W，超声破碎3s，间隔8s，有效破碎总时长20min)，之后将细胞破碎液低温离心(4℃，12,000×g，离心15min)以分离细胞碎片，上清液经0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤除去杂质后获得重组突变酶的粗酶液。同样用纯化缓冲液预处理装填好的Ni-NTA柱，平衡后上样粗酶液。用含有75mmol/L咪唑的缓冲液(Tris-HCl,20mmol/L,pH 7.5,500mM NaCl)冲洗镍柱以洗去大部分的杂蛋白，再将缓冲液中的咪唑浓度提升至150mmol/L(Tris-HCl,20mmol/L,pH 7.5,500mM NaCl)以洗脱目的蛋白。经镍柱纯化后的洗脱液上样至Sephadex G-25凝胶柱，用磷酸钠(50mmol/L,pH 7.5)缓冲液洗脱，收集的目的蛋白，最后通过10kDa的超滤膜进行浓缩，得到突变酶纯酶液。酶液可根据需要通过预冻或真空冷冻干燥等操作制备冻干粉。

实施例3突变酶的归一性及区域选择性测定

按照实施例2的方法制备菌悬液，并对突变酶的归一性及产率进行测定，分别取250μL重组菌E.coli/sleh1^W106T/F189L、E.coli/sleh1^W106T/F189I、E.coli/sleh1^W106L/F189L和E.coli/sleh1^W106L/F189I的菌悬液，分别悬浮于200μL磷酸钠缓冲液(50mmol/L,pH 7.5)中，再分别加入50μL rac-1,2-环氧辛烷溶液(200mmol/L，溶剂为甲醇)至终浓度为20mmol/L，于20℃、120r/min恒温震荡反应器中反应3h，取200μL反应后的样品用1mL乙酸乙酯萃取，将有机相经无水硫酸镁干燥。采用气相色谱进行检测，结果表明，突变酶SlEH1^W106T/F189L、SlEH1^W106T/F189I、SlEH1^W106L/F189L和SlEH1^W106L/F189I分别催化1,2-环氧辛烷对映归一性水解，产生(R)-1,2-辛二醇的ee_p分别为95.4、91.5、93.7和89.5％，产率分别为93.1、87.6、90.7和84.8％，其产物ee_p以及产率相较于野生型SlEH1皆有明显提高，如表1所示。

表1不同突变体归一性合成(R)-1,2-辛二醇的产率和对映体纯度

对突变酶的区域选择性系数进行测定：分别取250μL适量浓度的四种重组菌的纯酶液悬浮于200μL磷酸钠缓冲液(50mmol/L,pH 7.5)中，后分别加入50μL(S)-和(R)-1,2-环氧辛烷溶液至终浓度为20mmol/L，20℃、120r/min恒温震荡反应器中反应3h。结果表明，四种突变酶SlEH1^W106T/F189L、SlEH1^W106T/F189I、SlEH1^W106L/F189L和SlEH1^W106L/F189I的区域选择性系数α_S分别为96.7、93.3、95.9和93.2％，比野生型酶SlEH1的α_S(55.3％)有明显提高。另外，四种突变酶的β_R分别为98.9、97.4、97.1和96.3％，与野生型酶SlEH1的β_R(96.0％)一样保持在高水平，且有所提高(如表2)。

表2不同突变体的产率α_S、转化率β_R

实施例4突变子SlEH1^W106T/F189L的小试规模制备(R)-1,2-辛二醇

在100mL磷酸钠缓冲液(50mmol/L,pH 7.5)体系中，加入400mmol/L rac-1,2-环氧辛烷(51.3g/L)和200mg/mL的E.coli/sleh1^W106T/F189L菌悬液，20℃、120r/min恒温搅拌反应器中反应20h。用气相色谱监测反应进程，当反应转化率大于99.0％后停止反应。然后用50mL正己烷萃取水相三次，混合有机相，经无水硫酸镁干燥后减压蒸馏得到(R)-1,2-辛二醇的白色固体ee_p为94.7％，产率为96.4％。进一步用正己烷进行重结晶，最终得到(R)-1,2-辛二醇的ee_p>99.0％，总产率为82.6％。

实施例5突变子的底物谱测定

按照实施例2的方法制备重组菌的菌悬液，分别取1mL四种重组菌的菌悬液，悬浮于分别含有20mmol/L rac-1,2-环氧己烷、1,2-环氧庚烷、1,2-环氧葵烷、1,2-环氧-5-己烯和1,2-环氧-7-辛烯的1mL的磷酸钠缓冲液(50mmol/L,pH 7.5)中，20℃、120r/min恒温震荡反应器中反应10h。反应结束后取200μL样品用1mL乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后通过气相色谱分析，色谱分析条件如表3。

表3不同底物的气相色谱分析条件

^a手性GC柱:CB代表Cyclosil-B column(安捷伦公司；规格：30 m×0.25 mm×0.25μm)；β-DEX^TM 120代表β-DEX^TM 120column(Supelco公司；规格：30m×0.25mm×0.25μm)。

催化结果表4所示，四种突变体较野生型针对不同底物的对映归一性皆有明显提高，其中突变体SlEH1^W106T/F189L的提高最为明显。

表4突变体较野生型针对不同底物的对映归一性效果

对比例1

参照实施例4的方法，利用基因工程菌E.coli/sleh1^W106T/F189L在温和条件下对(R)-1,2-辛二醇进行小试规模生物制备，将制备效果与现有技术进行比较，结果显示，底物浓度、对映体纯度及产率均高于已报道的化学及生物方法，如表5。

表5不同催化剂制备(R)-1,2-辛二醇的比较

参考文献：

[1]Zang,C.；Liu,Y.G.；Xu,Z.J.；Tse,C.W.；Guan,X.G.；Wei,J.H.；Huang,J.S.；Che,C.M.Highly enantioselective iron-catalyzed cis-dihydroxylation of alkeneswith hydrogen peroxide oxidant via an Fe^III-OOH reactive intermediate.Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,10253–10257.

[2]Choudary,B.M.；Jyothi,K.；Madhi,S.；Lakshmi Kantam,M.Catalyticasymmetric dihydroxylation of aliphatic olefins with reusable resin-osmiumtetroxide.Adv.Synth.Catal.2003,345,1190–1192.

[3]Yan,L.；Morken,J.P.Site-selective mono-oxidation of 1,2-bis(boronates).Org.Lett.2019,21,3760–3763.

[4]Toribatake,K.；Nishiyama,H.Asymmetric diboration of terminalalkenes with a rhodium catalyst and subsequent oxidation:enantioselectivesynthesis of optically active 1,2-diols.Angew.Chem.Int.Edit.2013,52,11011–11015.

[5]Roy,T.；Barik,S.；Kumar,M.；Kureshy,R.I.；Ganguly,B.；Khan,N.-u.H.；Abdia,S.H.R.；Bajaja,H.C.Asymmetric hydrolytic kinetic resolution withrecyclable polymeric Co(III)-salen complexes a practical strategy in thepreparation of(S)-metoprolol,(S)-toliprolol and(S)-alprenolol computationalrationale for enantioselectivity.Catal.Sci.Technol.2014,4,3899–3908.

[6]Kureshy,R.I.；Singh,S.；Khan,N.U.；Abdi,S.H.；Ahmad,I.；Bhatt,A.；Jasra,R.V.Improved catalytic activity of homochiral dimeric cobalt-salen complex inhydrolytic kinetic resolution of terminal racemic epoxides.Chirality 2005,17,590–594.

[7]Weijers,C.A.G.M.；Botes,A.L.；van Dyk,M.S.；de Bont,J.A.M.Enantioselective hydrolysis of unbranched aliphatic 1,2-epoxides byRhodotorula glutinis.Tetrahedron-Asymmetry 1998,9,467–473.

[8]Botes,A.L.；Weijers,C.A.G.M.；van Dyk,M.S.Biocatalytic resolution of1,2-epoxyoctane using resting cells of different yeast strains with novelepoxide hydrolase activities.Biotechnol.Lett.1998,20,421–426.

对比例2

参照实施例1～2相同策略，分别对第33位苯丙氨酸、106位色氨酸、109位苯丙氨酸、130位缬氨酸、155位异亮氨酸、180位甲硫氨酸、189位苯丙氨酸、266位亮氨酸、267位缬氨酸、301位苯丙氨酸进行单突变或组合突变，对突变体的归一性合成(R)-1,2-辛二醇的产率、转化率和对映体纯度进行测定，结果如表6所示。

表6不同环氧化物水解酶重组菌归一性合成(R)-1,2-辛二醇的对映体纯度、转化率和产率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> SlEH1突变体及其在对映归一水解环氧化物中的应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Lys Ile Glu His Lys Met Val Ala Val Asn Gly Leu Asn Met

1 5 10 15

His Ile Ala Glu Leu Gly Gln Gly Pro Thr Ile Leu Phe Ile His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Met Val Tyr Leu Ala

35 40 45

Glu Arg Gly Tyr Cys Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Thr Gly Ala Pro Leu Asn Asp Pro Ser Lys Phe Thr Ile Phe His

65 70 75 80

Leu Val Gly Asp Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ile Ala Pro Asn Glu

85 90 95

Asp Lys Val Phe Val Val Ala His Asp Trp Gly Ala Phe Ile Ala Trp

100 105 110

His Leu Cys Leu Phe Arg Pro Asp Lys Val Lys Ala Leu Val Asn Leu

115 120 125

Ser Val His Tyr Leu Pro Arg Asn Ser Asn Met Asn Pro Val Glu Gly

130 135 140

Leu Lys Ala Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Glu Gly Asp Ile Glu Ala Glu Phe Ala Pro Ile Gly Ala Lys Ser Val

165 170 175

Leu Lys Lys Met Leu Thr Tyr Arg Asp Pro Ala Pro Phe Cys Phe Pro

180 185 190

Lys Gly Lys Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ser

195 200 205

Thr Trp Leu Ser Glu Glu Glu Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Lys Phe Glu

210 215 220

His Thr Gly Phe Thr Gly Ala Leu Asn Tyr Tyr Arg Ala Leu Ser Met

225 230 235 240

Asn Ala Glu Leu Thr Ala Pro Trp Thr Gly Ala Gln Val Asn Val Pro

245 250 255

Thr Lys Phe Ile Val Gly Glu Phe Asp Leu Val Tyr His Met Arg Gly

260 265 270

Ala Lys Glu Tyr Ile His Asn Gly Gly Phe Lys Lys Tyr Val Pro Leu

275 280 285

Leu Glu Glu Val Val Val Leu Glu Gly Ala Ala His Phe Val Asn Gln

290 295 300

Glu Arg Pro His Glu Ile Ser Lys His Ile Tyr Asp Phe Ile Gln Lys

305 310 315 320

Phe

<210> 2

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Lys Ile Glu His Lys Met Val Ala Val Asn Gly Leu Asn Met

1 5 10 15

His Ile Ala Glu Leu Gly Gln Gly Pro Thr Ile Leu Phe Ile His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Met Val Tyr Leu Ala

35 40 45

Glu Arg Gly Tyr Cys Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Thr Gly Ala Pro Leu Asn Asp Pro Ser Lys Phe Thr Ile Phe His

65 70 75 80

Leu Val Gly Asp Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ile Ala Pro Asn Glu

85 90 95

Asp Lys Val Phe Val Val Ala His Asp Thr Gly Ala Phe Ile Ala Trp

100 105 110

His Leu Cys Leu Phe Arg Pro Asp Lys Val Lys Ala Leu Val Asn Leu

115 120 125

Ser Val His Tyr Leu Pro Arg Asn Ser Asn Met Asn Pro Val Glu Gly

130 135 140

Leu Lys Ala Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Glu Gly Asp Ile Glu Ala Glu Phe Ala Pro Ile Gly Ala Lys Ser Val

165 170 175

Leu Lys Lys Met Leu Thr Tyr Arg Asp Pro Ala Pro Leu Cys Phe Pro

180 185 190

Lys Gly Lys Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ser

195 200 205

Thr Trp Leu Ser Glu Glu Glu Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Lys Phe Glu

210 215 220

His Thr Gly Phe Thr Gly Ala Leu Asn Tyr Tyr Arg Ala Leu Ser Met

225 230 235 240

Asn Ala Glu Leu Thr Ala Pro Trp Thr Gly Ala Gln Val Asn Val Pro

245 250 255

Thr Lys Phe Ile Val Gly Glu Phe Asp Leu Val Tyr His Met Arg Gly

260 265 270

Ala Lys Glu Tyr Ile His Asn Gly Gly Phe Lys Lys Tyr Val Pro Leu

275 280 285

Leu Glu Glu Val Val Val Leu Glu Gly Ala Ala His Phe Val Asn Gln

290 295 300

Glu Arg Pro His Glu Ile Ser Lys His Ile Tyr Asp Phe Ile Gln Lys

305 310 315 320

Phe

<210> 3

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Glu Lys Ile Glu His Lys Met Val Ala Val Asn Gly Leu Asn Met

1 5 10 15

His Ile Ala Glu Leu Gly Gln Gly Pro Thr Ile Leu Phe Ile His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Met Val Tyr Leu Ala

35 40 45

Glu Arg Gly Tyr Cys Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Thr Gly Ala Pro Leu Asn Asp Pro Ser Lys Phe Thr Ile Phe His

65 70 75 80

Leu Val Gly Asp Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ile Ala Pro Asn Glu

85 90 95

Asp Lys Val Phe Val Val Ala His Asp Thr Gly Ala Phe Ile Ala Trp

100 105 110

His Leu Cys Leu Phe Arg Pro Asp Lys Val Lys Ala Leu Val Asn Leu

115 120 125

Ser Val His Tyr Leu Pro Arg Asn Ser Asn Met Asn Pro Val Glu Gly

130 135 140

Leu Lys Ala Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Glu Gly Asp Ile Glu Ala Glu Phe Ala Pro Ile Gly Ala Lys Ser Val

165 170 175

Leu Lys Lys Met Leu Thr Tyr Arg Asp Pro Ala Pro Ile Cys Phe Pro

180 185 190

Lys Gly Lys Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ser

195 200 205

Thr Trp Leu Ser Glu Glu Glu Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Lys Phe Glu

210 215 220

His Thr Gly Phe Thr Gly Ala Leu Asn Tyr Tyr Arg Ala Leu Ser Met

225 230 235 240

Asn Ala Glu Leu Thr Ala Pro Trp Thr Gly Ala Gln Val Asn Val Pro

245 250 255

Thr Lys Phe Ile Val Gly Glu Phe Asp Leu Val Tyr His Met Arg Gly

260 265 270

Ala Lys Glu Tyr Ile His Asn Gly Gly Phe Lys Lys Tyr Val Pro Leu

275 280 285

Leu Glu Glu Val Val Val Leu Glu Gly Ala Ala His Phe Val Asn Gln

290 295 300

Glu Arg Pro His Glu Ile Ser Lys His Ile Tyr Asp Phe Ile Gln Lys

305 310 315 320

Phe

<210> 4

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Glu Lys Ile Glu His Lys Met Val Ala Val Asn Gly Leu Asn Met

1 5 10 15

His Ile Ala Glu Leu Gly Gln Gly Pro Thr Ile Leu Phe Ile His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Met Val Tyr Leu Ala

35 40 45

Glu Arg Gly Tyr Cys Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Thr Gly Ala Pro Leu Asn Asp Pro Ser Lys Phe Thr Ile Phe His

65 70 75 80

Leu Val Gly Asp Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ile Ala Pro Asn Glu

85 90 95

Asp Lys Val Phe Val Val Ala His Asp Leu Gly Ala Phe Ile Ala Trp

100 105 110

His Leu Cys Leu Phe Arg Pro Asp Lys Val Lys Ala Leu Val Asn Leu

115 120 125

Ser Val His Tyr Leu Pro Arg Asn Ser Asn Met Asn Pro Val Glu Gly

130 135 140

Leu Lys Ala Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Glu Gly Asp Ile Glu Ala Glu Phe Ala Pro Ile Gly Ala Lys Ser Val

165 170 175

Leu Lys Lys Met Leu Thr Tyr Arg Asp Pro Ala Pro Leu Cys Phe Pro

180 185 190

Lys Gly Lys Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ser

195 200 205

Thr Trp Leu Ser Glu Glu Glu Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Lys Phe Glu

210 215 220

His Thr Gly Phe Thr Gly Ala Leu Asn Tyr Tyr Arg Ala Leu Ser Met

225 230 235 240

Asn Ala Glu Leu Thr Ala Pro Trp Thr Gly Ala Gln Val Asn Val Pro

245 250 255

Thr Lys Phe Ile Val Gly Glu Phe Asp Leu Val Tyr His Met Arg Gly

260 265 270

Ala Lys Glu Tyr Ile His Asn Gly Gly Phe Lys Lys Tyr Val Pro Leu

275 280 285

Leu Glu Glu Val Val Val Leu Glu Gly Ala Ala His Phe Val Asn Gln

290 295 300

Glu Arg Pro His Glu Ile Ser Lys His Ile Tyr Asp Phe Ile Gln Lys

305 310 315 320

Phe

<210> 5

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Glu Lys Ile Glu His Lys Met Val Ala Val Asn Gly Leu Asn Met

1 5 10 15

His Ile Ala Glu Leu Gly Gln Gly Pro Thr Ile Leu Phe Ile His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Met Val Tyr Leu Ala

35 40 45

Glu Arg Gly Tyr Cys Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Thr Gly Ala Pro Leu Asn Asp Pro Ser Lys Phe Thr Ile Phe His

65 70 75 80

Leu Val Gly Asp Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ile Ala Pro Asn Glu

85 90 95

Asp Lys Val Phe Val Val Ala His Asp Leu Gly Ala Phe Ile Ala Trp

100 105 110

His Leu Cys Leu Phe Arg Pro Asp Lys Val Lys Ala Leu Val Asn Leu

115 120 125

Ser Val His Tyr Leu Pro Arg Asn Ser Asn Met Asn Pro Val Glu Gly

130 135 140

Leu Lys Ala Leu Tyr Gly Glu Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu

145 150 155 160

Glu Gly Asp Ile Glu Ala Glu Phe Ala Pro Ile Gly Ala Lys Ser Val

165 170 175

Leu Lys Lys Met Leu Thr Tyr Arg Asp Pro Ala Pro Ile Cys Phe Pro

180 185 190

Lys Gly Lys Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ser

195 200 205

Thr Trp Leu Ser Glu Glu Glu Leu Asp Tyr Tyr Ala Asn Lys Phe Glu

210 215 220

His Thr Gly Phe Thr Gly Ala Leu Asn Tyr Tyr Arg Ala Leu Ser Met

225 230 235 240

Asn Ala Glu Leu Thr Ala Pro Trp Thr Gly Ala Gln Val Asn Val Pro

245 250 255

Thr Lys Phe Ile Val Gly Glu Phe Asp Leu Val Tyr His Met Arg Gly

260 265 270

Ala Lys Glu Tyr Ile His Asn Gly Gly Phe Lys Lys Tyr Val Pro Leu

275 280 285

Leu Glu Glu Val Val Val Leu Glu Gly Ala Ala His Phe Val Asn Gln

290 295 300

Glu Arg Pro His Glu Ile Ser Lys His Ile Tyr Asp Phe Ile Gln Lys

305 310 315 320

Phe

<210> 6

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggaaaaaa tcgaacacaa aatggttgcg gttaacggtc tgaacatgca catcgcggaa 60

ctgggccagg gtccgaccat cctgttcatc cacggcttcc cggaactgtg gtacagctgg 120

cgtcaccaga tggtttacct ggcggaacgc ggttactgcg cggtggcgcc ggatctgcgt 180

ggctacggtg ataccaccgg cgctccgctg aacgatccga gcaaattcac cattttccac 240

ctggttggcg atctggttgc tctgctggaa gcgattgcgc cgaacgaaga caaagtgttc 300

gttgttgcgc acgacaccgg cgcgttcatc gcatggcacc tgtgcctgtt ccgtccggac 360

aaagttaaag cgctggttaa tctgtctgtt cactacctgc cgcgcaacag caacatgaac 420

ccggttgaag gcctgaaagc actgtacggc gaagattatt acatctgccg ttttcaggaa 480

gaaggtgata tcgaagcgga attcgcgccg atcggcgcga aaagcgttct gaagaaaatg 540

ctgacctacc gtgatccggc gccgctttgc ttcccgaaag gtaaaggcct ggaagcaatc 600

gcggatgcgc cgagcgatct gagcacctgg ctgtccgaag aagaactgga ttactacgct 660

aacaaattcg aacacaccgg tttcaccggc gcgctgaact actaccgtgc tctgtctatg 720

aacgcggaac tgaccgcgcc gtggaccggt gcgcaggtta acgttccgac caaattcatc 780

gttggtgaat tcgatctggt ttaccacatg cgtggcgcga aagaatacat ccacaacggc 840

ggtttcaaaa aatatgttcc gctgctggaa gaagttgttg ttctggaagg tgcggcgcat 900

ttcgttaacc aggaacgtcc gcacgaaatc tctaaacaca tctacgattt catccagaaa 960

ttc 963

<210> 7

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggaaaaaa tcgaacacaa aatggttgcg gttaacggtc tgaacatgca catcgcggaa 60

ctgggccagg gtccgaccat cctgttcatc cacggcttcc cggaactgtg gtacagctgg 120

cgtcaccaga tggtttacct ggcggaacgc ggttactgcg cggtggcgcc ggatctgcgt 180

ggctacggtg ataccaccgg cgctccgctg aacgatccga gcaaattcac cattttccac 240

ctggttggcg atctggttgc tctgctggaa gcgattgcgc cgaacgaaga caaagtgttc 300

gttgttgcgc acgacaccgg cgcgttcatc gcatggcacc tgtgcctgtt ccgtccggac 360

aaagttaaag cgctggttaa cctgtctgtt cactacctgc cgcgcaacag caacatgaac 420

ccggttgaag gcctgaaagc actgtacggc gaagattatt acatctgccg ttttcaggaa 480

gaaggtgata tcgaagcgga attcgcgccg atcggcgcga aaagcgttct gaagaaaatg 540

ctgacctacc gtgatccggc gccgatctgc ttcccgaaag gtaaaggcct ggaagcaatc 600

gcggatgcgc cgagcgatct gagcacctgg ctgtccgaag aagaactgga ttactacgct 660

aacaaattcg aacacaccgg tttcaccggc gcgctgaact actaccgtgc tctgtctatg 720

aacgcggaac tgaccgcgcc gtggaccggt gcgcaggtta acgttccgac caaattcatc 780

gttggtgaat tcgatctggt ttaccacatg cgtggcgcga aagaatacat ccacaacggc 840

ggtttcaaaa aatatgttcc gctgctggaa gaagttgttg ttctggaagg tgcggcgcat 900

ttcgttaacc aggaacgtcc gcacgaaatc tctaaacaca tctacgattt catccagaaa 960

ttc 963

<210> 8

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggaaaaaa tcgaacacaa aatggttgcg gttaacggtc tgaacatgca catcgcggaa 60

ctgggccagg gtccgaccat cctgttcatc cacggcttcc cggaactgtg gtacagctgg 120

cgtcaccaga tggtttacct ggcggaacgc ggttactgcg cggtggcgcc ggatctgcgt 180

ggctacggtg ataccaccgg cgctccgctg aacgatccga gcaaattcac cattttccac 240

ctggttggcg atctggttgc tctgctggaa gcgattgcgc cgaacgaaga caaagtgttc 300

gttgttgcgc acgaccttgg cgcgttcatc gcatggcacc tgtgcctgtt ccgtccggac 360

aaagttaaag cgctggttaa tctgtctgtt cactacctgc cgcgcaacag caacatgaac 420

ccggttgaag gcctgaaagc actgtacggc gaagattatt acatctgccg ttttcaggaa 480

gaaggtgata tcgaagcgga attcgcgccg atcggcgcga aaagcgttct gaagaaaatg 540

ctgacctacc gtgatccggc gccgctttgc ttcccgaaag gtaaaggcct ggaagcaatc 600

gcggatgcgc cgagcgatct gagcacctgg ctgtccgaag aagaactgga ttactacgct 660

aacaaattcg aacacaccgg tttcaccggc gcgctgaact actaccgtgc tctgtctatg 720

aacgcggaac tgaccgcgcc gtggaccggt gcgcaggtta acgttccgac caaattcatc 780

gttggtgaat tcgatctggt ttaccacatg cgtggcgcga aagaatacat ccacaacggc 840

ggtttcaaaa aatatgttcc gctgctggaa gaagttgttg ttctggaagg tgcggcgcat 900

ttcgttaacc aggaacgtcc gcacgaaatc tctaaacaca tctacgattt catccagaaa 960

ttc 963

<210> 9

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggaaaaaa tcgaacacaa aatggttgcg gttaacggtc tgaacatgca catcgcggaa 60

ctgggccagg gtccgaccat cctgttcatc cacggcttcc cggaactgtg gtacagctgg 120

cgtcaccaga tggtttacct ggcggaacgc ggttactgcg cggtggcgcc ggatctgcgt 180

ggctacggtg ataccaccgg cgctccgctg aacgatccga gcaaattcac cattttccac 240

ctggttggcg atctggttgc tctgctggaa gcgattgcgc cgaacgaaga caaagtgttc 300

gttgttgcgc acgaccttgg cgcgttcatc gcatggcacc tgtgcctgtt ccgtccggac 360

aaagttaaag cgctggttaa cctgtctgtt cactacctgc cgcgcaacag caacatgaac 420

ccggttgaag gcctgaaagc actgtacggc gaagattatt acatctgccg ttttcaggaa 480

gaaggtgata tcgaagcgga attcgcgccg atcggcgcga aaagcgttct gaagaaaatg 540

ctgacctacc gtgatccggc gccgatctgc ttcccgaaag gtaaaggcct ggaagcaatc 600

gcggatgcgc cgagcgatct gagcacctgg ctgtccgaag aagaactgga ttactacgct 660

aacaaattcg aacacaccgg tttcaccggc gcgctgaact actaccgtgc tctgtctatg 720

aacgcggaac tgaccgcgcc gtggaccggt gcgcaggtta acgttccgac caaattcatc 780

gttggtgaat tcgatctggt ttaccacatg cgtggcgcga aagaatacat ccacaacggc 840

ggtttcaaaa aatatgttcc gctgctggaa gaagttgttg ttctggaagg tgcggcgcat 900

ttcgttaacc aggaacgtcc gcacgaaatc tctaaacaca tctacgattt catccagaaa 960

ttc 963

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttgttgttg cgcatgatac cggcgcgttt attgcttgg 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttgttgttg cgcatgatct tggcgcgttt attgcttgg 39

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taccgcgatc ctgcaccaat ctgttttcct aaaggcaaa 39

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taccgcgatc ctgcaccact ttgttttcct aaaggcaaa 39

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gccttactgg ttagcagaat g 21

Claims

1.番茄来源的环氧化物水解酶突变体，其特征在于，具有如下一种或两种以上的位点突变：

2.环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是在如SEQ ID NO.1所示的野生型SlEH1氨基酸序列基础上，将第106位的色氨酸、第189位的苯丙氨酸进行一个或多个突变。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的载体。

5.表达权利要求1或2所述突变体的微生物细胞。

6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，宿主选自：E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10，表达权利要求1或2所述的环氧化物水解酶突变体。

7.一种催化剂，其特征在于，含有具有酶的活性的权利要求1或2所述的环氧化物水解酶突变体，或具有生物活性的权利要求5所述的微生物细胞或权利要求6所述的重组大肠杆菌。

8.权利要求1或2所述的环氧水解酶突变体，或权利要求5所述的微生物细胞，或权利要求6所述的重组大肠杆菌在水解脂肪类外消旋环氧化物方面的应用。

9.一种水解脂肪类外消旋环氧化物以制备光学纯的手性邻二醇的方法，其特征在于，以脂肪类外消旋环氧化物为底物，利用权利要求7所述的催化剂在10～30℃催化水解反应。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述脂肪类外消旋环氧化物化学通式为：