CN103275947B - 一种大子座座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺，更具体地，本发明涉及一种大子座座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有酵母浸粉0.25-2.00%（w/v），L-阿拉伯糖0.25-2.00？%（w/v），Fe³⁺？0.005-0.040？mol/L，VB₂0.005-0.040？%（w/v），三醋酸甘油酯2%（w/v），培养基初始pH=6.7-7.6。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量20%，于25℃，转速120？r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基，具有酯酶产率高，酯酶活力高等优点。

Description

一种大子座座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基及方法

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺，更具体地，本发明涉及一种大子座座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基及方法。

背景技术

酯酶是一类能够催化酯键水解形成相应的酸和乙醇的酶类，广泛分布于动植物和微生物(Bronscheuer，2002)。酯酶催化反应具较广的底物范围，在催化底物反应时不需要辅助因子，在一些变形剂，如有机溶剂中有很高的稳定性，此外酯酶催化反应具有立体特异性和区域专一性的特点（覃拥灵等，2007）。由于酯酶以上优点，使得酯酶在很多领域有着广泛的应用。近年来，全球市场工业用酶市场出现供不应求的局面，因此寻找新的产酯酶资源刻不容缓。

座壳孢菌是一类重要的昆虫病原真菌而被广泛应用于粉虱和介壳虫的生物防治。其中成员大子座座壳孢菌(Aschersonia macrostromatica)能够寄生上述寄主。从座壳孢中筛选高产酯酶的菌株为扩大资源、缓冲酯酶来源具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大子座座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基及方法。

本发明首先提供了一种座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基，所述培养基的原料含有酵母浸粉0.25-2.00%（w/v），L-阿拉伯糖0.25-2.00%（w/v），Fe³⁺ 0.005-0.040 mol/L，VB₂0.005-0.040 %（w/v），三醋酸甘油酯2%（w/v），培养基初始pH=6.7-7.6。

本发明优选的发酵生产酯酶培养基含有酵母粉0.25%，L-阿拉伯糖1%，FeCl₃·6H₂O 0.04mol/L，VB₂0.01%，三醋酸甘油酯2%（w/v），培养基初始pH=6.7。

其次，本发明还提供了一种大子座座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基及方法，所述方法包含以下步骤：

（a）将座壳孢菌接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于上述发酵生产酯酶的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25℃，转速120 r/min下培养。

所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计，牛肉膏2.0%，蔗糖2.0%，蛋白胨0.2%，酵母粉0.2%，(NH₄)₂SO₄ 0.5%，K₂HPO₄ 0.1% ，MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%，pH5.5。

本发明采用的座壳孢菌为大子座座壳孢菌（Jun-Zhi Qiu & Xiong Guan, A new species of Aschersonia(Clavicipitaceae, Hypocreales) from China. MYCOTAXON, 2010, 111: 471-475）。

采用本发明优化后的培养基，菌龄7d，发酵周期2d，发酵结果大子座座壳孢菌产酯酶为22 U/mL以上。

本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基，具有酯酶产率高，酯酶活力高等优点。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基配制：牛肉膏20.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g， (NH₄)₂SO₄ 5.0g，酵母粉2.0g，K₂HPO₄ 1.0g ，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸馏水定容到1000mL，调pH至5.5，分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。0.1MPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。

 （2）发酵种子液的制作：将大子座座壳孢菌接种于马铃薯琼脂培养基上，于25℃下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，25℃，转速120 r/min下培养48h，即为发酵种子液。

（3）酶液的制备：取步骤（2）发酵种子液接种至发酵培养基，在25℃、120r/min的摇床中培养2d得发酵液，4℃下， 5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长405nm处测定吸光值，换算成酶活单位U/mL。

（4）酯酶酶活测定：根据Westlake K等人的酯酶酶活测定方法，进行改进，取1 mL 1mmol/L的对硝基苯酯酸酯(p-NPC2)溶液、2 mL 50mM Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液加人试管中，放人恒温水浴器中，40℃保温15 min，再加0.5mL酶液振荡反应8min，立即加入2 mL 95%乙醇终止反应，在波长405nm处测定吸光值。另以在沸水浴中失活的酶液代替原酶液为空白。酶活力单位的定义为在本实验测定条件下，以每分钟催化产生1μmol的对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活力（U/g或U/mL）=A×K×V×n/(t×m)（A为样品的吸光度；K为吸光常数；V为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL）。

（5）标准曲线的制作：精确配制对硝基苯酚2mmol/L标准溶液；首先在试管中加入不同体积50mmol/L Tris-Hcl pH7.2， 在40℃保温15 min，在加入不同体积的对硝基苯酚标准液。反应8min后立即加入2mL95%乙醇。反应体系为6mL（对硝基苯酚和缓冲液4mL，终止液为2mL）。每个浓度做3平行实验，为空白对照。在波长405 nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，标准溶液溶度为横坐标，经统计处理得到的线性回归方程，y=0.0025x，R²=0.9976。

（6）不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产酯酶的影响

（a）碳源对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）（经细菌过滤器除菌后加入，下同）、蛋白胨1%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%、NaCl 0.1%、FeSO₄ ^.7H₂O 0.001%、自然pH的培养基中分别添加2%麦芽糖、果糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、甲壳素、可溶性淀粉、海藻糖、木糖醇、葡萄糖、D-半乳糖、α-乳糖、甘露醇、D-山梨醇、糊精，以不加C源做对照，0.1MPa，灭菌20min（下同），接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120r/min的摇床中培养2d检测酶活性，结果见表1。

（b）金属离子对产酶的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）、蔗糖2%、蛋白胨1%、自然pH的培养基分别添加0.02mol/L（以6（a）中含有的金属离子按其浓度换算得来）FeCl₃·6H₂O、NaCl、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂、MnCl₂·4H₂O、KCl、BaCl₂·2H₂O、ZnCl₂、CuCl₂·2H₂O、FeCl₂·4H₂O，以不加金属离子做对照，0.1MPa，灭菌，接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120r/min的摇床中培养2d检测酶活性，结果见表2。

（c）氮源对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）、蔗糖2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%、NaCl 0.1%、FeSO₄ ^.7H₂O 0.001%、自然pH的培养基中分别添加1%的酵母浸粉、蛋白胨、甘氨酸、（NH₄）₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NH₄NO₃、KNO₃、胰蛋白胨、叶酸、酸水解蛋白胨、尿素，以不加N源做对照，0.1MPa，灭菌，接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120r/min的摇床中培养2d检测酶活性，结果见表3。

（d）维生素对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）、蛋白胨1%，蔗糖2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%、NaCl 0.1%、FeSO₄ ^.7H₂O 0.001%、自然pH的培养基中分别添加0.01%硫胺素VB₁、核黄素VB₂、氨基嘌呤VB₄、吡哆醇类VB₆、烟酸、叶酸、抗坏血酸V_C、生育酚脂V_E ，以不加维生素做对照，0.1MPa，灭菌，接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120r/min的摇床中培养2d检测酶活性，结果见表4。

表1 不同碳源对酶产量的影响

表2 不同金属离子对酶产量的影响

表3 不同氮源对酶产量的影响

表4 不同维生素对酶产量的影响

从表中可以得出最佳的培养基成分为L-阿拉伯糖，酵母浸粉，Fe³⁺，VB₂，接下来的正交实验将以此作为发酵培养基成分。

实施例2

正交实验确定最优发酵条件

（1）正交实验确定最佳培养基

从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和pH值，配置不同的培养基，见表5，将相同量的（接种量10%）菌种接种于100mL，装有30mL培养液，在25℃，转速120 r/min下培养培养2d。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活，结果见表6。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验，结果见表7。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

       表5 大子座座壳孢菌产酯酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计

表6 大子座座壳孢酯酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计实验结果

    注:K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和，K4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表7 培养基成分优化验证试验

正交结果分析表明：最佳因素组合是A₃B₁C₄D₂E₁，即L-阿拉伯糖1%，酵母浸粉0.25%，Fe³⁺ 0.04mol/L，VB₂0.01%，pH6.7，且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包括L-阿拉伯糖2%、酵母浸粉0.25%、Fe³⁺0.04mol/L、VB₂0.01%、pH7.3，即A₄B₁C₄D₂E₃。表6变化因子的极差值R分别为碳源(37.95)、氮源(85.80)、金属离子(84.70)、维生素(137.50)和pH(20.90)，表明碳源、氮源、金属离子、维生素和pH的变化与大子座座壳孢菌产酯酶培养基相关，尤其是维生素的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言，pH的改变对产酶的影响较小。

(2)正交实验确定最优培养条件

在从正交实验确定的最优培养基的基础上，通过设定不同接种量，装液量，菌龄，培养时间，见表8。在25℃，转速120 r/min下培养，各组号的培养时间以表9为准。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验，结果见表10。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表8大子座座壳孢菌酯酶四因子三水平（3⁴）正交实验

表9大子座座壳孢菌酯酶四因子三水平（3⁴）正交实验设计实验结果

注: K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和， R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表10 培养条件优化验证试验

总结了4个因子(接种量、装液量、菌龄和培养时间)对座壳孢菌产酯酶产生的影响。表9中的R值表明接种量(50.60)是一个比其他培养条件更重要的因子，其次是装液量(49.50)，然后是培养时间(47.85)，对座壳孢菌产酯酶影响最小的因子是菌龄(41.80)。最优相应的实验条件应为A₃B₁C₃D₁(接种量20%，装液量50mL/250mL，菌龄7d，培养时间2d）。在培养该菌产的时候，要注意各因子之间的相互影响作用，以提高产酶效率。

实施例3

真菌产酯酶发酵方法

（1）    发酵种子的制备

（A）菌种和培养基

菌种：大子座座壳孢菌

斜面培养基：PDA培养基

液体种子培养基：牛肉膏20.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g， (NH₄)₂SO₄ 5.0g，K₂HPO₄ 1.0 g ，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，蒸馏水定容至1000mL，调pH值为5.5，0.1MPa，灭菌20min，(该培养基pH值较低是为了抑制杂菌生长)。

（B）种子液制备

将斜面上的纯种大子座座壳孢菌转接到多个250 mL三角瓶中，其中装有100mL液体种子培养基，然后在25℃(温度较发酵培养同样是为了抑制染菌)，在往复式震荡摇床转速120 r/min下培养培养48 h，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。

此外接种前可在种子液中加入抗生素，杀灭或者抑制杂菌的生长，从而获得不带杂菌的纯种菌种。

（2）    发酵培养

发酵培养基：按照培养基优化正交实验，即L-阿拉伯糖1.00%，酵母浸粉0.25%，FeCl₃·6H₂O 0.04mol/L，VB₂0.01%，pH6.7，，三醋酸甘油酯2% (w/v），配制。

将上一步骤中制备的大子座座壳孢菌发酵种子液，按培养条件正交实验得出的最佳条件，接种量20%接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液，

摇床温度：25℃±1℃，

发酵周期：2d

发酵产生结果大子座座壳孢菌产酯酶为22U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

Claims (4)

1.一种座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有酵母浸粉0.25-2.00％(w/v)，L-阿拉伯糖0.25-2.00％(w/v)，Fe³⁺0.005-0.040mol/L，VB₂0.005-0.040％(w/v)，三醋酸甘油酯2％(w/v)，培养基初始pH＝6.7-7.6。

2.一种如权利要求1所述座壳孢菌发酵生产酯酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有酵母浸粉0.25％(w/v)，L-阿拉伯糖1％(w/v)，FeCl₃·6H₂O0.04mol/L，VB₂0.01％(w/v)，三醋酸甘油酯2％(w/v)，培养基初始pH＝6.7。

3.一种座壳孢菌发酵产酯酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

(a)将座壳孢菌接种种子培养基，制得发酵种子液；

(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的发酵生产酯酶的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量20％，于25℃，转速120r/min下培养。

4.如权利要求3所述座壳孢菌发酵产酯酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计，牛肉膏2.0％，蔗糖2.0％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.2％，(NH₄)₂SO₄0.5％，K₂HPO₄0.1％，MgSO₄· 7H₂O0.05％，pH5.5。