CN111139191B - 一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法 - Google Patents

一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株产β‑环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法，属于微生物技术领域。本发明通过优化液体培养基以及对培养条件的控制等方法实现对一株具有产β‑环糊精葡萄糖基转移酶能力的米曲霉(Aspergillus oryzae)D5的液体发酵。本发明的发酵方法发酵活菌数高、发酵时间短，成本低廉，同时有效提高该菌株产β‑环糊精葡萄糖基转移酶的酶活，因此具有重要的工业化应用前景和实际意义。

Description

一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是由D-吡喃葡萄糖通过α-1，4-糖苷键首尾相连而成的环状低聚糖的总称，通常含有6-12个葡萄糖基单元，含量较多的为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精。工业生产上通常是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成。其在医药、分析化学、日用化工、环保、农业等领域应用广泛。其中由于β-环糊精的独特分子囊结构，近年来在食品领域中得到广泛的开拓与应用，它可以转化食品的形态、控制食品中香料及香味的挥发释放速度、掩盖不良气味、改善食品的口感等。
在调味品中β-环糊精的应用也得到了较多的关注，特别是在酱油中β-环糊精同其他糖类等共同构成酱油的体态和甜味，同时能与酱油中香气成分、维生素、色素等形成相对稳定的复合物，在一定程度上减少其挥发和氧化，还能够掩盖酱油发酵过程中产生的不快气味，改善酱油的气味和风味。而β-环糊精工业上一般是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的β-环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成。目前虽然已经报道几种关于芽孢杆菌产生的β-环糊精葡萄糖基转移酶的报道，但是由于现有芽孢杆菌发酵能力较差，产酶性能不佳，同时有可能为食品污染杂菌，限制了其在工业化生产特别是食品加工生产中的应用。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明在首次从豆瓣酱中分离得具有高产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉菌D5的基础上，对其低成本培养方式以及工业化发酵培养方式进行进一步探究，经试验验证，米曲霉(Aspergillus oryzae)D5在适宜的发酵培养条件下，能够在短时间内实现快速扩增，同时，通过对培养条件的进一步优化选择，有效降低了该菌株发酵成本，真正实现了对该菌株的低成本培养，同时有效提高该菌株产β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活，从而为该菌株在实际工业化特别是食品加工生产中的应用奠定了良好的基础。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法，所述方法包括：将曲霉菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到菌株发酵液。
其中，所述曲霉菌为米曲霉(Aspergillus oryzae)D5，该菌株已于2019年12月17日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.19262。经试验证明，该米曲霉具有高产β-环糊精葡萄糖基转移酶的能力。
所述发酵培养基至少包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。
具体的，本发明发酵培养基是在基础发酵培养基(酵母粉1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、K2HPO4 0.1％、MgSO4.7H2O 0.05％，自然PH)的基础上，通过综合考虑培养成本、菌体浓度、产酶活力以及原料来源的可行性，对碳源、氮源和无机盐成分进行进一步优化；
具体的，所述碳源包括但不限于淀粉、糊精、葡萄糖和蔗糖，进一步优选为淀粉；
所述氮源包括但不限于蛋白胨、干酪素、硫酸铵和氯化铵，进一步优选为干酪素；
进一步的，所述发酵培养基由如下原料组成：酵母粉、淀粉、干酪素、碳酸钠、磷酸氢二钾和硫酸镁。
更进一步的，所述发酵培养基由如下质量分数的原料组成：酵母粉1％、淀粉2.5％、干酪素1.85％、Na2CO3 0.35％、K2HPO4 0.1％、MgSO4.7H2O 0.05％，PH自然。
优选的，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5接种量为0.5～10％，接种量进一步优选为0.5％、1％、2％、5％、7％、10％，最优选为2％。
优选的，所述发酵培养温度为25～35℃，进一步优选为28℃、30℃、32℃和35℃，最优选为30℃。
进一步的，所述发酵培养方法还包括将制备得到的菌株发酵液进行离心处理、干燥得米曲霉(Aspergillus oryzae)D5菌体。
本发明的第二个方面，提供上述发酵培养方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)制备β-环糊精葡萄糖基转移酶；
b)制备β-环糊精；
c)食品加工；
d)酱油酿造。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
通过优化液体培养基以及对培养条件的控制等方法实现对一株具有产β-环糊精葡萄糖基转移酶能力的米曲霉(Aspergillus oryzae)D5的液体发酵。
上述技术方案中的发酵方法具有发酵活菌数高、发酵时间短，成本低廉等优点，同时有效提高该菌株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活，特别适合于工业化生产，因此具有重要的工业化应用前景和实际意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中曲霉菌D5的察氏培养基平板图和光镜图。
图2为本发明实施例中碳源对菌株产酶影响和淀粉添加量对菌株产酶影响图。
图3为本发明实施例中氮源对菌株产酶影响和干酪素对菌株产酶影响图。
图4为本发明实施例中碳酸钠添加量对菌株产酶影响图。
图5为本发明实施例中响应面分析图和等高线分析图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，现有芽孢杆菌发酵能力较差，产酶性能不佳，同时有可能为食品污染杂菌，限制了其在工业化生产特别是食品加工生产中的应用。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法，所述方法包括：将曲霉菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到菌株发酵液。
其中，所述曲霉菌为米曲霉(Aspergillus oryzae)D5，该菌株已于2019年12月17日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.19262。经试验证明，该米曲霉具有产β-环糊精葡萄糖基转移酶的能力。
本发明的又一具体实施方式中，所述发酵培养基至少包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。
本发明的又一具体实施方式中，本发明发酵培养基是在基础发酵培养基(酵母粉1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、K2HPO4 0.1％、MgSO4.7H2O 0.05％，自然PH)的基础上，通过综合考虑培养成本、菌体浓度、产酶活力以及原料来源的可行性，对碳源、氮源和无机盐成分进行进一步优化；
本发明的又一具体实施方式中，所述碳源包括但不限于淀粉、糊精、葡萄糖和蔗糖，进一步优选为淀粉；
本发明的又一具体实施方式中，所述氮源包括但不限于蛋白胨、干酪素、硫酸铵和氯化铵，进一步优选为干酪素；
本发明的又一具体实施方式中，所述发酵培养基由如下原料组成：酵母粉、淀粉、干酪素、碳酸钠、磷酸氢二钾和硫酸镁。
本发明的又一具体实施方式中，所述发酵培养基由如下质量分数的原料组成：酵母粉1％、淀粉2.5％、干酪素1.85％、Na2CO3 0.35％、K2HPO4 0.1％、MgSO4.7H2O 0.05％，PH自然。
本发明的又一具体实施方式中，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5接种量为0.5～10％，接种量进一步优选为0.5％、1％、2％、5％、7％、10％，最优选为2％。
本发明的又一具体实施方式中，所述发酵培养温度为25～35℃，进一步优选为28℃、30℃、32℃和35℃，最优选为30℃。
本发明的又一具体实施方式中，所述发酵培养方法还包括将制备得到的菌株发酵液进行离心处理、干燥得米曲霉(Aspergillus oryzae)D5菌体。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述发酵培养方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)制备β-环糊精葡萄糖基转移酶；
b)制备β-环糊精；
c)食品加工；
d)酱油酿造。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
1材料及方法
1.1材料与仪器
1.1.1样品
巧媳妇豆瓣酱
1.1.2培养基种类
1、初筛培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g、琼脂20g加水定容至1L，121℃灭菌20min。
2、复筛培养基/L：可溶性淀粉10g、蛋白胨5g，酵母膏5g、K2HPO4 0.2g、MgSO4.7H2O0.2g、NaCO3 0.2g、酚酞0.3g、甲基橙0.1g、琼脂20g，121℃灭菌20min。
3、基础发酵培养基/L(同种子培养基)：酵母粉10g/L、蛋白胨20g、葡萄糖20g、K2HPO4 1g、MgSO4.7H2O 0.5g，自然PH，分装到250ml锥形瓶中，每瓶50ml，121℃灭菌20min。
1.1.2试剂
1.1.3仪器与设备
1.2菌株筛选
1.2.1菌株的筛选分离纯化
无菌条件下称取10g豆瓣酱样品置于100ml无菌水中振荡培养1h，梯度稀释涂布于完全培养基上，30℃培养48小时，挑选不同形态的霉菌菌落进行划线直至形成单菌落，将其保存在斜面完全培养基上。
1.2.2产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株的初筛
将挑选好的菌株接种于β-环糊精葡萄糖基转移酶的筛选培养基上，30℃培养2-3天，观察是否出现淡黄色接近无色的斑点。在含有酚酞和甲基橙的平板内，环糊精会将酚酞包埋于疏水空腔内，形成无色二价阴离子。挑选出产颜色圈的菌株，接种到斜面培养基中保存。
1.2.3产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株的初筛
将菌株接种到种子培养基中发酵培养，按照1％的接种量接种到基础发酵培养基中，30℃、150r/min培养72h，5000r/min离心10min，制取粗酶液，测定酶活。
1.3β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定
酶活定义：使吸光度在单位时间内下降10％的酶量定义为一个酶活单位，U/ml。
测定方法：取试管b加入0.25％的马铃薯淀粉0.2ml和0.2mlPH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，加入10μL的酶液，40℃反应10min。立即加入0.5ml的醋酸种植反应后，加入3ml0.005％的碘液进行显色，定容至10ml，做三组平行。取试管a不加酶液为对照，蒸馏水为空白，在700nm下测定吸光度，根据公式计算酶活。
酶活计算公式：
酶活(U/ml)＝(a-b)/a*1000*稀释倍数
1.4发酵条件优化对得到的产酶霉菌在上述基础发酵培养基的条件下进行发酵条件的优化
1.4.1碳源优化
将菌种做成种子液后，以2％的添加量接种到不同碳源的液体培养基中，碳源分别为淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖，添加量1％，250ml锥形瓶，装液量为50ml，设置摇床温度为30℃，150r/min。培养72h。发酵结束后，制取粗酶液后测定酶活，通过比较结果，选择出最佳碳源，设置添加量为0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％。得出最佳碳源添加量
1.4.2氮源优化
在最佳碳源及添加量的基础上，选取蛋白胨、干酪素、硫酸铵、氯化铵为氮源，设置添加量为5g/L的条件下进行液体发酵挑选出最佳氮源后，设置添加梯度为0.25％、0.50％、0.75％、1％、1.25％、1.50％、1.75％、2％，获得最佳添加量。
1.4.3碳酸钠添量优化：
碳酸钠主要起到调节发酵液PH的作用，在最佳氮源和碳源的基础上设置添加量为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％。通过测定酶活得出最佳碳酸钠添加量。
1.5响应面优化产酶条件
根据Box-Behnken Design原理选取淀粉浓度、干酪素浓度、碳酸钠浓度3个因素，采用3因素3水平响应面分析法。确定因素的影响水平如下表。
响应面实验因素与水平
Figure BDA0002389016140000091
Figure BDA0002389016140000101
2.结果
2.1菌株筛选和鉴定
通过平板筛选，得到3株产特征圈的菌株，分别命名为D1、D2、D5，经发酵后测酶活，最终选取D5为优化菌株。
同时，对D5进行菌株鉴定，通过菌落和菌株形态观察，生理生化指标分析和18SrDNA序列进行测序，最终确定D5菌株属于米曲霉(Aspergillus oryzae)。
2.2单因素实验结果
2.2.1碳源对酶活的影响
加入四种碳源考察其对菌株产酶的影响，经发酵后测酶活，结果如图2所示，发现添加量2％的淀粉的摇瓶，单位酶活明显高于其他组。选取淀粉为最佳碳源，设置不同的添加量，测定结果如图所示，添加量为2.0％时酶活最高，最高为2319U/ml。
2.2.2氮源对酶活的影响
在最佳碳源的基础上，添加四种不同的氮源，考察氮源对菌株产酶量的影响，结果如图3所示，添加干酪素的培养基经菌株发酵后酶活最高，选取干酪素为氮源设置不同添加量，最终得出添加量在1％时酶活最高，为2537U/ml。
2.2.3碳酸钠添加量对酶活的影响
在最优氮源和碳源的基础上，考察不同的碳酸钠添加量对D5产酶的影响。酶活测定结果如图4所示，在碳酸钠添加量为0.5％时，菌株的产酶能力最强，酶活为2788U/ml。
2.3响应面法优化实验结果
Box-Behnken实验设计结果
Figure BDA0002389016140000111
用Design-Expert V8.0.6对实验结果进行回归性分析，该模型显著，F值为90.17，表示仅有0.01％的原因可能是有噪音引起的，Prob>f＝0.0001，说明回归方程在0.05的水平显著，实验设计结果可靠。同时失拟F值为0.9，P为0.5144，该模型失拟不显著，因此该模型较为适合，试验点均可用模型描述。此外，R2为0.9915表明该模型有较好的可信度，即该模型能够很好的解释该菌株对β-环糊精葡萄糖基转移酶的产量变化。根据离散分析，三因素的影响显著性排序为：淀粉浓度(A,P＝0.0026)>干酪素浓度(B,P＝0.0066)>碳酸钠浓度(C,P＝0.0142)。以酶活(Y)为因变量，淀粉(A)、干酪素(B)、碳酸钠(C)为自变量，建立回归方程如下:
Y＝-282+453A-534B+19860C+203AB+612AC+1308BC-252A2-116B2-34038C2.
根据实验结果建立的响应面分析图和等高线分析图如图5所示。
由模型得到最佳条件为淀粉2.5％，干酪素1.85％，碳酸钠0.35％，在此条件下单位酶活有最大响应，理论值为2991.19U/ml。
将D5在最佳产酶条件下，按照接种量2％进行发酵，72h后测酶活，测得最大酶活为3017.10U/ml，与理论值接近。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶的曲霉发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括：将米曲霉(Aspergillus oryzae)D5接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到菌株发酵液；
其中，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5已于2019年12月17日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.19262；
所述发酵培养基至少包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。
2.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖和蔗糖。
3.如权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，所述碳源为淀粉。
4.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述氮源选自蛋白胨、干酪素、硫酸铵和氯化铵。
5.如权利要求4所述的发酵培养方法，其特征在于，所述氮源为干酪素。
6.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基由如下原料组成：酵母粉、淀粉、干酪素、碳酸钠、磷酸氢二钾和硫酸镁，余量为水。
7.如权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基由如下原料组成：酵母粉1％、淀粉2.5％、干酪素1.85％、Na2CO3 0.35％、K2HPO4 0.1％、MgSO4.7H2O 0.05％，余量为水，pH自然。
8.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5接种量为0.5～10％。
9.如权利要求8所述的发酵培养方法，其特征在于，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5接种量为0.5％、1％、2％、5％、7％或10％。
10.如权利要求9所述的发酵培养方法，其特征在于，所述米曲霉(Aspergillusoryzae)D5接种量为2％。
11.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养温度为25～35℃。
12.如权利要求11所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养温度为28℃、30℃、32℃和35℃。
13.如权利要求12所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养温度为30℃。
14.如权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养方法还包括将制备得到的菌株发酵液进行离心处理、干燥得米曲霉(Aspergillus oryzae)D5菌体。
15.权利要求1-14任一项所述发酵培养方法在如下任意一种或多种中的应用：
a)制备β-环糊精葡萄糖基转移酶；
b)制备β-环糊精；
c)食品加工。
16.如权利要求15所述应用，其特征在于，所述食品加工为酱油酿造。
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