CN110982799B - 一种醇脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的醇脱氢酶突变体热稳定性高且不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的催化效率和转化效率(即时空产率)高，因此，本发明的醇脱氢酶突变体在生产如(S)‑(4‑氯苯基)‑(吡啶‑2‑基)‑甲醇、(R)‑(4‑氯苯基)‑(吡啶‑2‑基)‑甲醇等的手性双芳基醇中具有极高的应用前景。

Description

一种醇脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种醇脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术
手性双芳基醇是一类重要的手性化合物，可用于合成倍他司汀、罗托沙敏等多种药物，因此，手性双芳基醇在医药领域均具有广泛的应用。
目前，生产手性双芳基醇的方法主要为化学不对称合成法，此方法为以潜手性双芳基酮为原料，以trans-RuCl2[(R)-xylbinap][(R)-daipen]、(S)-[Ru(BINAP)Cl2]2(NE3)、(S,S)-6-CHOONa等为催化剂或以手性BINAL-H等为手性还原剂，在一定的条件下(高压)进行不对称还原反应以获得手性双芳基醇(具体可见参考文献“C.Y.Chen,et al.,Org.Lett.,2003,5,5039-5042”、“赵志全等,中国医药工业杂志,2006,37,726-727”、“B.G.Wang,et al,Org.Lett.,2017,19,2094-2097”以及公开号为CN101848893A、CN103121966A的专利申请文本)。
但是，化学不对称合成法所使用的催化剂或手性还原剂价格昂贵、反应需要高压条件且合成得到的产物光学纯度低，既不利于工业化生产，也不能满足药物对光学纯度的要求。
酶不对称还原法是指以潜手性双芳基酮为原料，以酶作为催化剂进行不对称还原反应以获得手性双芳基醇的方法。与化学不对称合成法相比，酶不对称还原法具有作用条件温和、成本低廉且合成得到的产物光学纯度高的优势，符合“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等工业发展的目标。因此，利用酶不对称还原法生产手性双芳基醇对实现手性双芳基醇的大规模工业化生产以及手性双芳基醇在医药领域的大规模应用具有重要意义。
现有的可用于不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的酶主要为醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，简称ADH，EC 1.1.1.1)，但是，大部分的醇脱氢酶热稳定性低，T50 15值不足50℃(具体可见参考文献：“Min Li,et al.,Applied and EnvironmentalMicrobiology.,2017,83,12,e00603-17”、“Xumin Gong,et al,ACS Catalysis,2019,9,1,147-153”)，这使得醇脱氢酶在工业生产温度下容易失活，并且，大部分的醇脱氢酶不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的转化效率低，时空产率低下，S/C不高(具体可见参考文献：“Xumin Gong,et al,ACS Catalysis,2019,9,1,147-153”、“Jieyu Zhou,et al,J.Am.Chem.Soc.2018,140,12645-12654”)，这大大阻碍了利用酶不对称还原法生产手性双芳基醇的工业化进程。
因此，急需找到热稳定性高且不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的转化效率高的醇脱氢酶以早日实现手性双芳基醇的大规模工业化生产以及手性双芳基醇在医药领域的大规模应用。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性高且不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的转化效率高的醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，简称ADH，EC1.1.1.1)。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种醇脱氢酶突变体，所述醇脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的醇脱氢酶的第36位赖氨酸、第132位苏氨酸、第159位天冬酰胺、第210位赖氨酸、第248位苏氨酸和/或第272位谷氨酰胺进行突变得到的；
或者，所述醇脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的醇脱氢酶的第36位赖氨酸、第132位苏氨酸、第159位天冬酰胺、第210位赖氨酸、第248位苏氨酸、第272位谷氨酰胺、第136位谷氨酰胺、第161位苯丙氨酸、第196位丝氨酸、第214位谷氨酸和第237位丝氨酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的醇脱氢酶的第36位赖氨酸突变为异亮氨酸、第132位苏氨酸突变为天冬氨酸、第159位天冬酰胺突变为天冬氨酸、第210位赖氨酸突变为谷氨酸、第248位苏氨酸突变为丙氨酸和/或第272位谷氨酰胺突变为亮氨酸得到的；
或者，所述醇脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的醇脱氢酶的第36位赖氨酸突变为异亮氨酸、第132位苏氨酸突变为天冬氨酸、第159位天冬酰胺突变为天冬氨酸、第210位赖氨酸突变为谷氨酸、第248位苏氨酸突变为丙氨酸、第272位谷氨酰胺突变为亮氨酸、第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第161位苯丙氨酸突变为缬氨酸、第196位丝氨酸突变为甘氨酸、第214位谷氨酸突变为甘氨酸和第237位丝氨酸突变为半胱氨酸得到的。
本发明还提供了编码上述醇脱氢酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)质粒、pET-28b(+)质粒或pET-20b(+)质粒。
本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供了上述醇脱氢酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得上述醇脱氢酶突变体。
本发明还提供了一种生产手性双芳基醇的方法，所述方法为将上述醇脱氢酶突变体添加至含有潜手性双芳基酮的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行提取，获得手性双芳基醇。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中还含有辅酶和辅酶循环系统；所述辅酶循环系统含有D-葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，或者，含有亚磷酸盐和亚磷酸盐脱氢酶，或者，含有甲酸和甲酸脱氢酶，或者，含有乳酸和乳酸脱氢酶，或者，含有甘油和甘油脱氢酶。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶循环系统含有D-葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为NADP+、NADPH、NAD+和/或NADH。
在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶突变体在反应体系中的添加量为1～10kU/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，潜手性双芳基酮的浓度为100～500mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，辅酶的浓度为0.1～1mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，葡萄糖脱氢酶的浓度为1～10kU/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，D-葡萄糖的浓度为20～1000mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系为含有潜手性双芳基酮、辅酶以及辅酶循环系统的缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.2mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为30～35℃、pH为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述潜手性双芳基酮为(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮、苯基-2-吡啶基甲酮、4-氟二苯甲酮或4-氯二苯甲酮。
在本发明的一种实施方式中，潜手性双芳基酮为(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮时，所述手性双芳基醇为(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇；潜手性双芳基酮为苯基-2-吡啶基甲酮时，所述手性双芳基醇为苯基-2-吡啶基甲醇；潜手性双芳基酮为4-氟二苯甲酮时，所述手性双芳基醇为4-氟二苯甲醇；潜手性双芳基酮为4-氯二苯甲酮时，所述手性双芳基醇为4-氯二苯甲醇。
本发明还提供了上述醇脱氢酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法或上述方法在生产手性双芳基醇中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述手性双芳基醇为(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇、苯基-2-吡啶基甲酮、4-氟二苯甲酮或4-氯二苯甲酮。
在本发明的一种实施方式中，所述手性双芳基醇为(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇或(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇。
[有益效果]
(1)本发明的醇脱氢酶突变体热稳定性高，其中，突变体M5的T50 15值和Ed值分别高达45.8℃和968.26kJ/mol，比野生型提高了3.8℃和11.19kJ/mol；突变体M63的T50 15值和Ed值分别高达53.1℃和989.13kJ/mol，比野生型提高了11.1℃和32.06kJ/mol；突变体M64的T50 15值和Ed值分别高达51.5℃和984.14kJ/mol，比野生型提高了9.5℃和27.07kJ/mol。
(2)本发明的醇脱氢酶突变体不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的转化效率高，其中，突变体M64不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的转化效率(即时空产率)高达651g/(L·d)，而野生型同条件下的转化率不足25％。
(3)本发明的醇脱氢酶突变体不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的催化效率高，其中，突变体M63不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的催化效率为27.47s–1·mM–1，是野生型的1.3倍；突变体M64不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的催化效率为20.27s–1·mM–1，是对照突变体S5的1.37倍。
(4)野生型醇脱氢酶可不对称还原潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，且ee值可达87.1％(R)，而本发明的醇脱氢酶突变体不对称还原前手性芳香酮生成手性双芳基醇时具有反转的立体选择性，其中，突变体M64可不对称还原潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，且ee值可达97.6％(S)。
(5)本发明的醇脱氢酶突变体热稳定性高且不对称还原潜手性双芳基酮生产手性双芳基醇的催化效率和转化效率(即时空产率)高，因此，本发明的醇脱氢酶突变体在生产如(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇、(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇等的手性双芳基醇中具有极高的应用前景。
附图说明
图1～4：重组质粒的的PCR扩增电泳图谱；其中，M：Marker，泳道1～64：重组质粒pET28a-KpADH-1～重组质粒pET28a-KpADH-64的酶切产物。
图5：重组大肠杆菌摇瓶诱导发酵获得的表达产物的SDS-PAGE电泳分析结果；其中，M：标准蛋白Maker，泳道1～64：重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-KpADH-1～重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-KpADH-64摇瓶诱导发酵获得的突变体M1～M64的纯酶。
图6：突变体M1～M64不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮所得产物的手性色谱图。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物；下述实施例中涉及的pET-28a(+)质粒、NADPH购自Novagen公司；下述实施例中涉及的葡萄糖脱氢酶(GDH)、乳酸脱氢酶(LDH)购自诺唯赞公司；下述实施例中涉及的D-葡萄糖购自捷瑞公司；下述实施例中涉及的潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮购自上海生工公司(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、卡那霉素100mg·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g/L、卡那霉素50mg·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
醇脱氢酶酶活的检测方法如下：
将含有1mM NADPH、1.0mM底物潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的磷酸钠缓冲液(PBS，100mM，pH 7.0)于30℃保温2min后，取10μL纯酶液加入磷酸钠缓冲液中于30℃进行反应，反应过程中，使用酶标仪检测反应液于340nm下吸光度的变化，并以此为依据计算酶活；
酶活的计算公式如下：
酶活力(U/mL)＝EW×V×103/(6220×l)；
式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm；
酶活的定义：在该条件下每分钟催化氧化lμmol NADPH所需酶量为一个酶活力单位(1U)。
醇脱氢酶不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化效率和立体选择性的检测方法如下：
将含有1mM NADPH、1.0mM底物潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的磷酸钠缓冲液(PBS，100mM，pH 7.0)于30℃保温2min后，取10μL纯酶液加入磷酸钠缓冲液中于30℃反应60min；反应结束后，沸水终止反应，取100μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡1～2min，12000rpm离心2～5min，取上清到离心管中，待有机相自然挥发完全，加入500μL色谱纯乙醇，进行手性液相色谱分析转化效率和ee值；
色谱条件具体如下：Daicel Chiralcel OD-H(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正已烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01，v/v/v)，流速0.8mL/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μL，(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇和(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇保留时间分别为11.12min和12.71min；
转化效率的计算方法如下：
Figure GDA0002987868960000061
ee值的计算方法如下：
Figure GDA0002987868960000062
Figure GDA0002987868960000063
As：反应液中(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的摩尔浓度；AR：反应液中(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的摩尔浓度；Asub：反应液中未反应完的(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的摩尔浓度。
实施例1：醇脱氢酶突变体的制备、表达及纯化
化学合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的醇脱氢酶的基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；将获得的基因与pET-28a(+)质粒经双酶切(NdeⅠ和XhoⅠ)后进行连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得含有编码野生型醇脱氢酶的基因的重组质粒pET28a-KpADH以及含有编码野生型醇脱氢酶的基因的重组菌E.coli BL21/pET28a-KpADH。
利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pET28a-KpADH为模板进行定点突变，获得含有编码醇脱氢酶突变体K36I(第36位赖氨酸突变为异亮氨酸)、T132D(第132位苏氨酸突变为天冬氨酸)、N159D(第159位天冬酰胺突变为天冬氨酸)、K210E(第210位赖氨酸突变为谷氨酸)、T248A(第248位苏氨酸突变为丙氨酸)、Q272L(第272位谷氨酰胺突变为亮氨酸)、K36I/T132D、K36I/N159D、K26I/K210E、K26I/T248A、K26I/Q272L、T132D/N159D、T132D/K210E、T132D/T248A、T132D/Q272L、N159D/K210E、N159D/T248A、N159D/Q272L、K210E/T248A、K210E/Q272L、T248A/Q272L、K36I/T132D/N159D、K36I/T132D/K210E、K36I/T132D/T248A、K36I/T132D/Q272L、K36I/N159D/K210E、K36I/N159D/T248A、K36I/N159D/Q272L、K36I/K219E/T248A、K36I/K210E/Q272L、K36I/T248A/Q272L、T132D/N159D/K210E、T132D/N159D/T248A、T132D/N159D/Q272L、T132D/K210E/T248A、T132D/K210E/Q272L、T132D/T248A/Q272L、N159D/K210E/T248A、N159D/K210E/Q272L、N159D/K248A/Q272L、K210E/T248A/Q272L、K36I/T132D/N159D/K210E、K36I/T132D/N159D/T248A、K36I/T132D/N159D/Q272L、K36I/T132D/K210E/T248A、K36I/T132D/K210E/Q272L、K36I/T132D/T248A/Q272L、K36I/N159D/K210E/T248A、K36I/N159D/K210E/Q272L、K36I/N159D/T248A/Q272L、K36I/K210E/T248A/Q272L、T132D/N159D/K210E/Q272L、T132D/N159D/T248A/Q272L、T132D/K210E/T248A/Q272L、T132D/N159D/K210E/T248A、N159D/K210E/T248A/Q272L、K36I/T132D/N159D/K210E/T248A、K36I/T132D/N159D/K210E/Q272L、K36I/T132D/N159D/T248A/Q272L、K36I/T132D/K210E/T248A/Q272L、K36I/N159D/K210E/T248A/Q272L、T132D/N159D/K210E/T248A/Q272L、K36I/T132D/N159D/K210E/T248A/Q272L、K36I/T132D/N159D/K210E/T248A/Q272L/Q136N/F161V/S196G/E214G/S237C、Q136N/F161V/S196G/E214G/S237C(第136位谷氨酰胺突变为天冬酰胺、第161位苯丙氨酸突变为缬氨酸、第196位丝氨酸突变为甘氨酸、第214位谷氨酸突变为甘氨酸和第237位丝氨酸突变为半胱氨酸)的基因的重组质粒，将上述醇脱氢酶突变体分别命名为M1～M64和S5；
其中，突变K36I、T132D、N159D、K210E、T248A、Q272L、Q136N、F161V、S196G、E214G、S237C所用引物如下：
K36I-F：AGAAGTCAAGACattGCTGAT(SEQ ID No.3)；
K36I-R：TAACTTATCAGCaatGTCTTG(SEQ ID No.4)；
T132D-F：GCTTCAATTATGgatCCACATAGA(SEQ ID No.5)；
T132D-R：TTGTCTATGTGGatcCATAATTGA(SEQ ID No.6)；
N159D-F：AATGCTTATGAAgatGTCGTT(SEQ ID No.7)；
N159D-R：AGCAGTAACGAcatCTTCATA(SEQ ID No.8)；
K210E-F：GAAGACGTCACTgaaAAACTAAAT(SEQ ID No.9)；
K210E-R：TTCATTTAGTTTttcAGTGACGTC(SEQ ID No.10)；
T248A-F：GATGTCGCCAAAgcaCACGTTTTG(SEQ ID No.11)；
T248A-R：ACCCAAAACGTGtgcTTTGGCGAC(SEQ ID No.12)；
Q272L-F：GGCGCCTTCTCTctgCAAGATATT(SEQ ID No.13)；
Q272L-R：AACAATATCTTGcagAGAGAAGGC(SEQ ID No.14)；
Q136N-F：CCACATAGAaatAATGATCCA(SEQ ID No.15)；
Q136N-R：TGGATCATTATTTCTATGTGG(SEQ ID No.16)；
F161V-F：TATGAAAATGTCgttACTGCT(SEQ ID No.17)；
F161V-R：ACAATAAGCAGTAACGACATT(SEQ ID No.18)；
S196G-F：ACTATCCACCCAggtTTCGTT(SEQ ID No.19)；
S196G-R：TCCGAAAACGAAACCTGGGTG(SEQ ID No.20)；
E214G-F：CTAAATggtACTTGTGAAATT(SEQ ID No.21)；
E214G-R：AATTTCACAAGTACCATTTAG(SEQ ID No.22)；
S237C-F：AAGACTCACTTCtgtCAATTC(SEQ ID No.23)；
S237C-R：ATCAATGAATTGACAGAAGTG(SEQ ID No.24)，
PCR反应体系(50μL)为：KOD酶(2.5U/mL)l.0μL，模板(5～50ng)l.0μL，dNTP4.0μL，10×reaction buffer 5.0μL，上下游引物各1.0μL，ddH2O补足至50μL；
PCR产物扩增条件均为：(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)54℃退火30sec，(4)72℃延伸150sec，重复步骤(2)～(4)进行10～15个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1h，将Dpn I处理后的扩增产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证(验证结果可见图1～4)以及测序验证，验证正确即获得分别含有编码醇脱氢酶突变体M1～M64和S5的基因的重组质粒pET28a-KpADH-1～重组质粒pET28a-KpADH-65以及分别含有编码醇脱氢酶突变体M1～M64和S5的基因的重组菌E.coli BL21/pET28a-KpADH-1～重组菌E.coli BL21/pET28a-KpADH-65。
将获得的重组菌E.coli BL21/pET28a-KpADH以及重组菌E.coli BL21/pET28a-KpADH-1～重组菌E.coli BL21/pET28a-KpADH-65分别涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照2％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD600达到0.8后，在发酵液中加入终浓度为0.2mM的IPTG，于25℃继续诱导培养8h，得到发酵液；将发酵液于4℃、8000rpm离心10min后，收集细胞；将收集得到的细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(100mmol·L-1，pH 6.0)中进行超声破碎，收集分别含有野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的细胞破碎上清液。
将获得的细胞破碎上清液使用亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)进行纯化，纯化过程如下：先使用缓冲液A(20mmol·L-1磷酸钠，500mmol·L-1NaCl，20mmol·L-1咪唑，pH 7.4)平衡镍柱，并实施例1获得的细胞破碎上清液过镍柱，继续使用缓冲液A洗脱未与镍柱结合的蛋白，待穿透峰流尽后，从缓冲液A到缓冲液B(20mmol·L-1磷酸钠，500mmol·L-1NaCl，500mmol·L-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的纯酶液。
将获得的醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的纯酶液进行SDS-PAGE分析，分析结果见图5。
由图5可知，醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的纯酶液均在45kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。
实施例2：醇脱氢酶突变体的温度稳定性
将实施例1获得的野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的纯酶液在温度分别为40～60℃的水浴锅中温浴15min，15min后，测定野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的酶活，以不同温度温浴前的活性为100％，温浴后的剩余活性与之相比计算相对活性，以测定野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的T50 15值(T50 15值为醇脱氢酶温浴15min后的活性为温浴前活性一半时所对应的温度，检测结果见表2)。
将实施例1获得的野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的纯酶液分别置于温度分别为30～45℃的恒温水浴中，每隔一段时间取样一次，测定野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的酶活，以不同温度水浴前的活性为100％，水浴后的剩余活性与之相比计算相对活性，以测定野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的半衰期t1/2(半衰期t1/2为在一定温度下孵育至活力损失一半的时间)；通过野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5在不同温度下的半衰期根据阿伦尼乌斯公式做出失活拟合线，计算野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的失活活化能Ed(计算结果见表2)；
失活活化能Ed的计算公式如下：
Ed＝-RT(lnk-lnA)；
Figure GDA0002987868960000091
式中，R：摩尔气体常量；T：对应温度；k：失活速率，t1/2：对应温度下半衰期，A：指前因子。
由表2可知，醇脱氢酶突变体M1～M64的热稳定性均较野生型醇脱氢酶有了明显的提升，其中，醇脱氢酶突变体M63的热稳定性最好，T50 15值和Ed值分别高达53.1℃和989.13kJ/mol，比野生型提高了11.1℃和32.06kJ/mol，45℃下的半衰期t1/2是野生型醇脱氢酶的3000倍；醇脱氢酶突变体S5的热稳定性则较野生型醇脱氢酶有了明显的下降。
表2野生型醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体M1～M64以及醇脱氢酶突变体S5的T50 15值、Ed值以及45℃下的t1/2
Figure GDA0002987868960000101
Figure GDA0002987868960000111
其中，nd：未测定。
实施例3：醇脱氢酶突变体的动力学参数以及不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的立体选择性
选择实施例1获得的野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M63、M64和S5，分别以浓度为0.1～5mM的潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮为底物，测定实施例1获得的野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M63、M64和S5的初始水解活力，采用Graph PadPrism 7.0软件中的非线性回归方法对数据进行拟合，分别得到米氏(Michaelis-Menten)方程的Km和Vmax值，再计算得到Kcat和Kcat/Km值，计算结果见表3；
其中，Kcat值的计算公式为：Kcat＝Vmax·M/60；其中，M为酶的分子质量，单位为kDa。
由表3可知，醇脱氢酶突变体M63不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的催化效率均较野生型醇脱氢酶有了明显的提升，是野生型醇脱氢酶的1.3倍；醇脱氢酶突变体M64不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的催化效率与野生型接近，但比醇脱氢酶突变体S5有1.35倍的提升；醇脱氢酶突变体S5不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的催化效率则较野生型有了一定的下降。
检测实施例1获得的野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M63、M64和S5不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的立体选择性，检测结果见表3。
由表3可知，醇脱氢酶突变体M63、M64和S5不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的立体选择性较野生型醇脱氢酶并没有下降；并且，由表3可知，野生型醇脱氢酶可不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，且ee值可达87.1％(R)，与野生型醇脱氢酶相比，醇脱氢酶突变体M64不对称还原不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇时具有反转的立体选择性，可不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，且ee值可达97.3％(S)。
表3野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M63、M64和S5的动力学参数以及不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成手性双芳基醇(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的立体选择性
Figure GDA0002987868960000112
Figure GDA0002987868960000121
实施例4：醇脱氢酶突变体不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化效率
选择实施例1获得的野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M64，将实施例1获得的野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M64分别以7g/L的添加量添加至分别含有100mM、200mM、500mM潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，在30℃、pH 7.0、200rpm条件下反应12h，得到反应液；除潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮外，磷酸钾缓冲液中还含有浓度为0.02mM的辅酶NADP+、浓度为1.5mM的葡萄糖、浓度为1.5mM的葡萄糖脱氢酶GDH和浓度为5％(v/v)的乙醇。
分别检测反应不同时间时野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M64不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化率，并计算野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M64不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化效率(即时空产率)，检测结果见表4～5。
由表4～5可知，100mM底物浓度下，野生型醇脱氢酶以及醇脱氢酶突变体M64分别在反应4h和2h时达到>99.9％的转化率，可见，醇脱氢酶突变体M64不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化效率较野生型醇脱氢酶有了明显的提升；并且，由表4～5可知，当潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的添加量为500mM时，野生型醇脱氢酶无法完全转化，而醇脱氢酶突变体M64的转化率则不受高浓度潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲的影响，可见，醇脱氢酶突变体M64可适应高浓度潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮的环境，不对称还原高浓度潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，并且具有较高的转化效率(即时空产率)，转化效率高达651g/(L·d)。
表4野生型醇脱氢酶不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化率
Figure GDA0002987868960000122
Figure GDA0002987868960000131
表5醇脱氢酶突变体M64不对称还原潜手性双芳基酮(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的转化率
Figure GDA0002987868960000132
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种醇脱氢酶突变体及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Val Leu Ile Ser Gly Ala Ser Gly Tyr Ile Ala Lys His Ile
1 5 10 15
Val Arg Val Leu Leu Glu Gln Asn Tyr Lys Val Ile Gly Thr Val Arg
20 25 30
Ser Gln Asp Lys Ala Asp Lys Leu Leu Lys Gln Tyr Asn Asn Pro Asn
35 40 45
Leu Ser Tyr Glu Ile Val Pro Glu Ile Ala Asn Leu Asp Ala Phe Asp
50 55 60
Asp Ile Phe Lys Lys His Gly Lys Glu Ile Lys Tyr Val Ile His Ala
65 70 75 80
Ala Ser Pro Val Asn Phe Gly Ala Lys Asp Leu Glu Lys Asp Leu Val
85 90 95
Ile Pro Ala Ile Asn Gly Thr Lys Asn Met Phe Glu Ala Ile Lys Lys
100 105 110
Tyr Ala Pro Asp Thr Val Glu Arg Val Val Met Thr Ala Ser Tyr Ala
115 120 125
Ser Ile Met Thr Pro His Arg Gln Asn Asp Pro Thr Leu Thr Leu Asp
130 135 140
Glu Glu Thr Trp Asn Pro Val Thr Glu Glu Asn Ala Tyr Glu Asn Val
145 150 155 160
Phe Thr Ala Tyr Cys Ala Ser Lys Thr Phe Ala Glu Lys Glu Ala Trp
165 170 175
Lys Phe Val Lys Glu Asn Ser Asp Ala Val Lys Phe Lys Leu Thr Thr
180 185 190
Ile His Pro Ser Phe Val Phe Gly Pro Gln Asn Phe Asp Glu Asp Val
195 200 205
Thr Lys Lys Leu Asn Glu Thr Cys Glu Ile Ile Asn Gly Leu Leu His
210 215 220
Ala Pro Phe Asp Thr Lys Val Glu Lys Thr His Phe Ser Gln Phe Ile
225 230 235 240
Asp Val Arg Asp Val Ala Lys Thr His Val Leu Gly Phe Gln Lys Asp
245 250 255
Glu Leu Ile Asn Gln Arg Leu Leu Leu Cys Asn Gly Ala Phe Ser Gln
260 265 270
Gln Asp Ile Val Asn Val Phe Asn Glu Asp Phe Pro Glu Leu Lys Gly
275 280 285
Gln Phe Pro Pro Glu Asp Lys Asp Thr Asp Leu Asn Lys Gly Val Thr
290 295 300
Gly Cys Lys Ile Asp Asn Glu Lys Thr Lys Lys Leu Leu Ala Phe Glu
305 310 315 320
Phe Thr Pro Phe His Lys Thr Ile His Asp Thr Val Tyr Gln Ile Leu
325 330 335
His Lys Glu Gly Arg Val
340
<210> 2
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagcgtat taattagtgg tgcttctgga tacattgcca aacatatcgt cagagttctt 60
ttggaacaaa attacaaagt aattggtact gttagaagtc aagacaaagc tgataagtta 120
ttgaaacaat ataataatcc taatttgtct tatgaaattg tacctgaaat agcaaactta 180
gatgcttttg atgacatttt taagaaacat ggtaaggaaa taaaatatgt cattcatgca 240
gcttcaccag tgaacttcgg cgcaaaagat ttggaaaaag atttagttat tcctgccatt 300
aatggtacca agaatatgtt cgaagctatt aaaaagtatg ccccagatac tgtcgaacgt 360
gttgtaatga ctgcttctta tgcttcaatt atgaccccac atagacaaaa tgatccaact 420
ttaactttag atgaagaaac ttggaatcca gtaactgaag aaaatgctta tgaaaatgtc 480
ttcactgctt attgtgcttc aaaaactttt gctgaaaagg aagcttggaa gttcgttaaa 540
gaaaatagtg atgctgttaa gtttaaacta accactatcc acccatcctt cgttttcgga 600
cctcagaact ttgatgaaga cgtcactaag aaactaaatg aaacttgtga aattatcaat 660
ggtttattac atgctccatt tgacaccaaa gtcgaaaaga ctcacttcag tcaattcatt 720
gatgttcgtg atgtcgccaa aactcacgtt ttgggtttcc aaaaagatga attaatcaac 780
caaagattgt tattatgtaa cggcgccttc tctcaacaag atattgttaa tgtatttaat 840
gaagatttcc cagagttaaa aggccaattc ccaccagaag ataaggacac cgatttaaac 900
aaaggtgtaa caggttgtaa aattgataat gaaaagacta aaaaattatt agcatttgaa 960
tttactcctt tccataaaac aattcatgac actgtctatc aaattttaca taaagaaggt 1020
agagtttaa 1029
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agaagtcaag acattgctga t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taacttatca gcaatgtctt g 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcttcaatta tggatccaca taga 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgtctatgt ggatccataa ttga 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatgcttatg aagatgtcgt t 21
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agcagtaacg acatcttcat a 21
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaagacgtca ctgaaaaact aaat 24
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttcatttagt ttttcagtga cgtc 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatgtcgcca aagcacacgt tttg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acccaaaacg tgtgctttgg cgac 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggcgccttct ctctgcaaga tatt 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacaatatct tgcagagaga aggc 24
<210> 15
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<213> 人工序列
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ccacatagaa ataatgatcc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tggatcatta tttctatgtg g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tatgaaaatg tcgttactgc t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
acaataagca gtaacgacat t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
actatccacc caggtttcgt t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tccgaaaacg aaacctgggt g 21
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ctaaatggta cttgtgaaat t 21
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aatttcacaa gtaccattta g 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
aagactcact tctgtcaatt c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atcaatgaat tgacagaagt g 21

Claims (9)

1.一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的醇脱氢酶的第36位赖氨酸突变为异亮氨酸、第132位苏氨酸突变为天冬氨酸、第159位天冬酰胺突变为天冬氨酸、第210位赖氨酸突变为谷氨酸、第248位苏氨酸突变为丙氨酸和第272位谷氨酰胺突变为亮氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述醇脱氢酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)质粒、pET-28b(+)质粒或pET-20b(+)质粒。
5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。
6.权利要求1所述醇脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为将权利要求5所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得权利要求1所述的醇脱氢酶突变体。
7.一种生产手性双芳基醇的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的醇脱氢酶突变体添加至含有潜手性双芳基酮的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行提取，获得手性双芳基醇。
8.如权利要求7所述的一种生产手性双芳基醇的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有辅酶和辅酶循环系统；所述辅酶循环系统含有D-葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，或者，含有亚磷酸盐和亚磷酸盐脱氢酶，或者，含有甲酸和甲酸脱氢酶，或者，含有乳酸和乳酸脱氢酶，或者，含有甘油和甘油脱氢酶。
9.权利要求1所述醇脱氢酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组质粒，或权利要求5所述宿主细胞，或权利要求6所述制备方法在生产手性双芳基醇中的应用。
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