CN102839161B

CN102839161B - 一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法

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Publication number: CN102839161B
Application number: CN 201210319225
Authority: CN
Inventors: 邱君志; 苏礼超; 涂洁; 宋飞飞; 关雄; 邱云锋; 李小霞; 郭庆丰; 何肖云; 吴国辉
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2012-09-03
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2032-09-03
Also published as: CN102839161A

Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有酵母粉1-3w%，D-山梨醇1-4w%，Ba²⁺0.01-0.04mol/L，VB₄0.005-0.02w%，三醋酸甘油酯2w%，培养基初始pH=6.6-7.5。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为125mL，接种量10%，于27℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，具有酯酶产率高，酯酶活力高等优点。

Description

一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法。

背景技术

酯酶（Esterase，EC3.1.1.1）是一类能够催化酯键水解形成相应的酸和乙醇的酶类，广泛分布于动植物和微生物(Bronscheuer，2002)。微生物能够产生多种具有酯解活力的酶类，包括酯酶(Esterase)和脂肪酶(Lipase)。酯酶能够水解或者合成酰基碳链长度小于10的甘油酯类，对于酰基碳链长度大于10的甘油酯类则没有催化活性。

酯酶催化反应具较广的底物范围，在催化底物反应时不需要辅助因子，在一些变形剂，如有机溶剂中有很高的稳定性，此外酯酶催化反应具有立体特异性和区域专一性的特点。由于酯酶以上优点，使得酯酶在很多领域有着广泛的应用。近年来，全球市场工业用酶市场不断扩大，而酯酶是其中一种被广泛使用的生物催化剂，在全球工业用酶市场占据很高的很高比例。随着日益高涨的能源成本、石油煤炭等不可再生资源的衰竭、环境污染以及经济全球化，大规模的可再生的，环保的生物处理工艺来代替或者互补传统不可再生，高能耗，高污染的工业生产工艺是刻不容缓。

在食品加工方面，利用酯酶分解底物后产物为呈香化合物，将酯酶己应用于奶制品的增香、改善稻米和发酵类饮料的香味等方面，如用酯酶处理过的奶制品比未处理的具有更好的香味和可接受性；在农业生产方面，人工合成的有机磷化物广泛用于杀虫剂，这些物质的残留将危害环境并且最终危害人类健康，来自于Brevundimonas diminuta和Alteromonas sp.酯酶被证明能有效降解这类物质，广泛应用于清除有机磷杀虫剂的污染；在医药合成方面，酯酶主要用于拆分手性药物。来自于Pseudomonas sp.的酯酶被应用于抗炎药物布洛芬的生产，来自于Bacillus cogulans的酯酶广泛应用于生物活性物质DL-甘油醇缩丙酮的生产；在轻化工业方面，酯酶广泛应用于制浆造纸、纺织品、皮革处理等。来自于Ophiostoma piceae的酯酶能够有效的水解甘油三酯和幽醇酯，酯酶能够显著降低制浆造纸过程中的树脂，因而能够显著提高机器的运行效率并改善纸张的品质，因而广泛应用于制浆造纸工业；化工日用品方面，碱性酯酶具有明显的助洗作用，加入后使得洗涤剂朝低磷或无磷的方向反应，有利于降低水体中无机磷含量，从而减少环境水体富营养化。酯酶除了在上述的食品加工、农业生产、医药合成以及轻化工业等行业广泛使用外，酯酶还被认为在环保型燃料、生物柴油等生物能源的开发具有广泛的前景。

微生物酯酶是一类重要的工业酶类，国内外上从20世纪90年代到现在，相继开发出各种酯酶，但是依旧无法满足现代工业需求。我国真菌产酯酶的相关研究起步较晚，在期刊杂志上鲜有报道，覃拥灵等人利用诱变裂褶菌ZM37.8，获得稳定的正突变高产菌株E1，其产酯酶量为87.56U/mL（覃拥灵等，2007）。真菌发酵有别于细菌发酵，真菌在发酵过程中可以随时取样接种于LB培养基，检测是否染杂菌；也可通过添加抗生素减少染菌，且真菌发酵条件温和，易于控制等鲜明特点。因此真菌发酵法生产的独特优势，有利于真菌酯酶更广泛地工业化应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法。

本发明首先提供了一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，所述培养基的原料含有酵母粉1-3w%，D-山梨醇1-4 w %，Ba²⁺ 0.01-0.04 mol/L，VB₄0.005-0.02 w %，三醋酸甘油酯2w%，培养基初始pH=6.6-7.5。

更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，含有酵母粉2%，D-山梨醇3%，BaCl₂·2H₂O 0.24%，VB₄0.01%，三醋酸甘油酯2%，培养基初始pH=6.9。

其次，本发明还提供了一种绿僵菌发酵产酯酶的方法，所述方法包含以下步骤：

（a）将绿僵菌接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为125mL，接种量10%，于27℃，转速160 r/min下培养。

所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计，牛肉膏2.0%，蔗糖2.0%，蛋白胨0.2%，酵母粉0.2%，(NH₄)₂SO₄ 0.5%，K₂HPO₄ 0.1% ，MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%，pH5.5。

本发明采用的绿僵菌为绿僵菌 M a Y D T R 03（以下简称绿僵菌Ma-3）（何学友等，应用绿僵菌和白僵菌林间防治木麻黄毒蛾的初步研究，福建林业科技，2011年6月）。

采用本发明优化后的培养基，菌龄4d，发酵周期54h，发酵产生结果绿僵菌Ma-3产酯酶为45U/mL以上。

本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产酯酶的培养基，具有酯酶产率高，酯酶活力高等优点。

附图说明

图1为对硝基苯酚标准曲线。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基配制：牛肉膏20.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g， (NH₄)₂SO₄5.0g，酵母粉2.0g，K₂HPO₄ 1.0g ，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸馏水定容到1000mL，调pH至5.5，分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。0.1MPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。

（2）发酵种子的制作：将绿僵菌Ma-3接种于马铃薯琼脂培养基上，于27℃下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，27℃，转速160 r/min下培养24h，即为发酵液。

（3）酶液的制备：取步骤（2）下的发酵液在4℃下， 5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长405nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mL。

（4）酯酶酶活测定：根据Westlake K等人的酯酶酶活测定方法，进行改进，取1 mL 1mmol/L的对硝基苯酯酸酯(p-NPC2)溶液、2 mL 50mM Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液加人试管中，放人恒温水浴器中，40℃保温15 min，再加1 mL酶液振荡反应4.5 min，立即加入2 mL 95%乙醇终止反应，在波长405nm处测定吸光值。另以在沸水浴中失活的酶液代替原酶液为空白。酶活力单位的定义为在本实验测定条件下，以每分钟催化产生1μmol的对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活力（U/g或U/mL）=A×K×V×n/(t×m)（A为样品的吸光度；K为吸光常数；V为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL）。

（5）标准曲线的制作：精确配制对硝基苯酚2mmol/L标准溶液；首先在试管中加入不同体积50mmol/L Tris-Hcl pH7.2，在40℃保温15 min，在加入不同体积的对硝基苯酚标准液。反应4.5min后立即加入2mL95%乙醇。反应体系为6mL（对硝基苯酚和缓冲液4mL，终止液为2mL）。每个浓度做3平行实验，为空白对照。在波长405 nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，标准溶液溶度为横坐标，经统计处理得到的线性回归方程，y=0.0025x，R²=0.9976，结果见图1。

（6）不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产酯酶的影响

（a）碳源对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）（经细菌过滤器除菌后加入，下同）、蛋白胨1%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%、NaCl 0.1%、FeSO₄ ^.7H₂O 0.001%、pH7.0的培养基中分别添加2%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、L(+)-阿拉伯糖、海藻糖、D-山梨醇、可溶性淀粉，0.1MPa，灭菌20min（下同），接入相同的绿僵菌菌液，在27℃、160r/min的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表1。

（b）金属离子对产酶的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）、蔗糖2%、蛋白胨1%、pH7.0的培养基分别添加0.02mol/L（以6（a）中含有的金属离子按其浓度换算得来）FeCl₃·6H₂O、NaCl、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂、MnCl₂·₄H₂O、KCl、BaCl₂·2H₂O、ZnCl₂、CuCl₂·2H₂O、FeCl₂·4H₂O，灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在27℃、160r/min的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表2。

（c）氮源对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）、蔗糖2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%、NaCl 0.1%、FeSO₄ ^.7H₂O 0.001%、pH7.0的培养基中分别添加1%的酵母粉、蛋白胨、甘氨酸、（NH₄）₂HPO₄、(NH4)₂SO₄、NaNO₃、NH₄NO₃、KNO₃、胰蛋白胨、叶酸、酸水解蛋白胨，灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在27℃、160r/min的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表3。

（d）维生素对酶产量的影响，在含有三醋酸甘油酯2% (w/v）、蛋白胨1%，蔗糖2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%、NaCl 0.1%、FeSO₄ ^.7H₂O 0.001%、pH7.0的培养基中分别添加0.01%硫胺素VB₁、核黄素VB₂、氨基嘌呤VB₄、吡哆醇类VB₆、烟酸、叶酸、抗坏血酸V_C、生育酚脂V_E 、V_A、V_D，灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在27℃、160r/min的摇床中培养60h检测酶活性，结果见表4。

表1 不同碳源对酶产量的影响

表2 不同金属离子对酶产量的影响

Figure 2012103192254100002DEST_PATH_IMAGE002

表3 不同氮源对酶产量的影响

表4 不同维生素对酶产量的影响

Figure 2012103192254100002DEST_PATH_IMAGE004

从表中可以得出最佳的培养基成分为D-山梨醇，酵母粉，Ba²⁺，VB₄，接下来的正交实验将以此作为发酵培养基成分。

实施例2

正交实验确定最优发酵条件

（1）正交实验确定最佳培养基

从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和pH值，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤（1）、（2）。见表5，将相同量的接种量（10%）菌种接种于250mL，装有50mL培养液，在27℃，转速160 r/min下培养培养48h。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表5 绿僵菌Ma-3酯酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计

表6 绿僵菌Ma-3酯酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计实验结果

Figure 2012103192254100002DEST_PATH_IMAGE006

注:K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和，K4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表7 培养基优化验证试验

正交结果分析表明：最佳因素组合是A₃B₃C₂D₂E₂，即D-山梨醇2%，酵母粉1%，Ba²⁺0.02mol/L，VB₄0.01%，pH6.9，且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包括D-山梨醇2%、酵母粉1%、Ba²⁺0.01mol/L、VB₄0.1%、pH6.9，即A₃B₃C₂D₂E₂。表6变化因子的极差值R分别为碳源(94.33)、氮源(102.86)、金属离子(117.25)、维生素(81.01)和pH(66.62)，表明碳源、氮源、金属离子、维生素和pH的变化与绿僵菌Ma-3产酯酶培养基相关，尤其是金属离子的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言，pH的改变对产酶的影响较小。

(2)正交实验确定最优培养条件

在从正交实验确定的最优培养基的基础上，通过设定不同接种量，装液量，菌龄，培养时间，在27℃，转速160 r/min下培养，各组号的培养时间以表9为准。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表8绿僵菌Ma-3酯酶四因子三水平（3⁴）正交实验

Figure 2012103192254100002DEST_PATH_IMAGE008

表9绿僵菌Ma-3酯酶四因子三水平（3⁴）正交实验设计实验结果

注: K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和， R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表10 培养条件优化验证试验

总结了4个因子(接种量、装液量、菌龄和培养时间)对绿僵菌Ma-3产酯酶产生的影响。表9中的R值表明培养时间(54.36)是一个比其他培养条件更重要的因子，其次是装液量(39.97)，然后是菌龄(35.71)，对绿僵菌Ma-3产酯酶影响最小的因子是接种量(19.19)。最优相应的实验条件应为A₂B₃C₂D₂(接种量10%，装液量125mL/250mL，菌龄4d，培养时间54h）。在培养该菌产的时候，要注意培养时间，以提高产酶效率。

实施例3

真菌产酯酶发酵方法

（1）发酵种子的制备

（A）菌种和培养基

菌种：绿僵菌Ma-3

斜面培养基：PDA培养基

液体种子培养基：牛肉膏20.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g， (NH₄)₂SO₄5.0g，K₂HPO₄ 1.0g ，MgSO₄·7H₂O 0. 5g，蒸馏水定容至1000mL，调pH值为5.5，0.1MPa，灭菌20min，(该培养基pH值较低是为了抑制杂菌生长)。

（B）种子液制备

将斜面上的纯种绿僵菌Ma-3转接到多个250mL三角瓶中，其中装有100mL培养基，然后在27℃(温度较发酵培养同样是为了抑制染菌)，在往复式震荡摇床转速160 r/min下培养培养4d，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。

此外接种前可在种子液中加入抗生素，杀灭或者抑制杂菌的生长，从而获得不带杂菌的纯种菌种。

（2）发酵培养

发酵培养基：按照培养基优化正交实验，即D-山梨醇2%，酵母粉1%，BaCl₂·2H₂O 0.24%，VB₄0.01%，pH6.9，，三醋酸甘油酯2% (w/v），配制。

将上一步骤中制备的绿僵菌Ma-3发酵种子液，按培养条件正交实验得出的最佳条件，接种量10%接种于250mL三角瓶中，瓶中装有125mL发酵培养液，

摇床温度：27℃±1℃，

发酵周期：54h，

发酵产生结果绿僵菌Ma-3产酯酶为45U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

Claims

1.一种绿僵菌MaYDTR 03发酵生产酯酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有酵母粉1-2w%，D-山梨醇1-4 w %，Ba²⁺ 0.01-0.04 mol/L，VB₄0.005-0.02 w %，三醋酸甘油酯2w%，培养基初始pH=6.6-7.5。

2.一种绿僵菌MaYDTR 03发酵生产酯酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料按重量分数计，含有酵母粉2%，D-山梨醇3%，BaCl₂·2H₂O 0.24%，VB₄0.01%，三醋酸甘油酯2%，培养基初始pH=6.9。

3.一种绿僵菌MaYDTR 03发酵产酯酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

（a）将绿僵菌MaYDTR 03接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为125mL，接种量10%，于27℃，转速160 r/min下培养。

4.如权利3所述绿僵菌MaYDTR 03发酵产酯酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计，牛肉膏2.0%，蔗糖2.0%，蛋白胨0.2%，酵母粉0.2%，(NH₄)₂SO₄ 0.5%，K₂HPO₄ 0.1% ，MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%，pH5.5。