CN102994472B

CN102994472B - 一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法

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Publication number: CN102994472B
Application number: CN 201210543900
Authority: CN
Inventors: 邱君志; 林瑞珠; 苏礼超; 涂洁; 宋飞飞; 邱云锋; 李小霞; 郭庆丰; 何肖云; 毛丽慧
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2012-12-17
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-12-17
Also published as: CN102994472A

Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。，所述培养基的原料配方为：橄榄油0.25-2w%，蛋白胨0.05-0.4w%，ZnCl₂0.0125-0.1mol／L，叶酸0.005-0.04w%，pH5.0-6.5，其余为水。该方法通过将发酵种子液接种于培养基，100mL的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25℃，转速150r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高等优点。

Description

一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种绿僵菌(Metarhizium anisopliae)发酵生产脂肪酶的培养基及方法。

背景技术

脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶)，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸脂肪酶是一类分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不仅可以催化酯水解反应还可以催化酯合成反应和转酯反应。微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的pH和温度范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂I21。脂酶在微生物界分布很广，据不完全统计，目前已有65个属的微生物能够产生脂肪酶。随着对微生物脂肪酶研究的深入，已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。

就微生物脂肪酶而言，由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的来源不足等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法，该培养基发酵生产的脂肪酶活力高，发酵方法的条件温和，易于控制，有利于工业化生产。

本发明首先提供了一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，所述培养基的原料含有橄榄油50.0 g／L，K₂ HPO₄ 1.0 g／L，CaCl₂ 0.1 g／L，NaCl 0.5 g／L，Mg₂SO₄·7H₂O 0.1 g／L，(NH4)₂SO₄1.0 g／L，葡萄糖10.0 g／L。

一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料配方为：橄榄油0.25%，蛋白胨0.2%，ZnCl2 0.1 mol／L，叶酸0.02 %，pH6.0，其余为水；所述绿僵菌为菌株MaYTTR-04。

其次，本发明还提供了一种绿僵菌发酵产脂肪酶的方法，所述方法包含以下步骤：

（a）将绿僵菌接种菌株MaYTTR-04种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，100mL的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25℃，转速150 r/min下培养。

所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计，马铃薯20%，蔗糖2%，。

本发明采用的绿僵菌为绿僵菌 MaYTTR-04(何学友等，金龟子绿僵菌MaYTTR-04菌株对松墨天牛成虫的致病力，昆虫学报, 2008年1月)。

采用本发明优化后的培养基，发酵周期72h，发酵产生结果绿僵菌MaYTTR-04产脂肪酶为30U/mL以上。

本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶活力高（30U/mL）等优点。

附图说明

图1为对硝基苯酚标准曲线。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基配制：马铃薯200.0 g／L，蔗糖20.0 g／L，其余为水，分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含100mL。0.1MPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基杀菌预处理。

（2）发酵种子的制作：将绿僵菌MaYTTR-04接种于马铃薯琼脂培养基上，于25℃下培养7d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，25℃，转速150 r/min下培养48h，即为发酵液。

（3）酶液的制备：取步骤（2）下的发酵液在4℃下， 5000 r/min离心，5min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在波长410nm处的吸光值。换算成酶活单位U/mL。

（4）脂肪酶酶活测定：在pH 8.0、50 ℃条件下，每min水解p-NPP释放1 μmol对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。

方法：溶液A：150 mg p-NPP溶于50 mL异丙醇；溶液B：500 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯胶。

取2个试管（分别是对照管和样品管），各加溶液B 2.85 mL和底物溶液A 0.1 mL（缓慢混合，该溶液至少可稳定2 h）。50 ℃水浴中预热5 min，然后在对照管中加入已灭活的酶液0.05 mL，样品管中加入酶液0.05 mL，立即混匀计时。在水浴中准确反应10 min时马上测定410 nm下酶水解产生的p-nitrophenol的吸光度值（OD₄₁₀值）。酶活计算公式：A＝（[A₁－A₀]×K＋C₀）×V₁×N／（V₂×t）

A——样品酶活（u/mL）A₁——样品的吸光度值（OD₄₁₀值）A₀——对照的吸光度值（OD₄₁₀值校准为0）K——p-nitrophenol标准曲线的斜率，

C₀——p-nitrophenol标准曲线的截距N——稀释倍数V₁——反应液的体积（3 mL）V₂——酶液的体积（0.05 mL）t——反应时间（10 min）。

（5）标准曲线的制作：（底物缓冲液指pH7.5磷酸缓冲液，A+B）

在波长410 nm处测定吸光值。以OD₄₁₀值为横坐标，p-nitrophenol含量为纵坐标绘制标准曲线。经统计处理得到的线性回归方程，y=45.592x，R²=0.9940，结果见图1。

（6）不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产脂肪酶的影响

（a）碳源对酶产量的影响，在含有橄榄油50.0 g／L，K₂ HPO₄ 1.0 g／L，CaCl₂ 0.1 g／L，NaCl 0.5 g／L，Mg₂SO₄·7H₂O 0.1 g／L，(NH4)₂SO₄1.0 g／L，的培养基中分别添加10.0 g／L葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、α-乳糖、D-半乳糖、橄榄油、可溶性淀粉，以不加任何碳源为对照。0.1MPa，灭菌20min（下同），接入相同的绿僵菌菌液，在25℃、150r/min的摇床中培养72h检测酶活性，结果见表1。

（b）氮源对酶产量的影响，在含有橄榄油50.0 g／L，K₂ HPO₄ 1.0 g／L，CaCl₂ 0.1 g／L，NaCl 0.5 g／L，Mg₂SO₄·7H₂O 0.1 g／L，，葡萄糖10.0 g／L的培养基中分别添加1.0 g／L的酵母粉、蛋白胨、甘氨酸、（NH₄）₂HPO₄、(NH4)₂SO₄、NH₄NO₃、尿素、胰蛋白胨，以不加任何氮源为对照。灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在25℃、150r/min的摇床中培养72h检测酶活性，结果见表2。

（c）金属离子对产酶的影响，在含有橄榄油50.0 g／L、(NH4)₂SO₄1.0 g／L，葡萄糖10.0 g／L的培养基分别添加0.02496mol/L（以6（a）中含有的金属离子按其浓度换算得来）NaCl、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂、MnCl₂·₄H₂O、KCl、BaCl₂·2H₂O、ZnCl₂、CuCl₂·2H₂O，以不加任何金属离子为对照。灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在25℃、150r/min的摇床中培养72h检测酶活性，结果见表3。

（d）维生素对酶产量的影响，在含有橄榄油50.0 g／L，K₂ HPO₄ 1.0 g／L，CaCl₂ 0.1 g／L，NaCl 0.5 g／L，Mg₂SO₄·7H₂O 0.1 g／L，(NH4)₂SO₄1.0 g／L，葡萄糖10.0 g／L的培养基中分别添加0.01%硫胺素VB₁、核黄素VB₂、吡哆醇类VB₆、烟酸、叶酸、抗坏血酸V_C、VB₅、复合VB，以不加任何维生素为对照。灭菌，接入相同的绿僵菌菌液，在25℃、150r/min的摇床中培养72h检测酶活性，结果见表4。

表1 不同碳源对酶产量的影响

表2 不同氮源对酶产量的影响

Figure 2012105439001100002DEST_PATH_IMAGE003

表3 不同金属离子对酶产量的影响

表4 不同维生素对酶产量的影响

从表中可以得出最佳的培养基成分为橄榄油，蛋白胨，Zn²⁺，叶酸，接下来的正交实验将以此作为发酵培养基成分。

实施例2

正交实验确定最优发酵条件

（1）正交实验确定最佳培养基

从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和pH值，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤（1）、（2）。见表5，将相同量的接种量（10%）菌种接种于装有50mL培养液的250mL三角烧瓶中，在25℃，转速150 r/min下培养培养72h。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表5 绿僵菌MaYTTR-04脂肪酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计

表6 绿僵菌MaYTTR-04脂肪酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计实验结果

注:Ⅰ1 为各因素水平1的所有酶活力之和，Ⅱ2 为各因素水平2的所有酶活力之和，Ⅲ3为各因素水平3的所有酶活力之和，Ⅳ4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表7 培养基优化验证试验

正交结果分析表明：最佳因素组合是A₁B₃C₄D₃E₃，即橄榄油0.25g/100mL，蛋白胨0.2 g/100mL，Zn²⁺0.1mol/L，叶酸0.02 g/100mL，pH6.0(即橄榄油0.25%，蛋白胨0.2%，Zn²⁺0.1mol/L，叶酸0.02%，pH6.0)，且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包括橄榄油0.25%，蛋白胨0.2%，Zn²⁺0.1mol/L，叶酸0.02%，pH6.0，即A₁B₃C₄D₃E₃。表6变化因子的极差值R分别为碳源(125.52)、氮源(42)、金属离子(95)、维生素(56.76)和pH(32.43)，表明碳源、氮源、金属离子、维生素和pH的变化与绿僵菌MaYTTR-04产脂肪酶培养基相关，尤其是碳源的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言，pH的改变对产酶的影响较小。

实施例3

真菌产脂肪酶发酵方法

（1）发酵种子的制备

（A）菌种和培养基

菌种：绿僵菌MaYTTR-04

斜面培养基：PDA培养基

液体种子培养基：PBA培养基。

（B）种子液制备

将斜面上的纯种绿僵菌MaYTTR-04转接到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，然后在25℃，在往复式震荡摇床转速150 r/min下培养3d，待菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。

（2）发酵培养

发酵培养基：按照培养基优化正交实验，即橄榄油0.25%，蛋白胨0.2%，Zn²⁺（ZnCl₂）0.1mol/L，叶酸0.02%，pH6.0配制。

将上一步骤中制备的绿僵菌MaYTTR-04发酵种子液，接种量10%接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液，

摇床温度：25℃±1℃，

发酵周期：72h，

发酵产生结果绿僵菌MaYTTR-04产脂肪酶为30U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

Claims

1.一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料配方为：橄榄油0.25%，蛋白胨0.2%，ZnCl ₂ 0.1 mol／L，叶酸0.02 %，pH6.0，其余为水；所述绿僵菌为菌株MaYTTR-04。

2.一种绿僵菌发酵产脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

（a）将绿僵菌菌株MaYTTR-04接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于权利要求1 所述的培养基，250mL 的三角瓶装液量为50mL，接种量10%，于25℃，转速150 r/min 下培养。

3.如权利要求2所述绿僵菌发酵产脂肪酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料配方为：按重量分数计，马铃薯20%，蔗糖2%，余量为水。