具体实施方式
实施例1最后酶序列的获得
利用Chembio3D Ultra 12.0软件模拟底物(R)-pCSO的三维结构并进行能量最小化处理,在己知亲核攻击位点为D101的前提下利用AutoDock 4.2软件将SEQ ID NO:1的酶(其核苷酸如SEQ ID NO:2所示)与(R)-pCSO进行分子对接模拟,并利用Gromacs 4.5软件将对接复合物进行动力学模拟。采用PyMOL软件找出(R)-pCSO周围12埃以内的氨基酸位点。发现,通过在该酶的帽子结构中改构增加2个酪氨酸残基以及在活性中心边缘增加一个组氨酸残基来分别增加将环氧化物中的O原子质子化的能力,同时也提高落入酶活性中心的1个水分子受到组氨酸残基活化的能力。并设计获得了EH-G酶,其相应的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;对照的改构酶EH-T酶,其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。采用全基因合成获得相应的基因。
实施例2酶的表达与纯化
以F1: CATAT Gatgcaactgaacaatgcgaa(SEQ ID NO:7)和R1: CTCGAG tcaatcgataccggcagttc(SEQ ID NO:8)为引物,下划线分别是Nde I和XhoI限制性酶切位点。分别以全合成的SEQ ID NO:2/4/6为模板,扩增条件为94℃3min,35个循环(94℃35s,56℃25s,72℃65s),72℃10min,获得EH、EH-G、EH-T基因编码区cDNA序列,PCR产物回收后与pUCm-T连接,转化E.coli JM109,测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-EH、pUCm-T-EH-G、pUCm-T-EH-T。
用Nde I和Xho I双酶切pUCm-T-EH、pUCm-T-EH-G、pUCm-T-EH-T,割胶回收目的基因EH、EH-G、EH-T,与经同样双酶切的pET-32a(+)连接,获得重组表达质粒pET-32a(+)-EH,pET-32a(+)-EH-G,pET-32a(+)-EH-T,转化E.coli BL21(DE3),经过PCR鉴定,分别获得阳性的工程菌命名为E.coliBL21/pET-32a(+)-EH、E.coliBL21/pET-32a(+)-EH-G、E.coliBL21/pET-32a(+)-EH-T。在IPTG终浓度0.2mmol/L,16℃诱导表达重组目的蛋白。1000mL诱导发酵液经8000r/min离心收集菌体,用5mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)悬浮,采用Ni柱进行目的蛋白纯化。不含目的基因的pET-32a(+)转化E.coli BL21(DE3)作为空白对照,命名为E.coli/pET-32a(+)。结果如图1所示:三种目的蛋白均得到了表达,并且条带大小相同,泳道2和4的对照,没有目的蛋白出现。
实施例3酶活性验证
在2mL EP管中加入100mg酶和150μL磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH7.0),25℃预热5min;加入50μL(R,S)-SO(200mmol/L),25℃反应3.5h后8000r/min离心2min,取100μL上清液于1mL乙酸乙酯(含1mmol/L的正己醇作为内标),激烈震荡,8000r/min离心2min,吸取上层有机相,经无水硫酸镁干燥,过0.22μm有机膜,进行气相色谱分析。具体的气相色谱分析方法为:样品分析采用气相色谱仪GC-2010、手性气相色谱柱CYCLOSIL-B和氢火焰离子化检测器。进样口和检测器温度均为250℃;初始柱温100℃,以5℃/min升温至210℃;载气为氮气,流速2.0mL/min,分流比1∶50。在此检测条件下,正己醇、(R)-SO、(S)-SO、(S)-PED和(R)-PED的保留时间分别为3.742、6.357、6.483、17.409min和17.524min。(R)-PED摩尔产率=(S/RS0)×100%,e.e.=[(S-R)/(S+R)]×100%;其中:S和R分别代表(S)-和(R)-PED的最终摩尔浓度,RS0代表(R,S)-SO的初始摩尔浓度。具体的结果如图2所示,EH-G的酶解效果为99.8%ees,30.5%yield,99.70%eep,69.5%yield,而EH酶解效果为99.4%ees,18.5%yield,99.5%eep,81.5%yield,从结果可以看出EH-G酶不仅具有较好的对映选择性,且具有良好的对映体归一性。本领域熟知,从99.4%ees变为99.8%ees在本领域已经是非常不容易的。相反空白对照和EH-T均没有相应的酶解效果。
实施例4温度稳定性分析
在缓冲液pH为8.0的条件下测定EH和EH-G在不同温度条件下(10-60℃)放置30min的条件下,计算催化pCSO水解的比活力,以最高比活力为100%,计算不同温度条件下EH和和EH-G的相对酶活力。结果如图3所示,由温度稳定性曲线可知当野生型在35摄氏度保温30min后,残余酶活力为61%,40摄氏度保温30min之后只剩下1.2%的活力。EH-G最高相对酶活出现在35摄氏度保温30min的条件,在45摄氏度保温30min时还有接近50%的酶活。从图3可以看出,EH-G酶活高活性区段比野生型有更好的温度范围。由此可见,EH-G具有较好的热稳定性具有更好的工业适用性。
实施例5pH稳定性分析
将实施例2中纯化得到的EH-G酶和EH酶分别于pH 5.O,pH 6.O,pH 7.O,pH 8.O,pH9.O,pH 10.0及室温下放置30min后,于pH 8.0的条件下,按照上述检测方法测定酶的活性,并根据对照组计算残余活力。对照组实验为:EH-G酶和EH酶不经过30min的pH梯度放置,直接于pH8.0测酶活,对应的酶活定义为100。结果显示,EH-G酶在pH5.0,pH6.0,pH10.0放置30min后,残余活力分别是15.6、19.2和16.2;EH酶在pH5.0,pH6.0,pH10.0放置30min后,残余活力分别是11.2、13.2和13.8。EH-G酶和EH酶在pH9残余活力分别是88.9和81.5。这说明pH对EH-G酶和EH酶稳定性的影响基本一致,EH-G酶的在pH8-9具有更好的稳定性。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 陕西斯戴木生物科技有限公司
<120> 一种环氧化物水解酶及其用途
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