EP1673463A1 - Procede de transformation d' epoxydes porteurs de groupes trifluoromethyle - Google Patents

Procede de transformation d' epoxydes porteurs de groupes trifluoromethyle

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Publication number
EP1673463A1
EP1673463A1 EP04791538A EP04791538A EP1673463A1 EP 1673463 A1 EP1673463 A1 EP 1673463A1 EP 04791538 A EP04791538 A EP 04791538A EP 04791538 A EP04791538 A EP 04791538A EP 1673463 A1 EP1673463 A1 EP 1673463A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
epoxide
diol
protein
activity
epoxides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04791538A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Justine Deregnaucourt
Alain Archelas
Roland Furstoss
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Rhodia Chimie SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Rhodia Chimie SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Rhodia Chimie SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1673463A1 publication Critical patent/EP1673463A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D301/00—Preparation of oxiranes
    • C07D301/32—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the subject of the present invention is a process for the hydrolysis of fluorinated epoxides comprising one or more CF 3 groups, and more particularly a process for treating a mixture of (R) and (S) enantiomers of such fluorinated epoxides, so as to enrich the mixture with one of the enantiomers of this epoxide and obtain in parallel the vicinal diol corresponding to the other enantiomer.
  • the subject of the invention is also a process for producing the enantiomers and / or the vicinal diols in enantiopure or enantiomerically enriched form. Another application of this process is the non-enantioselective biohydrolysis of a racemic or non-racemic epoxide.
  • Epoxides are very important intermediates in organic synthesis because they have a high reactivity. They combine the advantage of having a high cycle voltage and having a nucleofuge oxygen atom. The presence of an asymmetric carbon leads to molecules having two distinct stereoisomeric forms (enantiomers), the form (R) and the form (S), one being the image of the other in a mirror. It may be important, in certain cases, to have only one of these forms and it is then necessary to have means for separating these two stereoisomers or for specifically synthesizing the desired stereoisomer. Fluorinated molecules have an interesting positioning both in agrochemistry and in pharmacy.
  • EP-A-0 611 826 describes a process for the production of optically enriched epoxides using microscopic fungi chosen from various genera. Depending on the fungus used, the reaction makes it possible to prepare the form (R) or the form (S) of an epoxide.
  • WO-A-0068394 describes the isolation, cloning and over-expression of an enzyme called epoxide hydrolase from a fungus of the genus Aspergillus and the use of this epoxide hydrolase for the preparation of enantiomerically enriched molecules from mixtures of isomers of epoxy compounds described in very general terms.
  • the main object of the present invention is therefore to propose a process allowing the hydrolysis of epoxides carrying trifluoromethyl units. It relates more particularly to such a process allowing the separation of the enantiomers (R) and (S) of epoxides carrying trifluoromethyl units from a mixture - racemic or non-racemic - of enantiomers of said epoxide.
  • Another objective of the invention is to propose such a process which can be used for the preparation of epoxides or diols as intermediates for the synthesis of pharmaceutical, agrochemical or phytosanitary products.
  • epoxides carrying trifluoromethyl units can be hydrolyzed with opening of the epoxide and formation of a diol, and moreover that these epoxides can be separated enantioselectively, using an epoxide hydrolase.
  • an epoxide hydrolase such as that of Aspergillus niger LCP521. This allowed them to develop a process for enantioselective transformation epoxides - racemic or non-racemic - to CF 3 , based on the use of this epoxide hydrolase or of a protein or analogous polypeptide having an epoxide hydrolase activity on epoxides with trifluoromethyl motif.
  • the transformation can be carried out under conditions which are not or little enantioselective, and this variant can be used for a non or little enantioselective hydrolysis of epoxides.
  • the present invention therefore relates to a process for the hydrolysis of a fluorinated epoxide comprising one or more CF 3 groups, preferably an epoxide of formula (I) as described below, process in which the epoxide is treated presence of water with a protein having an epoxide hydrolase (EH) activity on the epoxides at CF 3 so as to induce the opening of the epoxide and the formation of the vicinal diol.
  • EH epoxide hydrolase
  • the epoxide may be an (R) or (S) isomer, or a mixture, racemic or non-racemic, of these isomers.
  • the present invention relates more particularly to a process for transforming a mixture of enantiomers (R) and (S) of a fluorinated epoxide comprising one or more CF 3 ⁇ groups, preferably an epoxide of formula (I), into a mixture enriched in one of the isomers and in diol corresponding to the other isomer, process in which: (A) a mixture of (R) and (S) enantiomers of the epoxide according to the invention is treated with (B ) a protein having an epoxide hydrolase (EH) activity on the epoxides at CF 3 , the process leading to the preferential opening either of the epoxide (R) to diol (R) or of the epoxide (S) to diol ( S).
  • EH epoxide hydrolase
  • the opening of an epoxide by a molecule of water is said to be “preferential”, in the sense that the protein has a higher affinity and catalytic constant for one of the enantiomers compared to the other, this which results in a higher rate of hydrolysis of this enantiomer. It is therefore possible, by controlling the hydrolysis reaction, in particular by stopping this reaction at the appropriate time, to obtain at a given instant a composition enriched in epoxide (R) or (S) and in diol of opposite absolute configuration.
  • the process according to the invention generally leads to a resolution reaction in which an enantiomer of the epoxide of configuration (R) or (S) is opened to give the corresponding diol.
  • the epoxide hydrolase according to the invention can therefore induce an enantioselective hydrolysis of these particular epoxides, in remarkable and unexpected proportions.
  • the transformation has a particularly advantageous enantioselectivity character when the enantioselectivity coefficient (E) (see infra) is greater than or equal to 10, preferably greater than or equal to 30.
  • EH can preferentially hydrolyze either the (R) isomer or the (S) isomer. It turns out that with the majority of epoxides, EH preferentially hydrolyzes the (R) isomer.
  • the process can comprise a subsequent step of separation of the epoxide (S) from the diol (R) or conversely the separation of the epoxide (R) from the diol (S), so as to recover on the one hand an enantiomerically enriched composition in epoxide and on the other hand a composition enriched in diol.
  • the separation step leads to recovering a composition enriched in epoxide (S) and a composition enriched in diol (R).
  • the separation step results in recovering a composition enriched in epoxide (R) and a composition enriched in diol (S).
  • At least one other treatment of the composition enriched in epoxide with the enzyme can be carried out if necessary, followed by extraction and separation.
  • the composition enriched in diol (R) or (S) can be subjected to a cyclization of the diol (R) or (S) to epoxide (R) or (S), then, if necessary, to at least one other treatment with the enzyme. , followed by a new cyclization.
  • the objective of successive treatments (2 or more) is to improve, if necessary, the enantiomeric excess of the corresponding enantiomer.
  • the epoxides targeted by the invention comprise one or more CF 3 groups, preferably from 1 to 3, and preferably they correspond to formula (I):
  • the group R represents an alkyl, alkenyl, cycloalkyl, aryl or aralkyl group, optionally substituted by alkyl, alkoxy, alkylthio or halogen; R optionally comprising one or more heteroatoms such as O or S; alkyl, alkoxy, alkylthio substituents comprising a C1-C6, preferably CC 3 , linear, branched or cyclic hydrocarbon chain and optionally comprising one or more halogen atoms, such as Cl, F, Br, preferably F; the group R ′ represents H or a linear, branched or cyclic C T C 10 alkyl, preferably CC 2 or C 3 and optionally comprising one or more heteroatoms, in particular halogen atoms, such as Cl, F, Br, preferably F or heteroatoms such as O or S; - it being understood that at least one of the radicals R and R ′ is, or comprises, one or more, preferably from 1 to
  • the epoxide of formula (I) is such that R 'is H or a linear alkyl in d, C 2 or C 3 , better still R' is H or C ⁇ alkyl optionally substituted by a or more halogen atoms, preferably F, for example substituted by 3 atoms of F.
  • the groups R can comprise from 1 to 20 C, in particular from 1 to 12 O When R is alkyl substituted by a halogen, R can be CF 3 .
  • the R groups can be substituted by from 1 to 3 groups chosen from trifluoromethyl, trifluoromethoxy and trifluoromethylthio.
  • the alkyl groups R can be linear or branched.
  • the alkyl group R comprises from 1 to 3 groups CF 3 .
  • the cycloalkyl groups R preferably contain from 3 to 10 C, preferably from 3 to 8 C, better still 5 to 7 C.
  • cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cyclooctyl optionally substituted by one or more atoms of halogen, such as Cl, F, Br, preferably F.
  • the cycloalkyl group R comprises from 1 to 3 CF 3 groups.
  • the aryl groups R may for example be the phenyl and naphthyl groups, optionally substituted by one or more halogen atoms, such as Cl, F, Br, preferably F.
  • the aryl group R comprises from 1 to 3 groups CF 3 .
  • the phenyl groups thus substituted are preferred modalities.
  • the aralkyl groups R may especially comprise from 7 to 18 C. Mention may be made, by way of examples, of the benzyl, 1-methylbenzyl, 2-phenylethyl, 3-phenylpropyl, 4-phenylbutyl, 1-naphthylmethyl, 2-naphthylmethyl groups, optionally substituted by one or more halogen atoms, such as Cl, F, Br, preferably F.
  • the aralkyl group R comprises from 1 to 3 CF 3 groups.
  • the epoxides comprising a phenyl radical R comprising a phenyl group carrying from 1 to 3, preferably 1 or 2 CF 3 groups, optionally trifluoromethoxy or trifluoromethylthio are preferred methods of the invention. It can also be specified that these groups can be in para, ortho or meta with respect to the carbon of the phenyl linked to the oxirane. However, a substitution for para or meta is preferred, and more preferably still for para. These preferred epoxides can also have a gem-disubstitution with an R 'preferably chosen from CrC 3 alkyls, preferably CH 3 .
  • epoxides can also be optionally substituted by one or more halogen atoms, such as Cl, F, Br, preferably F.
  • halogen atoms such as Cl, F, Br, preferably F.
  • Epoxide hydrolase A protein with epoxide hydrolase (EH) activity on epoxides at CF 3 is represented by the protein having as amino acid sequence the sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • This protein is the epoxide hydrolase of ⁇ 'Aspergillus niger registered at the Museum of Natural History (Paris) under number LCP521 (Laboratory of Cryptogamy, 12 rue Buffon, 75005 Paris, France).
  • This protein has been described in publication WO-A-00 68394, to which a person skilled in the art can refer to the need.
  • This protein constitutes for the purposes of the present invention, the reference protein, and at the same time constitutes a preferred embodiment.
  • the protein can also be a “variant”, “homologous” or “derivative” of the reference protein, which by definition has, like the reference protein, EH activity on a CF 3 epoxide, and preferably an activity biological at least identical, similar or analogous to the reference protein on the same substrate.
  • the preferred proteins are those having, for a given substrate, an enantioselectivity coefficient E greater than or equal to 10, preferably 30, more preferably 50, and better still 100, the enantioselectivity coefficient E being defined by the following formula:
  • the present invention defines below, and implements in the examples, a so-called monophasic method and a so-called biphasic method, which correspond to two embodiments.
  • the EH activity of the reference protein such as that of a "variant”, “homologous” or “derivative” can be evaluated for a given substrate, on the basis of these methods, and a comparison can be made between the performance of the reference protein and that of the other protein or proteins tested.
  • EH protein reference protein, “variant”, “homologous”, or “derivative”
  • an EH protein reference protein, “variant”, “homologous”, or “derivative”
  • an enzymatic solution is prepared: for example, 2 mg of enzymatic extract of the HE to be evaluated (purity of the order of 25%) are dissolved in 2.320 ml of distilled water; the solutions are placed at 27 ° C for 30 min; 100 ⁇ L of enzyme solution are then added to the reaction medium; regular samples of the reaction medium make it possible to monitor the formation of the diol during the reaction: 400 ⁇ L of the reaction medium are added to 200 ⁇ L of acetonitrile; after stirring with a vortex, extract with 400 ⁇ L of isooctane; for each sample, the organic phase is injected in chiral
  • a test or a similar test eg developed on the basis of this description, makes it possible to determine, in a panel of at least two proteins with EH activity, that (or those) which turns out to be the most efficient on a given substrate. More generally, such a test or a similar test makes it possible to determine the proteins, “variants”, “homologs”, and “derivatives” capable of leading, for a given substrate, to a coefficient E greater than or equal to 10, preferably to 30.
  • the present invention therefore allows a person skilled in the art to select the enzyme best suited to the substrate that he wishes to transform.
  • the protein has an EH activity on a CF 3 epoxide which is identical or substantially identical to the reference epoxide hydrolase.
  • a protein can be of natural origin, coming for example from an organism of the genus Aspergillus, from another microscopic fungus or from any other living source (bacteria, yeast, plant etc.) or even of synthetic or recombinant origin.
  • a naturally occurring protein may have been modified to give a synthetic or recombinant derivative protein or polypeptide.
  • "Variant”, “homologous”, or “derivative” proteins can be defined as comprising: i. the sequences having a percentage of homology equal to or greater than 40%, preferably 80%, more preferably 85%, even more preferred to 90%, and better still to 95, 96, 97, 98 or 99% with SEQ ID NO: 2, the protein thus defined having an EH activity on epoxides at CF 3 ; ii.
  • the sequences comprising at least 10, preferably at least 20, more preferably at least 50 or 100 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 2 or of a sequence as defined under i, the protein thus defined having EH activity on CF 3 epoxides.
  • the invention employs such a "variant”, “homologous” or “derivative” protein which has, for a given substrate, an enantioselectivity coefficient E greater than or equal to 10, preferably 30.
  • the term "homology” preferably refers to the identity between the amino acids being compared.
  • substitutions which are substitutions of amino acids of the same class, such as substitutions of amino acids with uncharged side chains (such as asparagine, glutamine, serine, threonine, and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as aspartic acid and glutamic acid), amino acids with nonpolar side chains (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, praline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine ), these substitutions with similar amino acids not significantly affecting the biological activity of the reference protein, and preferably leading to a protein retaining or increasing the biological activity of the reference protein More generally, by “variant, homologous, or derivative amino acid sequence”, therefore is meant any amino acid sequence which differs from the reference sequence by substitution, deletion and / or insertion of one or
  • this sequence constituting a protein or a polypeptide having an EH activity on epoxides at CF 3 , the modifications not significantly affecting the biological activity of the reference protein, and preferably retaining the biological activity of the reference protein or increasing biological activity compared to the reference protein
  • It can therefore be a protein or polypeptide comprising or essentially consisting of a fragment of SEQ ID NO: 2 or of a sequence such as defined under i, for example of a fragment formed by amino acids 1-339 or a homologous sequence.
  • Homology is usually determined using sequence analysis software (for example, Blast Software, National Center for Biotechnology Information, US
  • the degree of homology is established by recording all the positions for which the amino acids of the two sequences compared are identical or similar, relative to the total number of positions.
  • the “variant”, “homologous” or “derived” proteins or polypeptides are the same length or substantially the same length as the reference sequences.
  • Allelic variants derived from or derived from strains of microorganisms, eg from A niger, which have a biological activity similar to the reference protein are also considered to be homologous.
  • the proteins or polypeptides can also be chemically or enzymatically modified to improve their stability or their bioavailability.
  • the protein is provided in the form of a concentrated and / or purified preparation, obtained from a culture of a producing microorganism, in particular microscopic fungus, eg A. niger, in particular LCP521. We then speak of "natural" protein.
  • Such a preparation can be obtained by a step of extracting the enzyme from a cell culture, eg by mechanical lysis (for example passage through a French press) or chemical (including enzymatic), followed by a step of removing cellular debris and recovering the liquid phase, which may include a centrifugation step (preferably at low speed, eg of the order of 10,000 g) and / or appropriate filtration, with recovery of the centrifuge supernatant or filtrate. It is then preferable to concentrate the enzyme, eg by ultrafiltration. It is also preferred to carry out a purification of the enzyme and this can be done by chromatography methods, in particular by successive passages on ion exchange and / or exclusion columns, such as for example DEAE-Sepharose.
  • the preparation results from an extraction, followed by centrifugation, recovery of the supernatant, then concentration and preferably purification.
  • the producing microorganism can be modified by genetic engineering to overexpress the enzyme, as described below.
  • the protein is a so-called “recombinant” protein, and this recombinant protein can optionally be in the form of protein fusion.
  • a recombinant protein can be produced by a method in which a vector containing a nucleic acid encoding the protein is transferred into a host cell which is cultured under conditions allowing expression of the corresponding protein. The recombinant protein produced can then be recovered and purified.
  • Such proteins can be produced in eukaryotic or prokaryotic systems according to the usual techniques of molecular biology, microbiology and recombinant DNA, which are perfectly known to those skilled in the art. These techniques are explained in detail in the literature. We can refer for example to: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein “Sambrook et al., 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (DN Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed.
  • This embodiment provides for the expression of the protein, in eukaryotic or prokaryotic host cells, from a nucleotide sequence coding for this protein.
  • a nucleotide sequence (or nucleic acid) is in particular represented by: (a) a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence represented in SEQ ID NO: 1 (which codes for the HE having the sequence SEQ ID NO: 2, c ' i.e.
  • nucleotide sequence which codes for HE having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 (b) a nucleotide sequence which codes for HE having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2; (c) a nucleotide sequence which differs from the sequence according to (a) or (b) by degeneration of the code; or by a nucleotide sequence coding for a “variant”, “homologous”, or “derived” protein, in particular as defined above, and for example: (d) a nucleotide sequence hybridizing to a sequence according to (a), (b ) or (c), and coding for a protein having EH activity on epoxides with CF 3 ; (e) a nucleotide sequence having a percentage identity equal to or greater than 45%, preferably 80%, more preferably 85%, even more preferably 90%, and more preferably 95, 96, 97, 98 or 99% with SEQ ID NO: 1, and coding for a protein having EH activity
  • the proteins thus coded have an EH activity on an epoxide at CF 3 , and preferably a biological activity at least identical, similar or analogous to the reference protein on the same substrate.
  • the preferred proteins are those having, for a given substrate, an enantioselectivity coefficient E greater than or equal to 10, preferably 30.
  • the nucleotide sequence can be a nucleotide sequence hybridizing to a sequence according to (a), (b) or (c), and coding for a protein having EH activity on epoxides at CF 3 ;
  • the hybridization conditions are preferably high stringency conditions, a term the definition of which is well known to those skilled in the art, which can refer to general works such as Sambrook et al., 1989 and Hames & Higgins (1985) supra.
  • nucleotide sequences are generally determined using sequence analysis software (for example, Blast Software or Sequence Analysis Software Package mentioned above) which takes into account the nucleotides which differ between two sequences compared and missing nucleotides on one of the two sequences. The percentage value is given from the number of identical nucleotides out of the total number of nucleotides of the reference sequence.
  • a homologous nucleotide sequence therefore includes any nucleotide sequence which differs from the sequence SEQ ID NO: 1 by mutation, insertion, deletion or substitution of one or more bases, or by the degeneration of the genetic code, provided that it codes for a peptide exhibiting EH activity on epoxides at CF 3 .
  • nucleotide sequence according to characteristic (a) or (b), more preferably still according to characteristic (a). It can also be a sequence comprising or consisting essentially of a fragment of such a sequence (a) or (b), for example nucleotides 1-1197.
  • the nucleotide sequence can be inserted into an expression vector, in which it is operably linked to one or more element (s) allowing its expression or the regulation of its expression, such as in particular promoters, activators and / or transcription terminators.
  • the signals controlling the expression of the nucleotide sequences are chosen according to the cell host used.
  • the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • Host cells can be transiently or stably transfected with these expression vectors. These cells can be obtained by the introduction into host cells, prokaryotic or eukaryotic, of a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then the cultivation of said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • host cells include mammalian cells such as COS-7, 293, MDCK cells, insect cells such as SF9 cells, bacteria such as E.
  • the recombinant protein obtained can be purified from lysates and cell extracts, from the supernatant of the culture medium, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using specific mono- or polyclonal antibodies, etc.
  • niger LCP521 is commercially available under the reference "Epoxide Hydrolase, Aspergillus niger sp., Recombinant ftom Aspergillus niger", BioChemika, catalog Fluka, code 71832.
  • the protein with EH activity can also be produced by chemical synthesis.
  • chemical synthesis For this purpose, one can use any method well known to those skilled in the art.
  • the peptide of the invention can for example be synthesized by the techniques of synthetic chemistry, such as the Merrifield type synthesis which is advantageous for reasons of purity, antigenic specificity, absence of unwanted side products and for its ease of production.
  • the protein can be in solution or immobilized on an appropriate solid support, such as for example DEAE cellulose or DEAE Sepharose, Eupergit or modified Eupergit (C. Mateo et al., Org. Biomol. Chem., 1, 2739-2743 (2003)).
  • an appropriate solid support such as for example DEAE cellulose or DEAE Sepharose, Eupergit or modified Eupergit (C. Mateo et al., Org. Biomol. Chem., 1, 2739-2743 (2003)).
  • the epoxy substrate to be transformed is preferably dissolved in a suitable, preferably organic, solvent.
  • the substrate can be a racemic epoxide or a non-racemic epoxide.
  • the solvent for the substrate is an organic solvent miscible with water and the process is said to be “single-phase”. This solvent is by definition capable of dissolving the epoxy substrate and is compatible with the enzyme (the solvent does not significantly degrade the enzyme or its epoxide hydrolase activity vis-à-vis the epoxide at CF 3 ).
  • the substrate can be used in any concentration, within the limits of its solubility in the solvent.
  • solvents for the monophasic system include DMSO (dimethyl sulfoxide), DMF (dimethylformamide), acetone, THF (tetrahydrofuran), dioxane, propanol.
  • the preferred solvents are DMSO, DMF (dimethylformamide) and acetone. Two or more of these solvents can be used as a mixture.
  • the method then comprises mixing the substrate solution and the enzyme, preferably the enzyme in buffered solution and preferably in water.
  • the isolated enzyme is preferably used in aqueous solution, in particular water, eg distilled and / or purified water. Therefore, when it is in solid, eg pulverulent form, it is first dissolved in the aqueous solution.
  • Optimal enzyme concentrations can be determined for each substrate and can vary quite widely. In general, it is possible to work in a monophasic system with low concentrations of enzyme, for example of the order of 1 to 60 mg of enzyme per liter of reaction medium, preferably from 5 to 30 mg / l. For each substrate, it is possible to continuously monitor the duration of the hydrolysis reaction. For a new substrate, a preliminary experimental study provides access to the control parameters.
  • the enantioselectivity of the hydrolysis reaction by the enzyme is due to a higher affinity and a higher catalytic constant for the (R) enantiomer compared to the (S) enantiomer, or as the case may be for the enantiomer.
  • the duration of the hydrolysis phase can vary within wide limits depending in particular on the substrate considered and the enzyme concentration, it can nevertheless be specified as an indication that the duration of the hydrolysis phase may generally be between 10 and 300 min, preferably between 25 and 80 minutes.
  • the transformation reaction can be stopped by any suitable chemical or physical means, such as for example: addition of a solvent toxic for HE (acetonitrile for example); addition of base or acid, detergent, salts etc. ; or by freezing, heating, microwave, microfiltration etc.
  • the substrate solvent is an organic solvent which is not miscible with water and the process is said to be “biphasic”.
  • This solvent is by definition capable of dissolving the epoxy substrate and is compatible with the enzyme (the solvent does not significantly degrade the enzyme or its epoxide hydrolase activity vis-à-vis the epoxide at CF 3 ).
  • These water-immiscible solvents can be chosen from alkanes, for example iso-octane and hexane, cycloalkanes (for example cyclohexane) and aromatics (for example toluene). Two or more of these solvents can be used as a mixture.
  • a particular method consists in using in addition an organic solvent miscible with water, in particular a solvent as defined for the single-phase system.
  • an emulsion is preferably formed from the epoxy solution and the enzyme solution.
  • the emulsion can be formed at the time of mixing between the substrate solution (organic phase) and an aqueous solution of the enzyme (aqueous phase). It is also possible to form a pre-emulsion by mixing the substrate solution (organic phase) with water or an appropriate aqueous solution, this emulsion then being mixed with the aqueous solution of the enzyme.
  • the mixing means are such that an emulsion can form.
  • Epoxy substrates generally have higher solubility coefficients in the organic solvents used in this embodiment than in an aqueous solution containing water-miscible solvents in the monophasic mode.
  • the epoxide concentration can therefore be higher, and for example be between 1 and 1000 g of epoxide per liter of reaction medium, preferably between 10 and 500 g / l.
  • the organic phase advantageously represents from 1 to 60%, preferably from 5 to 50% of the total volume of the emulsion.
  • the ratios between 1 and 20%, preferably between 5 and 15%, are mainly used when the epoxide concentration in the reaction medium is less than or equal to 100 g / l. Above, preference is given to using ratios between 20 and 60%, preferably between 20 and 40%.
  • the concentration of enzyme in the aqueous phase can vary widely. It is between 0.002 and 3 g of pure enzyme per liter and preferably between 0.002 and 0.5 g / L.
  • the examples give a procedure using ethyl acetate and a passage in GC, which can be applied to each sample taken to monitor the progress of the reaction.
  • the duration of the hydrolysis phase can vary within wide limits, depending on the operating conditions, in particular the quantity of enzyme used, and the substrate to be transformed.
  • the duration of the hydrolysis phase may generally be between a few minutes, eg of the order of 15 to 30 minutes, and several days.
  • the transformation reaction can be stopped by any suitable means, such as adding ethyl acetate, ethyl ether, dichloromethane, etc., or also by the means and techniques mentioned for the single-phase system.
  • the temperature during the hydrolysis phase is generally maintained between 4 and 50 ° C., preferably between 25 and 30 ° C. .
  • the hydrolysis phase is carried out in a suitable reactor provided with suitable stirring or mixing means. The mixing or stirring parameters are chosen to optimize the hydrolysis phase.
  • stirring is maintained throughout the hydrolysis phase.
  • the pH can be maintained between 6 and 9, preferably between 6.5 and 7.5.
  • Co-reagents can be used to increase the stability of HE. Mention may be made, for example, of reducing agents such as? -Mercaptoethanol or cysteine.
  • the substrate mixture of epoxide and diol
  • the substrate can be extracted by conventional methods known to those skilled in the art, such as direct extraction or continuous extraction etc.
  • the residual epoxide and the diol can be separated by conventional methods known to those skilled in the art, for example by distillation, column chromatography, liquid / liquid extraction, etc. Operations of this type are detailed for example in example number 23.
  • the enantiomerically enriched diol can be cyclized to its epoxide.
  • the cyclization of the diol (R) or (S) any known method can be used.
  • the cyclization can be carried out in two stages, by adding 1 equivalent of tosyl chloride (TsCI) in the presence of tetrahydrofuran (THF), then sodium hydride (NaH).
  • the enantiomeric hydrolysis and cyclization operation can be repeated one or more times, so as to increase the enantiomeric excess of epoxide (R) or (S) or of diol.
  • the present invention therefore makes it possible to prepare mixtures comprising strong enantiomeric excesses in epoxide (S) and diol (R), [or conversely in epoxide (R) and diol
  • the present invention therefore also relates to the use of a protein with EH activity on a CF 3 epoxide according to the invention, for the preparation of such mixtures and preparations, from a racemic or non-racemic epoxide.
  • the epoxide hydrolase of YAspergillus niger LCP521 is used, for example an extraction protein, a recombinant protein or a protein produced by chemical synthesis.
  • a protein of another origin is used, or a "variant", “homologous” or “derivative” of the epoxide hydrolase of YAspergillus niger LCP521, which has EH activity on a CF epoxide 3 , and preferably an identical, similar or analogous biological activity to the epoxide hydrolase of Yspergillus niger LCP521 on the same substrate, or even a higher EH activity than the latter.
  • this protein with EH activity has, for a given substrate, an enantioselectivity coefficient E greater than or equal to 10, preferably 30.
  • the hydrolysis is not or little enantioselective.
  • the invention can then relate, inter alia, to a non-enantioselective hydrolysis process of a racemic or non-racemic mixture of epoxide to diol, process in which the reaction is carried out in a monophasic or biphasic system as described above.
  • a racemic epoxide is transformed into a racemic diol. This process can be carried out remarkably, under particularly mild and economical experimental conditions, avoiding in particular the use of a more or less concentrated mineral or acidic basic medium.
  • the selection of a protein with EH activity can be easily carried out on the basis of the test described above, or a similar test, the objective this time being to determine and select the proteins leading, for a given substrate, to a coefficient E less than 10.
  • Another object of the invention is therefore the application of the process according to the invention for the preparation of intermediates for the synthesis of pharmaceutically active compounds or for the preparation of such pharmaceutically active compounds, which are in the epoxide and / or diol form , preferably in the epoxide form (R) or (S), preferably enantiopure or enantiomerically enriched (ie having an enantiomeric excess greater than or equal to 95, 96, 97, 98 or 99%, or even equal to 100%), or in the diol (R) or (S) form, preferably enantiopure or enantiomerically enriched (ie having an enantiomeric excess greater than or equal to 95, 96, 97, 98 or 99%, or even equal to 100%).
  • the invention applies to the production of products of industrial interest endowed with biological activity, or of intermediates of such products, for example in the phytosanitary and agrochemical fields, eg insecticidal, anti-parasitic products, etc. .
  • pharmaceutically active compounds obtainable from the epoxides and diols according to the invention, there may be mentioned for example: BRL-35113 (CAS 90730-95-3); Clofuperol Hydrochloride (CAS 17230-8764) S-15511 (AN-2000-47942; J. Pharmacol. Exp. Ther.
  • the present invention also relates to a composition useful for implementing the transformation process according to the invention, comprising, for successive or simultaneous addition, a fluorinated epoxide in accordance with the invention, comprising one or more CF 3 groups, and a solvent for this epoxide, namely an organic solvent miscible with water or immiscible with water, as described above.
  • this composition also comprises, for successive or simultaneous addition, an enzyme in accordance with the present invention.
  • the present invention also relates to a composition useful for carrying out the transformation process according to the invention, comprising, for successive or simultaneous addition, an enzyme in accordance with the invention and an organic solvent miscible with water or not miscible with water, as described above.
  • this composition can comprise an aqueous solution.
  • the enzyme used is A niger epoxide hydrolase (EH of An) of the strain LCP521.
  • This enzyme is a recombinant protein produced in a strain of Aspergillus niger according to the method described in part B) "Cloning and characterization of the soluble epoxide hydrolase of Aspergillus niger which is related to epoxides hydrolase microsomal mammals" in WO- A-00 68394.
  • An enzyme thus produced is commercially available as mentioned above.
  • the enantioselectivity coefficient E is defined as:
  • the added enzymatic solution 100 ⁇ L contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 2,470 mL of distilled water.
  • the values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 5.
  • the added enzymatic solution (100 ⁇ L) contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 2.680 ml of distilled water.
  • the added enzymatic solution 100 ⁇ L contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 2,470 ml of distilled water.
  • the values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 50.
  • the added enzymatic solution 100 ⁇ L contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 15,065 ml of distilled water.
  • the added enzymatic solution 100 ⁇ L contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 2,320 mL of distilled water.
  • the values obtained correspond to an enantioselectivity coefficient of 25.
  • the added enzymatic solution (100 ⁇ L) contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 3.222 mL of distilled water.
  • the values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 30.
  • the added enzymatic solution 100 ⁇ L contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 5.273 ml of distilled water.
  • the values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 160.
  • Example 9 The procedure described in Example 9 is applied to 2- (trifluoromethyl-phenyl) -oxirane.
  • Example 9 The procedure described in Example 9 is applied to 3- (trifluoromethyl-phenyl) -oxirane. In this case, for 100 mg of substrate are added 1.7 mg of enzymatic extract of the EH of recombinant An (purity 25%).
  • Example 9 The procedure described in Example 9 is applied to 4- (trifluoromethyl-phenyl) -oxirane. In this case, for 100 mg of substrate are added 1.7 mg of enzymatic extract of the EH of recombinant An (purity 25%). The values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 270.
  • Example 9 The procedure described in Example 9 is applied to (3,5-bistrifluoromethyl-phenyl) - oxirane. In this case, for 100 mg of substrate are added 1.7 mg of enzymatic extract of the EH of recombinant An (purity 25%).
  • Example 9 The procedure described in Example 9 is applied to methyl- (3-trifluoromethyl-phenyl) - oxirane. In this case, for 100 mg of substrate are added 1.7 mg of enzymatic extract of the EH of recombinant An (purity 25%). The values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 25.
  • Example 15 The procedure described in Example 9 is applied to methyl- (4-trifluoromethyl-phenyl) - oxirane. In this case, for 100 mg of substrate are added 1.7 mg of enzymatic extract of the EH of recombinant An (purity 25%). The values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 50.
  • Example 17 The procedure described in Example 16 is applied to (2-trifluoromethyl-phenyl) -oxirane on the millimole scale.
  • Example 16 The procedure described in Example 16 is applied to (3-trifluoromethyl-phenyl) -oxirane on the millimole scale.
  • Example 16 The procedure described in Example 16 is applied to (4-trifluoromethyl-phenyl) -oxirane on the millimole scale.
  • Example 16 The procedure described in Example 16 is applied to methyl- (3-trifluoromethyl-phenyl) - oxirane on the millimole scale.
  • Example 16 The procedure described in Example 16 is applied to methyl- (4-trifluoromethyl-phenyl) - oxirane on the millimole scale.
  • Example 22 The procedure described in Example 16 is applied to 4- (trifluoromethylthio-phenyl) - oxirane on the millimole scale. The values obtained (ee e coefficient of enantioselectiv
  • the reaction is followed by chiral GC. 1 ⁇ L is regularly taken from the reaction medium which is added to 40 ⁇ L of ethyl acetate placed beforehand in an eppendorf. After stirring with a vortex and centrifugation, a chiral GC is injected to measure the enantiomeric excess of the residual epoxide. When it reaches a sufficient value (enantiomeric excess> 97%), the reaction is stopped by adding 30 ml of ethyl acetate. The mixture is left to settle, the organic phase is recovered and the aqueous phase is extracted with 2 ⁇ 50 ml of ethyl acetate.
  • Example 23 The procedure described in Example 23 is applied to 2- (trifiuoromethyl-phenyl) -oxirane.
  • Example 23 The procedure described in Example 23 is applied to 3- (trifluoromethyl-phenyl) -oxirane.
  • 19 F NMR ⁇ 1 H ⁇ / CDCI 3 5-62.34.
  • Example 23 The procedure described in Example 23 is applied to 4- (trifluoromethyl-phenyl) -oxirane.
  • Example 23 The procedure described in Example 23 is applied to methyl- (3-trifluoromethyl-phenyl) - oxirane.
  • 19 F NMR ⁇ 1 H ⁇ / CDCI 3 5 -61, 98.
  • Example 23 The procedure described in Example 23 is applied to methyl- (4-trifluoromethyl-phenyl) - oxirane.
  • Example 23 The monitoring and the treatment of the reaction retained are those presented in Example 23.
  • Epoxides not described in the literature The absolute configuration of the epoxides is obtained by chemical correlation.
  • the diols are cyclized to epoxide with configuration retention (method described below in Example 30.
  • the chiral GC injection makes it possible, by comparison of the chromatogram obtained with the epoxide resulting from the enzymatic reaction, to deduce the absolute configuration of the epoxide.
  • the added enzymatic solution (100 ⁇ L) contains 2 mg of enzymatic extract of the recombinant EH of An (characterized as having a purity of the order of 25%) in 4.434 ml of distilled water.
  • the internal standard is 3-bromo-acetophenone. The values obtained correspond to an apparent enantioselectivity coefficient E of 7.
  • reaction is followed by chiral GC.
  • 150 ⁇ L of reaction medium are regularly removed which is added to 100 ⁇ L of acetonitrile and 100 ⁇ L of iso-octane placed beforehand in an eppendorf.
  • a chiral GC is injected to measure the enantiomeric excess of the residual epoxide.
  • the reaction is stopped by adding 150 ml of ethyl acetate. The mixture is left to settle, the organic phase is recovered and the aqueous phase is extracted with 2 ⁇ 50 ml of ethyl acetate.
  • aqueous phases are combined, washed with 200 ml of saturated aqueous NaCl solution, dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure.
  • the residual epoxide and the diol formed are separated by flash chromatography on silica gel (50 parts; eluent: hexane / ethyl acetate 90/10 to pure ethyl acetate).
  • each isolated product is then purified in a ball oven to remove all traces of solvent and silica.

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Abstract

L'invention a trait à un procédé d'hydrolyse d'un époxyde fluoré comportant un ou plusieurs groupes CF3, procédé dans lequel on traite l'époxyde en présence d'eau avec une protéine ayant une activité époxyde hydrolase (EH) sur les époxydes à CF3 de manière à induire l'ouverture de l'époxyde et la formation du diol vicinal. Ce procédé permet de favoriser l'hydrolyse de l'un des isomères (R) et (S) et cette hydrolyse énantiosélective peut être mise à profit pour la séparation de ces isomères et la préparation d'époxydes ou de diols énantiopurs ou énantiomériquement enrichis. En variante, le procédé peut être utilisé pour une hydrolyse peu ou pas énantiosélective, pour la transformation d'un époxyde racémique ou non racémique en diol racémique ou non racémique.

Description

PROCEDE DE TRANSFORMATION D'EPOXYDES PORTEURS DE GROUPES TRIFLUOROMETHYLE
La présente invention a pour objet un procédé d'hydrolyse des époxydes fluorés comportant un ou plusieurs groupements CF3, et plus particulièrement un procédé permettant de traiter un mélange d'énantiomères (R) et (S) de tels époxydes fluorés, de manière à enrichir le mélange en l'un des énantiomères de cet époxyde et à obtenir en parallèle le diol vicinal correspondant à l'autre énantiomère. Elle a en particulier pour objet un procédé permettant la séparation des énantiomères (R) et (S) et plus particulièrement un procédé permettant l'enrichissement en isomère de configuration absolue (S) et en diol de configuration (R), ou inversement, l'enrichissement en isomère de configuration absolue (R) et en diol de configuration (S). L'invention a aussi pour objet un procédé permettant de produire les énantiomères et/ou les diols vicinaux sous forme énantiopure ou énantiomériquement enrichie. Une autre application de ce procédé est la biohydrolyse non énantiosélective d'un époxide racémique ou non racémique. Les époxydes sont des intermédiaires très importants en synthèse organique car ils possèdent une grande réactivité. Ils combinent en effet l'intérêt de posséder une tension de cycle importante et d'avoir un atome d'oxygène nucléofuge. La présence d'un carbone asymétrique conduit à des molécules possédant deux formes stéréoisomériques (énantiomères) distinctes, la forme (R) et la forme (S), l'une étant l'image de l'autre dans un miroir. Il peut être important, dans certains cas, de disposer uniquement de l'une de ces formes et il convient alors de disposer de moyens pour séparer ces deux stéréoisomères ou pour synthétiser spécifiquement le stéréoisomère désiré. Les molécules fluorées ont un positionnement intéressant aussi bien en agrochimie qu'en pharmacie. L'accès aux époxydes et diols vicinaux fluorés de configuration (R) ou (S) présente donc un intérêt, notamment en temps qu'intermédiaire de synthèse de ces molécules fluorées. L'utilisation de champignons microscopiques et de protéines d'origine fongique a été décrite comme pouvant servir à la séparation des stéréoisomères de certains époxydes. Ainsi, S. Pedragosa-Moreau et al. (J. Org. Chem. 1996, 61 : 7402-7407) décrivent l'utilisation d'époxyde hydrolase pour la synthèse d'oxyde de styrène para-substitué énantiopur. Ils ne décrivent ni ne suggèrent l'application à des époxydes porteurs de groupes CF3. EP-A-0 611 826 décrit un procédé de production d'époxydes optiquement enrichis utilisant des champignons microscopiques choisis dans divers genres. Suivant le champignon utilisé, la réaction permet de préparer la forme (R) ou la forme (S) d'un époxyde. WO-A-0068394 décrit l'isolement, le clonage et la sur-expression d'une enzyme dite époxyde hydrolase à partir d'un champignon du genre Aspergillus et l'utilisation de cette époxyde hydrolase pour la préparation de molécules énantiomériquement enrichies à partir de mélanges d'isomères de composés époxydes décrits en des termes très généraux. Une étude réalisée sur l'oxyde de para-nitrostyrène a révélé une plus forte affinité et une constante catalytique de l'enzyme supérieure pour l'énantiomère (R) par rapport à l'énantiomère (S), conduisant à l'hydrolyse rapide de l'isomère (R) en son diol correspondant. Ce document divulgue la séquence protéique et la séquence nucléotidique de l'époxyde hydrolase d'un champignon Aspergillus niger, ce qui permet à ce document de proposer la production de l'enzyme par génie génétique. Comme le rappelle le document EP-A-0 611 826, il existe de nombreuses classes d'époxydes. Le procédé est exemplifié dans ce document sur un nombre restreint de composés, à savoir l'oxyde de 3-chlorostyrène, le glycidol, l'allyl glycidyl éther, le 3,4-époxy- 1 -butène, le 1 ,2-époxyhexane, le 2,3-époxypropylebenzène et l'oxyde de styrène, alors que la variété des époxydes et des groupements réactifs qu'ils sont susceptibles de porter, est très vaste. Une activité époxyde hydrolase, et en particulier une activité époxyde hydrolase énantiosélective, sur des époxydes comportant un ou plusieurs groupes CF3 n'a jamais été démontrée. Compte tenu du caractère particulier des époxydes comportant un ou plusieurs groupes CF3, en particulier du fait de l'electronegativite importante du fluor, il était notoirement impossible à l'homme du métier de prévoir la réactivité et la spécificité d'une enzyme particulière selon l'invention par rapport à ce type de substrat.
La présente invention a donc pour objectif principal de proposer un procédé permettant l'hydrolyse d'époxydes porteurs de motifs trifluorométhyle. Elle a plus particulièrement pour objet un tel procédé permettant la séparation des énantiomères (R) et (S) d'époxydes porteurs de motifs trifluorométhyle à partir d'un mélange -racémique ou non racémique- d'énantiomères dudit époxyde. Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel procédé utilisable pour la préparation d'époxydes ou de diols comme intermédiaires pour la synthèse de produits pharmaceutiques, agrochimiques ou phytosanitaires.
Les demandeurs ont pu démontrer pour la première fois que des époxydes porteurs de motifs trifluorométhyle peuvent être hydrolyses avec ouverture de l'époxyde et formation d'un diol, et en outre que ces époxydes peuvent être séparés de manière énantiosélective, en utilisant une époxyde hydrolase telle que celle d'Aspergillus niger LCP521. Ceci leur a permis de mettre au point un procédé permettant la transformation énantiosélective d'époxydes -racémiques ou non racémiques- à CF3, basé sur l'emploi de cette époxyde hydrolase ou d'une protéine ou polypeptide analogue ayant une activité époxyde hydrolase sur des époxydes à motif trifluorométhyle. Suivant une variante de l'invention, et comme on le verra infra, la transformation peut être conduite dans des conditions qui ne sont pas ou peu énantiosélectives, et cette variante peut être mise à profit pour une hydrolyse non ou peu énantiosélective d'époxydes.
La présente invention a donc pour objet un procédé d'hydrolyse d'un époxyde fluoré comportant un ou plusieurs groupes CF3, de préférence un époxyde de formule (I) telle que décrit ci-après, procédé dans lequel on traite l'époxyde en présence d'eau avec une protéine ayant une activité époxyde hydrolase (EH) sur les époxydes à CF3 de manière à induire l'ouverture de l'époxyde et la formation du diol vicinal. L'époxyde peut être un isomère (R) ou (S), ou un mélange, racémique ou non racémique, de ces isomères. La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé permettant de transformer un mélange d'énantiomères (R) et (S) d'un époxyde fluoré comportant un ou plusieurs groupes CF3ι, de préférence un époxyde de formule (I), en un mélange enrichi en l'un des isomères et en diol correspondant à l'autre isomère, procédé dans lequel on traite: (A) un mélange d'énantiomères (R) et (S) de l'époxyde selon l'invention avec (B) une protéine ayant une activité époxyde hydrolase (EH) sur les époxydes à CF3, le procédé conduisant à l'ouverture préférentielle soit de l'époxyde (R) en diol (R) soit de l'époxyde (S) en diol (S). Par définition, l'ouverture d'un époxyde par une molécule d'eau est dite « préférentielle », en ce sens que la protéine a une affinité et une constante catalytique supérieures pour l'un des énantiomères par rapport à l'autre, ce qui se traduit par une vitesse d'hydrolyse supérieure de cet énantiomère. Il est donc possible, en contrôlant la réaction d'hydrolyse, notamment en stoppant cette réaction au moment opportun, d'obtenir à un instant donné une composition enrichie en époxyde (R) ou (S) et en diol de configuration absolue opposée. Le procédé selon l'invention conduit généralement à une réaction de dédoublement dans laquelle un énantiomère de l'époxyde de configuration (R) ou (S) est ouvert pour donner le diol correspondant. L'époxyde hydrolase conforme à l'invention peut donc induire une hydrolyse énantiosélective de ces époxydes particuliers, dans des proportions remarquables et inattendues. La transformation a un caractère d'énantiosélectivité particulièrement intéressant lorsque le coefficient d'énantiosélectivité (E) (voir infra) est supérieur ou égal à 10, de préférence supérieur ou égal à 30. En fonction du substrat époxyde, l'EH peut hydrolyser préférentiellement soit l'isomère (R), soit l'isomère (S). Il s'avère qu'avec la majorité des époxydes, l'EH hydrolyse préférentiellement l'isomère (R). Par convention, dans le présent exposé, les termes ou expressions « enzyme », « enzyme à activité époxyde hydrolase » et « protéine à activité époxyde hydrolase » sont synonymes et sont employés indifféremment. Le procédé peut comporter une étape subséquente de séparation de l'époxyde (S) du diol (R) ou inversement la séparation de l'époxyde (R) du diol (S), de manière à récupérer d'une part une composition énantiomériquement enrichie en époxyde et d'autre part une composition enrichie en diol. Avec une hydrolyse préférentielle de l'isomère (R), l'étape de séparation conduit à récupérer une composition enrichie en époxyde (S) et une composition enrichie en diol (R). Avec une hydrolyse préférentielle de l'isomère (S), l'étape de séparation conduit à récupérer une composition enrichie en époxyde (R) et une composition enrichie en diol (S). On peut procéder au besoin à au moins un autre traitement de la composition enrichie en époxyde par l'enzyme, puis extraction et séparation. La composition enrichie en diol (R) ou (S) peut être soumise à une cyclisation du diol (R) ou (S) en époxyde (R) ou (S), puis au besoin à au moins un autre traitement par l'enzyme, suivi d'une nouvelle cyclisation. L'objectif de traitements successifs (2 ou plus) est d'améliorer au besoin l'excès énantiomérique de l'énantiomère correspondant.
Définition des époxydes Les époxydes visés par l'invention comportent un ou plusieurs groupes CF3, de préférence de 1 à 3, et de manière préférée, ils répondent à la formule (I) :
dans laquelle : - le groupe R représente un groupe alkyle, alcényle, cycloalkyle, aryle ou aralkyle, éventuellement substitué par alkyle, alcoxy, alkylthio ou halogène ; R comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes tels que O ou S ; les substituants alkyle, alcoxy, alkylthio comportant une chaîne hydrocarbonée en Ci-Ce, de préférence en C C3, linéaire, ramifiée ou cyclique et comportant éventuellement un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F ; le groupe R' représente H ou un alkyle linéaire, ramifié ou cyclique en CTCIO, de préférence en C C2 ou C3 et comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, notamment atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F ou encore des hétéroatomes tels que O ou S ; - étant entendu que l'un au moins des radicaux R et R' est, ou comporte, un ou plusieurs, de préférence de 1 à 3, groupements trifluorométhyle (CF3) ; avec (B) une protéine ayant une activité époxyde hydrolase (EH) sur les époxydes à CF3. Suivant un mode de réalisation préféré, l'époxyde de formule (I) est tel que R' est H ou un alkyle linéaire en d, C2 ou C3, mieux encore R' est H ou alkyle en C^ éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogènes, de préférence F, par exemple substitué par 3 atomes de F. Les groupes R peuvent comporter de 1 à 20 C, notamment de 1 à 12 O Lorsque R est un alkyle substitué par un halogène, R peut être CF3. Les groupes R peuvent être substitués par de 1 à 3 groupes choisis parmi trifluorométhyle, trifluorométhoxy et trifluorométhylthio. Les groupes alkyles R peuvent être linéaires ou ramifiés. Ils comportent de préférence de 1 à 10 C, plus préférentiellement de 1 à 6 C. Par exemple : méthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, pentyle, isopentyle, hexyle ou isohexyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F. De préférence, le groupe alkyle R comporte de 1 à 3 groupements CF3. Les groupes cycloalkyle R comportent de préférence de 3 à 10 C, de préférence de 3 à 8 C, mieux encore 5 à 7 C. Par exemple : cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle ou cyclooctyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F. De préférence, le groupe cycloalkyl R comporte de 1 à 3 groupements CF3. Les groupes aryle R peuvent être par exemple les groupes phényle et naphtyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F. De préférence, le groupe aryle R comporte de 1 à 3 groupements CF3. Les groupes phényle ainsi substitués sont des modalités préférées. Les groupes aralkyle R peuvent notamment comprendre de 7 à 18 C. A titre d'exemples, on peut citer les groupes benzyle, 1-méthylbenzyle, 2-phényléthyle, 3- phénylpropyle, 4-phénylbutyle, 1-naphtylméthyle, 2-naphtylméthyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F. De préférence, le groupe aralkyle R comporte de 1 à 3 groupements CF3. Les époxydes comportant un radical R phényle comportant un groupe phényle portant de 1 à 3, de préférence 1 ou 2 groupements CF3, éventuellement trifluorométhoxy ou trifluorométhylthio sont des modalités préférées de l'invention. On peut encore préciser que ces groupements peuvent être en para, ortho ou meta par rapport au carbone du phényle relié à l'oxirane. On préfère cependant une substitution en para ou meta, et plus préférentiellement encore en para. Ces époxydes préférés, peuvent encore comporter une gem-disubstitution avec un R' choisi de préférence parmi les alkyles en CrC3, de préférence CH3. Ces époxydes peuvent aussi être éventuellement substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F. Plusieurs exemples intéressants de phényl-oxiranes substitués par CF3 en positions 2, 3, 4 et 3,5, ou substitués par -O-CF3 ou - S-CF3 en position 4, R' étant H ou CH3, sont décrits dans les exemples.
L'époxyde hydrolase Une protéine ayant une activité époxyde hydrolase (EH) sur les époxydes à CF3 est représentée par la protéine ayant pour séquence en acides aminés la séquence décrite à la SEQ ID NO : 2. Cette protéine est l'époxyde hydrolase de \ 'Aspergillus niger enregistrée au Muséum d'Histoire Naturelle (Paris) sous le numéro LCP521 (Laboratoire de Cryptogamie, 12 rue Buffon, 75005 Paris, France). Cette protéine a été décrite dans la publication WO-A- 00 68394, à laquelle l'homme du métier peut se référer au besoin. Cette protéine constitue pour les besoins de la présente invention, la protéine de référence, et constitue en même temps un mode de réalisation préféré. La protéine peut aussi être un « variant », « homologue », ou « dérivé » de la protéine de référence, qui par définition présente, comme la protéine de référence, une activité EH sur un époxyde à CF3, et de préférence une activité biologique au moins identique, similaire ou analogue à la protéine de référence sur le même substrat. Dans le cas d'application à une hydrolyse énantiosélective, les protéines préférées sont celles présentant pour un substrat donné, un coefficient d'énantiosélectivité E supérieur ou égal à 10, de préférence à 30, de manière plus préférée à 50, et mieux encore à 100 , le coefficient d'énantiosélectivité E étant défini par la formule suivante:
F _ In [(1-c)(1-ees)] ln [(1-c)(1+ees)] avec c : taux de conversion ees : excès énantiomérique du substrat résiduel après hydrolyse enzymatique.
La présente invention définit ci-après, et met en œuvre dans les exemples, un procédé dit monophasique et un procédé dit biphasique, qui correspondent à deux modes de réalisation. L'activité EH de la protéine de référence, comme celle d'un « variant », « homologue », ou « dérivé », peut être évaluée pour un substrat donné, sur la base de ces procédés, et une comparaison peut être réalisée entre les performances de la protéine de référence et celles de la ou des autres protéines testées. On peut aussi faire l'évaluation d'une protéine EH (protéine de référence, « variant », « homologue », ou « dérivé ») en reproduisant le test suivant : 5,0 mg de substrat époxyde sont dissous dans 3 mL de DMSO ; on ajoute 3 μL de 3-(trifluorométhyl)-acétophénone (étalon interne) et 7,9 mL d'eau distillée ; une solution enzymatique est préparée : par exemple, 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH à évaluer (pureté de l'ordre de 25%) sont dissous dans 2,320 mLd'eau distillée ; les solutions sont placées à 27°C pendant 30 min ; on ajoute ensuite 100 μL de solution enzymatique au milieu réactionnel ; des prélèvements réguliers du milieu réactionnel permettent de suivre au cours de la réaction la formation du diol : 400 μL du milieu réactionnel sont ajoutés à 200 μL d'acétonitrile ; après agitation au vortex, extraire par 400 μL d'isooctane ; pour chaque prélèvement la phase organique est injectée en GC chirale pour mesurer l'excès énantiomèrique de l'époxyde résiduel et la phase aqueuse est injectée sur HPLC phase inverse pour doser la formation du diol (Colonne Nucleodur Chrompack ; Eluant :_CH3CN/H2O 60/40 ; débit 0.5 mL.min-1 ; λ = 264 nm ; injection 30 μL) ; on a par cette méthode accès aux paramètres ee et c, ce qui permet de calculer la valeur de E ; on a aussi accès à l'activité (diol formé). Une comparaison peut être réalisée entre les performances de la protéine de référence et celles de la ou des autres protéines testées. Suivant un mode de réalisation avantageux, un tel test, ou un test similaire e.g. élaboré à partir de la présente description, permet de déterminer, dans un panel d'au moins deux protéines à activité EH, celle (ou celles) qui s'avère la plus performante sur un substrat donné. Plus largement, un tel test ou un test similaire permet de déterminer les protéines, les « variants », « homologues », et « dérivés » aptes à conduire, pour un substrat donné, à un coefficient E supérieur ou égal à 10, de préférence à 30. La présente invention permet donc à l'homme du métier de sélectionner l'enzyme la mieux adaptée au substrat qu'il souhaite transformer. Un tel test ou un test similaire permet aussi à l'homme du métier d'évaluer l'impact de modifications apportées à la séquence de l'enzyme, e.g. à la séquence SEQ ID NO : 2, et donc notamment de pouvoir évaluer les modifications et mutations faites à des fins d'amélioration des performances de l'enzyme. De manière tout à fait préférée, la protéine possède une activité EH sur un époxyde à CF3qui est identique ou sensiblement identique à l'époxyde hydrolase de référence. Comme on le verra infra, une telle protéine peut être d'origine naturelle, provenant par exemple d'un organisme du genre Aspergillus, d'un autre champignon microscopique ou de toute autre source vivante (bactérie, levure, plante etc.) ou encore d'origine synthétique ou recombinante. Une protéine d'origine naturelle peut avoir été modifiée pour donner une protéine ou un polypeptide dérivé synthétique ou recombinant. Les protéines « variantes », « homologues», ou « dérivées » peuvent être définies comme comprenant : i. les séquences ayant un pourcentage d'homologie égal ou supérieur à 40 %, de préférence à 80 %, de manière plus préférée à 85 %, de manière encore plus préférée à 90 %, et mieux encore à 95, 96, 97, 98 ou 99 % avec la SEQ ID NO : 2, la protéine ainsi définie ayant une activité EH sur les époxydes à CF3 ; ii.les séquences comprenant au moins 10, de préférence au moins 20, de manière plus préférée au moins 50 ou 100 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO : 2 ou d'une séquence telle que définie sous i, la protéine ainsi définie ayant une activité EH sur les époxydes à CF3. Suivant un mode de réalisation préféré, l'invention emploie une telle protéine « variante», « homologue», ou « dérivée » qui présente pour un substrat donné, un coefficient d'énantiosélectivité E supérieur ou égal à 10, de préférence à 30. Le terme "homologie" se réfère de préférence à l'identité entre les acides aminés comparés. Cette notion d'homologie peut aussi prendre en compte les substitutions « conservatives » qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique), d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la praline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine), ces substitutions par des acides aminés similaires ne portant pas significativement atteinte à l'activité biologique de la protéine de référence, et conduisant de préférence à une protéine conservant ou accroissant l'activité biologique de la protéine de référence Plus généralement, par « séquence d'acides aminés variante, homologue, ou dérivée », on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence de référence par substitution, déletion et/ou insertion d'un acide aminé ou de plusieurs acides aminés, cette séquence constituant une protéine ou un polypeptide ayant une activité EH sur des époxydes à CF3, les modifications ne portant pas significativement atteinte à l'activité biologique de la protéine de référence, et de préférence conservant l'activité biologique de la protéine de référence ou accroissant l'activité biologique par rapport à la protéine de référence Il peut donc s'agir d'une protéine ou polypeptide comprenant ou essentiellement constitué d'un fragment de la SEQ ID NO : 2 ou d'une séquence telle que définie sous i, par exemple d'un fragment formé par les acides aminés 1-339 ou une séquence homologue. L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Blast Software, National Center for Biotechnology Information, U.S.
National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894, USA ; ou Séquence
Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Des séquences d'acides aminés sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité ou similitude). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces (« gaps ») dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques ou similaires, par rapport au nombre total de positions. De préférence, les protéines ou polypeptides « variants », « homologues », ou « dérivés » sont de même longueur ou sensiblement de même longueur que les séquences de référence. Sont également considérés comme homologues les variants alléliques issus ou dérivés de souches de microorganismes, e.g. d'A niger, qui ont une activité biologique similaire à la protéine de référence. Conformément à l'invention, les protéines ou polypeptides peuvent être par ailleurs modifiés chimiquement ou enzymatiquement pour améliorer leur stabilité ou leur biodisponibilité.
Production de l'époxyde hydrolase Suivant un premier mode de réalisation, la protéine est apportée sous la forme d'une préparation concentrée et/ou purifiée, obtenue à partir d'une culture d'un microorganisme producteur, notamment champignon microscopique, e.g. A. niger, en particulier LCP521. On parle alors de protéine « naturelle ». Une telle préparation peut être obtenue par une étape d'extraction de l'enzyme à partir d'une culture cellulaire, e.g. par lyse mécanique (par exemple passage dans une presse de French) ou chimique (y compris enzymatique), suivie d'une étape d'élimination des débris cellulaires et de récupération de la phase liquide, ce qui peut comprendre une étape de centrifugation (de préférence à faible vitesse, e.g. de l'ordre de 10 000 g) et/ou de filtration appropriée, avec récupération du surnageant de centrifugation ou du filtrat. On préfère ensuite concentrer l'enzyme, e.g. par ultrafiltration. Il est également préféré de procéder à une purification de l'enzyme et cela peut être effectué par des méthodes de chromatographie, notamment par passages successifs sur des colonnes d'échange d'ions et/ou d'exclusion, comme par exemple DEAE-Sepharose, Phényl- Sepharose, Mono Q et Superose 12, etc. Typiquement, la préparation est issue d'une extraction, suivie de centrifugation, récupération du surnageant, puis concentration et de préférence purification. Le microorganisme producteur peut être modifié par génie génétique pour sur-exprimer l'enzyme, comme décrit infra. Suivant un deuxième mode de réalisation, la protéine est une protéine dite « recombinante », et cette protéine recombinante peut éventuellement être sous forme de protéine fusion. Une protéine recombinante peut être produite par un procédé dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique codant pour la protéine est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression de la protéine correspondante. La protéine recombinante produite peut ensuite être récupérée et purifiée. De telles protéines peuvent être produites dans des systèmes eucaryotes ou procaryotes suivant les techniques usuelles de biologie moléculaire, microbiologie et de l'ADN recombinant, qui sont parfaitement connues de l'homme du métier. Ces techniques sont expliquées en détail dans la littérature. On peut se référer par exemple à : Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein "Sambrook et al., 1989") ; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover éd. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait éd. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985) IRL Press, Oxford] ; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984) IRL Press, Oxford] ; Animal Cell Culture [R.l. Freshney, éd. (1986)] ; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)] ; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Ce mode de réalisation prévoit l'expression de la protéine, dans les cellules hôtes eucaryotes ou procaryotes, à partir d'une séquence nucléotidique codant pour cette protéine. Une telle séquence nucléotidique (ou acide nucléique) est notamment représentée par : (a) une séquence nucléotidique comprenant la séquence nucléotidique représentée à la SEQ ID NO : 1 (qui code pour l'EH ayant la séquence SEQ ID NO : 2, c'est-à-dire pour la protéine de référence) ; (b) une séquence nucléotidique qui code pour l'EH ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 ; (c) une séquence nucléotidique qui diffère de la séquence selon (a) ou (b) par dégénérescence du code; ou par une séquence nucléotidique codant pour une protéine « variante », « homologue », ou « dérivée », notamment comme défini supra, et par exemple : (d) une séquence nucléotidique s'hybridant a une séquence selon (a), (b) ou (c), et codant pour une protéine ayant une activité EH sur les époxydes à CF3 ; (e) une séquence nucléotidique ayant un pourcentage d'identité égal ou supérieur à 45 %, de préférence à 80 %, de manière plus préférée à 85 %, de manière encore plus préférée à 90 %, et mieux encore à 95, 96, 97, 98 ou 99 % avec la SEQ ID NO : 1 , et codant pour une protéine ayant une activité EH sur les époxydes à CF3 ; (f) un fragment d'une séquence nucléotidique selon (a), (b), (c), (d) ou (e), comprenant au moins 30, de préférence au moins 60, de manière plus préférée au moins 150 ou 300 nucléotides consécutifs, et codant pour une protéine ayant une activité EH sur les époxydes à CF3. Les protéines ainsi codées ont une activité EH sur un époxyde à CF3, et de préférence une activité biologique au moins identique, similaire ou analogue à la protéine de référence sur le même substrat. Dans le cas d'application à une hydrolyse énantiosélective, les protéines préférées sont celles présentant pour un substrat donné, un coefficient d'énantiosélectivité E supérieur ou égal à 10, de préférence à 30. Suivant la caractéristique d), la séquence nucléotidique peut être une séquence nucléotidique s'hybridant a une séquence selon (a), (b) ou (c), et codant pour une protéine ayant une activité EH sur les époxydes à CF3 ; les conditions d'hybridation sont de préférence des conditions de stringence élevées, terme dont la définition est bien connue de l'homme du métier, qui peut se référer aux ouvrages généraux tels que Sambrook et al., 1989 et Hames & Higgins (1985) supra. En ce qui concerne la caractéristique e), l'identité entre séquences nucléotidiques est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Blast Software ou Séquence Analysis Software Package mentionnés supra) qui tient compte des nucléotides qui diffèrent entre deux séquences comparées et des nucléotides manquants sur l'une des deux séquences. La valeur de pourcentage est donnée à partir du nombre de nucléotides identiques sur le nombre total de nucléotides de la séquence de référence. Une séquence nucléotidique homologue inclut donc toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID NO : 1 par mutation, insertion, déletion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour un peptide présentant l'activité EH sur des époxydes à CF3. les modifications ne portant pas significativement atteinte à l'activité biologique de la protéine de référence, et de préférence conservant l'activité biologique de la protéine de référence ou accroissant l'activité biologique par rapport à la protéine de référence. Suivant un mode de réalisation préféré, il est fait usage de la séquence nucléotidique suivant la caractéristique (a) ou (b), plus préférentiellement encore suivant la caractéristique (a). Il peut aussi s'agir d'une séquence comprenant ou constituée essentiellement d'un fragment d'une telle séquence (a) ou (b), par exemple nucléotides 1-1197.
Comme cela est parfaitement connu en soi (voir références supra), la séquence nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à un ou des élément(s) permettant son expression ou la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription. Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium. Les cellules hôtes peuvent être transfectées de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, telles que les cellules COS-7, 293, MDCK, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9, des bactéries telles que E. coli et des souches de levures telles que Saccharomyces cerevisiae ou des champignons filamenteux comme Aspergillus niger. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. La protéine recombinante obtenue peut être purifiée à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc. Une époxyde hydrolase recombinante correspondant à l'enzyme de A. niger LCP521 est commercialement disponible sous la référence « Epoxide Hydrolase, Aspergillus niger sp., recombinant ftom Aspergillus niger », BioChemika, catalogue Fluka, code 71832.
La protéine à activité EH peut encore être produite par synthèse chimique. A cet effet, on peut recourir à n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier. Le peptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.
Pour son usage dans le procédé de transformation de l'invention, la protéine peut être en solution ou immobilisée sur un support solide approprié, tel que par exemple le DEAE cellulose ou le DEAE Sepharose, Eupergit ou Eupergit modifié (C. Mateo et al., Org. Biomol. Chem., 1, 2739-2743 (2003)).
On peut encore utiliser directement dans le procédé, des cellules entières du champignon tel que Aspergillus niger, modifié génétiquement de manière à sur-exprimer l'époxyde hydrolase à un niveau satisfaisant. Ceci peut être réalisé en insérant, de manière opérante dans le génome du champignon, une ou plusieurs cassettes d'expression contenant la séquence codante définie plus haut, sous la dépendance d'un ou des élément(s) permettant son expression ou la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et ou terminateurs de transcription. On peut aussi choisir de modifier le niveau d'expression du gène codant pour l'époxyde hydrolase, par exemple par insertion d'un promoteur hétérologue fort et/ou un activateur pour contrôler le gène in situ. Enfin, on peut aussi introduire dans le champignon un vecteur d'expression non intégratif, comme décrit supra. Comme décrit supra, un tel microorganisme recombiné peut aussi être utilisé pour la production d'enzyme in vitro, auquel cas le procédé d'extraction de l'enzyme produite est ensuite mis en œuvre.
Conditions du procédé de transformation Le substrat époxyde à transformer est de préférence mis en solution dans un solvant, de préférence organique, approprié. Le substrat peut être un époxyde racémique ou un époxyde non racémique. Suivant un premier mode de réalisation, le solvant du substrat est un solvant organique miscible à l'eau et le procédé est dit « monophasique ». Ce solvant est par définition capable de dissoudre le substrat époxyde et est compatible avec l'enzyme (le solvant ne dégrade pas notablement l'enzyme ni son activité d'époxyde hydrolase vis-à-vis de l'époxyde à CF3). Le substrat peut être employé en toute concentration, dans les limites de sa solubilité dans le solvant. Des exemples de solvants pour le système monophasique comprennent le DMSO (diméthylsulfoxyde), le DMF (diméthylformamide), l'acétone, le THF (tetrahydrofurane), le dioxane, le propanol. Les solvants préférés sont le DMSO, le DMF (diméthylformamide) et l'acétone. Deux ou plus de ces solvants peuvent être employés en mélange. La méthode comprend ensuite le mélange de la solution de substrat et de l'enzyme, de préférence de l'enzyme en solution tamponnée et de préférence dans l'eau. L'enzyme isolée est de préférence employée en solution aqueuse, notamment de l'eau, e.g. eau distillée et/ou purifiée. De ce fait, lorsqu'elle se présente sous forme solide, e.g. pulvérulente, elle est d'abord dissoute dans la solution aqueuse. Les concentrations optimales en enzyme peuvent être déterminées pour chaque substrat et peuvent varier dans d'assez larges proportions. De manière générale, on peut travailler en système monophasique avec de faibles concentrations en enzyme, par exemple de l'ordre de 1 à 60 mg d'enzyme par litre de milieu réactionnel, de préférence de 5 à 30 mg/l. Pour chaque substrat il est possible de contrôler en continu la durée de la réaction d'hydrolyse. Pour un nouveau substrat, une étude préliminaire expérimentale permet d'accéder aux paramètres de contrôle. L'énantiosélectivité de la réaction d'hydrolyse par l'enzyme est due à une plus forte affinité et une constante catalytique supérieure pour l'énantiomère (R) par rapport à l'énantiomère (S), ou selon le cas pour l'énantiomère (S) par rapport à l'énantiomère (R). Les deux énantiomères peuvent être hydrolyses, mais la vitesse d'hydrolyse de l'un des énantiomères étant considérablement supérieure, le contrôle de la durée de la réaction permet de piloter la réaction. Il est donc bien évident que l'homme du métier est à même de déterminer facilement les conditions de durée optimales pour un substrat donné. Ceci peut être réalisé en réalisant des prélèvements réguliers du milieu réactionnel sur lesquels on évalue l'évolution de l'excès énantiomérique (ee) et le taux de conversion (c). Les exemples donnent un mode opératoire utilisant de l'acétonitrile pour arrêter la réaction (voir infra) dans chaque échantillon prélevé et une extraction à l'isooctane pour passage en chromatographie en phase gazeuse (CPG). Si la durée de la phase d'hydrolyse peut varier dans de larges proportions en fonction notamment du substrat considéré et de la concentration en enzyme, on peut néanmoins préciser à titre indicatif que la durée de la phase d'hydrolyse pourra être généralement comprise entre 10 et 300 min, de préférence entre 25 et 80 minutes. L'arrêt de la réaction de transformation peut être réalisé par tout moyen chimique ou physique approprié, comme par exemple: ajout d'un solvant toxique pour l'EH (acétonitrile par exemple) ; addition de base ou d'acide, de détergent, de sels etc. ; ou encore par congélation, chauffage, micro-onde, microfiltration etc.
Suivant un deuxième mode de réalisation, le solvant du substrat est un solvant organique qui n'est pas miscible à l'eau et le procédé est dit « biphasique ». Ce solvant est par définition capable de dissoudre le substrat époxyde et est compatible avec l'enzyme (le solvant ne dégrade pas notablement l'enzyme ni son activité d'époxyde hydrolase vis-à-vis de l'époxyde à CF3). Ces solvants non miscibles à l'eau peuvent être choisis parmi les alcanes, par exemple l'iso-octane et l'hexane, les cycloalcanes (cyclohexane par exemple) et les aromatiques (toluène par exemple). Deux ou plus de ces solvants peuvent être employés en mélange. Dans ce deuxième mode de réalisation, une modalité particulière consiste à utiliser en plus un solvant organique miscible à l'eau, notamment un solvant tel que défini pour le système monophasique. Dans ce deuxième mode de réalisation, une émulsion est de préférence formée à partir de la solution d'époxyde et de la solution d'enzyme. L'émulsion peut être formée au moment du mélange entre la solution de substrat (phase organique) et une solution aqueuse de l'enzyme (phase aqueuse). Il est aussi possible de former une pré-émulsion par mélange de la solution de substrat (phase organique) avec de l'eau ou une solution aqueuse appropriée, cette émulsion étant ensuite mélangée à le solution aqueuse de l'enzyme. Les moyens de mélange sont tels qu'une émulsion peut se former. Les substrats époxyde ont en général des coefficients de solubilité supérieurs dans les solvants organiques utilisés dans ce mode de réalisation que dans une solution aqueuse contenant des solvants miscibles à l'eau du mode monophasique. La concentration en époxyde peut donc être supérieure, et par exemple être comprise entre 1 et 1000 g d'époxyde par litre de milieu réactionnel, de préférence entre 10 et 500 g/l. La phase organique représente avantageusement de 1 à 60 %, de préférence de 5 à 50 % du volume total de l'émulsion. Les ratios compris entre 1 et 20%, de préférence entre 5 et 15 %, sont principalement utilisés lorsque la concentration en époxyde dans le milieu réactionnel est inférieure ou égale à 100 g/l. Au-dessus, on utilise préférentiellement les ratios compris entre 20 et 60 %, de préférence entre 20 et 40 %. La concentration en enzyme dans la phase aqueuse peut varier dans de larges proportions. Elle se situe entre 0,002 et 3 g d'enzyme pure par litre et de préférence entre 0.002 et 0.5 g/L. Dans ce mode de réalisation biphasique, il est aussi possible de déterminer à l'avance et/ou de contrôler en continu la durée de la réaction d'hydrolyse pour un substrat donné. Comme décrit supra, ceci peut être réalisé en effectuant des prélèvements réguliers du milieu réactionnel sur lesquels on évalue l'évolution de l'excès énantiomérique et le taux de conversion. Les exemples donnent un mode opératoire utilisant de l'acétate d'éthyle et un passage en CPG, que l'on peut appliquer sur chaque échantillon prélevé pour suivre l'évolution de la réaction. La durée de la phase d'hydrolyse peut varier dans de larges proportions, en fonction des conditions opératoires, notamment de la quantité d'enzyme mise en œuvre, et du substrat à transformer. On peut néanmoins préciser que la durée de la phase d'hydrolyse pourra être généralement comprise entre quelques minutes, e.g de l'ordre de 15 à 30 minutes, et plusieurs jours. L'arrêt de la réaction de transformation peut être réalisé par tout moyen adapté, tel que ajout d'acétate d'éthyle, d' éther éthylique, de dichlorométhane, etc., ou encore par les moyens et techniques mentionnés pour le système monophasique. Dans le procédé de l'invention, et notamment dans les deux modes de réalisation qui viennent d'être décrits, la température lors de la phase d'hydrolyse est généralement maintenue entre 4 et 50°C, de préférence entre 25 et 30 °C . La phase d'hydrolyse est conduite dans un réacteur approprié muni de moyens d'agitation ou de mélange adaptés. Les paramètres de mélange ou d'agitation sont choisis pour optimiser la phase d'hydrolyse. Suivant une modalité particulière, il est procédé à un contrôle continu ou à intervalles réguliers des conditions d'agitation, notamment de la vitesse de rotation des moyens d'agitation. Dans le système bi-phasique, ce contrôle permet notamment d'assurer le maintien du milieu réactionnel sous la forme d'une émulsion appropriée. Suivant une modalité préférée, l'agitation est maintenue tout au long de la phase d'hydrolyse. Le pH peut être maintenu entre 6 et 9, de préférence entre 6,5 à 7,5. Des co-réactifs peuvent être utilisés pour accroître la stabilité de l'EH. On peut citer à titre préféré des agents de réduction tels que le ?-mercaptoéthanol ou la cystéine. A l'issue de la phase d'hydrolyse, le substrat (mélange d'époxyde et de diol) peut être extrait par des méthodes classiques connues de l'homme du métier, comme par exemple l'extraction directe ou l'extraction en continu etc. A partir du produit de l'hydrolyse, éventuellement d'un extrait de celui-ci, l'époxyde résiduel et le diol peuvent être séparés par des méthodes classiques connues de l'homme du métier, par exemple par distillation, chromatographie sur colonne, extraction liquide/liquide, etc. Des opérations de ce type sont détaillées par exemple dans l'exemple numéro 23. Comme mentionné supra, le diol énantiomériquement enrichi peut être cyclisé en son époxyde. Pour la cyclisation du diol (R) ou (S), on peut utiliser toute méthode connue. A titre d'exemple, la cyclisation peut être réalisée en deux étapes, par ajout de 1 équivalent de chlorure de tosyle (TsCI) en présence de tetrahydrofurane (THF), puis d'hydrure de sodium (NaH). L'opération d'hydrolyse énantiomérique et de cyclisation peut être reconduite une ou plusieurs fois, de façon à accroître l'excès énantiomérique en époxyde (R) ou (S) ou en diol. La présente invention permet donc de préparer des mélanges comportant de forts excès énantiomériques en époxyde (S) et diol (R), [ou inversement en époxyde (R ) et diol
(S)], des préparations à fort excès énantiomérique en époxyde (S), [ou inversement en époxyde (R)], des préparations à fort excès énantiomérique en diol (R) [ou inversement (S)]. Ces préparations peuvent être énantiopures ou essentiellement énantiopures, i.e. présenter un excès énantiomérique en époxyde (R) ou (S) et ou en diol (R) ou (S) supérieur ou égal à 95, 96, 97, 98 ou 99 %, voire égal à 100 %. Ces préparations, qui peuvent être des mélanges d'époxyde et de diol, ou qui peuvent être issues d'une séparation entre époxyde et diol, et éventuellement d'une cyclisation du diol, sont d'autres objets de la présente invention. . La présente invention a donc aussi pour objet l'utilisation d'une protéine à activité EH sur un époxyde à CF3 conforme à l'invention, pour la préparation de tels mélanges et préparations, à partir d'un époxyde racémique ou non racémique. Suivant une mode de réalisation préféré, l'époxyde hydrolase de YAspergillus niger LCP521 est utilisée, par exemple une protéine d'extraction, une protéine recombinante ou une protéine produite par synthèse chimique. Suivant un autre mode de réalisation, on utilise une protéine d'une autre origine, ou un « variant », « homologue » ou « dérivé » de l'époxyde hydrolase de YAspergillus niger LCP521 , qui a une activité EH sur un époxyde à CF3, et de préférence une activité biologique identique, similaire ou analogue à l'époxyde hydrolase de YAspergillus niger LCP521 sur le même substrat, voire une activité EH supérieure à cette dernière. De manière préférée, cette protéine à activité EH présente pour un substrat donné, un coefficient d'énantiosélectivité E supérieur ou égal à 10, de préférence à 30.
Suivant un autre mode de réalisation, l'hydrolyse est non ou peu énantiosélective. L'invention peut alors concerner entre autres un procédé d'hydrolyse non énantiosélective d'un mélange racémique ou non racémique, d'époxyde en diol procédé dans lequel la réaction est conduite en système monophasique ou biphasique comme décrit supra. Suivant une modalité particulière, on transforme un époxyde racémique en diol racémique. Ce procédé peut être conduit de manière remarquable, dans des conditions expérimentales particulièrement douces et économiques, évitant en particulier l'utilisation d'un milieu acide ou basique minéral plus ou moins concentré. La sélection d'une protéine à activité EH peut être facilement réalisée sur la base du test décrit supra, ou d'un test similaire, l'objectif étant cette fois de déterminer et sélectionner les protéines conduisant, pour un substrat donné, à un coefficient E inférieur à 10. Certains des époxydes et diols selon l'invention sont des intermédiaires utiles comme intermédiaires de synthèse de composés pharmaceutiquement actifs. Un autre objet de l'invention est donc l'application du procédé selon l'invention pour la préparation d'intermédiaires de synthèse de composés pharmaceutiquement actifs ou pour la préparation de tels composés pharmaceutiquement actifs, se présentant sous la forme époxyde et/ou diol, de préférence sous la forme époxyde (R) ou (S), de préférence énantiopure ou énantiomériquement enrichie (i.e. présentant un excès énantiomérique supérieur ou égal à 95, 96, 97, 98 ou 99 %, voire égal à 100 %), ou sous la forme diol (R) ou (S), de préférence énantiopure ou énantiomériquement enrichie (i.e. présentant un excès énantiomérique supérieur ou égal à 95, 96, 97, 98 ou 99 %, voire égal à 100 %). Plus généralement, l'invention s'applique à la production de produits d'intérêt industriel doués d'activité biologique, ou d'intermédiaires de tels produits, par exemple dans les domaines phytosanitaires et agrochimiques, e.g. produits insecticides, anti-parasitaires, etc. Comme composés pharmaceutiquement actifs pouvant être obtenus à partir des époxydes et des diols selon l'invention, on peut citer par exemple : BRL-35113 (CAS 90730-95-3) ; Clofuperol Hydrochloride (CAS 17230-8764) S-15511 (AN-2000-47942 ; J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, N°2, 753-60, 2000) ; - Aprepitant (CAS 170729-80-3) ; Flumaxedol Hydrochloride (CnH^CIFaNO) ; Iralukast (CAS 15181 -24-7 ; Novartis AG) ; Mabuterol Hydrochloride (C13H19CI2F3N2O) ; Oxaflozane Hydrochloride (CAS 26629-86-7) ; - S-15261 (AN-94-44449 ; Diabetologia 37, N°10, 969-75, 1994) ; Fludorex (CAS 15221-81-5) ; Flumetramide (CAS 7125-73-7) ; Fluminorex (CAS 720-76-3) ; et L-709210, L-732138, L-733060, L-636281 , L-740141 , L-741671 , L-742311 , L-742694, ou L-758298 (Merck&Co Inc).
La présente invention a également pour objet une composition utile pour la mise en œuvre du procédé de transformation selon l'invention, comportant, pour addition successive ou simultanée, un époxyde fluoré conforme à l'invention, comportant un ou plusieurs groupes CF3, et un solvant de cet époxyde, à savoir un solvant organique miscible à l'eau ou non miscible à l'eau, tel que décrit supra. Selon une caractéristique particulière, cette composition comporte en outre, pour addition successive ou simultanée, une enzyme conforme à la présente invention. La présente invention a encore pour objet une composition utile pour la mise en œuvre du procédé de transformation selon l'invention, comportant, pour addition successive ou simultanée, une enzyme conforme à l'invention et un solvant organique miscible à l'eau ou non miscible à l'eau, tels que décrit supra. Selon une caractéristique complémentaire, cette composition peut comprendre une solution aqueuse. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples d'application non limitatifs. Exemples Dans les exemples qui suivent, l'enzyme utilisée est l'époxyde hydrolase d'A niger (EH d'An) de la souche LCP521. Cette enzyme est une protéine recombinante produite dans une souche d'Aspergillus niger conformément au procédé décrit sous la partie B) « Clonage et caractérisation de l'époxyde hydrolase soluble d'Aspergillus niger qui est apparentée aux époxydes hydrolase microsomales de mammifère » dans WO-A-00 68394. Une enzyme ainsi produite est commercialement disponible comme mentionné supra.
Résolution cinétique par l'EH d'An - Système monophasique Exemple 1
Résolution cinétique du 4-(trifluorométhoxy-phényl)-oxirane par l'EH d'An - Système monophasique
5,1 mg de 4-(trifluorométhoxy-phényl)-oxirane sont dissous dans 3 mL de DMSO. On ajoute 3 μL de 3-(trifluorométhyl)-acétophénone (étalon interne) et 7,9 mL d'eau distillée ([4- (trifluorométhoxy-phényl)-oxirane]=2,5 mM ; %DMSO=30). Une solution enzymatique est préparée : 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) sont dissous dans 4,550 mL d'eau distillée. Les solutions sont placées à 27°C pendant 30 min. On ajoute ensuite 100μL de solution enzymatique au milieu réactionnel. Des prélèvements réguliers du milieu réactionnel permettent de suivre au cours de la réaction l'excès énantiomérique du substrat résiduel et son taux de conversion (400 μL du milieu réactionnel sont ajoutés à 200 μL d'acétonitrile. Après agitation au vortex, extraire par
400 μL d 'so-octane et injecter 2μL de la phase organique sur CPG chirale). Les valeurs obtenues correspondent à une valeur du coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 30.
Le coefficient d'énantiosélectivité E est défini comme étant :
E In [(1 -c)(1 -ees)] ln [(1-c)(1+ees)]
Avec c : taux de conversion ees : Excès énantiomérique du substrat résiduel après hydrolyse enzymatique.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=120°C ; tr=4,4 min et 4,8 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=3,9 min pour l'étalon interne) Exemple 2
La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au 2-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane (4,7 mg soit [2-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane] =2,5 mM), en présence de 25 % de DMSO. La solution enzymatique ajoutée (100μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) dans 2,470 mL d'eau distillée. Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 5.
Analyses réalisées sur une colonne type Lipodex E (T=100°C ; tr=3,8 min et 4,8 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr= 4,3 pour l'étalon interne)
Exemple 3
La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au 3-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane (5,0 mg soit [3-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane] =2,66 mM) , en présence de 20 % de DMSO.
La solution enzymatique ajoutée (100μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) dans 2.680 mL d'eau distillée.
Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité de 10.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=90°C ; tr=13,2 min et 13,7 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=10,4 min pour l'étalon interne)
Exemple 4 La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au 4-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane (4,7 mg soit [4-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane] =2,5 mM) , en présence de 20 % de DMSO. La solution enzymatique ajoutée (100μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) dans 2.470 mL d'eau distillée. Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 50.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=120°C ; tr=9,7 min et 10,7 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=3,9 min pour l'étalon interne) Exemple 5
La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au 3,5-(bistrifluorométhyl-phényl)- oxirane (0,77 mg soit [3,5-(bistrifluorométhyl-phényl)-oxirane] =0,3 mM) , en présence de 25 % de DMSO. La solution enzymatique ajoutée (100μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) dans 15.065 mL d'eau distillée.
Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 4.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=80°C ; tr=9,8 min et 10,1 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=17,1 min pour l'étalon interne) Exemple 6
La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)- oxirane (5,0 mg soit [méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)-oxirane] =2,5 mM), en présence de 30 % de DMSO. La solution enzymatique ajoutée (100μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) dans 2.320 mL d'eau distillée.
Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité de 25.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=100°C ; tr=8,5 min et 9,1 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=6,9 min pour l'étalon interne)
Exemple 7 La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)- oxirane (3,6 mg soit [méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)-oxirane] =1 ,8 mM), en présence de 30 % de DMSO. La solution enzymatique ajoutée (100μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) dans 3.222 mL d'eau distillée. Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 30.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=120°C ; tr=6,4 min et 7,1 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=3,9 min pour l'étalon interne)
Exemple 8
La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au 4-(trifluorométhylthio-phényl)-oxirane (4,4 mg soit [4-(trifluorométhylthio-phényl)-oxirane] =2 mM), en présence de 30 % de DMSO. La solution enzymatique ajoutée (100μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25%) dans 5.273 mL d'eau distillée. Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 160.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=130°C ; tr=7,2 min et 7,6 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=2,8 min pour l'étalon interne)
Résolution cinétique par l'EH d'An - Système biphasique - échelle analytique Exemple 9
Résolution cinétique du 4-(trifluorométhoxy-phényl)-oxirane par l'EH d'An - Système biphasique ; échelle analytique Dans un tube haut et étroit à fond plat (diamètre 15 mm), 100 mg de 4- (trifluorométhoxy-phényl)-oxirane sont placés dans 100 μL d'/so-octane. On ajoute 20 μL de 3-(trifluorométhyl)-acétophénone (étalon interne) et 850 μL d'eau distillée. Le flacon est bouché, muni d'une violente agitation magnétique (formation d'une émulsion) et placé à 27°C. Avant l'ajout de 0,86 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (pureté 25 %) en solution dans 50 μL d'eau distillée, l'agitation est stoppée, 1 μL de la phase organique est prélevé et l'agitation est relancée. Le prélèvement est dilué par de l'acétate d'éthyle et injecté en CPG chirale. Ce type de prélèvement, répété au cours du temps, permet de suivre évolution de l'excès énantiomérique du substrat résiduel et du taux de conversion de l'époxyde. Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 160.
Analyses réalisés sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T=120°C ; tr=4,4 min et 4,8 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=3,9 min pour l'étalon interne)
Exemple 10
La procédure décrite dans l'exemple 9 est appliquée au 2-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane.
Dans ce cas, pour 100 mg de substrat sont ajoutés 1 ,7 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (pureté 25 %). Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 20.
Exemple 11
La procédure décrite dans l'exemple 9 est appliquée au 3-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane. Dans ce cas, pour 100 mg de substrat sont ajoutés 1 ,7 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (pureté 25 %).
Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 10. Exemple 12
La procédure décrite dans l'exemple 9 est appliquée au 4-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane. Dans ce cas, pour 100 mg de substrat sont ajoutés 1 ,7 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (pureté 25 %). Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 270.
Exemple 13
La procédure décrite dans l'exemple 9 est appliquée au (3,5-bistrifluorométhyl-phényl)- oxirane. Dans ce cas, pour 100 mg de substrat sont ajoutés 1 ,7 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (pureté 25 %).
Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 17.
Exemple 14
La procédure décrite dans l'exemple 9 est appliquée au méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)- oxirane. Dans ce cas, pour 100 mg de substrat sont ajoutés 1 ,7 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (pureté 25 %). Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 25.
Exemple 15 La procédure décrite dans l'exemple 9 est appliquée au méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)- oxirane. Dans ce cas, pour 100 mg de substrat sont ajoutés 1 ,7 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (pureté 25 %). Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 50.
Résolution cinétique par méthode chimique (comparatif)
Exemple 16
Résolution cinétique de 4-(trifluorométhoxy-phényl)-oxirane par méthode chimique
Dans un mini-réacteur de 1 mL muni d'une agitation magnétique, 204 mg (1 mmole) de 4- (trifluorométhoxy-phényl)-oxirane sont ajoutés à 4,76 mg (0.007 mmole) de (R,R)(Salen)Co(OAc). On introduit en une seule fois 9,9 μL d'eau (0.55 mmol) à température ambiante. Le système est placé pendant 48h sous agitation à température ambiante. On extrait ensuite la totalité du milieu réactionnel par 10 mL d'/so-octane. 1 mL de la phase organique est alors prélevé. On lui ajoute 1 mL de solution d'/so-octane contenant de l'étalon 3-(trifluorométhyl)-acétophénone à 5 g.L'1. 0.2 μL de ce mélange est injecté en GC chirale. Les valeurs obtenues (eeép0Xyde résider 98,6 % ; eedl0ι %) correspondent à un coefficient d'énantiosélectivté E apparent de 84.
Exemple 17 La procédure décrite dans l'exemple 16 est appliquée au (2-trifluorométhyl-phényl)-oxirane à l'échelle de la millimole.
Les valeurs obtenues (eeβpoxyde résιdue,=23,3 % ; c=77,7 %) correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 1.4. Exemple 18
La procédure décrite dans l'exemple 16 est appliquée au (3-trifluorométhyl-phényl)-oxirane à l'échelle de la millimole.
Les valeurs obtenues (eeépo yde % ; c=61 %) correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent supérieur ou égal à 33.
Exemple 19
La procédure décrite dans l'exemple 16 est appliquée au (4-trifluorométhyl-phényl)-oxirane à l'échelle de la millimole.
Les valeurs obtenues (eeépoxyde % ; eedl0ι f0rmé =79,3 %) correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 38.
Exemple 20
La procédure décrite dans l'exemple 16 est appliquée au méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)- oxirane à l'échelle de la millimole. Les valeurs obtenues (eeép0χyde réadue 0.1 % ; c =2,0 %) correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent de 1.
Exemple 21
La procédure décrite dans l'exemple 16 est appliquée au méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)- oxirane à l'échelle de la millimole.
Les valeurs obtenues (eeepoxyde résιduei=0,2 % ; c =19,4 %) correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité E apparent proche de 1.
Exemple 22 La procédure décrite dans l'exemple 16 est appliquée au 4-(trifluorométhylthio-phényl)- oxirane à l'échelle de la millimole. Les valeurs obtenues (eee coefficient d'énantiosélectiv
Résolution cinétique par Echelle préparative
Exemple 23
Résolution cinétique de biphasique ; échelle prépar
Dans un flacon muni d'un phényl)-oxirane racémique d'eau distillée. L'ensemble est place sous agitation dans un Dam tnermostate a ^r. Pendant ce temps, on prépare une solution enzymatique contenant 12,5 mg par mL d'eau d'extrait enzymatique EH d'An recombinante (pureté 25 %). Cette solution est elle aussi placée à 27°c. Après 30 minutes, on ajoute au milieu réactionnel 1 mL de la solution enzymatique précédemment préparée. Ce moment correspond au temps t0.
La réaction est suivie par GC chirale. On prélève régulièrement 1 μL au milieu réactionnel que l'on ajoute à 40 μL d'acétate d'éthyle placés au préalable dans un eppendorf. Après agitation au vortex et centrifugation, on injecte en GC chirale pour mesurer l'excès énantiomérique de l'époxyde résiduel. Lorsqu'il atteint une valeur suffisante (excès énantiomèrique>97 %), on stoppe la réaction par ajout de 30 mL d'acétate d'éthyle. On laisse décanter, récupère la phase organique et extrait par 2x50 mL d'acétate d'éthyle la phase aqueuse. Les phases organiques sont réunies, lavées par 30 mL de solution aqueuse saturée en NaCI, séchées sur MgSO4 et concentrées sous pression réduite. L'époxyde résiduel et le diol formé sont séparés par chromatographie flash sur gel de silice (50 parties ; éluant : hexane / acétate d'éthyle 90/10 jusqu'à acétate d'éthyle pur). En vue de la mesure des pouvoirs rotatoires, chaque produit isolé subit ensuite une purification au four à boules pour éliminer toute trace de solvant et de silice. On obtient 615 mg de (R)-(4- trifluoromethoxy-phenyl)-ethane-1 ,2-diol (rdt= 45,6% ; ee= 94,5%) et 543 mg de (S)-4-
(trifluorométhoxy-phényl)-oxirane (rdt= 43,4% ; ee = 98,6%).
Analyse structurale (SM-(trifluorométrιoxy-phényl)-oxirane
RMN 1H / CDCI3 : 5 2,79 (dd, 1 H, 3JHH = 2,5 Hz, 1JHH = 5,3 Hz, H,), δ 3,19 (dd, 1 H, 3JHH = 4,0 Hz, 1JHH = 5,3 Hz, H,), δ 3,92 (dd, 1 H, 3JHH = 2,5 Hz, 3JHH = 4,0 Hz, H2), δ 7,38-7,65 (m, 4H, H4.β.7,β). RMN 13C / CDCI3 : δ 51 ,3 (d), δ 51 ,7 (C2), δ 120,4 (q, 1JC =265,5 Hz, d), δ 121 ,1 (C4 et C8), δ 126,9 (C5 et C7), δ 136.4 (C3), δ 149,1 (q, J=1 ,9 Hz, C6). RMN 19F {1H} / CDCI3 : δ -57,35. HRMS : calculé pour C9H6F3θ2 (MS ES") : 203,0320. Trouvé : 203,0311.
Analyse élémentaire : Calculé : C : 52,95 % ; H : 3,46 % ; F : 27,92 %. Trouvé : C : 52,60 % ; H : 3,38 % ; F : 29,04 %.
[α] D ≈ + 13,7 (c 1 ,58 ; CHCI3) [(S) / ee = 98,6 %] (f?)-(4-trifluoromet oxy-phenvπ-ethane-1 ,2-diol
F : 64 °C. RMN 1H / CDCI3 : 5 2,13 (massif, 1 H, H10 ou H9), 5 2,69 (massif, 1 H, H10 ou H9), 5 3,70 (m, 2H, H^.), 5
4,84 (m, 1 H, H2), 5 7,21 (d, 2H, 3JHH = 8,75 Hz, H4.8), 5 7,41 (d, 2H, 3JHH = 8,5 Hz, H5,7).
RMN 13C / Acétone-d6 : 5 68,7 (d), 5 74,5 (C2), 5 121 ,4 (C5 et C7), 5 121 ,5 (q, JCF=253,3 Hz, C,,), 5
128,8 (C4 et C8), 5 143,1 (C3), 5 148,9 (m, C6).
RMN 18F {1H} / CDCI3 : 5 -57,61. HRMS : calculé pour C9H8F3θ3 (MS ES") : 221 ,0426. Trouvé : 221 ,0437.
Analyse élémentaire : Calculé : C : 48,66 % ; H : 4,08 % ; F : 25,65 %. Trouvé : C : 48,79 % ; H :
4,08 % ; F : 26,41 %.
[α] . 2 %2 = - 41 ,5 (c 1 ,04 ; CHCI3) [(S) / ee = 94,5 %] Exemple 24
La procédure décrite dans l'exemple 23 est appliquée au 2-(trifiuorométhyl-phényl)-oxirane. On obtient le (S)-2-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane (rdt=34,5% ; ee=97,9%) et le (R)-2- trifluoromethyl-phenyl)-ethane-1 ,2-diol (rdt=59,2% ; ee=77,3%). Analyse structurale
(S)-2-(trifluorométhyl-p ényl)-oxirane
RMN 1H / DMSO-de : δ 2,75 (dd, 1 H, JHH = 5,5 Hz, 3JHH = 2,5 Hz, H,), 5 3,21 (dd, 1 H, 1 JHH = 5,5 Hz, 3JHH = 4,25 Hz H,.). 5 4,15 (m, 1 H, H2), 5 7,44 (d, 1 H, 3JHH = 7,75 Hz, H8), 5 7,54 (t, 3JHH = 7,5 Hz, H7), 5 7,63 (t, 1 H, 3JHH = 7,5 Hz, H6), 5 7,75 (d, 1 H, 3JHH = 7,75 Hz, H5). RMN 13C / DMSO-ofβ : 548,5 (q, 4JCF=2,7 Hz, C2), 5 50,2 (d), 5 124,3 (q, 1JCF=273,5, C10), 5 125,5 (q, 3JCF=5,4 Hz, C5), 5 125,5 (m, C6 ou C8), 5 126,9 (q, 2JCF=30,7 HZ, C4), 5 128,2 (C7), 5 32,9 (m, C6 ou C8), 5 136,2 (m, C3). RMN 19F {1H} / CDCI3 : 5 -59,62. HRMS : calculé pour C9H6F30 (MS ES") : 187,0371. Trouvé : 187,0374. [α] £ = + 62,4 (c 0, 98 ; CHCI3) [(S) / ee = 97,9 %]
(f?)-2-(trifluoromethyl-phenyl)-ethane-1 ,2-diol
F : 51 °C.
RMN 1H / CDCI3 : 5 2,45 (s, 1 H, H9 ou H10), 5 3,00 (s, 1 H, H9 ou H10), 5 3,67 (massif, 2H, Hι r), 5 5,23
(massif, 1 H, H2) 5 7,44-7,65 (m, 4H, H4,6,7.8).
RMN 13C / CDCI3 : 5 67,8 (C,), 5 74,4 (C2), 5 125,6 (q, 3JC =5,8 Hz, C5), 5 124,2 (q, 1JCF=273,7 Hz, d,), 5 127,3 (q, 2JCF=30,3 Hz, C4), 5 128,0 (C7), 5 128,2 (m, C6 ou C8), 5 132,2 (m, C6 ou C8), 5 139,2
(C3).
RMN 19F {1H} / CDCI3 : 5 -57,93.
HRMS : calculé pour C9H8F302 (MS ES") : 205,0476. Trouvé : 205,0468. [α] 2 β 2 = - 47,9 (c 0,98 ; CHCI3) [(S) / ee = 77,3 %]
Exemple 25
La procédure décrite dans l'exemple 23 est appliquée au 3-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane. On obtient le (S)-3-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane (rdt=11,4%; ee=98,7%) et ie (R)-3- (trifluoromethyl-phenyl)-ethane-1,2-diol (rdt=84,9% ; ee=13,2%).
Analyse structurale
(S)-3-(trifluorométhyl-phénv0-oxirane
RMN1H/CDCI3: 52,79 (dd, 1H, 3JHH = 2,5 Hz, 1JHH = 5,3 Hz, H,), 53,19 (dd, 1H, 3JHH = 4,0 Hz, 1JHH = 5,3 Hz, H,), 53,92 (dd, 1 H, 3JHH = 2,5 Hz, 3JHH = 4,0 Hz, H2), 57,38-7,65 (m, 4H, H4,6,7,8). RMN 13C / CDCI3 : 551,4 (d), 551,7 (C2), 5122,3 (q, 3JCF=3,8 Hz, C4), 5124,0 (q, 1JCF=272,0 HZ, C10), 5125,0 (q, 3JC=3,7 Hz, C6), 5128,7 (m, C7), 5129,8 (C8), 5131,0 (q, 2JCF=32,4 HZ, C5), 5138,8 (C3). RMN19F{1H}/CDCI3:5-62,34.
HRMS : calculé pour C9H6F30 (MS ES") : 187,1412. Trouvé : 187,1324.
[α]" = + 9,1 (c 0, 92; CHCI3) [(S) / ee = 98,7 %]. Configuration (S) d'après Ferris, M. J.,
Arylethanolamine derivatives and their use in pharmaceutical compositions, EP 40,000, 1981.
(ffl-3-(trifluoromethyl-phenvπ-ethane-1,2-diol
RMN 1H / CDCI3 : 52,26 (massif, 1H, H9 ou H10), 52,87 (massif, 1H, H9 ou H10), 53,57 (dd, 1H, 1J = 11 Hz, 3J= 8,25 Hz, H , 53,73 (dd, 1H, 1J = 11 Hz, 3J = 3,25 Hz, H ), 54,81 (dd, 1H, 3J = 3,25 Hz, 3J= 8,25 Hz, H2) 57,44-7,65 (m, 4H, H aromatiques). RMN 13C / CDCI3 : 5 67,9 (d), 5 74,0 (C2), 5 122,8 (q, 3JCF=3,8 Hz, C4 ou C6), 5 124,8 (q, 3JCF=3,7 Hz, C4 ou C6), 5 124,0 (q, 1JCF=272,4 Hz, d,), 5 129,0 (C7 ou C8), 5 129,4 (C7 ou C8), 5 130,9 (q, 2JCF=32,3 Hz, C5), 5 139,4 (C3).
[α] p = - 5,7 (c 0,98 ; CHCI3) [(S) / ee = 13,2 %]
Exemple 26
La procédure décrite dans l'exemple 23 est appliquée au 4-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane. On obtient le (S)-4-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane (rdt=37,4% ; ee=97,9%) et le (R)-4- (trifluoromethyl-phenyl)-ethane-l ,2-diol (rdt=51 ,3% ; ee=84,3%).
Analyse structurale
(S)-4-(trifluorométhyl-phényl)-oxirane
RMN 1H / CDCI3 : 5 2,77 (dd, 1 H, 1JHH = 5,75 Hz, 3JHH = 2,75 Hz, H,), 5 3,18 (dd, 1 H, 1JHH = 5,75 Hz, 3JHH = 4,0 Hz Hr), 5 3,91 (dd, 1 H, 3JHH = 4 Hz, 3JHH = 2,75 Hz, H2), 5 7,39 (d, 1 H, 3JHH = 8 Hz, H4, H8), 5 7,60 (d, 2H, 3JHH = 8 Hz, H5, H7).
RMN 13C / CDCI3 : 5 51 ,4 (d), 5 51 ,7 (C2), 5 124.0 (q, 1JCF=271 ,8 Hz, C10), 5 125,5 (q, 3JCF=4,0 HZ, C5 et C7), 5 125,7 (C4 et C8), 5 130,4 (q, 2JCF=32,2 HZ, C6), 5 141 (s, C3).
RMN 19F {1H} / CDCI3 : 5 -62,28.
HRMS : calculé pour C9H6F30 (MS ES") : 187,0371. Trouvé : 187,0374. [α] " = + 18,0 (c 1 ,13 ; CHCI3) [(S) / ee = 97,9 %] (ff)-4-(trifluoromethyl-phenylVethane-1.2-diol
F : 101 °C (Litt. : 93 °C d'après Hirose, K.; Ogasahara, K.; Nishioka, K.; Tobe, Y.; Naemura, K.; J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2 2000, 1984-1993. "Enantiosélective complexation of phenoic crown ethers with chiral aminoethanol derivatives: effects of substituents of aromatic rings of hosts and guests on complexation".
RMN 1H / CDCI3 : 5 2,07 (massif, 1 H, H10 ou H9), 5 2,70 (massif, 1 H, H10 ou H„), 5 3,88 (m, 2H, H1ιr). δ 4,89 (m, 1 H, H2), 5 7,50 (d, 2H, 3JHH = 8,5 Hz, H4,8), 5 7,63 (d, 2H, 3JHH = 8,5 Hz, H5.7). RMN 13C / Acétone-d6 : 5 68,6 (d), 5 74,7 (C2), 5 125,5 (q, 1JCF=269,4 Hz, di), 125,6 (q, 3JCF=3,8 Hz, C5 et C7), 5 127,8 (C4 et C8), 5 129,5 (q, 2JCF=31 ,9 Hz, C6), 5 148,5 (C3). RMN 19F {1H} / Acétone-d6 : 5 -62,21. HRMS : calculé pour C9H9F302 (MS ES") : 205,0476. Trouvé : 205,0457.
[α] ^ = - 39,3 (c 1 ,03 ; CHCI3) [(S) / ee = 84,3 %]. Configuration (R) d'après Shimada, T. ; Mukaide, K. ; Shinohara, A. ; Han, J. W. ; Hayashi, T., Asymmetric synthesis of 1-Aryl-1,2-ethanediols from Arylcetylenes by palladium-catalysed asymmetric hydrosilylation as a key step, J. Am. Chem. Soc, 2002, 724, 1584-1585
Exemple 27
La procédure décrite dans l'exemple 23 est appliquée au méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)- oxirane. On obtient le (S)-méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)-oxirane (rdt=32,7% ; ee=98,3%) et le (f?)-méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)-ethane-1 ,2-diol (rdt=64,1 % ; ee=59,0%).
Analyse structurale
(S)-méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)-oxirane
RMN 1H / CDCI3 : 5 1 ,55 (s, 3H, H10), 5 2,75 (d, 1 H, 1JHH = 5,4 Hz, H,), 5 2,98 (d, 1 H, 1JHH = 5,4 Hz,
H , 5 7,40-7,59 (m, 4H, H4,e,7,8).
RMN 13C / CDCI3 : 5 21 ,5 (C10),5 56,2 (d), 5 57,0 (C2), 5 122,2 (q, 3JCF=3,8 Hz, C4 ou C6), 5 124,1 (q,
1JCF=272,5 Hz, Cn), 5 124,3 (q, 1JCF=3,8 Hz, C4 ou C6), 5 128,7 (C7), 5 128,9 (CB), 5 130,8 (q,
2JCF=32,1 Hz, C5), 5 142,4 (C3). RMN 18F {1H} / CDCI3 : 5 -62,27.
HRMS : calculé pour C10H8F3O (MS ES") : 201 ,0527. Trouvé : 201 ,0533.
[α] 2o = + 8,3 (c 1 ,0 ; CHCI3) [(S) / ee = 98,3 %] (f?)-méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)-ethane-1 ,2-diol
F : 48 °C.
RMN 1H / CDCI3 : 5 1 ,52 (s, 3H, H ), 5 2,37 (massif, 1 H, H9 ou H10), 5 2,99 (massif, 1 H, H9 ou H10), 5 3,69 (m, 2H, H,,,.), 5 7,43-7,73 (m, 4H, H4,6,7,8).
RMN 13C / CDCIj : 5 26,0 (dι),5 70,7 (d), 5 74,7 (C2), 5 122,1 (q, 3JCF=3,8 HZ, C4 OU C6), 5 124,0 (q, 1JCF=3,8 Hz, C4 OU Cβ), 5 124,2 (q, 1JCF=272,4 Hz, C12), 5 128,6 (C7 ou C8), 5 128,8 (C7 ou C8), 5 130,7 (q, 2JCF=32,1 Hz, C5), 5 142,4 (C3). RMN 19F {1H} / CDCI3 : 5 -61 ,98.
HRMS : calculé pour C10H10F3O2 (MS ES") : 219,0633. Trouvé : 219,0630.
Analyse élémentaire : Calculé : C : 54,55 % ; H : 5,04 % ; F : 25,88 %. Trouvé : C : 53,57 % ; H : 5,03 % ; F : 25,68 %. [α] β = - 5,9 (c 1 ,25 ; CHCI3) [(S) / ee = 59,0 %]
Exemple 28
La procédure décrite dans l'exemple 23 est appliquée au méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)- oxirane. On obtient le (S)-méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)-oxirane (rdt=35,0% ; ee=99,1 %) et le (R)-méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)-ethane-1 ,2-diol (rdt=58,0% ; ee=88,3%).
Analyse structurale (S)-méthvt-(4-trifluorométhyl-phényl)-oxirane
RMN 1H / CDCI3 : 5 1 ,73 (s, 3H, H10), 5 2,76 (d, 1 H, 1JHH = 5,4 Hz, H^, 5 3,00 (d, 1 H, 1JHH = 5,4 Hz, H,), 5 7,48 (d, 2H, 3JHH = 8,1 Hz, H4,8), 5 7,59 (d, 2H, 3JHH = 8,1 Hz, H5,7).
RMN 3C / CDCI3 : 5 22,2 (C10), 5 57,1 (d), 5 57,8 (C2), 5 124,9 (q, 1JCF=270,3 Hz, C„), 5 126,1 (q,
3JCF=3,8 Hz, C5 et C7), 5 126,5 (C4 et C8), 5 130,5 (q, 2JCF=31 ,9 HZ, C6), 5 146,1 (C3).
RMN 19F {1H} / CDCI3 : 5 -62,13.
HRMS : calculé pour C10H8F3O (MS ES") : 201 ,0527. Trouvé : 201 ,0536. [α] g = + 16,7 (c 0, 89 ; CHCI3) [(S) / ee = 99,1 %]
(f?)-méthyl-(4-trifluorométhyl-phényl)-ethane-1 ,2-diol
F : 59 °C (Litt. : 57,5 °C d'après Suprun, W.; J. Prakt. Chem 1996, 338, 231 -237. "Untersuchungen zur oxidation von p-substituierten alpha-methylstyrolen".
RMN H / CDCI3 : 5 1 ,55 (s, 3H, Hu), 5 1.84 (dd, 1 H, 3JH9 ι = 5 Hz, 3JH9Hr = 7,25 Hz, H9), 5 2,68 (s, 1 H, H10), 5 3,74 (ddd, 2H, 1JHιHr = 11 Hz, 3JH9H1 = 5 Hz, 3JH9Hr = 7.25 Hz, H,.,.), δ 7,58 (d, 2H, 3JHH =
8,75 Hz, H4ι8), 5 7,63 (d, 2H, 3JHH = 8,75 Hz, H5,7).
RMN 13C / Acétone-d6 : 5 26,4 (d,),5 71 ,5 (d), 5 75,0 (C2), 5 125,4 (q, 3JCF=3,8 Hz, C5 et C7), 5
125,6 (q, 1JCF=269,6 Hz, C12), 5 127,1 (C4 et C8), 5 128,3 (q, 2JCF=32, 1 HZ, C6), 5 152,6 (C3). RMN 19F {1H} / CDCIj : 5 -61 ,98. HRMS : calculé pour C10H10F3O2 (MS ES") : 219,0633. Trouvé : 219,0614. , 22
[α] ~ = - 9,4 (c 1 ,03 ; CHCI3) [(S) / ee = 88,3 %]
Exemple 29
Dans un flacon muni d'une agitation mécanique, on place 645 mg de 4-(trifluorométhylthio- phényl)-oxirane racémique (soit 2,93 mmoles) dans 6,45 mL d'/so-octane. On ajoute 57,05 mL d'eau distillée. L'ensemble est placé sous agitation dans un bain thermostaté à 27°c. Pendant ce temps, on prépare une solution enzymatique contenant 12,9 mg par mL d'eau d'extrait enzymatique EH d'An recombinante (pureté 25 %). Cette solution est elle aussi placée à 27°c. Après 30 minutes, on ajoute au milieu réactionnel 1 mL de la solution enzymatique précédemment préparée. Ce moment correspond au temps t0. Le suivi et le traitement de la réaction retenus sont ceux présentés dans l'exemple 23. On obtient le (S)-4-(trifluorométhylthio-phényl)-oxirane (rdt=37,2% ; ee=98,0%) et le (R)-4- (trifluorométhylthio-phényl)-ethane-1 ,2-diol (rdt=38,9% ; ee=85,0%).
Analyse structurale (S)-4-(trifluorométhylthio-phényl)-oxirane
RMN 1H / CDCIj : 5 2,78 (dd, 1 H, 3JHH = 2,5 Hz, 1JHH = 5,5 Hz, H,), 5 3,18 (dd, 1 H, 3JHH = 4,0 Hz, 1JHH = 5,5 Hz, H,), 5 3,89 (dd, 1 H, 3JHH = 2,5 Hz, 3JHH = 4,0 Hz, H2), 5 7,37 (d, 2H, 3JHH = 8,2 Hz, H4,8), 5 7,64 (d, 2H, 3JHH = 8,2 Hz, H5,7).
RMN 13C / DMSO-dβ : 5 66,9 (d), 5 73,1 (C2), 5 124,0 (q, J=1 ,9 Hz, C6), 5 127,9 (C4 et C8), 5 129,6 (q, 1JC =307.6 Hz, d,), 5 135,7 (C5 et C7), 5 147,4 (C3). RMN 19F {1H} / CDCI3 : 5 -43,27. HRMS : calculé pour C9H6F3OS (MS ES") : 219,0091. Trouvé : 219,0100.
Analyse élémentaire : Calculé : C : 49,09 % ; H : 3,20 % ; F : 25,88 % ; S : 14,56 %. Trouvé : C : 49,41 % ; H : 3,22 % ; F : 27,11 % ; S : 13,38 %. , 22
[α] o = + 21 ,1 (c 1 ,20 ; CHCI3) [(S) / ee = 98,5 %] (R)-4-(trifluorométhylthio-phényl)-ethane-1 ,2-diol
F : 72 °C. RMN 1H / DMSO-cfe : 53,46 (m, 2H, H1 ιV). δ 4,61 (dd, 1 H, J = 4.25 Hz, J= 5,75 Hz, H2), 54,83 (dd, 1 H,
J = 5,75 Hz, J = 5,75 Hz, H9), 5 5,47 (d, 1 H, J = 4,25 Hz, H10), 5 7,51 (d, 2H, 3JHH = 8 Hz, H4ιβ), 5 7,67
(d, 2H, 3JHH = 8 Hz, H5.7).
RMN 13C / DMSO-d6 : 5 67,9 (d), 5 74,7 (C2), 5 120,8 (m, Cβ), 5 130,0 (q, 1JCF=318,4 HZ, d), 5
127,9 (C4 et Cβ). 5 135,8 (C5 et C7), 5 147,4 (C3). RMN 19F {1H} / CDCI3 : 5 -42,22.
HRMS : calculé pour C9H8F302S (MS ES") : 237,0197. Trouvé : 237,0190.
Analyse élémentaire : Calculé : C : 48,35 % ; H : 3,81 % ; F : 23,92 % ; S : 13,46 %. Trouvé : C :
46,04 % ; H : 3,68 % ; F : 24,62 % ; S : 13,69 %.
[a] 2 = - 5 (c 1 ,18 ; CHCI3) [(S) / ee = 85,0 %]
Détermination des configurations absolues Diols non décrits dans la littérature Nous avons appliqué une méthode utilisant le dichroïsme circulaire décrite sur des substrats du même type, par Bar, L. D.; Pescitelli, G.; Pratelli, C; Pmi, D.; Salvadori, P., Détermination of absolute configuration of acyclic 1,2-diols with o2(OAc) . Snatzke's method revisited, J. Org. Chem., 2001, 66, 4819-4825.
Protocole expérimental : A une solution d'environ 0,6 à 0,7 mg.mL"1 de Mo2(AcO)4 commercial dans le DMSO, une quantité de diol est ajoutée de telle sorte que le ratio ligand/métal soit compris entre 0,6 :1 ,2 (pour les substrats de faible pureté optique). Le premier ICD (Induced Circular Dichroism) est mesuré immédiatement après le mélange et un contrôle est effectué toutes les dix minutes jusqu'à stabilisation (40-50 min).
Résultats
Dichroïsme circulaire , conditions & résultats expérimentaux (Δε normalisé par rapport à la concentration en
Selon les régies décrites par Snatzke, tous les diols testés sont de configuration absolue (R).
Epoxydes non décrits dans la littérature On obtient la configuration absolue des époxydes par corrélation chimique. Les diols sont cyclisés en époxyde avec rétention de configuration (méthode décrite ci-dessous dans l'exemple 30. L'injection en GC chirale permet par comparaison du chromatogramme obtenu avec l'époxyde issu de la réaction enzymatique de déduire la configuration absolue de l'époxyde.
Exemple 30 Cyclisation du ( ?)-méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)-ethane-1 ,2-diol
Dans un mini-réacteur conique de 3 mL muni d'une agitation magnétique, on place 11 ,0 mg (1 mmole) de (f?)-méthyl-(3-trifluorométhyl-phényl)-ethane-1 ,2-diol (ee=88,3%) et 500 μL de THF. On ajoute un équivalent de chlorure de tosyle en solution dans 500 μL de THF. Après une heure d'agitation à température ambiante, on ajoute 6 équivalents d'hydrure de sodium. Après 12h d'agitation, on ajoute 100 μL d'eau et extrait par 1 mL d'éther éthylique. On injecte la phase organique en GC chirale.
Cette technique a permis de montrer que tous les époxydes résiduels décrits dans les exemples 23 à 29 étaient de configuration absolue (S).
Exemple 31
Echelle analytique
La procédure décrite dans l'exemple 1 est appliquée au 2-(4-Trifluoromethyl- phenoxymethyl)-oxirane (6,54 mg soit [2-(4-Trifluoromethyl-phenoxymethyl)-oxirane] = 3 mM), en présence de 30 % de DMSO. La solution enzymatique ajoutée (100 μL) contient 2 mg d'extrait enzymatique de l'EH d'An recombinante (caractérisée comme ayant une pureté de l'ordre de 25 %) dans 4,434 mL d'eau distillée. L'étalon interne est le 3-bromo- acetophénone. Les valeurs obtenues correspondent à un coefficient d'énantiosélectivité apparent E de 7.
Analyses réalisées sur une colonne type Chirasil-Dex CB (T = 110°C ; tr=33,2 min et 33,8 min pour les deux énantiomères de l'époxyde ; tr=22,2 pour l'étalon interne)
Echelle préparative Dans un fermenteur de 1 L, on place 763 mg de 2-(4-Trifluoromethyl-phenoxymethyl)- oxirane (soit 3,5 mmoles) dans 105 mL de DMSO. On ajoute 664 mL d'eau distillée. L'ensemble est placé sous agitation, la température étant contrôlée et maintenue à 27°C. On prépare une solution enzymatique contenant 0,763 mg d'extrait enzymatique d'An recombinante (pureté 25 %) par mL d'eau. Après 30 minutes, on ajoute au milieu réactionnel 1 mL de la solution enzymatique précédemment préparée. Ce moment correspond au temps to-
La réaction est suivie par GC chirale. On prélève régulièrement 150 μL de milieu réactionnel que l'on ajoute à 100 μL d'acétonitrile et 100 μL d'iso-octane placés au préalable dans un eppendorf. Après agitation au vortex et centrifugation, on injecte en GC chirale pour mesurer l'excès énantiomérique de l'époxyde résiduel. Lorsque l'excès énantiomérique de l'époxyde résiduel atteint la valeur de 80 %, on stoppe la réaction par ajout de 150 mL d'acétate d'éthyle. On laisse décanter, récupère la phase organique et extrait la phase aqueuse par 2x50 mL d'acétate d'éthyle. Les phases aqueuses sont réunies, lavées par 200 mL de solution aqueuse saturée en NaCI, séchées sur MgSO4 et concentrées sous pression réduite. L'époxyde résiduel et le diol formé sont séparés par chromatographie flash sur gel de silice (50 parties ; éluant : hexane / acétate d'éthyle 90/10 jusqu'à acétate d'éthyle pur). En vue de la mesure des pouvoirs rotatoires, chaque produit isolé subit ensuite une purification au four à boules pour éliminer toute trace de solvant et de silice. On obtient 369 mg de (S)-2-(4-Trifluoromethyl-phenoxymethyl)-ethane-1 ,2-diol (rdt= 44,7 % ; ee= 85,4%) et 194 mg de (R)-2-(4-Trifluoromethyl-phenoxymethyl)-oxirane (rdt= 25,4% ; ee = 79,4%).
Analyse structurale
(f?)-2-(4-Trifluoromethyl-phenoxymethyl)-oxirane
RMN 1H / CDCI3 : δ 2,69 (dd, 1 H, J=2,5 Hz, J=4,75 Hz, H , δ 2,84 (dd, 1 H, J=4,75 Hz, J=4,25 Hz, H , δ 3,3 (m, 1 H, H2), δ 3,98 (dd, 1 H, J=6 Hz, J=11 Hz, H3), δ 4,22 (dd, 1 H, J=3 Hz, J=11 Hz, H3), δ 7,18 (m A2B2, 4H, protons aromatiques). RMN 13C / CDCI3 : δ 44,2 (C,), δ 49,6 (C2), δ 68,6 (C3), δ 114,3 (C5 et C9), δ 123.1 (q, 2JCF=32,4 Hz, C7), δ 124,1 (q, 1JCF=269,6 Hz, C10), δ 126,6 (q, 3JCF=3,5 Hz, C6 et C8), δ 160.6 (C4). RMN 19F {1H} / CDCI3 : £ -61 ,69. [α] D = + 4,5 (c 1 ,0 ; CHCI3) [(S) / ee = 79,4 %] fS)-2-(4-Trifluoromethyl-phenoxymethyl)-ethane-1 ,2-diol
RMN 1H / CD3OD : δ 3,21 (dd, 1H, J=1 ,5 Hz, J=3,25 Hz), δ 3,57 (m, 2H), δ 3,95 (m, 3H), δ 7,24 (m A2B2, 4H, 10 protons aromatiques). RMN 13C / CD3OD : δ 62,3 (d), δ 68,9 (C2), δ 69,9 (C3), δ 114,1 (C5 et C9), δ 122,1 (q, 2JCF=32,2 Hz, C7), δ 124,2 (q, 1JCF=286,1 Hz, C10), δ 126,2 (q, 3JCF=3,8 Hz, C6 et C8), δ 161 ,4 (C4). [α] 2l = - 6,6 (c 1 ,1 ; CHCI3) [(S) I ee = 85,4 %].
T5 Il doit être bien compris que l'invention définie par les revendications annexées n'est pas limitée aux modes de réalisation particuliers indiqués dans la description ci-dessus, mais en englobe les variantes qui ne sortent ni du cadre ni de l'esprit de la présente invention.

Claims

Revendications
1- Procédé d'hydrolyse d'un époxyde fluoré comportant un ou plusieurs groupes CF3, procédé dans lequel on traite l'époxyde en présence d'eau avec une protéine ayant une activité époxyde hydrolase (EH) sur les époxydes à CF3 de manière à induire l'ouverture de l'époxyde et la formation du diol vicinal.
2- Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la protéine ayant une activité époxyde hydrolase (EH) sur les époxydes à CF3 comporte la séquence en acides aminés suivante : i. la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 2 ; ou ii. une séquence ayant un pourcentage d'homologie égal ou supérieur à 40 %, de préférence à 80 %, de manière plus préférée à 85 %, de manière encore plus préférée à 90 %, et mieux encore à 95, 96, 97, 98 ou 99 % avec la SEQ ID NO : 2, la protéine ainsi définie ayant une activité EH sur les époxydes à CF3 ; iii. une séquence comprenant au moins 10, de préférence au moins 20, de manière plus préférée au moins 50 ou 100 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO : 2 ou d'une séquence telle que définie sous ii, la protéine ainsi définie ayant une activité EH sur les époxydes à CF3.
3- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la protéine est codée par un acide nucléique comprenant la séquence suivante : (a) la séquence nucléotidique représentée à la SEQ ID NO : 1 ; (b) une séquence nucléotidique qui code pour la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 ; (c) une séquence nucléotidique qui diffère de la séquence selon (a) ou (b) par dégénérescence du code; (d) une séquence nucléotidique s'hybridant a une séquence selon (a), (b) ou (c), et codant pour une protéine ayant une activité EH sur les époxydes à CF3 ; (e) une séquence nucléotidique ayant un pourcentage d'identité égal ou supérieur à 45 %, de préférence à 80 %, de manière plus préférée à 85 %, de manière encore plus préférée à 90 %, et mieux encore à 95, 96, 97, 98 ou 99 % avec la SEQ ID NO : 1 , et codant pour une protéine ayant une activité EH sur les époxydes à CF3 ; (f) un fragment d'une séquence nucléotidique selon (a), (b), (c), (d) ou (e), comprenant au moins 30, de préférence au moins 60, de manière plus préférée au moins 150 ou 300 nucléotides consécutifs, et codant pour une protéine ayant une activité EH sur les époxydes à CF3.
4- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la protéine est l'époxyde hydrolase d' Aspergillus niger LCP521 , naturelle ou recombinante.
5- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'époxyde répond à la formule (I) :
dans laquelle :
- le groupe R représente un groupe alkyle, alcényle, cycloalkyle, aryle ou aralkyle, éventuellement substitué par alkyle, alcoxy, alkylthio ou halogène ; R comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes tels que O ou S; les substituants alkyle, alcoxy, alkylthio comportant une chaîne hydrocarbonée en CrC6, de préférence en Cι-C3, linéaire, ramifié ou cyclique et comportant éventuellement un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F ;
- le groupe R' représente H ou un alkyle linéaire, ramifié ou cyclique en CrC10, de préférence en d. C2 ou C3 et comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, notamment atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F ou encore des hétéroatomes tels que O ou S ;
- étant entendu que l'un au moins des radicaux R et R' est, ou comporte, un ou plusieurs, de préférence de 1 à 3, groupements trifluorométhyle (CF3). 6- Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'époxyde de formule (I) est tel que R' est H ou un alkyle linéaire en d, C2 ou C3, de préférence R' est H ou alkyle en d éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogènes, de préférence par 3 atomes de F. 7- Procédé selon la revendication 5 ou 6 , dans lequel, à la formule (I), les groupes R sont choisis parmi les groupes suivants : - alkyles linéaires ou ramifiés, comportant de 1 à 10 C, de préférence de 1 à 6 C, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F ;
- cycloalkyle comportant de 3 à 10 C, de préférence de 3 à 8 C, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F ; - phényle ou naphtyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F ;
- aralkyle comportant de 7 à 18 C, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, tels que Cl, F, Br, de préférence F.
8- Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, dans lequel R comporte de 1 à 3 groupements CF3.
9- Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, dans lequel R est un phényle substitué par de 1 à 3 groupes choisis parmi trifluorométhyle, trifluorométhoxy et trifluorométhylthio.
10- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel l'époxyde est un mélange d'énantiomères (R) et (S).
11- Procédé selon la revendication 10, dans lequel le mélange est racémique.
12- Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel on effectue une hydrolyse d'époxyde avec un coefficient d'énantiosélectivité supérieur ou égal à 10, de préférence supérieur ou égal à 30.
13- Procédé selon la revendication 10 ou 11 , dans lequel on effectue une hydrolyse énantiosélective et l'on produit un mélange enrichi en l'un des isomères et en diol correspondant à l'autre isomère.
14- Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel on produit une préparation enrichie en époxyde (S) et en diol (R).
15- Procédé selon la revendication 14, dans lequel, à l'issue de la réaction d'hydrolyse, on sépare le diol (R) de l'époxyde (S), et l'on récupère ce dernier.
16- Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel on produit une préparation enrichie en époxyde (R) et en diol (S). 17- Procédé selon la revendication 16, dans lequel, à l'issue de la réaction d'hydrolyse, on sépare le diol (S) de l'époxyde (R), et l'on récupère ce dernier. 18- Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel on produit une préparation enrichie en diol (R), et, à l'issue de la réaction d'hydrolyse, on sépare l'époxyde (S) du diol (R), et l'on récupère ce dernier. 19- Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel on produit une préparation enrichie en diol (S), et, à l'issue de la réaction d'hydrolyse, on sépare l'époxyde (R) du diol (S), et l'on récupère ce dernier.
20- Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 et 13, dans lequel on effectue une hydrolyse d'époxyde avec un coefficient d'énantiosélectivité inférieur à 10.
21- Procédé selon la revendication 20, dans lequel on effectue l'hydrolyse des isomères (R) et (S) et l'on produit un diol racémique ou non racémique. 22- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 , dans lequel l'époxyde est en solution dans un solvant organique miscible à l'eau.
23- Procédé selon la revendication 22, dans lequel ce solvant est choisi parmi le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, l'acétone, le tetrahydrofurane, le dioxane, le propanol, et leurs mélanges.
24- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 , dans lequel l'époxyde est en solution dans un solvant organique non miscible à l'eau. 25- Procédé selon la revendication 24, dans lequel ce solvant est choisi parmi l'iso- octane, l'hexane, les cycloalcanes, les aromatiques et leurs mélanges.
26- Procédé selon la revendication 24 ou 25, dans lequel une émulsion est formée entre la solution organique d'époxyde et une solution aqueuse de la protéine à activité EH.
27- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, dans lequel la protéine à activité EH est en solution aqueuse.
28- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et 14 à 20, pour produire un excès énantiomérique en époxyde (R) ou (S) supérieur ou égal à 97 %. 29- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel on produit une préparation énantiopure ou énantiomériquement enrichie en époxyde ou diol (R) ou (S), l'époxyde ou le diol étant unproduit pharmaceutique, phytosanitaire ou agrochimique ou un intermédiaire de produit pharmaceutique, phytosanitaire ou agrochimique.
30- Composition utile pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 29, comportant, pour addition successive ou simultanée, un époxyde fluoré comportant un ou plusieurs groupes CF3 et un solvant organique. 31- Composition selon la revendication 30, comportant un solvant organique miscible à l'eau choisi parmi : le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, l'acétone, le tetrahydrofurane, le dioxane, le propanol, et leurs mélanges.
32- Composition selon la revendication 30, comportant un solvant organique non miscible à l'eau choisi parmi : l'iso-octane, l'hexane, les cycloalcanes, les aromatiques et leurs mélanges.
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