CN102899256B

CN102899256B - 一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法

Info

Publication number: CN102899256B
Application number: CN201210374664.5A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 曾宪经; 林晓珊; 何小妮; 陈子健
Original assignee: South China University of Technology SCUT; Quantum Hi Tech China Biological Co Ltd
Current assignee: South China University of Technology SCUT; Quantum Hi Tech China Biological Co Ltd
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: CN102899256A

Abstract

本发明公开了一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法。本发明首先通过氯化锂和紫外诱变筛选菌株，再通过基因组改组技术来改变菌株中果糖基转移酶的性质，最终得到本发明提供的产果糖基转移酶的菌株。该菌株名称为米曲霉scut209，保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC NO:M2012106。其产果糖基转移酶产酶的能力高，达到34987U/g细胞，具备了较高的工业应用价值。

Description

一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法

技术领域

本发明属于发酵工程和微生物育种的技术领域，特别涉及一种产果糖基转移酶的菌株及其制备方法。

背景技术

低聚果糖是果糖基经β（2→1）糖苷键连接而成的，聚合度为2～9的功能性低聚糖，属于食品原料。低聚果糖按结构分为蔗-果型低聚果糖和果-果型低聚果糖，其中蔗-果型低聚果糖主要由在蔗糖的果糖（F）残基上通过β（2→1）糖苷键连接1～4个果糖基（F）所形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）和蔗果六糖（GF5）的混合物。

果糖基转移酶能催化蔗糖生成蔗果低聚糖。其酶促反应机理最早由K.H.Jung等报道，当以蔗糖为底物时，最初只有蔗果三糖（GF2）和葡萄糖（G）生成：2GF→GF2+G，但随着反应进行下去，蔗果三糖（GF2）和蔗果四糖（GF3）也可以作为反应底物，其反应分别是：

2GF2→GF3+G；2GF3→GF4+G（GF4代表蔗果五糖）。

K.H.Jung等用一个反应方程式来描述FTase的酶促反应：

GFn+GFn→GFn+1+GFn-1。

以蔗糖为原料生产低聚果糖，果糖基转移酶是必需的催化剂。果糖基转移酶存在于植物以及微生物中。据文献报道，植物中的果糖基转移酶催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的果糖基转移酶比植物的催化活性高，且耐高温，可催化较高浓度的蔗糖进行转糖基反应，使用方便。

目前，在亚洲国家，工业上主要是采用微生物果糖基转移酶作用于蔗糖，进行分子内转移果糖基反应来生产低聚果糖。具有果糖基合成酶活性的微生物包括丝状真菌、酵母菌和细菌。与植物来源的果糖基转移酶不同，多数微生物来源的果糖基转移酶往往同时具有转果糖基活性（Ut）和水解活性（Uh），这些酶即可以转化蔗糖为低聚果糖，又可以催化水解蔗糖和低聚糖进行可逆反应，使低聚果糖降解。生产上常采用Ut/Uh值作为筛选高产果糖基转移酶微生物的依据。

研究表明，不同微生物来源的果糖基转移酶的相对分子质量、米氏常数、最适作用温度、最适pH及基质特异性方面存在一定差异，如来源于节杆菌（Arthrobacter sp.）的果糖基转移酶的分子质量为52kDa，最适温度为55℃，最适pH6.5，而来源于微杆菌（Microbacterium sp.）的果糖基转移酶的分子质量46kDa，最适温度48℃，最适pH6.0。而同一微生物所产果糖基转移酶在不同pH下，Ut/Uh值不同，如来源于黑曲霉的果糖基转移酶在pH4.0～5.0和pH8.0时低聚果糖产量最高，而在pH5.0～8.0范围内的水解酶活力最高。由此可见，自然进化的微生物酶并不能保证在每一种条件下都能进行有效地催化，常常受到包括对非天然底物的催化缓慢、酶的稳定性低、在反应相中活力低、复合酶中反应体系不可选（如果糖基转移酶）等因素的限制，难以满足实际生产的需要。为了修改酶的特性而更适用于实际生产，各研究者采取不同的技术方法、从不同角度对现有酶进行改造，以期获得比天然酶更高的活力或不同的催化活性，提高酶的应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种产果糖基转移酶的菌株。

本发明的另一目的在于提供所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种产果糖基转移酶的菌株，名称为米曲霉scut209（Aspergillus oryzae scut209），保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC NO:M2012106；

所述的产果糖基转移酶菌株的菌落形态为疏松放线状，中部突起，颜色初呈乳白色，后渐变为带黄褐色至淡绿褐色；

所述的产果糖基转移酶的菌株产果糖基转移酶产酶的能力达到34987U/g细胞，比出发菌株提高了78.5%，具备较高工业应用价值；

所述的产果糖基转移酶的菌株的制备方法，包含以下步骤：

（1）将出发菌株的孢子置于距离30w紫外灯25cm处，照射10min，红光下涂布于含质量百分比1.0%LiCl的PDA平板，30℃下培养2天，通过果糖基转移酶酶活力筛选比出发菌株活力高的菌株；

（2）收集步骤（1）筛选得到的果糖基转移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，分别制备得到原生质体；然后将6株菌株的原生质体分为两组，每组含3株菌株；将两组原生质体分别于80℃下热灭活10min和30W紫外灯下25cm处灭活10min；然后按照体积比1:1的比例混合；于30℃，在原生质体融合溶液的介导下原生质体融合5min后，用渗透压稳定剂稀释，将稀释液涂布于再生培养基，30℃下避光培养2d；将再生培养基平板上的再生单菌落分别接种于斜面培养基，30℃下培养，得到再生菌株孢子；

（3）将步骤（3）得到的再生菌株孢子接种于发酵培养基中，28～30℃、150～200r/min培养2天，通过检测果糖基转移酶酶活力进行筛选，得到F1代；

（4）将F1的果糖基转移酶酶活力最高的6株菌株任意的孢子，重复步骤（2）～（4），重复3次，得到产果糖基转移酶的菌株；

步骤（1）中所述的出发菌株为产果糖基转移酶的米曲霉，优选为米曲霉（Aspeigillus oryzae）BLB-21，菌种保藏号CMGCC No.2951；

步骤（1）中所述的出发菌株的孢子的浓度优选为10⁵～10⁷个/mL；

步骤（2）中所述的原生质体的制备步骤优选为：收集生长旺盛，孢子呈灰黑色的孢子，将其浓度调整为10⁵～10⁷个/mL；采用25mmol/Lβ-巯基乙醇+5mmol/LEDTA-2Na的溶液体系处理20min，离心；用无菌水洗涤离心收集的孢子，在0.6mol/L、pH7.0的山梨醇溶液+质量体积比2.5%溶菌酶+质量体积比2.0%蜗牛酶+质量体积比1.5%纤维素酶组成的复合酶体系中，于35～37℃下进行酶解4～6h，制得原生质体；

步骤（2）中所述的原生质体融合溶液的组成为：质量百分比30%的聚乙二醇6000、0.01mol/LCaCl₂和0.02mol/L MgCl₂；

步骤（2）中所述的渗透压稳定剂优选为0.6mol/L、pH7.0的山梨醇溶液；

步骤（2）中所述的再生培养基的组成优选为：质量百分比3.0%的白砂糖、质量百分比3.6%的营养肉汤和质量百分比2.0%的琼脂；

步骤（3）中所述的发酵培养基的组成优选为：质量百分比5.0%的白砂糖、质量百分比的豆粕粉、质量百分比0.3%的玉米粉和水。

本发明的原理：本发明通过基因组改组技术（Genome Shuffling）来改变菌株中果糖基转移酶的性质，以提高Ut/Uh比值，增加单位酶活力的低聚果糖产量。基因组改组技术是一门新兴的分子选育技术，它运用循环的基因组改组，在不需要弄清楚基因组序列数据或网络信息的情况下，即可以在全基因组的不同位置上同时发生改组，产出优势后代。基因组改组是整个基因组的定向进化，通过改组使分散的优点集中，是一个利用传统的育种方式结合了多个亲本的优点杂交过程。采用基因组改组技术进行菌种选育，筛选出最佳生产菌种，通过液态发酵培养后提取出果糖基转移酶，进而研究其最适反应温度、最适pH、最适底物浓度等，以求果糖基转移酶的最大产量化。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明所提供的产果糖基转移酶的菌株产果糖基转移酶产酶的能力达到34987U/g细胞，比出发菌株提高了78.5%，具备有工业应用的价值。

附图说明

图1是初始菌株的果糖基转移酶生产能力的HPLC测定图谱。

图2是紫外与氯化锂复合诱变菌株的果糖基转移酶酶活力检测结果图。

图3是原生质体融合第4代菌株的果糖基转移酶酶活力检测结果图。

图4是米曲霉（Aspergillus oryzae）scut209的菌落形态图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用的果糖基转移酶活力测定方法为：果糖基转移酶或产酶菌体作用于蔗糖，首先生成蔗果三糖（1-kestose）；蔗果三糖含量测定方法采用HPLC法，试验方法按GB/T23528-20096.5执行。

酶活力单位定义：在酶供应者标识的最佳酶化反应的条件下，将蔗糖转化为低聚果糖，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需酶量为一个酶活力单位（U）；

式中：

10----10%(w/w)蔗糖溶液中的蔗糖总量，g；

GF2----蔗果三糖的百分含量，%；

0.504----1μmol蔗果三糖=0.504mg；

t----反应时间，60min；

W----菌丝质量，g。

高效液相色谱(HPLC)检测参数为：Cosmosil色谱糖柱；流动相：乙腈-水(75%，v/y)；流速:1.0mL/min；示差折光检测器（RI）:Waters2410；监测器灵敏度:4；柱温:30℃；进样体积:10μL。

实施例1

（1）出发菌株孢子悬液的制备

实施方案以米曲霉（Aspeigillus oryzae）BLB-21（菌种保藏号CMGCCNo.2951；已在申请号为200910018452.1、名称为“一种米曲霉菌种及其制备高纯度低聚半乳糖的方法”中公开）为初始菌株。在本发明实验条件下，初始菌株经过三次斜面培养基（白砂糖5.0%w/w，豆粕粉2.0%w/w，玉米粉0.3%w/w，琼脂2.0%w/w；以下所用的斜面培养基同此处）活化培养后，接种于100ml发酵培养基（白砂糖5.0%w/w，豆粕粉2.0%w/w，玉米粉0.3%w/w以及水，下同）中，30℃下摇瓶培养2天后过滤取出，进行菌丝体的果糖基转移酶酶活力测定，其测定结果如表1和图1所示。

表1初始菌株果糖基转移酶生产能力HPLC测定的数据分析

用斜面培养基培养4天的斜面菌种中加入无菌水，将孢子洗下，经脱脂棉过滤后置于装有玻璃珠的小三角瓶中，振荡均匀，制备成单孢子悬液，用光学显微镜计数后调节孢子浓度为10⁶个/mL左右，备用。

（2）紫外线和氯化锂复合诱变

将50μL孢子悬液置于距离30w紫外灯25cm处，分别照射0min（对照）和10min，红光下分别涂布于含质量百分比1.0%LiCl的PDA平板，30℃下培养2d（天），记录菌落数及计算致死率，并进行果糖基转移酶酶活力检测。在获得的182株复合诱变突变株中，发生正突变的有52株（占28.6%），其中产酶能力较高的6株（UVLi6、UVLi17、UVLi27、UVLi53、UVLi78和UVLi81）突变菌株的酶活力检测结果如图2所示，其中的control为以出发菌株为对照。

（3）复合诱变株的原生质体制备

将步骤（2）筛选获得的产酶能力较高的6株突变菌株分为A（UVLi6、UVLi17和UVLi53）、B（UVLi27、UVLi78和UVLi81）两组，作为多亲株原生质体融合进行基因组改组的出发菌株。

选取生长旺盛，孢子呈灰黑色的新鲜斜面培养物（培养3d左右），分别洗脱后保持孢子相同浓度（10⁶个/ml左右）；采用25mmol/Lβ-巯基乙醇+5mmol/LEDTA-2Na体系处理20min。将离心收集的孢子用无菌水洗涤2次，在复合酶体系（首先配制0.6mol/L、pH7.0的山梨醇溶液，加入溶菌酶、蜗牛酶和纤维素酶，溶菌酶的终浓度为质量体积比2.5%，蜗牛酶的终浓度为质量体积比2.0%，纤维素酶的终浓度为质量体积比1.5%）中，于35℃下进行酶解5h，制得原生质体，备用。

（4）原生质体双灭活处理及多亲株融合

将步骤（3）所制得的A（UVLi6、UVLi17和UVLi53）、B（UVLi27、UVLi78和UVLi81）两组原生质体浓度均保持在10⁷个/ml左右，分别在80℃下热灭活10min和30W紫外灯下25cm处灭活10min。然后按照体积比1:1的比例混合，在原生质体融合溶液（浓度为质量百分比30%的聚乙二醇6000+0.01mol/LCaCl₂+0.02mol/L MgCl₂，30℃）的介导下，多亲株原生质体融合作用5min后，用渗透压稳定剂（0.6mol/L、pH7.0的山梨醇）稀释后，取100μl涂布于再生培养基（白砂糖3.0%（w/w），营养肉汤3.6%（w/w），琼脂2.0%（w/w））平板，30℃下避光培养2d。将再生培养基平板上所有再生单菌落（126株）接种于斜面培养基，每个单菌落接种一支斜面，30℃下培养，编号备用。

（5）高产果糖基转移酶突变菌株的筛选

挑取由步骤（4）获得的突变株单菌落接种于30ml发酵培养基中，于30℃、200r/min下恒温摇床中培养2天，收集菌体称重，并进行果糖基转移酶酶活力测定。

选取由多亲株原生质体融合获得126株单菌落中产果糖基转移酶酶活力最高的6株（F1-15、F1-23、F1-38、F1-46、F1-97、和F1-108）突变体构成了F1代，然后再次重复步骤（3）、（4）和（5）的操作，F1代被分成A（F1-15、F1-23和F1-38）和B（F1-46、F1-97和F1-108）两组，再次被制备成为原生质体，用同样的方法再进行融合再生。这一过程经过四次的重复操作，得到后代突变株分别标记为F2、F3、F4等。经过四次多亲株原生质体的递进融合，经过酶活力与生物量的重复筛选和产酶能力测定，结果如图3（其中的control为以出发菌株为对照）所示。最终筛选出果糖基转移酶产酶能力比出发菌株提高78.5%的突变株F4-102。将其保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，命名为米曲霉scut209（Aspergillus oryzae scut209），保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC NO:M2012106。其菌落形态为疏松放线状，中部突起，颜色初为乳白色，后渐变为带黄褐色至淡绿褐色，如图4所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种产果糖基转移酶的菌株，其特征在于：名称为米曲霉scut209（Aspergillus oryzae scut209），保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC NO: M2012106。