CN101886069A - 利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法，属于生物技术制菌领域。该方法是利用产色酵母和产酒酵母种属的差异，利用双热灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有来源于不同亲本的产色产酒的融合子菌株。其工艺步骤包括两亲本菌体和两亲本原生质体的制备；两亲本原生质体融合；融合子的检出与挑选和融合子发酵性能测试及复筛。本发明方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高；其获得的酵母融合菌株，对于酒精发酵及色素积累过程的代谢调控理论研究及提高酒精发酵生产的管理控制效率都具有积极意义；同时也为酒精工业及色素生产的菌种选育提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种原生质体融合技术，特别涉及一种利用双热灭活亲本并通过原生质体融合技术构建同时具有酒精发酵与色素积累能力的酵母菌株的方法，属于生物技术制菌领域。
背景技术
酒精是重要的有机溶剂及燃料。在世界经济高速发展、能源危机日益加深的今天，酒精作为一种可再生能源受到越来越多的关注。目前，燃料酒精，尤其是以纤维素水解产物作为原料的燃料酒精生产，已成为世界范围内的研究热点。
与此同时，一些酵母菌体具有一定的色素积累能力，如类胡萝卜素、黄酮类色素等的积累。然而，多数情况下这些酵母菌体的色素含量较低，如果仅以这些酵母菌体生产色素则成本太高，缺乏工业应用价值。一般而言，产色酵母多分布在红酵母属(Rhodotorula)、发夫酵母属(Phaffia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、瓶型酵母属(Pityrosporum)以及黑酵母属(Aureobasidium)等数属，不具备产乙醇的能力；而产酒酵母分布在酿酒酵母属(Saccharomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、翰逊酵母属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)等数属，具备将葡萄糖、麦芽糖等小分子糖类物质转变为乙醇的能力。可见，通过微生物育种的方式，获得同时具有产色素和产乙醇的酵母菌株，意义极大。
常用的微生物育种技术主要有自然分离、诱变筛选、细胞结合、原生质体融合、基因导入以及基因破坏等方式。其中，原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。这种育种方式可以打破微生物的种界界限，实现远缘菌株的基因重组，使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组的机会，从而把更多优良性状组合到一个单一菌株中。
原生质体融合育种工作在酵母菌种中已有广泛开展，传统方法采用抗药性标记或营养缺陷标记亲本菌株，以便检出融合子菌株，其工作相当繁琐，且这些遗传标记往往会干扰菌株的正常代谢，影响菌株的一些重要性状[刘玲，叶博，刘长江.原生质体融合亲本菌株抗药性标记的筛选[J].江苏农业科学，2007(3)：225-227.]；[谭悠久，谭红等.以抗生素抗性为选择标记的毛壳菌种间原生质体融合[J].华东理工大学学报(自然科学版)，2010，36(1)：36-41.]；以及[B.S.Gunashree，G.Venkateswaran.Enhanced phytaseproduction through interspecific protoplast fusion of Aspergillus niger CFR 335 andAspergillus ficuum SGA 01 auxotrophic mutants[J].Enzyme and Microbial Technology 46(2010)562-567.]。目前有较多采用的双亲菌株不同方式灭活处理，如紫外线灭活、热灭活，由于菌株失活机制的不同，根据“致死损伤互补”原则，灭活细胞通过双亲本原生质体融合而再生，可生长成具有双亲性状的机能完整的融合子菌株。在此基础上，经研究实验，提出一种更为简单的、利用双热灭活亲本并通过原生质体融合技术构建同时具有酒精发酵与色素积累能力的酵母菌株的方法，这正是本发明的任务所在。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述传统方法中所存在的不足，基于灭活两亲本细胞通过原生质体融合而再生成融合子菌株基础上，提出一种以酒精酵母和产色酵母菌株为亲本，利用双热灭活亲本并通过原生质体融合构建同时具有乙醇发酵与色素积累能力的酵母菌株的方法，通过该方法不仅可获得同时具有乙醇能力和色素积累能力的新型酵母菌株；且方法简单，过程易实现；还能减少乙醇与色素同时生产的设备投入及生产成本。
本发明的目的是由以下措施构成的技术方案来实现的。
本发明的利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法，依次包括以下工艺步骤：
(1)两亲本菌体的制备
分别将具有产乙醇和产色素能力的两亲本酵母细胞接种于酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂培养基即YPD固体培养基斜面上，待生长时间18～24小时后，刮取斜面上生长的酵母细胞，制得细胞浓度为107～109个/mL的菌悬液，吸取200μL菌悬液，接种于经115～125℃和15～25分钟灭菌的YPD液体培养基的瓶中，置于28～32℃的恒温摇床中培养10～18小时，制得两亲本菌体；
(2)两亲本原生质体的制备
将步骤(1)的两亲本菌体培养液以浓度为0.4～0.9mol/L NaCl离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞稀释到浓度为106～107个/mL，取10mL稀释后的菌悬液，用4℃冷冻离心机离心2～4分钟，再加入5mL浓度为8～12mg/mL的蜗牛酶液酶解，轻摇使离心后的菌体和酶液充分混合，再置于温度28～32℃、转速150～200r/min的恒温摇床中，酶解90～150分钟；然后将酶解后的酵母细胞悬液置于4℃冷冻离心机中用0.4～0.9mol/LNaCl溶液洗涤两次，离心洗涤条件为2200r/min、4分钟，再将其悬于5mL，0.4～0.9mol/LNaCl溶液中，即制得两亲本原生质体；
(3)两亲本原生质体融合
于65～95℃下分别对产酒酵母和产色酵母的原生质体灭活15～45分钟后，将两亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，于4℃冷冻离心机中2200r/min离心4分钟，然后加入配比为20～40％PEG6000、0.01mol/L CaCl2、0.4～0.9mol/LNaCl的融合剂，混匀后放入恒温培养箱中，25～35℃保温，静置30～45分钟以待融合；取出融合后酵母原生质体悬液，放入冷冻离心机中，在2200r/min、4分钟条件下用0.4～0.9mol/L NaCl溶液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生质体重悬于0.4～0.9mol/L NaCl溶液中，得到融合后的原生质体；
(4)融合子的检出与挑选
对融合后的原生质体进行初次筛选，先将其接种于具有再生培养基的平皿中，培养24～48小时，生长出融合子菌落；从生长的融合子菌落中挑选出菌落颜色接近粉红色的菌落；然后用划线分离法纯化挑选出融合子菌株，再将纯化后的融合子菌株接种于固体YPD培养基斜面，25～32℃培养，培养24h后，每隔约8～12h观察一次，挑选出具显著酒香味的斜面菌株，进行再次划线分离纯化，通过传代培养，以获得具有明显酒香味的稳定的融合子菌株，以试管斜面保存；
(5)融合子发酵性能测试及复筛
将初筛的融合子，通过杜氏管发酵实验对融合子的发酵能力强弱进行测定，实验时每支试管装115～125℃、15～25分钟灭菌的YPD液体培养基10mL，其中每支试管分别接入一接种环相应菌种，每3h观察1次，记录杜氏管中气泡产生情况，选出产生气泡多的融合子，即发酵性能好的融合子；分别将发酵性能好的融合子斜面菌苔2-3环接种于115～125℃、15～25分钟灭菌的麦芽汁发酵培养基中，25～32℃恒温振荡培养发酵3～7天，待发酵液有明显酒味后，取样常压蒸馏，并用酒精计测定蒸馏液的酒精度数，选出产乙醇能力强的融合子菌株。
上述技术方案中，所述蜗牛酶液以浓度为0.2mol/L、pH值为6.2的磷酸缓冲溶液配制，该磷酸缓冲溶液中含有0.4～0.9mol/L NH4Cl。
上述技术方案中，所述蜗牛酶液的使用浓度为9mg/mL，酶解时间为120分钟。
上述技术方案中，所述融合剂融合时，应保证亲本的原生质体细胞浓度为106～107个/mL，若细胞浓度小于此范围，则离心浓缩；若细胞浓度大于此范围，则加入渗稳溶液稀释。
上述技术方案中，所述的融合剂配比为30％PEG6000、0.01mol/L CaCl2、0.6mol/LNaCl。
本发明与现有技术相比进一步具有如下优点及有益技术效果：
1、本发明方法利用双亲本灭活原生质体融合手段选育同时具备产色素和产乙醇能力的新菌株，其方法简单，过程易实现。
2、采用本发明方法构建具备产色素和产乙醇能力的融合子菌株，可以实现乙醇与色素的同时生产，将原有的两套工艺合二为一，从而减少设备投入及生产成本，有利于经济效益的提高。
3、本发明方法通过产酒酵母与产色酵母的原生质体融合，将颜色这一简单直观的表征引入酒精发酵过程，有利于工艺控制及管理。
4、采用本发明方法构建具备产色素和产乙醇能力的融合子菌株，有利于通过发酵工艺及产物生成动力学的分析，并从理论上探讨酵母菌株乙醇与色素生物合成代谢的规律。
附图说明
图1为本发明方法所构建的融合子KP-1菌株的发酵产气状态；
图2为本发明方法所构建的融合子LP-23菌株的斜面培养外观状态；
图3为本发明方法所构建的融合子KP-8-2菌株的液体培养外观状态。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明作进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
本发明的实例中使用的菌株有以下三种：实验室编号PY-1的菌株为产色酵母，发酵力微弱，不产乙醇，培养菌体呈粉红色，用作亲本A；实验室编号LII-E12和K211的菌株为产酒酵母，发酵力强，培养菌体呈乳白色，用作亲本B；
所使用的培养基有以下三种：
YPD固体培养基为1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5～2％琼脂；
麦芽汁发酵培养基为麦芽汁2％，蔗糖10％，MgSO4·7H2O 0.5％，NH4·NO30.5％，KH2PO40.5％，pH自然；
所使用的再生培养基：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，0.6mmol/LNaCl，1.5～2％琼脂。
本发明实施例依次按照下面的操作步骤构建所述融合子菌株。
实施例1
(1)两亲本菌体的制备
分别将产酒酵母K211菌株与产色酵母PY-1菌株接种于酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂培养基即YPD固体培养基斜面上，待生长时间24小时后，刮取斜面上生长的酵母细胞，制得细胞浓度为5×108个/mL的菌悬液，吸取200μL菌悬液，接种于盛有30mL，经123℃、15分钟灭菌的YPD液体培养基的三角瓶中，于30℃、150r/min的恒温摇床中培养18小时，制得两亲本菌体；
(2)两亲本原生质体的制备
将步骤(1)的两亲本菌体培养液以浓度为0.6mol/L NaCl溶液在4℃冷冻离心机中离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞稀释到浓度为1×107个/mL，取10mL稀释后的菌悬液，于4℃冷冻离心机中2200r/min离心4分钟，然后将离心后的产酒酵母K211菌株与产色酵母PY-1菌株细胞中分别加入5mL浓度为8mg/mL的蜗牛酶液，该蜗牛酶液以含0.6mol/L NH4Cl的0.2mol/L、pH6.2磷酸缓冲溶液配制，轻摇使细胞与酶液充分混合，置于温度32℃、转速为200r/min的恒温摇床中，酶解150分钟；
酶解完成的酵母细胞悬液置于4℃冷冻离心机中用0.6mol/L NaCl溶液离心洗涤两次，离心条件为2200r/min、4分钟，离心完成后将其悬于5mL 0.6mol/L NaCl溶液中，即制得两亲本原生质体；
(3)亲本原生质体融合
于90℃下对酒精酵母K211的原生质体灭活15分钟，95℃下对产色酵母PY-1的原生质体灭活15分钟，两酵母菌原生质体致死率达100％，将两灭活亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，于4℃冷冻离心机2200r/min离心4分钟，然后加入配比为20％PEG6000、0.01mol/L CaCl2、0.4mol/L NaCl的融合剂，融合前调整原生质体细胞悬浮液浓度达1×106个/mL，混合好后放入恒温培养箱中，25℃保温静置45分钟，取出融合后酵母原生质体悬液，放入4℃冷冻离心机中，2200r/min、4分钟条件下用0.6mol/LNaCl溶液离心洗涤两次，以洗净融合剂，将洗涤完成的原生质体重悬于0.6mol/LNaCl溶液中，可获得融合后的原生质体；
(4)融合子的检出
以菌落颜色为第一次的筛选条件，先将融合后的原生质体接种于具有再生培养基的平皿中，培养48小时，从生长的融合子菌落中挑选出菌落颜色接近粉红色的菌落；用划线分离法纯化挑选出的融合子菌株，再将纯化后的融合子菌株接种于固体YPD培养基斜面，32℃培养，于24小时后每隔8小时观察一次，挑选出具显著酒香味的斜面菌株，进行4次传代培养，从中再一次挑选出能明显保持酒味和香味的菌株作为融合子，以试管斜面保存；
(5)融合子发酵性能测试及复筛
初筛出融合子后，通过杜氏管发酵实验对融合子的发酵能力强弱进行测定，实验时每支试管装123℃、15分钟灭菌的YPD液体培养基10mL，其中每支试管分别接入一接种环相应菌种，每3小时观察1次，记录杜氏管中气泡产生情况，选出产生气泡最多，即发酵能力相对最强的融合子编号为KP-1菌株，如图1所示，产色酵母亲本A基本上无气泡生成，发酵能力微弱，产酒酵母亲本B的杜氏管中充满气泡，发酵性能强，融合子1-5为融合子KP-1菌株的平行实验，产气量与亲本B相当，具有良好的发酵能力；
将KP-1融合子菌株斜面菌苔2-3环接种于123℃、15分钟灭菌的麦芽汁发酵培养基中，32℃恒温振荡培养发酵3天，发酵液呈浅粉红色，色素生成情况良好，同时发酵液酒味明显，发酵液常压蒸馏后，可检测到0.5％以上乙醇含量，即有乙醇生成能力。
实施例2
(1)亲本菌体的制备
分别将产酒酵母LII-E12菌株与产色酵母PY-1菌株接种于YPD固体培养基斜面上，待生长时间18小时后，刮取斜面上生长的酵母细胞，制得细胞浓度为5×107个/mL的菌悬液，吸取200μL菌悬液，接种于盛有30mL经121℃、15分钟灭菌的YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、150r/min的恒温摇床中培养13小时，制得两亲本菌体；
(2)亲本原生质体的制备
将步骤(1)的两亲本菌体培养液以浓度为0.6mol/LNaCl在4℃冷冻离心机中离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞稀释到浓度为1×106个/mL，取10mL稀释后的菌悬液，于4℃冷冻离心机中2200r/min离心4分钟，然后向离心后的产酒酵母LII-E12菌株与产色酵母PY-1菌株细胞中分别加入5mL浓度为12mg/mL的蜗牛酶液，该蜗牛酶液以含0.6mol/L NH4Cl的0.2mol/L、pH6.2磷酸缓冲溶液配制，轻摇使细胞与酶液充分混合，置于恒温摇床中，200r/min，28℃酶解90分钟；
酶解后的酵母细胞悬液置于4℃冷冻离心机中用0.6mol/LNaCl溶液离心洗涤两次，离心条件为2200r/min、4分钟，离心完成后将其悬于5mL 0.6mol/L NaCl溶液中，即制得两亲本原生质体；
(3)两亲本原生质体融合
于80℃下对产酒酵母LII-E12的原生质体灭活25分钟，85℃下对产色酵母PY-1的原生质体灭活35分钟，此条件下两酵母菌的原生质体致死率达100％，两灭活亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，4℃冷冻离心机2200r/min离心4分钟，然后加入配比为40％PEG6000、0.01mol/LCaCl2、0.9mol/L NaCl的融合剂，融合前调整原生质体细胞悬液浓度达1×107个/mL，混合好后放入恒温培养箱中，35℃保温静置30分钟；取出融合后的酵母原生质体悬液，放入4℃冷冻离心机中，用0.6mol/LNaCl溶液2200r/min、4分钟离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤完成的原生质体重新悬浮于0.6mol/LNaCl溶液中，得到融合后的原生质体；
(4)融合子的检出
以菌落颜色为第一次的筛选条件，先将融合后的原生质体分别接种于具有再生培养基的平皿中，培养40小时，从生长的融合子菌落中挑选出菌落颜色接近粉红色的菌落；用划线分离法纯化挑选出的融合子菌株，再将纯化后的融合子菌株接种于固体YPD培养基斜面，25℃培养，于24小时后每隔12小时观察一次，挑选出具显著酒香味的斜面菌株，进行3次传代培养，从中再一次挑选出能明显保持酒味和香味的菌株作为融合子，以试管斜面保存；
(5)融合子发酵性能测试及复筛
初筛出融合子后，通过杜氏管发酵实验对融合子的发酵能力强弱进行测定，实验时每支试管装121℃、15分钟灭菌的YPD液体培养基10mL，其中每支试管分别接入一接种环相应菌种，每3小时观察1次，记录杜氏管中气泡产生情况，选出产生气泡最多，即发酵能力相对较强的融合子LP-23菌株，其与产色来源亲本菌株A颜色类似，为粉红色，但相对于产色酵母亲本菌株A颜色略浅，各菌株颜色如图2所示；
将LP-23融合子菌株斜面菌苔2-3环接种于121℃、15分钟灭菌的麦芽汁发酵培养基中，25℃恒温振荡培养发酵7天，发酵液呈浅粉红色，酒味明显，经蒸馏检测乙醇含量，LP-23融合子菌株有1.7％的乙醇生成能力。
实施例3
(1)亲本菌体的制备
分别将产酒酵母K211菌株与产色酵母PY-1菌株接种于YPD固体培养基斜面上，待生长时间20小时后，刮取斜面上生长的酵母细胞，制得细胞浓度为1×108个/mL的菌悬液，吸取200μL菌悬液，接种于盛有30mL经118℃、20分钟灭菌的YPD液体培养基的三角瓶中，32℃，150r/min的恒温摇床中培养15小时，制得两亲本菌体；
(2)亲本原生质体的制备
将步骤(1)的两亲本菌体培养液以浓度为0.6mol/LNaCl在4℃冷冻离心机中离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞稀释到浓度为5×106个/mL，取10mL稀释后的菌悬液，于4℃冷冻离心机中2200r/min离心4分钟，然后离心后的产酒酵母K211菌株与产色酵母PY-1菌株细胞中分别加入5mL浓度为9mg/mL的蜗牛酶液，该蜗牛酶液以含0.6mol/L NH4Cl的0.2mol/L、pH6.2磷酸缓冲溶液配制，轻摇使细胞与酶液充分混合，置于恒温摇床中，200r/min，30℃酶解120分钟；
酶解完成的酵母细胞悬液置于4℃冷冻离心机中用0.6mol/L NaCl溶液离心洗涤两次，离心条件为2200r/min、4分钟，离心完成后将其悬于5mL 0.6mol/L NaCl溶液中，即制得两亲本原生质体；
(3)亲本原生质体融合
于80℃下对产酒酵母K211的原生质体灭活30分钟，85℃下对产色酵母PY-1的原生质体灭活35分钟，此条件下两酵母菌的原生质体致死率达100％，两灭活亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，4℃冷冻离心机2200r/min离心4分钟，然后加入配比为30％PEG6000、0.01mol/LCaCl2、0.6mol/L NaCl的融合剂，融合前调整原生质体细胞悬液浓度达5×106个/mL，混合好后放入恒温培养箱中，30℃保温静置35分钟；取出融合后的酵母原生质体悬液，放入4℃冷冻离心机中，用0.6mol/L NaCl溶液2200r/min、4分钟离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤完成的原生质体重新悬浮于0.6mol/LNaCl溶液中，得到融合后的原生质体；
(4)融合子的检出
以菌落颜色为第一次的筛选条件，先将融合子分别接种于具有再生培养基的平皿中，培养36小时，从生长的融合子菌落中挑选出菌落颜色接近粉红色的菌落；用划线分离法纯化挑选出的融合子菌株，再将纯化后的融合子菌株接种于固体YPD培养基斜面，30℃培养，于24小时后每隔12小时观察一次，挑选出具显著酒香味的斜面菌株，进行5次传代培养，从中再一次挑选出能明显保持酒味和香味的菌株作为融合子，以试管斜面保存；
(5)融合子发酵性能测试及复筛
初筛出融合子后，通过杜氏管发酵实验对融合子的发酵能力强弱进行测定，实验时每支试管装118℃、20分钟灭菌的YPD液体培养基10mL，其中每支试管分别接入一接种环相应菌种，每3小时观察1次，记录杜氏管中气泡产生情况，筛选出发酵能力相对最强的融合子KP-8-2菌株，作为同时具有产酒精和产色素能力的融合子酵母菌株；
将KP-8-2融合子菌株接种麦芽汁发酵培养基中，25℃恒温振荡培养发酵3天。发酵液呈浅粉红色，如图3所示，并有明显酒味，取样蒸馏，检测酒精度数达到2.3％。
产乙醇产色素融合子菌株的获得及其育种方法的实现，为进一步优化产乙醇发酵工艺以及进行复合诱变育种，奠定了菌种资源基础。
本发明将产乙醇与产色素的多种性状结合，构建同时具备产色素及产乙醇能力的新菌株，进一步有以下几方面的意义：(1)由于在发酵过程中有色素生成，可以通过颜色的变化来监控酒精发酵过程；(2)很多色素在乙醇中具有较好的溶解性，因此在酒精发酵生产的同时，有可能通过对酵母细胞中色素的溶出而减弱色素合成的反馈抑制效应，从而提高色素的生产能力；(3)由于色素不挥发的特性，发酵过程结束后，可在蒸馏获得乙醇的同时得到色素；(4)有可能将产色产乙醇菌株应用于酿酒产业中以提高产品的保健价值。因此，构建同时具有产乙醇和色素积累能力的酵母菌株，不仅有利于提高发酵过程的监控水平和生产效率，同时也可以降低色素生产成本，为乙醇及色素生产提供新途径。
Claims (5)
1.一种利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法，其特征在于依次包括以下工艺步骤：
(1)两亲本菌体的制备
分别将具有产乙醇和产色素能力的两亲本酵母细胞接种于酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂培养基即YPD固体培养基斜面上，待生长时间18～24小时后，刮取斜面上生长的酵母细胞，制得细胞浓度为107～109个/mL的菌悬液，吸取200μL菌悬液，接种于经115～125℃和15～25分钟灭菌的YPD液体培养基的瓶中，置于28～32℃的恒温摇床中培养10～18小时，制得两亲本菌体；
(2)两亲本原生质体的制备
将步骤(1)的两亲本菌体培养液以浓度为0.4～0.9mol/LNaCl离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞稀释到浓度为106～107个/mL，取10mL稀释后的菌悬液，用4℃冷冻离心机离心2～4分钟，再加入5mL浓度为8～12mg/mL的蜗牛酶液酶解，轻摇使离心后的菌体和酶液充分混合，再置于温度28～32℃、转速150～200r/min的恒温摇床中，酶解90～150分钟；然后将酶解后的酵母细胞悬液置于4℃冷冻离心机中用0.4～0.9mol/LNaCl溶液洗涤两次，离心洗涤条件为2200r/min、4分钟，再将其悬于5mL，0.4～0.9mol/LNaCl溶液中，即制得两亲本原生质体；
(3)两亲本原生质体融合
于65～95℃下分别对产酒酵母和产色酵母的原生质体灭活15～45分钟后，将两亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，于4℃冷冻离心机中2200r/min离心4分钟，然后加入配比为20～40％PEG6000、0.01mol/L CaCl2、0.4～0.9mol/LNaCl的融合剂，混匀后放入恒温培养箱中，25～35℃保温，静置30～45分钟以待融合；取出融合后酵母原生质体悬液，放入冷冻离心机中，在2200r/min、4分钟条件下用0.4～0.9mol/LNaCl溶液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生质体重悬于0.4～0.9mol/LNaCl溶液中，得到融合后的原生质体；
(4)融合子的检出与挑选
对融合后的原生质体进行初次筛选，先将其接种于具有再生培养基的平皿中，培养24～48小时，生长出融合子菌落；从生长的融合子菌落中挑选出菌落颜色接近粉红色的菌落；然后用划线分离法纯化挑选出融合子菌株，再将纯化后的融合子菌株接种于固体YPD培养基斜面，25～32℃培养，培养24h后，每隔约8～12h观察一次，挑选出具显著酒香味的斜面菌株，进行再次划线分离纯化，通过传代培养，以获得具有明显酒香味的稳定的融合子菌株，以试管斜面保存；
(5)融合子发酵性能测试及复筛
将初筛的融合子，通过杜氏管发酵实验对融合子的发酵能力强弱进行测定，实验时每支试管装115～125℃、15～25分钟灭菌的YPD液体培养基10mL，其中每支试管分别接入一接种环相应菌种，每3h观察1次，记录杜氏管中气泡产生情况，选出产生气泡多的融合子，即发酵性能好的融合子；分别将发酵性能好的融合子斜面菌苔2-3环接种于115～125℃、15～25分钟灭菌的麦芽汁发酵培养基中，25～32℃恒温振荡培养发酵3～7天，待发酵液有明显酒味后，取样常压蒸馏，并用酒精计测定蒸馏液的酒精度数，选出产乙醇能力强的融合子菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蜗牛酶液以浓度为0.2mol/L、pH值为6.2的磷酸缓冲溶液配制，该磷酸缓冲溶液中含有0.4～0.9mol/L NH4Cl。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述蜗牛酶液的使用浓度为9mg/mL，酶解时间为120分钟。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的融合剂融合时，应保证亲本的原生质体细胞浓度为106～107个/mL，若细胞浓度小于此范围，则离心浓缩；若细胞浓度大于此范围，则加入渗稳溶液稀释。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于所述的融合剂配比为30％PEG6000、0.01mol/L CaCl2、0.6mol/L NaCl。
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