CN107988308B

CN107988308B - 一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN107988308B
Application number: CN201810033872.6A
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 宗迅成; 阚婷婷; 胡蝶; 李剑芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN107988308A

Abstract

本发明公开一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明通过菜豆来源的环氧水解酶进行单向定点突变，获得对映选择性与对映归一性提高的突变酶W102L。与野生型相比，W102L对外消旋对氯环氧苯乙烷rac‑pCSO的E值从2.6提高至25.5，对rac‑pCSO的对映选择性提高了9.8倍。使用PvEH1^W102L全细胞动力学拆分150mmol·L^‑1的rac‑pCSO，反应4h后，可获得(R)‑对氯环氧苯乙烷的产率为45.62％(ee_s＝96.30％)和(R)‑对氯苯基乙二醇产率为50.91％(ee_p＝90.26％)。

Description

一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

对映纯对氯环氧苯乙烷(pCSO)与其水解产物对氯苯乙二醇(pCPED)是多种手性药物与功能材料的重要中间体，如R型对氯环氧苯乙烷((R)-pCSO)可以用于合成CB1拮抗剂；R型对氯苯乙二醇((R)-pCPED)是NMDA受体抑制剂——依利罗地的重要手性砌块。目前，一系列合成对映纯pCSO与pCPED的生物化学方法已经被报道。其中，Suresh等人利用一类手性大环席夫碱类化合物催化对氯苯乙烯加氧合成(R)-pCSO，其ee_P最高可达47％；Karboune等人利用来自重组黑曲霉(Aspergillus niger)的环氧化物水解酶(AnEH)水解外消旋对氯环氧苯乙烷制备(R)-pCSO，当转化率达到51％时，ee_P为87％并保留S型底物；Manoj等人使用两种对映选择性互补的EH(StEH与AnEH)协同水解外消旋pCSO合成(R)-pCSO，ee_P达到93％。利用EHs催化制备(R)-pCSO与(R)-pCPED与席夫碱催化合成相比，具有ee_P高，来源清洁，更易分离等优势。

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。该反应的立体化学结果与酶对底物的立体选择性(包括对映选择性与对映归一性)紧密相关：具有对映选择性的EHs快速催化某一构型环氧化物的水解反应，得到相应的产物邻二醇以及保留另一构型环氧化物，即进行酶促动力学拆分。其中，EHs对外消旋环氧化物的对映选择率E决定环氧化物的对映体纯度。若继续反应，另一构型环氧化物也会被水解，即进行酶促对映归一性水解。底物完全转化时，区域选择性系数决定最终产物邻二醇的对映体纯度。环氧化物和邻二醇的对映体纯度通常用对映体过量值ee评价，分别表示为ee_s和ee_p。

EHs广泛存在于各生物体中，如真菌、细菌、古生菌、病毒、植物和哺乳动物等。迄今为止，NCBI数据库中收录的EHs基因序列已达数千个。PDB数据库中与EHs晶体结构相关的数据已达两百多条，根据其晶体结构与催化机理的不同，EHs分为三类：(1)α/β水解折叠EHs，例如有微生物来源的ArEH，植物来源的StEH和动物来源的MmsEH；(2)非α/β水解折叠EHs，例如来源于人的LTA₄H；(3)其他类型，例如来源于红串红球菌的LEH。为了更好地将PvEH1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，对现有的EHs中进行结构和特性方面的优化显得十分必要。

发明内容

为了更好地将PvEH1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，本发明利用定点突变获得了立体选择性提高的PvEH1突变体。本发明采用全质粒PCR的方法对102位色氨酸进行单向定点突变，获得了立体选择性和催化活性同时提高的突变酶W102L，解决了立体选择性不能满足生产高对映纯环氧化物与邻二醇的需求，为拓宽PvEH1的工业应用奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种催化外消旋环氧化物的方法，所述方法是向含有外消旋环氧化物的体系中加入SEQ ID NO.1所示的环氧化物水解酶或表达SEQ ID NO.1所示的环氧化物水解酶的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述含有外消旋环氧化物的体系为溶液体系。

在本发明的一种实施方式中，所述外消旋环氧化物包括但不限于外消旋对氯环氧苯乙烷。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在pH为6～8的有机相中进行催化反应。

在本发明的一种实施方式中，所述有机相包括但不限于甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SEQ ID NO.1所示的环氧化物水解酶表达至大肠杆菌中，培养菌体细胞，以200～280U/g底物的添加量加入所述细胞，催化外消旋对氯环氧苯乙烷生成R型对氯环氧苯乙烷及R型对氯苯乙二醇。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SEQ ID NO.1所示的环氧化物水解酶表达至大肠杆菌中，培养菌体细胞，以235U/g底物的添加量加入所述细胞，催化外消旋对氯环氧苯乙烷生成R型对氯环氧苯乙烷及R型对氯苯乙二醇。

本发明还提供所述环氧化物水解酶在食品、医药领域水解外消旋环氧化物方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备手性药物或功能材料。

本发明的有益效果：

本发明通过菜豆来源的环氧水解酶1(PvEH1)的Trp102进行单向定点突变，获得对映选择性与对映归一性(即立体选择性)提高的突变酶W102L。与野生型相比，W102L对外消旋对氯环氧苯乙烷rac-pCSO的E值从2.6提高至25.5，这表明W102L对rac-pCSO的对映选择性提高了9.8倍。同时，该突变体的稳定性没有发生变化，有利于酶在工业生产上的应用

附图说明

图1为PvEH1W102L拆分pCSO液相色谱分析以及ee_s与初始底物浓度关系；(a)为全细胞催化反应的液相色谱分析；(b)为ee_s与初始底物浓度关系；

图2为PvEH1W102L全细胞动力学拆分rac-pCSO进程曲线。

具体实施方式

突变体命名方式：

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如W102L，表示位置102的氨基酸由亲本PvEH1的Trp替换成Leu，位置的编号对应于亲本PvEH1的氨基酸序列。

全细胞比活力和对映选择性测定：称取100mg重组菌湿菌体悬浮于1mL磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH＝7.0)中，吸取200μL菌悬液(100mg·mL^-1)加入到含750μL磷酸钠缓冲液的2mL EP管中，25℃孵育5min后加入50μL rac-pCSO(200mmol·L^-1，溶剂为甲醇)至终浓度为10mmol·L^-1，25℃、800r·min^-1恒温震荡反应器中反应10min，取50μL样品用1mL乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥。样品分析采用高效液相色谱仪Waters e2695、手性液相色谱柱和紫外检测器。rac-pCSO高效液相色谱条件为：流动相为正己烷:异丙醇＝80:20，柱温为30℃，流速为0.8mL·min^-1，检测波长为220nm，手性液相色谱柱AS-H(250mm×4.6mm×5μm)。(R)-对氯环氧苯基乙烷((R)-pCSO)：6.290min，(S)-p对氯环氧苯基乙烷((S)-pCSO)：7.062min，(R)-对氯苯基乙二醇((R)-pCPED)：7.977min，(S)-对氯苯基乙二醇((S)-pCPED)：9.059min。在上述测定条件下，酶活单位定义为每分钟消耗1μmol的pCSO或rac-mCSO所需的酶量定义为1个单位酶活(U)。全细胞比活力(U·g^-1)计算如公式(1)所示，其中c全细胞催化rac-pCSO或rac-mCSO的转化率，C₀为初始浓度，t为反应时间，v为反应体积，m为全细胞质量。

底物ee_s和产物ee_p的计算公式(2)和(3)所示，其中R_s和S_s分别代表(R)-pCSO和(S)-pCSO的峰面积，R_p和S_p表示(R)-pCPED和(S)-pCPED的峰面积^[17]。酶的对映选择性通常用对映体比率(enantiomeric ratio,E)来评价，E值越高，则对映选择性越高，其计算公式如(4)，其中c是转化率。

实施例1：突变质粒构建

利用高纯度质粒小提试剂盒PurePlasmid Mini Kit(购于康为试剂有限公司)从实验室保藏的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pveh1(叶慧华,胡蝶,李闯,等.新型菜豆环氧化物水解酶的异源表达及对映归一性催化特性[J].中国生物工程杂志,2016,36(10):21-27.169:41-54.)中提取质粒作为单向定点突变的模板，

所用的引物为W102L-F(5’-3’GTTGCCCATGATCTCGGAGCCCTAGTA)；W102L-R(TACTAGGGCTCCGAGATCATGGGCAAC)。

利用

HS PCR酶(购于TaKaRa公司)采用全质粒PCR的方法。以PvEH1的质粒为模板，PCR条件：变性98℃，10s；退火55℃，5s；延伸72℃，3.5min，循环30次，72℃延伸10min。PCR产物经采用Dpn I酶消化模板质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化参照SK9302超级感受态细胞制备试剂盒使用说明书，突变体经测序确认碱基序列。得到了氨基酸序列为SEQ ID NO:1的突变酶，与野生酶(Phaseolus vulgaris来源的PvEH1，GenBankaccession no.XM007146940)相比，第102位的氨基酸由色氨酸突变成了亮氨酸。

实施例2：突变体酶的获取

将获得的突变酶表达载体接种(接种量为1％)于2mL含1％卡那霉素的LB培养基中，于37℃、220r·min^-1培养过夜；取2mL培养液转接于100mL含1％卡那霉素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入100μL的IPTG(500mmol·L^-1)至终浓度为0.5mmol·L^-1，20℃下诱导10h后离心收集重组菌菌体。经测定，菌体的环氧化物水解酶对rac-pCSO的酶活为27U/g菌体。

实施例3：全细胞催化初始底物浓度分析

在2mL EP管中加入湿菌体菌悬液浓度为200mg·mL^-1的PvEH1^W102L全细胞，底物初始浓度从0到300mmol·L^-1的rac-pCSO，缓冲液为磷酸钠缓冲液(pH＝7.0，100mmol·L^-1)，反应体系为1mL，25℃、220r·min^-1恒温摇床中反应12h后，取50μL样品用1mL乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后HPLC测定ee_s。

如图1(a)所示，利用PvEH1^W102L全细胞催化rac-pCSO水解过程中未见明显的副产物生成，其中(S)-pCSO被PvEH1^W102L优先催化水解为(R)-pCPED。

采用终浓为200mg·mL^-1的PvEH1^W102L分别拆分初始浓度从50到300mmol·L^-1不等的rac-pCSO，反应12h，结果如图1(b)。当底物初始浓度≤150mmol·L^-1时，最终ee_s均可到达99％，这意味着经过24h反应后(S)-pCSO基本被水解完全。而当底物初始浓度大于150mmol·L^-1时，体系中的(S)-pCSO不能被完全水解。

实施例4：全细胞催化反应进程

在2mL EP管中加入湿菌体菌悬液浓度为200mg·mL^-1的PvEH1^W102L全细胞，底物初始浓度为150mmol·L^-1的rac-pCSO，缓冲液为磷酸钠缓冲液(pH＝7.0，100mmol·L^-1)，反应体系为1mL，25℃、220r·min^-1恒温摇床中，反应不同时间取50μL样品用1mL乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后使用HPLC测定残余(R)-pCSO和(S)-pCSO的浓度、ee_s、ee_p和c绘制反应进程曲线。

通过对于PvEH1^W102L全细胞动力学拆分初始浓度为150mmol·L^-1的rac-pCSO定期取样监测(结果如图2)，发现在PvEH1^W102L催化的rac-pCSO水解开环反应中，产物(R)-pCPED的ee_p可达到90％以上，符合利用生物催化法生产高对映纯(R)-pCPED的工业要求；此外，反应过程中(S)-pCSO的浓度从初始的75mmol·L^-1经过4h的反应快速下降到了1.29mmol·L^-1，仅为初始浓度的0.8％。此时(R)-pCSO的产率为45.62％，(S)-pCSO的保留率仅为0.8％，ee_s为96.30％，并且(R)-pCPED产率达到了50.91％，ee_p为90.26％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Gly Val Glu His Arg Thr Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met

1 5 10 15

His Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ala Leu Ser

35 40 45

Ala Leu Gly Tyr Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Asp Ala Pro Ala Ser Val Ser Ser Tyr Thr Ile Leu His Leu Val

65 70 75 80

Ala Asp Val Val Ala Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Asp Gln Val Phe

85 90 95

Leu Val Ala His Asp Leu Gly Ala Leu Val Gly Trp Tyr Thr Cys Leu

100 105 110

Phe Arg Pro Asp Arg Ile Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Phe

115 120 125

Met Pro Arg Asn Pro Lys Val Lys Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Leu

130 135 140

Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu Pro Gly Lys Met

145 150 155 160

Glu Thr Leu Tyr Asp Asn Asn Ile Glu Glu Ala Ile Lys Asn Met Leu

165 170 175

Thr Ser Arg Arg Pro Gly Pro Pro Ile Leu Pro Lys Glu Gly Ala Gly

180 185 190

Ser Asn Pro Leu Ala Ser Gly Ser Leu Pro Ser Arg Pro Leu Pro Ser

195 200 205

Trp Leu Ser Gln Glu Asp Leu Thr Tyr Tyr Ala Ser Lys Phe Gly Lys

210 215 220

Thr Gly Leu Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Leu Asn Leu Asn

225 230 235 240

Trp Glu Leu Thr Ala Ala Trp Thr Gly Val Gln Val Lys Val Pro Val

245 250 255

Lys Phe Ile Thr Gly Asp Leu Asp Ile Val His Thr Ser Leu Gly Thr

260 265 270

Lys Asp Tyr Ile Glu Ser Gly Ala Phe Lys Arg Asp Val Pro Phe Leu

275 280 285

Glu Glu Val Val Val Gln Glu Gly Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu

290 295 300

Ala Ala Glu Asp Val Ser Asn His Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe

305 310 315 320

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccatggg cagcagccat 60

catcatcatc atcacagcag cggcctggtg ccgcgcggca gccatatgga aggcgtagaa 120

cacaggacag tggaagtgaa tggcatcaaa atgcatgtag cagagaaagg agagggtcct 180

gtcgtcttgt tcctccatgg cttccccgag ctctggtact cctggcgcca ccagattctg 240

gctctcagcg ccctcgggta ccgcgccgtg gctcctgatc tgcgtggcta cggagacacc 300

gatgccccgg cttcggtgag cagctacacc atcttgcacc tcgtggctga cgtcgtggca 360

ctcattgact cacttggtgt ggatcaagtc ttcctcgttg cccatgatct cggagcccta 420

gtaggatggt acacatgttt atttcgacct gatagaatca aggcctatgt ttgcctcagc 480

gtccctttca tgcccagaaa cccaaaagtg aagcccgttg atgccatgcg tgccctttat 540

ggggatgact actacatctg cagattccag gaaccaggca agatggaaac tctgtatgac 600

aataatatcg aagaagcaat caagaacatg cttacaagta ggagaccagg accaccaatc 660

ctccccaaag aaggagcggg ttccaatccc cttgcttcag ggtcccttcc atcaaggcct 720

cttccatctt ggctctcaca ggaagatctg acttactatg cttctaaatt tggcaagaca 780

ggcttaactg gtggcctcaa ctactataga aatctcaacc tcaattggga gctcacagca 840

gcatggactg gagttcaagt caaagttcct gtgaagttca ttacaggtga tttggatata 900

gttcacacct cactggggac caaagactac atagagagtg gtgctttcaa gagagatgtg 960

ccatttttgg aggaagtggt tgtgcaggaa ggggttgctc acttcaacaa ccaagaagct 1020

gcagaggatg tcagcaatca catttatgat tttatcaaca agttctgact cgagcaccac 1080

caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaa 1125

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttgcccatg atctcggagc cctagta 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tactagggct ccgagatcat gggcaac 27

Claims

1.一种催化外消旋环氧化物的方法，其特征在于，所述方法是向含有外消旋环氧化物的体系中加入SEQIDNO.1所示的环氧化物水解酶或表达SEQIDNO.1所示的环氧化物水解酶的细胞，环氧化物水解酶的添加量为200~280U/g底物，所述方法催化外消旋对氯环氧苯乙烷生成R型对氯环氧苯乙烷和R型对氯苯乙二醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有外消旋环氧化物的体系为溶液体系。

5.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，在pH为6~8的有机相中进行催化反应。

6. SEQIDNO.1所示的环氧化物水解酶在食品、医药领域水解外消旋环氧化物方面的应用。

7. SEQIDNO.1所示的环氧化物水解酶在制备手性药物或功能材料方面的应用。

8.权利要求1~4任一项所述的方法在制备含有对氯环氧苯乙烷和/或R型对氯苯乙二醇的药物方面的应用。