CN109609391B - 一种菌丝球的定量接种方法 - Google Patents

一种菌丝球的定量接种方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109609391B
CN109609391B CN201910116323.XA CN201910116323A CN109609391B CN 109609391 B CN109609391 B CN 109609391B CN 201910116323 A CN201910116323 A CN 201910116323A CN 109609391 B CN109609391 B CN 109609391B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycelium pellets
mycelium
volume
inoculation
pellets
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910116323.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109609391A (zh
Inventor
倪莉
周康熙
刘志彬
张雯
张晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou University
Original Assignee
Fuzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuzhou University filed Critical Fuzhou University
Priority to CN201910116323.XA priority Critical patent/CN109609391B/zh
Publication of CN109609391A publication Critical patent/CN109609391A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109609391B publication Critical patent/CN109609391B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供了一种菌丝球的定量接种方法，利用微孔板进行菌丝球培养，绘制菌丝球干重与培养体积之间的标准曲线，以标曲确定菌丝球的接种量。在微孔板培养体系中，可根据不同培养液体积来制备不同数量及大小的菌丝球，同一培养体积下菌丝球的数量及大小相近，可满足不同的接种需求。本发明所述的菌丝球接种方法，为菌丝球的接种拟定了计量标准，能够克服菌丝球接种时难以定量的问题。

Description

一种菌丝球的定量接种方法
技术领域
本发明属于丝状真菌接种发酵技术领域，具体涉及一种菌丝球的定量接种方法。
背景技术
丝状真菌在一定条件下液态发酵容易缠绕成球，球状菌丝体与游离菌丝体相比，物质的传递效率不同，群体感应和胁迫程度也不同，进而影响其代谢水平。有研究表明，红曲霉在菌丝球条件下洛伐他汀的产量增加；黑曲霉在菌丝球条件下柠檬酸产量增加。
当前文献极少体积菌丝球的接种问题，因为多数文献都是直接接种孢子液让其自然成球，随后继续发酵。然而，这种发酵方式下，菌丝球的成球情况太多随机，菌丝球的数量、大小不一，菌丝球的量更是无从得知，对于菌丝球的发酵研究较为不利。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种菌丝球的定量接种方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种菌丝球的定量接种方法：把PDA平板上的丝状真菌孢子制备成孢子悬液，接种至装有不同体积的培养液的24深孔板中30℃、200r/min发酵4d形成菌丝球，绘制培养液体积与菌丝球干重之间的标曲。根据预先确定菌丝球的接种量，由标曲换算应在微孔板中加多少体积的培养液，培养后经过无菌纱布过滤，将菌丝球接种于发酵液即可。具体操作方法如下：
PDA培养基的配置方法为：称取200g去皮切块的马铃薯，加600mL水煮20min，八层纱布过滤取汁，在马铃薯汁中加入20g葡萄糖、15~20g琼脂，煮沸后冷却定容至1L，摇匀分装121℃灭菌20min。临用时，将PDA培养基用微波炉溶解，52℃保温20min后于无菌超净台中倒平板，冷却凝固。
丝状真菌孢子悬液的配置方法为：在平板中加生理盐水，用接种铲轻轻刮下孢子，把孢子液过四层擦镜纸，滤掉菌丝，将滤液稀释至106CFU/mL。
24深孔板中的培养液的配置方法为：味精22.33g，硫酸铵9.72g，可溶性淀粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。
干重测定方法为：将孔板中每个孔的菌丝球分别转移至离心管中，4500r/min离心10min，弃上清，60℃烘干至恒重，将此重量扣去空管质量即为干重。
标曲的绘制方法为：24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL，孢子悬液接种量为5%。待发酵完成后，按照所述方法称干重，以培养基体积为横坐标，干重为纵坐标，绘制标准曲线。
本发明的有益效果在于：
（1）由于孔板培养条件下孢子接触几率增加，相比于摇瓶发酵而言，丝状真菌更易成球，从而更容易获得菌丝球；
（2）微孔板中不同培养体积条件下菌丝球的大小及数量不同，可根据实际所需定向培养菌丝球；
（3）可根据菌丝球的标曲知晓菌丝球的接种量，更利于菌丝球接种的量化管理。
附图说明
图1为红曲霉摇瓶发酵效果图。
图2为不同培养体积下的24深孔板发酵效果图。
图3为红曲霉菌丝球接种量的标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
所用丝状真菌为红曲霉。
红曲霉孢子液的制备：在PDA平板中加生理盐水，用接种铲轻轻刮下孢子，把孢子液过四层擦镜纸，滤掉菌丝，将滤液稀释至106CFU/mL。
PDA培养基的配置方法为：称取200g去皮切块的马铃薯，加600mL水煮20min，八层纱布过滤取汁，在马铃薯汁中加入20g葡萄糖、20g琼脂，煮沸后冷却定容至1L，摇匀分装121℃灭菌20min。临用时，将PDA培养基用微波炉溶解，52℃保温20min后于无菌超净台中倒平板，冷却凝固。
红曲霉培养液的制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，可溶性淀粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。
摇瓶发酵：将红曲霉孢子液接种于装有30mL的培养液的250mL锥形瓶中，30℃200r/min培养4d，接种量为5%。
24孔板发酵：将红曲霉孢子悬液接种至装有不同体积的培养液的24深孔板中30℃、200r/min发酵4d，接种量为5%。其中，24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL。
摇瓶发酵的效果如图1，从图1可看出，红曲霉难以形成肉眼可见的菌丝球。孔板发酵效果如图2，孔板中培养液体积为1.2mL时，菌球数量少、直径小；培养液体积在2.4~4.8mL时，菌球直径几乎一致，但菌球的数量随着培养液体积的增加而增加；培养液体积为6.0或7.2时，几乎形成一个大菌球，且培养液的体积在7.2mL时红曲霉菌丝球较为规则、表面较为光滑。因此可根据实际接种菌丝球的数量或大小需求来定向培养红曲霉。
另一方面，将不同培养液体积中的红曲霉菌丝球进行干重测定绘制标曲，标曲如图3所示，标曲线性良好，即可根据初始培养液体积去换算实际接种菌丝球的质量，使菌丝球发酵的接种问题从经验化转变为数量化。
干重测定方法为：将孔板中每个孔的所有物质分别转移至离心管中，4500r/min离心10min，弃上清，60℃烘干至恒重，将此重量扣去空管质量即为干重。
标曲的绘制方法为：24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL，孢子悬液接种量为5%。待发酵完成后，按照所述的方法称干重，以培养基体积为横坐标，干重为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图1所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种菌丝球的定量接种方法，其特征在于：把PDA平板上的红曲霉孢子制备成孢子悬液，接种至装有不同体积的培养液的24深孔板中，30℃、200r/min发酵4d形成菌丝球，绘制培养液体积与菌丝球干重之间的标曲，根据标曲确定菌丝球的接种量；PDA培养基为：称取200g去皮切块的马铃薯，加600mL水煮20min，八层纱布过滤取汁，在马铃薯汁中加入20g葡萄糖、15~20g琼脂，煮沸后冷却定容至1L，摇匀分装121℃灭菌20min，临用时，将PDA培养基用微波炉溶解，52℃保温20min后于无菌超净台中倒平板，冷却凝固；孢子悬液浓度为106CFU/mL；培养液配置方法为：味精22.33g，硫酸铵9.72g，可溶性淀粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min；干重测定方法，将孔板中每个孔的菌丝球分别转移至离心管中，4500r/min离心10min，弃上清，60℃烘干至恒重，将此重量扣去空管质量即为干重；标曲的绘制方法，24深孔板中每列4孔为同一组平行，每行6孔为对照，每行微孔板的培养基体积分别为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2mL，孢子悬液接种量为5%；待发酵完成后，称干重，以培养基体积为横坐标，干重为纵坐标，绘制标准曲线；接种方法，预先确定菌丝球的接种量，根据标曲换算应在微孔板中加多少体积的培养液，培养后经过无菌纱布过滤，将菌丝球接种于发酵液即可。
CN201910116323.XA 2019-02-15 2019-02-15 一种菌丝球的定量接种方法 Active CN109609391B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910116323.XA CN109609391B (zh) 2019-02-15 2019-02-15 一种菌丝球的定量接种方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910116323.XA CN109609391B (zh) 2019-02-15 2019-02-15 一种菌丝球的定量接种方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109609391A CN109609391A (zh) 2019-04-12
CN109609391B true CN109609391B (zh) 2023-03-17

Family

ID=66019803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910116323.XA Active CN109609391B (zh) 2019-02-15 2019-02-15 一种菌丝球的定量接种方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109609391B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099253A (zh) * 2014-07-11 2014-10-15 江南大学 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120137382A1 (en) * 1998-09-22 2012-05-31 Mendel Biotechnology, Inc. Stress tolerance in plants
CN102389139B (zh) * 2011-09-30 2013-04-03 河北师范大学 一种食用菌营养保健功能性饮料的制备方法
US9427008B2 (en) * 2012-09-06 2016-08-30 Mycotechnology, Inc. Method of myceliation of agricultural substates for producing functional foods and nutraceuticals
CN102850127A (zh) * 2012-09-10 2013-01-02 阜阳市德益农业科技有限公司 杏鲍菇液体菌种培养液
CN103642890B (zh) * 2013-12-25 2015-07-08 山东建筑大学 载体发酵技术制备乙醇的方法
CN105505781A (zh) * 2014-10-20 2016-04-20 上海理工大学 控制曲霉属丝状真菌形成菌丝球的方法
CN108663361B (zh) * 2018-05-22 2020-12-25 福州大学 一种快速测定液态发酵液中生物量的方法
CN108753625B (zh) * 2018-05-24 2021-11-30 富乐顿生物工程科技（北京）有限公司 一种产多糖空间珊瑚状猴头菌st21-3及其在提高生物免疫活性中的应用
CN109055444B (zh) * 2018-08-28 2020-06-05 江苏国信协联能源有限公司 一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法
CN109557314B (zh) * 2018-12-07 2020-12-11 中国农业科学院油料作物研究所 一种用来鉴定评价黄曲霉毒素产毒菌株产毒力的方法
CN110195022B (zh) * 2019-06-28 2021-04-27 福州大学 一种降低红曲霉菌球直径同时提高生物量和色素量的方法
AU2020102268A4 (en) * 2020-09-15 2020-10-29 Changshu Institute Of Technology Edible fungus culture medium based on disposable bamboo chopsticks and preparation method and application thereof
CN112899117A (zh) * 2021-03-01 2021-06-04 山西农业大学 红曲霉联合乳酸菌、芽孢菌共发酵高γ-氨基丁酸红枣薏米醋的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099253A (zh) * 2014-07-11 2014-10-15 江南大学 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Response of juvenile Norway spruce(Picea abies[L.]Karst.) to ectomycorrhizal inoculation of perlite-peat substrates in a nursery ";Repac Sendecky等;《Journal of Sustainable Forestry》;20181231;第37卷(第8期);第771-786页 *
"海洋黑曲霉菌丝球的形成机理及其对含染料废水的脱色作用";陆涛;《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20170613;第1-145页 *
稻草纤维素糖化液发酵柠檬酸的条件研究";刘毅等;《广东农业科学》;20120810;第39卷(第15期);第86-89页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109609391A (zh) 2019-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104805023B (zh) 蜜环菌菌剂的制备方法及该方法制成的蜜环菌菌剂
CN106978465B (zh) 一种提高桦褐孔菌总三萜发酵产量的发酵方法
CN106591160A (zh) 一种复配小曲及小曲白酒的生产方法
CN107432135B (zh) 利用真菌促进锁阳种子萌发的方法
CN105198635A (zh) 大规模培养海水小球藻的大量元素营养液
CN105779299A (zh) 一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及应用
CN109609391B (zh) 一种菌丝球的定量接种方法
CN109006175B (zh) 一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法
CN105543113B (zh) 一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法
CN105219653B (zh) 产洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株及其应用
CN104357337B (zh) 食品发酵用的根霉及应用
CN105647815A (zh) 一种提高米曲霉曲酸产量的方法
CN111607553B (zh) 一种高产多糖的灵芝菌丝体培养基及其培养方法
CN106399121B (zh) 一种紫色红曲菌菌株
CN108841798B (zh) 一种拟青霉发酵产生超氧化物歧化酶的培养基及方法
CN107988085B (zh) 一种高产酸性果胶酶的棘孢曲霉菌株及其应用
CN103157105A (zh) 一种制备猪瘟活疫苗的方法
CN112125732A (zh) 鹿茸菇液体原种培养液及鹿茸菇原种制作工艺
CN112779207A (zh) 一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法
CN106947703B (zh) 一株匍枝根霉及其应用
CN107245458A (zh) 一种高抗性产海藻糖酿酒酵母菌株的筛选及应用
CN112921058B (zh) 黑曲霉发酵产柠檬酸的方法
CN104212874B (zh) 一种定量检测蜡蚧轮枝菌的选择性培养基及其应用
CN114940951B (zh) 一种扣囊复膜酵母及其在小曲清香型原酒中的应用
CN110016489B (zh) 一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant