CN110055169A - 一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统 - Google Patents

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Abstract

一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统，属于酶工程技术领域。本发明利用卤醇脱卤酶催化底物释放质子造成pH降低，pH降低可通过指示剂颜色改变来反映，在比色原理的基础上搭建集成图像采集和图像分析设备的微流体系统。所述文库定量筛选的方法基于纸质微流体平台，在固定有指示剂的微流体载体上吸附卤醇脱卤酶，滴加底物后进行孵育，通过指示剂检测pH值变化，发生颜色变化后进行图像采集，通过图像分析获取质子浓度和指示剂颜色强度的线性关系作为标准曲线，基于所述标准曲线检测吸附卤醇脱卤酶突变体的微流体反应体系中质子浓度，通过微流体反应体系中质子浓度实现酶活性的测定。本发明具有简单、快速、灵敏的特点，实现了卤醇脱卤酶文库的定量筛选。

Description

一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法及相关微流体系统。
背景技术
卤醇脱卤酶(HHDHs)是生物技术领域重要的酶，它能催化卤代醇发生脱卤反应，生成环氧化物，质子和卤离子。来自A.radiobacter AD1的卤醇脱卤酶HheC与来自Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064的卤代烷烃脱卤酶DhaA可以共同应用于1,2,3-TCP的生物降解过程中，是降解有机卤化物的有效手段。此外，HHDHs具有良好的立体和区域选择性，可用于生产有价值的手性β-取代醇，在化合物合成领域中备受关注。到目前为止，卤醇脱卤酶已成功应用于手性环氧化物，卤代醇，氰醇，叠氮醇的合成。其中，前体化合物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在HHDHs的催化作用下，以(S)-环氧化物作为中间体，广泛地应用在他汀类药物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的生产过程中。尽管HHDHs具有如此优越的催化潜力，但是天然酶在催化活性、稳定性和选择性等方面往往难以满足工业化生产的需要。为了能够快速实现HHDHs催化过程的产业化应用，对其进行分子改造是必不可少的。
目前，酶的改造主要通过以下两条途径来实现。一是通过计算机的分析计算，结合基因工程对酶的DNA序列进行改造，如定点突变等；二是利用基因工程技术模拟自然界中的进化，如定向突变等。前者是以已知一些信息如酶的功能位点、空间结构等为依据对酶分子进行改造，虽然目标明确但对于改造已知信息有限的酶存在很大局限性；后者的实用性相对更强，具有普适性。定向进化技术不需要事先了解酶的空间结构与催化机制，构建随机突变文库，通过高通量筛选方法得到某些特性改良的突变酶体。定向突变体文库的建立包括对亲本酶基因进行突变，创造多样性基因，再导入适当的载体中进行文库的构建。建立突变文库的方法比较通用，也能满足库容较大文库的需求，而文库筛选方法的筛选能力是制约定向进化技术的最大瓶颈。由于突变基因文库往往被亚克隆并在微生物中表达，因此对大量微生物细胞的筛选首先要进行有效分离，然后用酶检测技术或其他信号检测技术(比如分光光度、气相色谱、高效液相色谱、质谱、核磁共振等)进行检测，筛选的有效性很大程度上取决于酶检测技术的水平和各种信号探测技术的应用。因此合适的筛选方法是能否获得优良的卤醇脱卤酶突变体的关键。
传统文库筛选方法主要有平板克隆筛选、噬菌体展示技术、96孔板筛选、荧光激活细胞分选(FACS)技术。但是这些方法在不同程度上依然不能满足目前文库筛选的需要。平板克隆筛选的操作比较简单，但灵敏度差，不易反映微小变化，无法实现定量检测并且筛选的工作量非常大，而且还受到很多酶不具备相应筛选底物的限制。噬菌体展示技术是一种高通量的筛选技术，可高选择性地筛选复杂分子，但是需要进行细胞克隆操作，并且这种技术并不是一种定量筛选，只能筛选出具有酶活的克隆，而对活性的强弱不能进行很好地分辨。96孔板筛选的优势在于减小测定体积，反应周期短，但其本身同样无法实现定量检测。平板克隆筛选、噬菌体展示技术和96孔板筛选由于只是定性的筛选，不能准确的反映突变体的真正催化活性，在经过文库筛选后，还要进一步鉴定酶活力，才可以确定突变体的酶活力的改变程度，比如96孔板筛选结合分光光度计进行文库筛选和定量判定，以区分高酶活和低酶活的突变体，但这种方法要想实现高通量、快速筛选则需要配套多通道、多波长检测仪器，设备投入较大、技术操作复杂；此外，还可通过HHDHs脱卤作用产生的质子和卤离子对其活性进行测定，但是这种方法通常需要重金属汞离子，产生的废液对环境造成极大污染。关于定量文库筛选目前主要是FACS技术，虽然这一项技术能对大容量样本进行超高通量的定量分析和筛选，具有显著优势，但仍然存在仪器成本高、应用范围窄，难以应用于大规模的工业化生产的局限性。
在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的微流体技术作为一种新兴的系统化平台技术，在近年来备受瞩目，并在生物技术，医学，化学和材料科学领域具有广泛应用。其中，基于纸质微流体平台广泛应用在诊断、食品安全和环境监测分析平台，具有简单，低成本，可携带，可生物降解等优势。因此，基于该技术本发明考虑设计一种快速、定量筛选卤醇脱卤酶文库的方法。
发明内容
针对现有文库筛选方法存在的问题，本发明提供了一种基于纸质微流体平台通过图像分析pH变化所引起颜色变化实现快速、定量筛选卤醇脱卤酶的方法和相关微流体系统。
一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，包括微流体平台、图像采集设备以及后端图像分析设备；所述微流体平台包括吸附有pH指示剂和缓冲液的载体，所述微流体平台用于反映文库中酶蛋白突变体催化底物导致微环境pH变化所引起的颜色变化，所述图像采集设备用于采集微流体平台的颜色图片，所述图像分析设备用于分析所述颜色图片的颜色强度并基于质子浓度与pH指示剂颜色强度之间的标准曲线计算酶活。
进一步地，所述标准曲线为0～1.2mM范围内质子浓度与pH指示剂最终颜色强度之间的线性关系。
进一步地，所述载体具体优选为玻璃纤维或纤维素纸。
进一步地，所述载体采用打孔机制成直径为6～8mm的圆形纸盘。
进一步地，所述pH指示剂为苯酚红指示剂，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
一种卤醇脱卤酶文库筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：构建微流体平台；
在载体上吸附苯酚红指示剂和HEPES缓冲液；
步骤B：建立标准曲线；
在0～1.2mM范围内选择多个已知浓度的HCl溶液，将已知浓度的HCl溶液滴加到吸附有HEPES缓冲液的载体上，然后滴加苯酚红溶液进行反应，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，不同浓度的HCl溶液重复上述步骤，得到不同浓度HCl溶液下载体的颜色图片；通过对不同浓度HCl溶液下pH指示剂的颜色强度进行分析，建立得到pH指示剂颜色强度与质子浓度的线性关系作为标准曲线；
步骤C：文库定量筛选；
将文库中卤醇脱卤酶突变体吸附在经步骤A处理得到的载体上，然后加入卤醇脱卤酶的底物进行孵育，待孵育完成，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，分析图像中颜色强度并根据步骤B得到标准曲线得到质子浓度，再通过质子浓度测定酶的活性。
进一步地，所述步骤A中载体具体优选为玻璃纤维或纤维素纸。
进一步地，所述步骤A中载体采用打孔机制成直径为6～8mm的圆形纸盘。
进一步地，所述步骤A中HEPES缓冲液的浓度范围优选为0.5～2mM。
进一步地，所述步骤C中卤醇脱卤酶突变体为无细胞酶提取物或者全细胞酶提取物。
进一步地，所述全细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂进行温育，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中，得到用于文库筛选的全细胞酶提取物。
进一步地，所述无细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂，于37℃温育18小时，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中进行超声裂解，离心细胞裂解物，得到上清液作为用于文库筛选的无细胞酶提取物。
具体地，所述无细胞酶提取物或者全细胞酶提取物的制作流程中诱导剂为阿拉伯糖。
具体地，所述无细胞酶提取物或者全细胞酶提取物的制作流程中温育条件为37℃温育18小时。
作为一种实施方式，所述步骤C中底物为1,3-二氯-2-丙醇。
进一步地，所述步骤C中无细胞酶提取物的文库筛选具体操作为：
将不同突变体的无细胞提取物吸附在载体上，所述然后在载体上滴加底物，置于30℃的培养箱中温育5～20分钟。
进一步地，所述步骤C中全细胞酶提取物的文库筛选具体操作为：
将不同突变体的全细胞提取物吸附在载体上，所述然后在载体上滴加底物，置于30℃的培养箱中温育10～40分钟。
进一步地，所述步骤C中吸附有阳性突变体的载体在苯酚红指示剂作用下颜色从红色变为橙色，然后变为黄色，颜色强度与阳性突变体的酶活性成比例。
本发明利用卤醇脱卤酶催化底物释放质子造成pH降低，pH可以通过指示剂颜色改变来反映，在比色原理的基础上搭建集成图像采集和图像分析设备的微流体系统，具有简单、快速、灵敏的特点，实现了卤醇脱卤酶文库的定量筛选。通过图像分析获取质子浓度和pH指示剂颜色强度的线性关系作为标准曲线，基于所述标准曲线检测吸附卤醇脱卤酶突变体的微流体反应体系中质子浓度，通过微流体反应体系中质子浓度实现酶活性的测定。
本发明定量筛选高通量文库的构思具体是，基于纸质微流体平台，在固定有指示剂的滤纸载体上吸附卤醇脱卤酶，并将底物滴加在滤纸载体进行孵育，然后通过指示剂检测pH值变化，视觉捕捉到颜色变化后进行图像采集，并传到计算机进行定量分析。研究表明，指示剂的颜色从红色变为橙色，最后变为黄色，颜色的变化与底物浓度和酶活性成比例，并通过多种底物验证了该方法的有效性。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用卤醇脱卤酶的脱卤反应产生质子导致微环境pH变化引起苯酚红指示剂颜色变化，通过比色分析建立质子浓度与pH指示剂颜色强度的线性关系，实现卤醇脱卤酶的定量筛选，检测过程简单、直接、快速、灵敏的优势，本发明提供手段不局限于筛选卤醇脱卤酶，可广泛应用于催化过程改变微环境pH值的酶蛋白的文库筛选。
2、本发明提供的筛选方法具有功能灵活性，既可以筛选全细胞提取物，也可以筛选无细胞的酶蛋白提取液，通过文库快速筛选卤醇脱卤酶，并定量检测有机卤化物，相比传统液相测定具有高通量筛选的优势。
3、本发明所构建的微流体平台成本低、载体材料价格低、容易获取且环保，体系不需要耗费大量试剂，筛选成本低；采集设备和图像分析设备对结果进行记录具有诸多优势，包括高分辨率摄像头，高速数据传输，远程报告结果，便携性等；本发明为未来开发自动化和多路分析系统开辟了一个简单、经济实惠的平台。
附图说明
图1是苯酚红在7种不同类型滤纸载体上的显色结果。
图2是不同浓度HCl的校准曲线。其中(A)是颜色强度数据的拟合结果；(B)是不同HCl浓度下滤纸载体的颜色变化。
图3是使用5mM 1,3-DCP作为底物固相筛选卤醇脱卤酶突变文库的结果。
图4是HheC突变体对不同底物的反应差异。
图5是起始反应速率随底物浓度变化的拟合图。
图6是卤醇脱卤酶对不同浓度底物1,3-DCP的检测线和最低线性范围。
图7是卤醇脱卤酶对不同浓度底物2,3-DCP的检测线和最低线性范围。
图8是在30-70℃的检测温度范围内对HheC游离酶的相对酶活的影响。
图9是在30-70℃的温检测度范围内对HheC固定酶的相对酶活的影响。
图10是固定化HheC在4℃和30℃后的热稳定性测定结果。
具体实施方式
为了使得所属领域技术人员能够更加清楚本发明方案及原理，下面结合附图和具体实施例进行详细描述。本发明的内容不局限于任何具体实施例，也不代表是最佳实施例，本领域技术人员所熟知的一般替代也涵盖在本发明的保护范围内。
实施例1：
微流体平台的系统设置和试剂的选择；
步骤A：载体的选择；
具体步骤包括：通过筛选市面上7种不同类型的纤维素和玻璃纤维膜纸作为优选的载体材料，本实施例所选为中性载体，材料简单且成本低廉，是非常理想的载体材料。
步骤B：指示剂/缓冲系统
指示剂的选择取决于酶活性的最佳pH，卤醇脱卤酶的最适p H为8至9，指示剂和缓冲液的p Ka值应与之相近。因此选择苯酚红(pKa＝8.0)和HEPES(pKa＝8.2)分别作为催化反应中的指示剂和缓冲液；分别将溶解8μl苯酚红溶液的等量HEPES缓冲液滴加到7个圆盘(从左至右依次记为A至G)上，使用6mm打孔机分别冲压上述7种滤纸载体，并经打孔得到的纸盘分别置于每个圆盘中在37℃下进行温育，温育5分钟后进行拍摄。
卤醇脱卤酶在催化邻卤醇形成环氧化物的同时，会释放1分子的H+，从而造成pH的降低。本实施例中通过选择指示剂变色范围恰好落在酶催化所能改变的pH范围内，使得pH的降低可以通过指示剂颜色的改变而反应出来。这种比色法的原理是质子化的酚红变成黄色，而去质子化的酚红保持红色。如图1所示，苯酚红的颜色从红色变为橙色，然后从橙色变为黄色。
步骤C：图像的采集和分析
将相机固定在纸盘上方30厘米处进行拍摄，采集后将图像传输到电脑，使用ImageJ软件中红-绿-蓝(RGB)和色调-饱和-亮度(HSB)系统分析图像，然后确定RGB和HSB的灵敏度。通过测试一系列HCl浓度对苯酚红颜色变化和数据中最高线性选择最佳色彩空间。
步骤D：校正曲线的检测
为了确定颜色强度和质子浓度之间的线性关系，制备了浓度梯度分别为0，0.1mM，0.3mM，0.5mM，0.7mM，0.9mM，1.2mM，1.5mM，75mM，2.0mM，2.5mM，3.0mM的HCl溶液，采用没有转入靶基因的大肠杆菌细胞经超声处理得到样品用作阴性对照，HEPES缓冲液作为空白对照。将已知多组浓度的HCl溶液滴加到纸盘上，并将苯酚红溶液点在纸的相同位置，反应1分钟之后拍摄结果，将拍摄结果使用ImageJ软件分析颜色强度；然后再次基于多组浓度的HCl溶液重复上述步骤，所有颜色强度结果都是三次测量的平均值。
如图2所示，滤纸的颜色随着酸浓度的增加而渐渐变黄，在0～1.2mM范围内呈现线性关系，随着质子浓度继续增大，校正曲线饱和，呈现S形。
实施例2：
筛选突变文库
步骤A：蛋白的表达和收集
选择野生型卤醇脱卤酶和在重组大肠杆菌中异源表达突变体，以120rpm在37℃培养18小时后悬浮于10mM HEPES中，并使用超声处理裂解细胞。离心后收集上清作为酶粗提液，使用Bradford法测定蛋白质浓度，并使用卤化物释放法测量活性；全细胞筛选时，将细胞悬浮在HEPES缓冲液中，洗涤两次后用于文库筛选；使用的培养基的成分包括10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物5g，10g/L氯化钠，氨苄青霉素用作抗生素，阿拉伯糖作为诱导剂；
步骤B：无细胞和全细胞酶的文库筛选
为了证明本发明用于文库筛选的效用，使用5mM 1,3-DCP作为底物筛选卤醇脱卤酶突变体。将30μg无细胞提取物吸附在每个纸盘上，然后将10μl 5mM底物溶液分别滴加到每个纸盘，在30℃的培养箱中孵育10-20分钟，然后使用ImageJ软件拍摄并分析图像。对于全细胞筛选，每个纸盘能够吸附10μl细胞悬浮液。将10μl 5mM底物滴加在纸盘，并在30℃的培养箱中孵育20-40分钟。若纸盘颜色从红变黄，则该酶为阳性突变体。实验以野生型HheC作为阳性对照，而没有靶蛋白的无细胞提取物用作阴性对照。如图3所示，A1至C1为加入突变体P84A的实验组，A2至C2为阴性对照组，A3至C3为加入突变体P135A的实验组，A4至C4为加入突变体W249F的实验组，A5至C5加入突变体W249P的实验组，A6至C6加入突变体G137A的实验组，A7至C7加入突变体W139A的实验组，A8至C8为阳性对照组。结果表明，没有加入酶的阴性对照组(A2至C2)保持原始颜色，加入野生型HheC(A8至C8)及其突变体的滤纸变为黄色，其中两个突变体表现出优良的活性。SDS-PAGE结果证实突变体表达量相当，因此的确是由于酶活性引起滤纸颜色变化。
实施例3：
卤醇脱卤酶突变体的活性分析
使用1,3-DBP，2,3-DBP，1,3-DCP和2,3-DCP四种底物测定HheC突变体的酶活力；先用6mm打孔机打出5个纸盘，并放入培养皿中，其中2个纸盘用作阴性对照(不转入卤醇脱卤酶基因组)和空白(不加酶)，其他3个纸盘中加入相同酶、相同底物和显色剂。将相机固定在三脚架上用于捕获图像，每30秒拍摄一次图像，拍摄10分钟。随着反应产物质子浓度的增加，滤纸的颜色不断变化，拟合曲线最陡的部分用来确定初始速率；通过改变纸盘中底物的种类来分别研究不同底物的反应差异，结果加图4所示，结果表明HheC突变体对溴化物的活性比氯化物更高，反应顺序为1,3-DBP>2,3-DBP>1,3-DCP>2,3-DCP。
实施例4：
固定化酶的催化特性分析
使用10mM HEPES缓冲液制备不同浓度的卤醇脱卤酶HheC W249P溶液0.5-5mM，酶活力检测方法同如实施例3，使用Origin软件模拟数据。结果表明，起始反应速率随着底物1,3-DCP浓度的增加呈双曲线饱和增长，该趋势遵循Michalis-Menten，如图5所示，动力学参数如表1所示。
根据Michaelis-Menten方程，Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度，因此Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关；Kcat是酶的催化常数，即单位时间内每分子酶所能转换的底物分子数，表示酶催化特定底物的能力；kcat/Km指酶的催化效率。卤醇脱卤酶HheC W249P对于不同底物的催化效率由高到低依次为1,3-DCP、1,3-DBP、2,3-DBP、2-CPE和2,3-DCP。
实施例5：
卤代醇的检测
该方法使用HheC W249P检测1,3-DCP和2,3-DCP，制备了浓度范围为0～1mM的1,3-DCP和2,3-DCP溶液。将8μl酶溶液吸附在纸盘上，在30℃下干燥3分钟，然后滴加8μl底物，30℃下温育5分钟。从培养箱中取出纸盘后，在同一位置上再滴加4μl苯酚红，使用ImageJ软件拍摄并分析。分析物浓度的增加导致更多质子释放，从而颜色强度加深。如图6和7所示，酶蛋白对1,3-DCP的最低检测限为0.08mM，而2,3-DCP的检测限为0.147mM。
实施例6：
酶的热稳定性检测
为了确定固定化酶在微流体盘上的稳定性，研究了热稳定性和储存稳定性。通过在30-70℃水浴中孵育游离和固定化酶来测定热稳定性，在1小时后从水浴中拿出游离和固定化酶，并在冰上快速冷却5分钟。使用5mM，1,3-DCP在30℃下测量游离酶和固定化酶的残余活性，并将未处理的酶作为标准进行比较。结果表明，固定化酶比游离酶更稳定。如图8和9所示，在30℃温育3小时后，固定化酶保留了96％的初始活性，在50℃保持了83％的初始活性；而在30℃和50℃温育3小时的游离酶分别保留了96％和30％的原始活力；在孵育3小时后，游离HheC在60℃几乎丧失活性，而固定化酶在相同条件下仍保持60％的初始活性。
实施例7：
酶的储存稳定性检测
为了检测微流体系统的储存稳定性，将吸附了酶蛋白的纸盘分别储存在4℃和30℃中保存28天，取相同批次的酶60μg吸附在纸盘上，并在每周测量一次酶活力。如图10所示，在4℃储存28天后，酶活力保留了66％；而在30℃储存了28天后，酶活力保留了71％。
以上结合附图对本发明的实施例进行了详细阐述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，不脱离本发明宗旨和权利要求所保护范围的情况下还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护。

Claims (10)

1.一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，包括微流体平台、图像采集设备以及后端图像分析设备；所述微流体平台包括吸附有pH指示剂和缓冲液的载体，所述微流体平台用于反映文库中酶蛋白突变体催化底物导致微环境pH变化所引起的颜色变化，所述图像采集设备用于采集微流体平台的颜色图片，所述图像分析设备用于分析所述颜色图片的颜色强度并基于质子浓度与颜色强度间的标准曲线计算酶活。
2.根据权利要求1所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述酶蛋白突变体为卤醇脱卤酶突变体，所述pH指示剂为苯酚红指示剂，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述标准曲线为0～1.2mM范围内质子浓度与pH指示剂最终颜色强度之间的线性关系。
4.根据权利要求1所述的一种用于酶蛋白文库筛选的微流体系统，其特征在于，所述载体具体为玻璃纤维或纤维素纸。
5.一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：构建微流体平台；
在载体上吸附苯酚红指示剂和HEPES缓冲液；
步骤B：建立标准曲线；
在0～1.2mM范围内选择多个已知浓度的HCl溶液，将已知浓度的HCl溶液滴加到吸附有HEPES缓冲液的载体上，然后滴加苯酚红溶液进行反应，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，不同浓度的HCl溶液重复上述步骤，得到不同浓度HCl溶液下载体的颜色图片；通过对不同浓度HCl溶液下载体的颜色强度进行分析，建立得到颜色强度与质子浓度的线性关系作为标准曲线；
步骤C：文库定量筛选；
将文库中卤醇脱卤酶突变体吸附在经步骤A处理得到的载体上，然后加入卤醇脱卤酶的底物进行孵育，待孵育完成，在苯酚红指示剂作用下载体颜色发生改变，待反应完成后采集载体颜色，分析图像中颜色强度并根据步骤B得到标准曲线得到质子浓度，再通过质子浓度测定酶的活性。
6.根据权利要求5所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述步骤A中载体具体优选为玻璃纤维或纤维素纸。
7.根据权利要求5所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述步骤A中HEPES缓冲液的浓度范围为0.5～2mM。
8.根据权利要求5所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述步骤C中卤醇脱卤酶突变体为无细胞酶提取物或者全细胞酶提取物。
9.根据权利要求8所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，所述全细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂进行温育，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中，得到用于文库筛选的全细胞酶提取物；所述无细胞酶提取物的制作流程如下：将卤醇脱卤酶的基因组转入大肠杆菌中，在培养基中培养，加入诱导剂，于37℃温育18小时，诱导完成后收集细胞，悬浮于缓冲液4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)中进行超声裂解，离心细胞裂解物，得到上清液作为用于文库筛选的无细胞酶提取物。
10.根据权利要求8所述的一种卤醇脱卤酶文库定量筛选方法，其特征在于，作为一种实施方式，所述步骤C中无细胞酶提取物的文库筛选具体操作为：将不同突变体的无细胞提取物吸附在载体上，所述然后在载体上滴加底物，置于30℃的培养箱中温育5～20分钟；所述步骤C中全细胞酶提取物的文库筛选具体操作为：将不同突变体的全细胞提取物吸附在载体上，所述然后在载体上滴加底物，置于30℃的培养箱中温育10～40分钟。
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