CN104342483A - 一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法 - Google Patents
一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104342483A CN104342483A CN201310321476.0A CN201310321476A CN104342483A CN 104342483 A CN104342483 A CN 104342483A CN 201310321476 A CN201310321476 A CN 201310321476A CN 104342483 A CN104342483 A CN 104342483A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- halide alcohol
- alcohol dehalogenase
- screening method
- rapid screening
- deep
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108010013164 halohydrin dehalogenase Proteins 0.000 title abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 43
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims description 75
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 61
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 40
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 33
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 16
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 claims description 10
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- NUHCTOLBWMJMLX-UHFFFAOYSA-N bromothymol blue Chemical compound BrC1=C(O)C(C(C)C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C(=C(Br)C(O)=C(C(C)C)C=2)C)=C1C NUHCTOLBWMJMLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- -1 dibromothymolsulfonphthalein sodium-salt Chemical class 0.000 claims description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 2
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims 2
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 claims 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 abstract 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 19
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 7
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004176 ammonification Methods 0.000 description 6
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000002309 gasification Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- JEVCWSUVFOYBFI-UHFFFAOYSA-N cyanyl Chemical compound N#[C] JEVCWSUVFOYBFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种酶的筛选方法,特别涉及一种卤醇脱卤酶的筛选方法。用pH显色经过初筛和复筛两步法来筛选高酶活的卤醇脱卤酶。本发明使用深孔板进行微型化培养,实现了高通量培养和粗酶液的高通量制备;突破性的利用pH的变化来筛选高酶活的卤醇脱卤酶,效率高,成本低、速度快;消耗的培养基和试剂少;本发明使得可机械化自动化操作以实现,借助自动化的高通量筛选仪器可以进一步大幅度降低劳动量,提高筛选通量。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶的筛选方法,特别涉及一种卤醇脱卤酶的筛选方法。
背景技术
卤醇脱卤酶(halohydrin dehalogenase,HHDH)是一种具有催化活性的水解酶,能够可逆性作用于邻羟基卤化物(邻卤醇)形成环氧化物及环氧化物的开环。
环氧化物被公认为有机合成中最重要、应用最广泛的合成中间体之一,环氧化物手性合成和开环对于手性药物的合成非常重要。例如阿托伐他汀钙的侧链中间体A5((R)‐4‐氰基‐3‐羟基丁酸乙酯)的酶法合成中,就是利用卤醇脱卤酶作为生物催化剂。
天然的卤醇脱卤酶在工业化过程中存在生产成本高、酶活低、稳定性差等现象,制约了这类酶在大规模生产中的应用,通过筛选得到高酶活的卤醇脱卤酶是降低生产成本的重要方法之一。定点突变在卤醇脱卤酶的改造中扮演着重要的角色,通过此手段已对该类酶的某些特性如稳定性、转换数及对应体选择性等进行了改造,并获得了一些好的突变体。但该方法存在筛选容量过大、筛选过程复杂,且费用昂贵、费时费力等特点。
目前,卤醇脱卤酶的筛选主要利用气相色谱(GC)检测产物的生成量来计算酶活的值,从而筛选到酶活较高的卤醇脱卤酶,如专利US7588928中,就是用这种方法进行筛选的。但在筛选过程中由于突变体很多,使用的仪器和检测费用昂贵、过程复杂且费时费力,不利于大规模的推广使用。
在利用卤醇脱卤酶催化的过程中,反应体系中由于有HCl的生成,pH会逐渐减小,pH的变化速率与反应的快慢有直接的关系,在相同条件下,而反应的快慢与酶活的大小直接相关。因此,可以利用反应体系pH的变化速率来快速筛选具有高酶活的卤醇脱卤酶。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有筛选卤醇脱卤酶的方法成本高及工作量大和周期长的不足等问题。
实现本发明目的的技术方案是本发明提供了一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法,是基于深孔板的微型化培养与基于pH耦联变化的筛选方法。具体的方法如下:
取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落,经稀释菌浓度后接种于装有液体培养基的深孔板的孔中,每个孔有一个特定的编号;于30~40℃温度下,180~220rpm的摇床中培养4~10h;然后加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷),于28~35℃温度下、180~220rpm的摇床中继续培养10~20h;将深孔板重复进行超低温冷冻后室温融化;将深孔板离心处理5~30min;深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液稀释待测。取反应管,加入反应底物,去离子水和pH指示剂,加入稀释的待测粗酶液,以原始的卤醇脱卤酶作为对照,于30~70℃水浴中反应10~30min,根据反应过程中体系颜色的变化情况进行初筛,根据初步测定结果,选择对应的克隆进行摇瓶复筛,复筛时在反应体系中加入反应底物、去离子水,用pH计在线监测体系的pH变化,加入稀释的待测粗酶液,以原始的卤醇脱卤酶作对照,于30~70℃水浴反应10~30min,根据反应过程中体系pH变化速度的快慢筛选出高酶活的卤醇脱卤酶。
初筛时,反应初时体系的颜色为蓝紫色,随着反应的进行,pH下降,体系的颜色由蓝紫变为紫色,后来变为黄色。筛选出比对照颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落进行复筛。
复筛:在初筛出的卤醇脱卤酶单菌落中筛选出,在复筛开始后单位时间内pH变化量比作为对照的原始的卤醇脱卤酶快的卤醇脱卤酶单菌落,即为高酶活的卤醇脱卤酶。
本发明进一步的方案:
挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落,适当稀释菌浓度,接种于装有液体培养基的深孔板的孔中,每一孔由板号、行号和列号的组合标记,使每个孔有一个特 定的编号。盖上深孔板的三明治盖子,于30~40℃、180~220rpm摇床培养4~10h。加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷),于28~35℃、180~220rpm摇床继续培养10~20h。结束后把深孔板放入‐80℃超低温冰箱,待温度稳定后从超低温冰箱中拿出深孔板至室温融化,然后再按以上过程2遍或2遍以上冻融菌体细胞。将深孔板放置于孔板离心机,5000~10000×g离心5~30min。深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释。在反应管中加入反应底物、去离子水和pH指示剂,加入稀释的待测粗酶液,以原始的卤醇脱卤酶作对照,于30~70℃水浴反应10~30min,根据反应过程中体系颜色的变化情况进行筛选,根据初步测定结果,选择对应的克隆进行摇瓶复筛,获得高酶活的卤醇脱卤酶。
复筛时在反应体系中加入反应底物、去离子水,用pH计在线监测体系的pH变化,加入稀释的待测粗酶液,以原始的卤醇脱卤酶作对照,于30~70℃水浴反应10~30min,根据反应过程中体系pH变化速度的快慢筛选出高酶活的卤醇脱卤酶。
卤醇脱卤酶的单克隆菌落,来自于对原始基因序列进行人工定点突变后获得的单克隆菌落突变体,或是对原始基因序列进行随机突变后获得的单克隆菌落突变体,或是未经突变的含卤醇脱卤酶的菌落。
采用微量化梯度稀释法稀释菌浓度的具体步骤为:用带滤芯的无菌移液吸头以8通道移液器,自深孔板的A1~H1孔中吸取0.1mL卤醇脱卤酶粗酶液,移至装有0.9mL无菌生理盐水的深孔板的A2~H2孔中,振荡混匀,再用8通道移液器吸取0.1mLA2~H2,对应地移至深孔板A3~H3深孔中,如此逐级稀释至适当浓度。
所述液体培养基为:蛋白胨8~15g/L、酵母粉2~10g/L、甘油8~15g/L、磷酸二氢钾0.5~1.5g/L、硫酸镁0.1~0.5g/L,pH7.0、0.1MPa灭菌30min。
上述的深孔板可以是:6孔板、12孔板、24孔板、48孔和96孔板。深孔板的三明治盖,是从上依次由带孔的不锈钢盖子、除菌微滤膜片和硅胶孔垫三层组成,不锈钢盖子和硅胶孔垫上的孔与深孔板的深孔对应,以保证各微孔独立地与外界交换空气。培养基装液量为深孔板孔体积的5~30%。
所用的反应底物为4‐X‐3‐羟基丁酸乙酯,其中X为Cl、Br等,氰化钠,氰化钾, 盐酸,硫酸,磷酸,氢氧化钠中的一种或几种。此处优选(S)‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯、氰化钠和磷酸。(S)‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯为反应底物1。
反应底物氰化钠用去离子水配成10%‐40%的氰化钠溶液,缓慢滴加磷酸至pH6.8。优选去离子水配成30%的氰化钠溶液,缓慢滴加磷酸至pH6.8,此为反应底物2。
初筛时底物1的浓度为10‐50mM,底物2中氰化钠的浓度为10‐80mM。
初筛所用的pH指示剂为溴百里酚蓝、溴甲酚紫、酚红、中性红、甲酚红的一种或几种组合。此处优选1.0g/l溴甲酚紫钠盐和1.0g/l的溴百里酚蓝钠盐水溶液的混合指示剂。
初筛时用的深孔板,反应装液量为深孔板的5~30%。深孔板放在离心管架中,于30~70℃、180~220rpm水浴振荡反应10‐30min,优选反应条件50℃、200rpm条件下反应。
初筛pH指示剂的加量为反应液体积的0.005%‐0.05%,优选加量为0.02%。
复筛时的反应容器为50ml、100ml的三口烧瓶,其中一个烧瓶口可插入pH电极在线监测pH的变化情况。
复筛得到的卤醇脱卤酶单菌落做催化反应测酶活,定时取样用乙酸乙酯萃取底物和产物,利用GC检测底物和产物的含量,从而计算出酶活值。
卤醇脱卤酶酶活的定义:在指定的温度和pH条件下,每分钟生成1μmol(R)‐4‐氰‐3‐羟基丁酸乙酯所需的酶量,为一个酶活单位(U)。
卤醇脱卤酶酶活的测定方法:取底物(S)‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯和氰化钠至反应体系浓度分别为30mM,溶于0.5M磷酸盐缓冲液(pH7.0)中,水浴温度50℃,磁力搅拌,取稀释后的卤醇脱卤酶适量加入反应体系中,开始计时,20min后取样,用三倍体积的乙酸乙酯萃取,用GC测定转化率。
底物及产物的具体分析条件为:色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA),FID检测器。色谱柱温度208℃,气化和检测温度均为230℃,载气流量20‐30ml/min,进样量0.3‐0.5μL,载气为N2。
筛选效果的判断:
1.初筛:反应初时体系的颜色为蓝紫色,随着反应的进行,pH下降,体系的颜色由蓝紫变为紫色,后来变为黄色。筛选出比对照颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落。
2.复筛:在初筛的卤醇脱卤酶单菌落中,筛选出在开始后,单位时间pH变化量比对照快的。
测定酶活:在复筛的卤醇脱卤酶单菌落中,选取pH变化量最快的一组测定酶活值。
本发明具有积极的效果:(1)本发明使用深孔板进行微型化培养,实现了高通量培养和粗酶液的高通量制备;(2)本发明突破性的利用pH的变化来筛选高酶活的卤醇脱卤酶,效率高,成本低、速度快;消耗的培养基和试剂少;(3)本发明使得可机械化自动化操作以实现,借助自动化的高通量筛选仪器可以进一步大幅度降低劳动量,提高筛选通量。
具体实施方式
(实施例1)
1.卤醇脱卤酶的初筛
挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落(其中1号孔为原始对照),接种于装有0.6ml氨苄抗性液体培养基的48孔深孔板的孔中,每个孔的容积为4.6ml。盖上深孔板的三明治盖子,于37℃、200rpm摇床培养6h后,加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷),温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。
所用的培养基为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L,pH7.0、0.1MPa灭菌30min,待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。
结束后把深孔板放入‐80℃超低温冰箱,待温度稳定后从超低温冰箱中拿出深孔板至室温融化,然后再按以上过程2遍冻融菌体细胞。将深孔板放置于孔板离心机,10000×g离心30min。深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。
取一个48孔深孔板,每个孔容积4.6ml,每个孔依次加入53mg反应底物11(S) ‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯,4μL的反应底物2氰化钠,0.94ml pH6.8的去离子水,(S)‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯的浓度为10毫摩每升,氰化钠的浓度为15,0.2μL混合pH指示剂,盖上深孔板的三明治盖子,于50℃、200rpm水浴振荡30min,此时反应体系的颜色为蓝紫色。用8通道移液器吸取5μL的稀释酶液于对应编号的反应孔内,继续水浴振荡,开始计时,观察每个反应孔的颜色变化情况,选取比原始对照颜色变化快的,对应编号分别为7#、23#、26#、39#、43#,对这几个编号对应的卤醇脱卤酶单菌落进行复筛。
2.卤醇脱卤酶的复筛
挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌对应编号为1#、7#、23#、26#、39#、43#,的单菌落(其中1号孔为原始对照),接种于装有3ml氨苄抗性液体培养基的15ml的离心管,于37℃、200rpm摇床培养6h后,加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷),温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。
所用的培养基为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L,pH7.0、0.1MPa灭菌30min,待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。
结束后加入0.01%的溶菌酶,待细胞完全破碎后,置于冷冻离心机,4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。
取5个50ml的三口烧瓶,每个烧瓶依次加入530mg反应底物1,40μL的反应底物2,9.4ml pH6.8的去离子水,插入pH电极在线监测反应体系的pH,于50℃、200rpm磁力搅拌30min,此时调整每个反应体系的pH都为6.82。用移液器吸取50μL的稀释酶液于对应编号1#、7#、23#、26#、39#、43#的三口烧瓶内,继续磁力搅拌,开始计时,观察每个烧瓶5min反应体系pH的变化情况。
3.卤醇脱卤酶酶活的测定
挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌对应编号为1#、26#的单菌落(其中1号孔为原始对照),接种于装有25ml氨苄抗性液体培养基的250ml摇瓶中,于37℃、200rpm 摇床培养6h后,加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷),温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。
所用的培养基为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L,pH7.0、0.1MPa灭菌30min,待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。结束后离心收集菌体,加入4ml的pH7.00.1M的Tris‐HCl缓冲液,超声破碎,待细胞完全破碎后,置于冷冻离心机,4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。
取2个50ml的三口烧瓶,每个烧瓶依次加入530mg反应底物1,40μL的反应底物2,9.4ml0.5M磷酸盐缓冲液(pH7.0)中,水浴温度50℃,磁力搅拌,取稀释后的卤醇脱卤酶50μL加入反应体系中,开始计时,20min后取样,用三倍体积的乙酸乙酯萃取,用GC测定转化率。
底物及产物的具体分析条件为:色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA),FID检测器。色谱柱温度208℃,气化和检测温度均为230℃,载气流量20‐30ml/min,进样量0.3‐0.5μL,载气为N2。
通过以上检测结果,计算出1#原始对照的酶活为127U/ml,26#对应的酶活为410U/ml,筛选得到的卤醇脱卤酶单菌落酶活是原始对照的3.2倍。
复筛中在5min时体系的pH变化值:
编号 | 1# | 7# | 23# | 26# | 39# | 43# |
pH变化值 | 0.12 | 0.17 | 0.23 | 0.37 | 0.2 | 0.24 |
(实施例2)
1、卤醇脱卤酶的初筛
挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落,接种于装有0.6ml氨苄抗性液体培养基的48孔深孔板的孔中,每个孔的容积为4.6ml。盖上深孔板的三明治盖子,于37℃、200rpm摇床培养6h后,加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷), 温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。
所用的培养基为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L,pH7.0、0.1MPa灭菌30min,待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。
结束后把深孔板放入‐80℃超低温冰箱,待温度稳定后从超低温冰箱中拿出深孔板至室温融化,然后再按以上过程2遍冻融菌体细胞。将深孔板放置于孔板离心机,10000×g离心30min。深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。
取一个48孔深孔板,每个孔容积4.6ml,每个孔依次加入53mg反应底物1(S)‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯,4μL的反应底物2氰化钠,(S)‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯的浓度为30毫摩每升,氰化钠的浓度为30毫摩每升,0.94ml pH6.8的去离子水,0.8μL混合pH指示剂,盖上深孔板的三明治盖子,于50℃、200rpm水浴振荡30min,此时反应体系的颜色为蓝紫色。用8通道移液器吸取5μL的稀释酶液于对应编号的反应孔内,继续水浴振荡,开始计时,观察每个反应孔的颜色变化情况,选取比原始对照颜色变化快的,对应编号分别为8#、15#、23#、39#、42#,对这几个编号对应的突变体进行复筛。
2、卤醇脱卤酶的复筛
挑取含有卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌对应编号为1#、8#、15#、23#、39#、42#,的单菌落(其中1号孔为原始对照),接种于装有3ml氨苄抗性液体培养基的15ml的离心管,于37℃、200rpm摇床培养6h后,加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷),温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。
所用的培养基为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L,pH7.0、0.1MPa灭菌30min,待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。
结束后加入0.01%的溶菌酶,待细胞完全破碎后,置于冷冻离心机,4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。
取5个50ml的三口烧瓶,每个烧瓶依次加入530mg反应底物1,40μL的反应底 物2,9.4ml pH6.8的去离子水,插入pH电极在线监测反应体系的pH,于50℃、200rpm磁力搅拌30min,此时调整每个反应体系的pH都为6.82。用移液器吸取50μL的稀释酶液于对应编号1#、8#、15#、23#、39#、42#的三口烧瓶内,继续磁力搅拌,开始计时,观察每个烧瓶5min反应体系pH的变化情况。
3、卤醇脱卤酶酶活的测定
挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌对应编号为1#、23#的单菌落(其中1号孔为原始对照),接种于装有25ml氨苄抗性液体培养基的250ml摇瓶中,于37℃、200rpm摇床培养6h后,加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷),温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。
所用的培养基为:蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L,pH7.0、0.1MPa灭菌30min,待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。结束后离心收集菌体,加入4ml的pH7.00.1M的Tris‐HCl缓冲液,超声破碎,待细胞完全破碎后,置于冷冻离心机,4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。
取2个50ml的三口烧瓶,每个烧瓶依次加入530mg反应底物1,40μL的反应底物2,9.4ml0.5M磷酸盐缓冲液(pH7.0)中,水浴温度50℃,磁力搅拌,取稀释后的卤醇脱卤酶50μL加入反应体系中,开始计时,20min后取样,用三倍体积的乙酸乙酯萃取,用GC测定转化率。
底物及产物的具体分析条件为:色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA),FID检测器。色谱柱温度208℃,气化和检测温度均为230℃,载气流量20‐30ml/min,进样量0.3‐0.5μL,载气为N2。
通过以上检测结果,计算出1#原始对照的酶活为127U/ml,23#卤醇脱卤酶单菌落对应的酶活为405U/ml,筛选得到卤醇脱卤酶单菌落酶活是原始对照的3.2倍。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含 在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:用pH显色经过初筛和复筛两步法来筛选高酶活的卤醇脱卤酶。
2.根据权利要求1所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌的单菌落稀释后接种于装有液体培养基深孔板的多个孔中,在摇床中进行两次培养;
(2)将深孔板超低温冷冻然后室温融化,至少重复进行2次;
(3)将前述经过冻融的深孔板进行离心处理,取上清液为粗酶液;
(4)将粗酶液和含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌的单菌落分别加入不同个装有反应底物和去离子水及pH指示剂混合液的反应管中,将加入含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落的反应管作为参照管,在相同条件下反应,筛选出比参照管颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落,完成初筛;
(5)将初筛所得的卤醇脱卤酶单菌落对应的粗酶液分别加入不同个装有反应底物、去离子水混合液的反应管中,用pH计在线监测各管内体系的pH的变化,同样以含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落反应管作为参照管,复筛出单位时间内pH变化量比参照管大的卤醇脱卤酶单菌落,即为高酶活的卤醇脱卤酶。
3.根据权利要求2所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:初筛时pH指示剂的加入量为反应体系液体体积的0.005%-0.05%。
4.根据权利要求2所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:初筛时pH指示加量为反应体系液体体积的0.02%。
5.根据权利要求2所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:初筛所用的pH指示剂为溴百里酚蓝、溴甲酚紫、酚红、中性红、甲酚红的一种或几种组合。
6.根据权利要求2所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:初筛所用的pH指示剂为1.0g/l溴甲酚紫钠盐和1.0g/l的溴百里酚蓝钠盐水溶液的混合指示剂。
7.根据权利要求2所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:所述反应底物为通式为4-X-3-羟基丁酸乙酯,其中X为Cl、Br中之一,或氰化钠、氰化钾、盐酸、硫酸、磷酸、氢氧化钠中的一种或几种组合。
8.根据权利要求7所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:所述反应底物为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯或氰化钠或磷酸中一种或几种组合。
9.根据权利要求7所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:初筛时反应底物为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和为氰化钠的混合物时,(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度为10-50毫摩每升,氰化钠的浓度为10-80毫摩每升。
10.根据权利要求9所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法,其特征在于:(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度为30毫摩每升,氰化钠的浓度为30毫摩每升。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310321476.0A CN104342483B (zh) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | 一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310321476.0A CN104342483B (zh) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | 一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104342483A true CN104342483A (zh) | 2015-02-11 |
CN104342483B CN104342483B (zh) | 2017-05-24 |
Family
ID=52498936
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310321476.0A Active CN104342483B (zh) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | 一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104342483B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110055169A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-07-26 | 电子科技大学 | 一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统 |
CN110423740A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-08 | 盐城工学院 | 一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101636497A (zh) * | 2007-03-07 | 2010-01-27 | 三菱丽阳株式会社 | 改良型卤代醇环氧酶 |
CN101760468A (zh) * | 2008-12-25 | 2010-06-30 | 安琪酵母股份有限公司 | 卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用 |
CN102827853A (zh) * | 2012-09-06 | 2012-12-19 | 江苏阿尔法药业有限公司 | 一种卤醇脱卤酶基因突变体及其应用 |
-
2013
- 2013-07-26 CN CN201310321476.0A patent/CN104342483B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101636497A (zh) * | 2007-03-07 | 2010-01-27 | 三菱丽阳株式会社 | 改良型卤代醇环氧酶 |
CN101760468A (zh) * | 2008-12-25 | 2010-06-30 | 安琪酵母股份有限公司 | 卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用 |
CN102827853A (zh) * | 2012-09-06 | 2012-12-19 | 江苏阿尔法药业有限公司 | 一种卤醇脱卤酶基因突变体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
李阳: "卤醇脱卤酶HheC的高效表达与纯化及其酶活检测方法的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑 》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110055169A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-07-26 | 电子科技大学 | 一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统 |
CN110423740A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-08 | 盐城工学院 | 一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用 |
CN110423740B (zh) * | 2019-08-15 | 2023-02-21 | 盐城工学院 | 一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104342483B (zh) | 2017-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rajawat et al. | A modified plate assay for rapid screening of potassium-solubilizing bacteria | |
Li et al. | A Hg (II)-specific probe for imaging application in living systems and quantitative analysis in environmental/food samples | |
CN102618431B (zh) | 一种基于过程质谱仪的封闭式光生物反应器装置及藻细胞生长过程监控方法 | |
CN102899256B (zh) | 一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法 | |
Dietzsch et al. | On-line multiple component analysis for efficient quantitative bioprocess development | |
CN205426847U (zh) | 水体中有毒物质生物在线监测及自动预警装置 | |
CN108642130B (zh) | 一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法 | |
Hu et al. | Improvement of panaxnotoginseng cell culture for production of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation in pneumatically agitated bioreactors | |
CN104342483A (zh) | 一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法 | |
Paul et al. | Investigation of cell line specific responses to pH inhomogeneity and consequences for process design | |
CN109022269A (zh) | 多通道室内反硝化培养装置及其培养方法 | |
Mei et al. | A sequential injection analysis/chemiluminescent plant tissue-based biosensor system for the determination of diamine | |
CN105018343B (zh) | 原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化样品处理装置及自动化工作站 | |
AU2021101699A4 (en) | Evaluation method of soil biological activity and productivity based on determination of soil enzyme activity | |
CN106770946A (zh) | 一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法 | |
CN103983636B (zh) | 一种硫酸盐还原菌快速检测方法及其试剂盒 | |
WO2018235441A1 (ja) | 連続培養条件のスクリーニング方法および連続培養条件のスクリーニング装置 | |
CN105018609B (zh) | 一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法 | |
CN104975090B (zh) | 一种丁烷氧化菌丰度的自动化检测方法 | |
CN103667157A (zh) | 一种改良的解磷菌分离鉴别及解磷能力测定方法 | |
Wang et al. | Investigating drivers of N2 loss and N2O reducers in paddy soils across China | |
CN102604884B (zh) | 细胞的发酵培养方法 | |
US10907191B2 (en) | Method for measuring activity of oxidoreductase | |
CN209024539U (zh) | 多通道室内反硝化培养装置 | |
WO2023102770A1 (zh) | 基于人工智能创制的高附加值代谢物底盘 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181123 Address after: 210008 Room 101, block F7, 9 Wei Di Road, Qixia District, Nanjing, Jiangsu. Patentee after: NANJING NUOYUN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 210046 four buildings, 108 East four, South Gan, Jiangsu, Nanjing Patentee before: NANJING LANG'EN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO., LTD. |
|
TR01 | Transfer of patent right |