CN101845397B - 一种培养金龟子绿僵菌的方法 - Google Patents

一种培养金龟子绿僵菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种培养金龟子绿僵菌的方法。该方法，包括如下步骤：1)用液体培养基对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)进行液体发酵培养，将容器内的所有物质记作液体发酵产物；2)将所述液体发酵产物接种于固体发酵培养基，进行固体发酵培养，得到金龟子绿僵菌。本发明是一种金龟子绿僵菌液固双相发酵的培养方法，该方法将液体发酵罐生产与固体发酵生产相结合。该方法的液体深层发酵中，所采用的培养基是以甘蔗渣为主要载体，仅用三种廉价、易得的农副产品为原料，大大降低了成本。

Description

一种培养金龟子绿僵菌的方法
技术领域
本发明涉及一种培养金龟子绿僵菌的方法。
背景技术
化学农药的大量使用对环境生态造成了严重的影响，生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是生物防治的重要手段之一。虫生真菌种类多，代谢类型复杂，以其安全有效，显著的流行潜力，容易大量生产等优点，在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位。绿僵菌是世界性分布的杀虫真菌，能寄生8个目30个科约200种昆虫、螨类及线虫。利用绿僵菌防治害虫的研究已有百年，它致病力强、效果好，对人、畜、作物及害虫天敌无毒害，是当今用于生物防治的虫生真菌研究的主要对象之一。
目前，对金龟子绿僵菌的培养方法一般都生产周期长、菌剂含孢量低、成本高，阻碍了对金龟子绿僵菌的生产进程。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培养金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的方法。
本发明所提供的培养金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的方法，包括如下步骤：1)用液体培养基对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)进行液体发酵培养，将容器内的所有物质记作液体发酵产物；2)将所述液体发酵产物接种于固体发酵培养基，进行固体发酵培养，得到金龟子绿僵菌。
上述方法中，所述步骤1)中，所述液体发酵培养的条件为：温度为28℃，通入空气的量为10L/min/35L所述液体培养基和所述容器内的气压为0.03Mpa。
上述方法中，所述步骤1)中，液体发酵培养至液体发酵产物呈如下状态：液体发酵产物中有菌丝及液生孢子，液体发酵产物中菌丝体中无液泡，液体发酵产物中无断裂的菌丝。
上述方法中，所述步骤1)中，液体发酵培养的时间为65小时～72小时，具体为65小时、68小时或72小时。
上述方法中，所述步骤1)中，所述液体培养基由玉米粉、豆饼粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、KCl、FeSO4·7H2O和水组成；所述各组分的配比为：20g玉米粉∶40g豆饼粉∶2.5g蛋白胨∶0.5gKH2PO4∶0.5gMgSO4∶0.5gKCl∶0.01gFeSO4·7H2O∶1000ml水。
上述方法中，所述步骤2)中，所述固体发酵培养的方式按照如下a阶段、b阶段和c阶段依次进行：
a阶段：在温度为24℃、湿度为95％(体积百分含量)的条件下培养；
b阶段：在温度为28℃、湿度为80％(体积百分含量)的条件下培养；
c阶段：在温度为28℃、湿度为40％(体积百分含量)的条件下培养。
上述方法中，所述步骤2)中，所述a阶段的培养时间为2天-3天；所述b阶段的培养时间为2天；所述c阶段的培养时间为2天。
上述方法中，所述步骤2)中，所述接种的量为：使所述液体发酵产物与固体发酵培养基的体积比为20∶80。
上述方法中，所述步骤2)中，所述固体发酵培养基由甘蔗渣、麸皮、玉米粉、KH2PO4、MgSO4、KCl和水组成；所述各组分的质量份数比为：300-400份甘蔗渣∶150-200份麸皮∶90-150份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶300-400份水；
所述各组分的质量份数比具体为：300份甘蔗渣∶150份麸皮∶150份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶300份水，或350份甘蔗渣∶180份麸皮∶120份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶350份水，或400份甘蔗渣∶200份麸皮∶90份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶400份水。
上述方法中，所述麸皮为小麦麸皮。
上述方法中，所述步骤2)中，所述培养过程中包括翻料的步骤。
上述方法中，所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF813，ACCC编号为31518。
本发明是一种金龟子绿僵菌液固双相发酵的培养方法，该方法将液体发酵罐生产与固体发酵生产相结合。该方法的液体深层发酵中，所采用的培养基是以甘蔗渣为主要载体，仅用三种廉价、易得的农副产品为原料，大大降低了成本。
本发明生产工艺经济实用、生产效率高，投资少，占地小，生产可以实现规模化且无三废问题。具体优点如下：1)提高培养绿僵菌的竞争力，降低杂菌的污染；2)提高绿僵菌产分生孢子速度，降低绿僵菌的培养时间和使用空间；3)确保接种绿僵菌菌液对固体颗粒物质的均匀覆盖，使菌体能同步生长。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae(Metsch.)]JF813，分离自海南乐东树林表层土壤的金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae(Metsch.)]，保存于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，保藏编号为31518。公众可从ACCC订购该菌株。
实施例1、
1、一级平板菌种培养：
将分离纯化的菌种接种于PDA培养基平板，放入28℃培养箱，培养7～10天，待菌丝长满平板并产孢时，转入摇瓶培养；
每1000ml PDA培养基组成：马铃薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
2、液体种子培养：
在1000ml三角瓶中，装入400ml的液体种子培养基，接入平板菌种，接种量为1000ml三角瓶接1/6培养好的一级平板菌种(培养皿规格90mm)，接种后置于恒温摇床(28℃，180转/分)培养3～5天；
每1000ml液体种子培养基组成：20g玉米粉、40g豆饼粉、2.5g蛋白胨、0.5gKH2PO4、0.5gMgSO4、0.5gKCl、0.01gFeSO4·7H2O和1000ml水；调pH至6.5。121℃高压灭菌30分钟，待冷却至40℃后接种。
3、液体发酵生产：
取50升机械搅拌发酵罐，装入35升液体培养基，将3瓶步骤2中培养好的1000ml摇瓶种子接入培养，按5％接种量(体积比)进行接种；培养条件为：温度28℃，通入空气，通气量为10L min-1，保压0.03Mpa，培养65小时，然后放罐，此时发酵液中出现大量菌丝及液生孢子，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝。
每1000ml液体培养基组成：20g玉米粉、40g豆饼粉、2.5g蛋白胨、0.5gKH2PO4、0.5gMgSO4、0.5gKCl、0.01gFeSO4·7H2O和1000ml水；调pH至6.5；121℃高压灭菌30分钟，待冷却至40℃后接种。
玉米粉购自农贸市场。豆饼粉购自农贸市场。蛋白胨购自海南青鸟生物科技有限公司，产品目录号为050170。
4、固体发酵生产
固体培养料组成：甘蔗渣、小麦麸皮、玉米粉、KH2PO4、MgSO4、KCl和水；其质量份数比为：300份甘蔗渣、150份麸皮、150份玉米粉、0.5份KH2PO4、0.5份MgSO4、0.5份KCl、300份水；pH自然，121℃蒸汽灭菌60分钟；
在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的无菌房子内接种。将步骤3得到的发酵产物与固体培养料混合均匀，接种量为20％(即步骤3得到的发酵产物与固体培养料体积比为20∶80)。
接种后，将混匀后的混合物装于浅盘中，各装入量疏松度和深度一致，然后按如下阶段培养：
a阶段：在温度为24℃、湿度为95％(体积百分含量)的条件下培养；时间为2d；期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度；该阶段菌丝生长阶段，要求低温高湿；
b阶段：在温度为28℃、湿度为80％(体积百分含量)的条件下培养；时间为2d；期间改用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度；该阶段开始形成孢子，要求高温中湿；
c阶段：在温度为28℃、湿度为40％(体积百分含量)的条件下培养；时间为2d；期间不需要覆盖；该阶段菌要求高温低湿。
上述培养过程中，要经常进行翻料。
5、发酵产物的干燥
将固体发酵好的产物80目过筛，收集金龟子绿僵菌孢子，将其放入干燥箱内进行干燥，温度设为26℃，干燥24小时后取出，测得含水量为6.0％。
孢子产量为3.28×1010个活性孢子/克菌。
生产周期为6天。
实施例2、
1、一级平板菌种培养：与实施例1中所述方法相同。
2、液体种子培养：与实施例1中所述方法相同。
3、液体发酵生产：与实施例1中所述方法相同，不同的是培养时间为68小时。
4、固体发酵生产
固体发酵方法与实施例1中所述方法相同，不同的是a阶段的培养时间为3天，固体培养料组成不同，如下：
固体培养料组成：甘蔗渣、小麦麸皮、玉米粉、KH2PO4、MgSO4、KCl和水；其质量份数比为：350份甘蔗渣∶180份麸皮∶120份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶350份水；pH自然，121℃蒸汽灭菌60分钟；
5、发酵产物的干燥
方法与实施例1中所述方法相同。
结果：孢子产量为4.51×1010个活性孢子/克菌。生产周期为7天。
实施例3、
1、一级平板菌种培养：与实施例1中所述方法相同。
2、液体种子培养：与实施例1中所述方法相同。
3、液体发酵生产：与实施例1中所述方法相同，不同的是培养时间为72小时。
4、固体发酵生产
固体发酵方法与实施例1中所述方法相同，不同的是固体培养料组成不同，如下：
固体培养料组成：甘蔗渣、小麦麸皮、玉米粉、KH2PO4、MgSO4、KCl和水；其质量份数比为：400份甘蔗渣∶200份麸皮∶90份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶400份水；pH自然，121℃蒸汽灭菌60分钟；
5、发酵产物的干燥
方法与实施例1中所述方法相同。
结果：孢子产量为3.01×1010个活性孢子/克菌。生产周期为6天。

Claims (11)

1.一种培养金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的方法，包括如下步骤：1)用液体培养基对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)进行液体发酵培养，将容器内的所有物质记作液体发酵产物；2)将所述液体发酵产物接种于固体发酵培养基，进行固体发酵培养，得到金龟子绿僵菌；
所述步骤2)中，所述固体发酵培养基由甘蔗渣、麸皮、玉米粉、KH2PO4、MgSO4、KCl和水组成；所述各组分的质量份数比为：300-400份甘蔗渣∶150-200份麸皮∶90-150份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶300-400份水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述液体发酵培养的条件为：温度为28℃，通入空气的量为10L/min/35L，所述液体培养基和所述容器内的气压为0.03Mpa。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，液体发酵培养至液体发酵产物呈如下状态：液体发酵产物中有菌丝及液生孢子，液体发酵产物中菌丝体中无液泡，液体发酵产物中无断裂的菌丝。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，液体发酵培养的时间为65小时～72小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，液体发酵培养的时间为65小时、68小时或72小时。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述液体培养基由玉米粉、豆饼粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、KCl、FeSO4·7H2O和水组成；所述各组分的配比为：20g玉米粉∶40g豆饼粉∶2.5g蛋白胨∶0.5gKH2PO4∶0.5gMgSO4∶0.5gKCl∶0.01gFeSO4·7H2O∶1000ml水。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述固体发酵培养的方式按照如下a阶段、b阶段和c阶段依次进行：
a阶段：在温度为24℃和湿度为95％(体积百分含量)的条件下培养；
b阶段：在温度为28℃和湿度为80％(体积百分含量)的条件下培养；
c阶段：在温度为28℃和湿度为40％(体积百分含量)的条件下培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述a阶段的培养时间为2天-3天；所述b阶段的培养时间为2天；所述c阶段的培养时间为2天。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述接种的量为：使所述液体发酵产物与固体发酵培养基的体积比为20∶80。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 
所述步骤2)中，所述固体发酵培养基的各组分的质量份数比为：300份甘蔗渣∶150份麸皮∶150份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶300份水，或350份甘蔗渣∶180份麸皮∶120份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶350份水，或400份甘蔗渣∶200份麸皮∶90份玉米粉∶0.5份KH2PO4∶0.5份MgSO4∶0.5份KCl∶400份水。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述麸皮为小麦麸皮；
所述步骤2)中，所述培养过程中包括翻料的步骤；
所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF813，ACCC编号为31518。 
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839161A (zh) * 2012-09-03 2012-12-26 福建农林大学 一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102260103A (zh) * 2011-04-29 2011-11-30 山东理工大学 一种抗菌蝇食用菌生物培养基
CN102994472B (zh) * 2012-12-17 2013-12-25 福建农林大学 一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法
CN103704074B (zh) * 2013-12-28 2016-04-06 新疆农业大学 绿僵菌喷施堆肥场地地面防治白星花金龟幼虫的方法
CN107410216A (zh) * 2017-05-14 2017-12-01 蒋春霞 一种用于杀灭白蚁的诱杀虫培养方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100381557C (zh) * 2004-08-26 2008-04-16 华南理工大学 金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法
CN100360038C (zh) * 2006-01-19 2008-01-09 成都医学院 一种利用废弃菌渣生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839161A (zh) * 2012-09-03 2012-12-26 福建农林大学 一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法
CN102839161B (zh) * 2012-09-03 2013-07-03 福建农林大学 一种绿僵菌发酵生产酯酶的培养基及方法

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