CN105112306B - 一株米曲霉及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株米曲霉及其培养方法与应用。米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY‑03，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9450。本发明还涉及该米曲霉的培养方法与应用。本发明所述米曲霉BYCY‑03，酶活达到1200U/ml，相对于传统β‑果糖基转移酶活力提高40％以上，同时还具有耐葡萄糖的特性，应用于低聚果糖生产中可大大提高蔗糖转化成低聚果糖的能力，显著降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一株米曲霉及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
米曲霉属半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。
低聚果糖是指2～5个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基→果糖连接键为主体骨架连结形成的碳水化合物。低聚果糖是一种天然活性物质。甜度为蔗糖的0.3-0.6倍。既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味清爽。是具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂——促生物质。
当前国内外生产低聚果糖的方法主要是菌种发酵法和酶转化法，菌种发酵法是指用产β-果糖基转移酶的菌种直接发酵蔗糖溶液生产低聚果糖，该方法的缺点是生产的低聚果糖纯度不高，后续提纯困难。酶转化法是指先培养产酶菌种，然后提取β-果糖基转移酶进行酶转化生产低聚果糖，该方法目前存在的问题是提取的酶活较低，转化过程中受到反应中高含量的副产物葡萄糖的影响造成转化率低，生产成本高居不下。
因此，寻找一种高酶活性的β-果糖基转移酶成为解决低聚果糖生产瓶颈的关键。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株米曲霉及其培养方法与应用。
本发明另一个目的是提供该米曲霉菌株在生产低聚果糖中的应用，由于该菌株所产β-果糖基转移酶具有高转化蔗糖成低聚果糖的能力，可显著降低生产成本。
本发明的技术方案如下：
一株米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9450，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所述米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03的原始菌株分离于山东德州百龙创园低聚果糖生产车间附近的土壤，并经过反复多次诱变、筛选，获得。
该菌株生长较快，质地疏松。初呈白黄色，后转黄褐色，分生孢子头放射状，一直径180～320μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。该菌株可高产β-果糖基转移酶，经培养发酵后该酶酶活可达到1200U/ml，相对于传统β-果糖基转移酶活力提高40％以上，同时还具有耐葡萄糖的特性，应用于低聚果糖生产中可大大提高蔗糖转化成低聚果糖的能力，显著降低生产成本。
上述米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03的培养方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于固体培养基中，在28～35℃的条件下，活化培养20～30h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在28～35℃的条件下，增殖培养20～30h，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在28～35℃，扩大培养20～35h，即得菌体发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：
硝酸铵0.2％；硫酸铵0.1％；磷酸二氢钾0.1％；尿素0.05％；蛋白胨1％；蔗糖2％；葡萄糖5％，余量水，pH为4.5～6.5；
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖5％，葡萄糖5％，蛋白胨1％，硫酸铵0.1％；磷酸二氢钾0.1％；余量水。
所述步骤(1)中的固体培养基为本领域常规固体培养基，如PDA培养基等。
上述米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03在制备β-果糖基转移酶固定化酶中的应用。
上述应用，步骤如下：
(a)取上述制备的菌体发酵液经过滤收集菌丝体；
(b)将收集到得菌丝体加入预冷的磷酸缓冲液然后与经过预处理吸附剂进行反应，反应时间为10～24h，使菌丝体固定在吸附剂表面，制得β-果糖基转移酶固定化酶。
根据本发明优选的，所述步骤(a)中，过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3～0.5MPa，流速为5～10m3/h。
根据本发明优选的，所述步骤(b)中，吸附剂选自氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷或纤维素之一。
上述制备的β-果糖基转移酶固定化酶在制备低聚果糖中的应用。
有益效果
1.本发明从土壤中分离出米曲霉菌种，在经过紫外诱变、亚硝基胍诱变处理等诱变处理技术，最后获得高产β-果糖基转移酶的高产菌株命名为BYCY-03，其酶活达到1200U/ml，相对于传统β-果糖基转移酶活力提高40％以上，同时还具有耐葡萄糖的特性，应用于低聚果糖生产中可大大提高蔗糖转化成低聚果糖的能力，显著降低生产成本。
2.本发明摈弃了传统的米曲霉菌种直接发酵蔗糖溶液生产低聚果糖的方法，通过制备获得β-果糖基转移酶固定化酶，提高了酶的使用效率，极大地降低后续低聚果糖提纯的难度和成本，并显著提高低聚果糖成品的质量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一株米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9450，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03的筛选过程如下：
(1)富集培养
选取山东德州百龙创园低聚果糖生产车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离地面5～15cm处的土壤约10g，用无菌水稀释10倍，加入PDA培养基进行富集培养，培养基成分：
马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、去离子水1000毫升、硝酸铵0.2％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.1％；PH6.5～7.0。
制作方法如下
200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加1～10g琼脂，硝酸铵0.2％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.1％继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足去离子水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，(121℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
(2)纯种分离
采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤(1)中富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，28～35℃培养30h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，分别编号01～10。
将01～10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养28～35℃培养30h，对01～10摇瓶发酵液β-果糖基转移酶酶活进行测定，03号摇瓶酶活最高，达到805U/ml。
平板培养基成分：
马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、去离子水1000毫升、硝酸铵0.2％；硫酸铵0.1％；磷酸氢二钾0.1％；PH6.5～7.0。
摇瓶培养基成分：
100ml豆饼浸出汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。
所述豆饼浸出汁制作方法：100克豆饼，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3～4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。
(3)诱变筛选
对03号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用20W紫外线灯15cm照射，照射时间为180s，得到的高产菌种再进行离子注入诱变处理，最终得到高产β-果糖基转移酶的高产菌株命名为BYCY-03，其酶活达到1800U/ml。
酶活测定用pH 5.5、50mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制，10％(w/v，单位g/ml)的蔗糖溶液作底物，加入适量的酶液(控制三糖最终生成量10％)，40℃水浴振荡反应40min后,立即于100℃沸水浴中15min，终止反应，离心，取上清液测定各糖组分含量。
酶活定义如下：在上述反应条件下，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需酶量为转移酶1个活力单位(U)。
实施例2
实施例1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03的培养方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于PDA培养基中，在30℃的条件下，活化培养30h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30℃的条件下，增殖培养30h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下：
100ml豆饼浸出汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH
所述豆饼浸出汁制作方法：100克豆饼，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3～4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1％的比例接种于发酵培养基中，在30℃，扩大培养35h，即得菌体发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，麸皮2％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，余量水。
经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为8.0×109cfu/ml。
实施例3
实施例1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03的培养方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于PDA培养基中，在35℃的条件下，活化培养20h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在35℃的条件下，增殖培养20h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下：
100ml豆饼浸出汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH
所述豆饼浸出汁制作方法：100克豆饼，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比10％的比例接种于发酵培养基中，在38℃，扩大培养20h，即得菌体发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，麸皮2％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，余量水。
经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为7.0×109cfu/ml。
实施例4
实施例1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03的培养方法，步骤如下：
(1)取米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03接种于PDA培养基中，在32℃的条件下，活化培养25h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在32℃的条件下，增殖培养25h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下：
100ml豆饼浸出汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。
所述豆饼浸出汁制作方法：100克豆饼，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比10％的比例接种于发酵培养基中，在38℃，扩大培养20h，即得菌体发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，麸皮2％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，余量水。
经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为7.5×109cfu/ml。
实施例5
米曲霉(Aspergillus oryzae)BYCY-03在制备β-果糖基转移酶固定化酶中的应用，步骤如下：
(a)取实施例2制备的菌体发酵液经板框式压滤机过滤，工作压力为0.3～0.5MPa，流速为5～10m3/h，收集菌丝体；
(b)将收集到得菌丝体加入预冷的磷酸缓冲液然后与经过预处理吸附剂进行反应，反应时间为10～24h，使菌丝体固定在硅藻土表面，制得β-果糖基转移酶固定化酶。
实施例6
β-果糖基转移酶固定化酶在制备低聚果糖中的应用，步骤如下：
(i)配制质量浓度为40％的蔗糖溶液；
(ii)向步骤(i)制得的蔗糖溶液中加入β-果糖基转移酶固定化酶，保温反应后12h后，制得低聚果糖粗溶液；
(iii)将步骤(ii)制得低聚果糖粗溶液经活性炭脱色，活性炭添加量为0.1wt％，脱色时间为1.5h，然后经板框过滤，再经离交，得到透光率为85％的糖液进行色谱分离，运行压力0.2MPa，温度60℃，水耗比1:1.2，每小时进料1.8m3，收集蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，制得总糖中低聚果糖含量不小于95wt％的低聚果糖糖液。
Claims (9)
1.一株米曲霉（Aspergillus oryzae）BYCY-03，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9450，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
2.如权利要求1所述米曲霉（Aspergillus oryzae）BYCY-03的培养方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取米曲霉（Aspergillus oryzae）BYCY-03接种于固体培养基中，在28～35℃的条件下，活化培养20～30h，制得活化菌株；
（2）取步骤（1）制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在28～35℃的条件下，增殖培养20～30h，制得种子液；
（3）取步骤（2）制得的种子液，按体积比1～10%的比例接种于发酵培养基中，在28～35℃，扩大培养20～35h，即得菌体发酵液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：
硝酸铵 0.2%；硫酸铵0.1%；磷酸二氢钾 0.1%；尿素0.05%；蛋白胨1%；蔗糖 2%；葡萄糖5%，余量水，pH 为4.5～6.5。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖5%，葡萄糖5%，蛋白胨1%，硫酸铵0.1%；磷酸二氢钾 0.1%；余量水。
5.权利要求1所述米曲霉（Aspergillus oryzae）BYCY-03在制备β-果糖基转移酶固定化酶中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤如下：
（a）取权利要求2制备的菌体发酵液经过滤收集菌丝体；
（b）将收集到得菌丝体加入预冷的磷酸缓冲液然后与经过预处理吸附剂进行反应，反应时间为10～24h，使菌丝体固定在吸附剂表面，制得β-果糖基转移酶固定化酶。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（a）中，过滤采用板框式压滤机过滤，工作压力为0.3～0.5MPa，流速为5～10m3/h。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（b）中，吸附剂选自氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷或纤维素之一。
9.如权利要求1所述米曲霉（Aspergillus oryzae）BYCY-03在制备低聚果糖中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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