CN110195022B - 一种降低红曲霉菌球直径同时提高生物量和色素量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低红曲霉菌球直径同时提高生物量和色素量的方法。由于丝状真菌在频繁相互接触的情况下容易缠绕成球，菌丝球直径过大时菌球内部菌丝活性降低，不利于发酵。在24深孔板中通过添加玻璃珠（1~5颗）、控制接种量（接种量为6%~12%（v/v））、调整pH=7、添加表面活性剂（吐温80，添加量0.1wt%）的方式来降低菌丝球的缠绕程度，进而提高菌量和色素量。本发明的最大优点在于不改变种子液和发酵液的成分，也不影响培养体系中物质的非生物转化关系，不对菌株高通量筛选和培养基快速优化等方面造成干扰，在科研领域和生产实践中具有显著的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种基于微孔板发酵体系减小红曲霉菌丝球直径、提高生物量和色素产量的方法。
背景技术
在液态发酵过程中，丝状真菌受到培养条件的影响而呈现不同状态：菌丝聚集程度较低的絮状、聚集程度较高的球状或团块状。菌丝聚集程度不同，其发酵行为不同，对底物的利用率、产物的生产率、菌体生物量也不同。
微孔板发酵体系是为了实现菌株的高通量培养而诞生的，它因培养体积小、能够一次性同时发酵大批量的样品而受到青睐。
对于丝状真菌而言，当其处于空间相对狭小的微孔板发酵体系时，孢子接触机会增加、菌丝缠绕几率增加，可能会发生成球甚至结块等现象，而所成的球或团块往往形状大小不一，发酵的平行性较差，该批数据往往失去统计的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种基于微孔板发酵体系减小红曲霉菌丝球直径、提高生物量和色素产量的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种降低红曲霉菌球直径同时提高生物量和色素量的方法为：将红曲霉种子液接种于每孔含4.8mL发酵培养基的24深孔板中，接种量为6~12%（v/v）、添加玻璃珠、添加表面活性剂；的方式来降低红曲霉菌丝球直径、提高生物量和色素产量。该体系于30℃、200r/min培养6d。
上述方法中红曲霉种子液的制备方法为：在PDA平板中添加5mL生理盐水，用勺子或接种铲将红曲霉孢子轻轻刮下，形成菌悬液，取2.5mL菌悬液接种于50mL种子液中，30℃、200r/min培养2d。
其中，种子液的配方为：籼米粉35.00g/L、黄豆粉12.00g/L、无水葡萄糖12.00g/L、硝酸钠1.00g/L、磷酸二氢钾1.00g/L、七水合硫酸镁0.50g/L，121℃灭菌20min。
上述方法中，发酵培养基的配置方法为2g/L磷酸二氢钾、10g/L葡萄糖、10g/L硫酸铵、0.625g/L硫酸镁，用上述米浆定容至1L，3mol/L氢氧化钠调整pH至7， 121℃灭菌20min。所述米浆的制备为20g/L籼米粉煮沸后4000r/min离心10min过滤米渣，取米浆上清液。
上述方法中所述玻璃珠直径为2.5mm，每孔添加1~5颗灭菌的玻璃珠。
上述方法中所述表面活性剂为吐温80，添加量0.1wt%。
相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明的方法不需要复杂的仪器设备和昂贵的试剂药品，成本低廉、易于实行；
（2）本发明的方法不改变种子液和发酵液的成分，也不影响培养体系中物质的非生物转化关系，不对菌株高通量筛选和培养基快速优化等方面造成干扰；
（3）本发明的方法通过添加玻璃珠、控制接种量和调整pH，有效控制菌丝球直径大小，从而提高红曲霉的生物量和色素产量。
（4）本发明的方法中添加表面活性剂吐温80，提高红曲霉色素的产量。
附图说明
图1为红曲霉菌丝球直径与生物量关系图。
图2为红曲霉菌丝球直径与总色素量关系图。
图3为接种量对红曲霉菌丝球直径、生物量和总色素量的影响。
图4为玻璃珠个数对红曲霉菌丝球直径、生物量和总色素量的影响。
图5为初始pH对红曲霉菌丝球直径、生物量和总色素量的影响。
图6为表面活性剂对红曲霉菌丝球直径、生物量和总色素量的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
一种降低红曲霉菌球直径同时提高生物量和色素量的方法为：
红曲霉种子液的制备方法为：在PDA平板中添加5mL生理盐水，用勺子或接种铲将红曲霉孢子轻轻刮下，形成菌悬液，取2.5mL菌悬液接种于50mL种子液中，30℃、200r/min培养2d。
种子液的配方为：籼米粉35.00g/L、黄豆粉12.00g/L、无水葡萄糖12.00g/L、硝酸钠1.00g/L、磷酸二氢钾1.00g/L、七水合硫酸镁0.50g/L，121℃灭菌20min。
发酵培养基配置：2g/L磷酸二氢钾、10g/L葡萄糖（碳源）、10g/L硫酸铵（氮源）、0.625g/L硫酸镁（金属离子），用米浆定容至1L，然后分装至24孔板中，121℃灭菌20min。所述米浆的制备为：20g/L籼米粉煮沸后4000r/min离心10min过滤米渣，取米浆上清液。
若无涉及变量，每孔培养基不添加玻璃珠、pH自然（4.5）、接种量2%（v/v）、培养基体积为4.8mL。
将培养2d后的红曲霉种子液接种于含有发酵培养基的24深孔板中，200r/min、30℃培养6d。
设置变量如下：
（1）碳源（10g/L）：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖
（2）氮源（10g/L）：酵母提取粉、大豆蛋白胨、味精、硫酸铵、硝酸钠
（3）金属离子（0.625g/L）：硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸钙
（4）接种量（v/v）：2%、4%、6%、8%、10%、12%
（5）搅拌程度（玻璃珠个数）：0、1、2、3、4、5（玻璃珠直径2.5mm）
（6）初始pH：4、5、6、7、8（用3mol/L氯化氢或3mol/L氢氧化钠调节）
（7）表面活性剂（0.1wt%）：十二烷基三甲基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、曲拉通X-100、吐温80、甜菜碱、蛋黄卵磷脂。
检测方法：
（1）菌丝球直径：将发酵培养6d后的菌丝球捞出，于低倍显微镜下观察测量直径；
（2）红曲色素：采用吸光值法。将24深孔板4000r/min离心10min，取上清液测定胞外色素；在沉淀中加入75%vol酒精于灭菌锅中60℃保温120min，再次4000r/min离心10min，取上清液测定胞内色素。其中，各颜色的波段为：黄色素410nm、橙色素465nm、红色素505nm。
色素含量计算方法：每种色素含量=吸光值×稀释倍数/样品体积，色素含量单位为U/mL。总色素含量为三种色素含量之和。
（3）生物量：称干重法，发酵培养6d后将24深孔板4000r/min离心后的沉淀60℃烘至恒重后称干重。
检测结果：
红曲霉菌丝球直径与生物量的关系见图1。红曲霉菌丝球直径与总色素量的关系见图2。不同培养条件下红曲霉的菌丝球大小、生物量、色素产量都不同，以此来构建菌丝球大小分别与生物量、色素产量之间的关系更加能够说明问题。将上述7个变量组（碳源、氮源、金属离子、接种量、搅拌程度、初始pH、表面活性剂）的数据用散点图绘制菌球直径与生物量之间的关系（图1）、菌丝球直径与色素量的关系（图2）。尽管培养条件不同，从图1看出，随着菌丝球直径的增大，红曲霉的生物量呈下降趋势；从图2看出，随着菌丝球直径的增大总色素产量有明显的降低趋势。表明菌丝球对生物量和色素产量的影响是普遍且客观存在的，并不在特定培养条件下才能出现，培养过程中需要控制菌丝球的大小。
对于上述改变接种量的变量组，实验结果如图3所示。图3结果表明，随着接种量的增加，红曲霉菌丝球直径逐渐减小、生物量逐渐升高，当红曲霉接种量在6%~12%（v/v）时，色素产量达到最高，且波动不大，为37.5~42.5U/mL，因此确定接种量的范围为6%~12%（v/v）。
对于上述改变搅拌程度的变量组，实验结果如图4所示。图4结果表明，随着玻璃珠的个数增加，红曲霉菌丝球的大小逐渐减小。此外，只要培养基中有加入玻璃珠，其生物量和总色素量都处于较高水平，且波动较小，生物量为3.79~4.13mg/mL，总色素量为26.59~31.39U/mL，因此确定加入培养基中的玻璃珠个数为1~5个。
对于上述改变初始pH的变量组，实验结果如图5所示。图 5 结果表明，随着pH由酸性往中性偏移，红曲霉菌丝球直径逐渐减小、生物量和色素量逐渐增加。但当pH为8时，红曲霉的菌量和色素量相比pH为7时下降了。因此确定最优初始pH为7。
对于上述改变表面活性剂的变量组，实验结果如图6所示。图6结果表明，甜菜碱、十二烷基三甲基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵对红曲霉细胞有毒性，因此菌球大小、生物量、色素产量都低；红曲霉对曲拉通X-100、吐温80、蛋黄卵磷脂这三种表面活性剂有耐受性，但添加曲拉通X-100和蛋黄卵磷脂时，对菌球大小的控制、生物量和色素量的增产没有效果（初始pH为4.5，参考图5中pH为4与pH为5的数据），而吐温80能提高红曲色素的产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (1)
1.一种降低红曲霉菌球直径同时提高生物量和色素量的方法，其特征在于：将红曲霉种子液接种于每孔含4.8mL发酵培养基的24深孔板中，添加玻璃珠、表面活性剂来降低红曲霉菌丝球直径、提高生物量和色素产量；
所述红曲霉种子液为在PDA平板中添加5mL生理盐水，用勺子或接种铲将红曲霉孢子轻轻刮下，形成菌悬液，取2.5mL菌悬液接种于50mL种子液中，30℃、200r/min培养2d；
所述种子液的配方为：籼米粉35.00g/L、黄豆粉12.00g/L、无水葡萄糖12.00g/L、硝酸钠1.00g/L、磷酸二氢钾1.00g/L、七水合硫酸镁0.50g/L，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的配置方法为：2g/L磷酸二氢钾、10g/L葡萄糖、10g/L硫酸铵、0.625g/L硫酸镁，用米浆定容至1L，用3mol/L氢氧化钠调整pH至7，24深孔板中每孔加入发酵液4.8mL，121℃灭菌20min；所述米浆的制备方法为： 20g/L籼米粉煮沸后4000r/min离心10min过滤米渣，取米浆上清液；
种子液的接种量占发酵液的体积为：8%v/v；
所述添加玻璃珠为24深孔板中每孔加入直径为2.5mm的玻璃珠4颗；
所述表面活性剂为吐温80，其添加量为0.1wt%。
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